Name: Nagrania patch clamp z neuronów siatkówki myszy w dostosowanym do ciemności preparacie plasterków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Naucz się techniki patch clamp w ciemno przystosowanych plasterkach siatkówki myszy. Metoda umożliwia rejestrację odpowiedzi elektrofizjologicznych neuronów siatkówki na bodźce świetlne LED.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant NIH EY17606 (APS).

1. Przygotowanie elektrod
<ol>
<li>Przygotować elektrody pomiarową i odniesienia, zanurzając obie w 1M NaCl i przyłożając między nie napięcie 15V przy użyciu fali sinusoidalnej o częstotliwości 1 Hz przez ok. 20 s.</li>
<li>Wykonać elektrody pomiarowe za pomocą wyciągacza mikropipet (Sutter Instruments P-97). W przypadku pipet do techniki patch-clamp należy użyć szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,2 mm i średnicy wewnętrznej 0,69 mm (Sutter Instruments, Cat#B120-69-10). Zmierzyć rezystancję szeregową przez końcówkę elektrody. Na podstawie wielkości komórek docelowych wybrać średnicę końcówki pipety; dla ciał komórek o średnicy ok. 20 μm zastosować ok. 5 MΩ, a dla ciał komórek o średnicy ok. 5 μm zastosować ok. 12 MΩ.</li>
<li>Przygotować elektrody uziemiające/odniesienia. Za pomocą strzykawki wypełnić krótki odcinek rurki polietylenowej (Intramedic, PE205) roztworem 1 mM NaCl zawierającym 3,5% Agaru (Sigma; Cat# A7002) w 1M NaCl. Umieścić ten mostek agarowy nad elektrodą odniesienia Ag/AgCl.</li>
</ol>
2. Przygotowywanie roztworów
<ol>
<li>Zewnętrzny roztwór kąpieli, pożywka Amesa zawierająca wodorowęglany (1 L): 1 butelka Ames' Medium (Sigma; Cat# A1420), 1,9 g NaHCO3, 7 mL Penicillin-Streptomycin (Sigma; Cat# P0781) w celu zapobiegania wzrostowi bakterii. Dostosować osmolalność do ~ 280 mOsm.</li>
<li>Roztwór do krojenia, pożywka Amesa zawierająca bufor pH HEPES (1 L): 1 butelka Ames' Medium, 0,887 g NaCl, 2,38 g HEPES, 7 mL Penicillin-Streptomycin. Dostosować pH do ~ 7,4 przy użyciu 1M NaOH i/lub 1M HCl. Dostosować osmolalność do ~ 280 mOsm.</li>
<li>Wewnętrzny roztwór do pipety z aspartanem potasu (K-Asp) (w mM): 125 K-Aspartate, 10 KCl, 10 HEPES, 5 NMG-HEDTA, 0,5 CaCl2, 1 ATP-Mg, 0,2 GTP-Mg; pH dostosowane do ~ 7,3 za pomocą NMG-OH, a osmolalność dostosowana do ~ 280 mOsm.</li>
<li>Agarowe podłoże stabilizujące agarozę o niskiej temperaturze żelowania zawierającą siatkówkę (5% wagowo), 7,5 g Agar (Sigma; Cat# A7002) rozpuszczone w 150 mL dH2O.</li>
</ol>

3. Dzień eksperymentu
<ol>
<li>Odmrozić z zamrażarki ~ 1,5 mL wewnętrznego roztworu K-Asp oraz wybrany fluorofor. Rozcieńczyć fluorofor do odpowiedniego stężenia, które należy wyznaczyć empirycznie.</li>
<li>Wlać do światłoszczelnego pojemnika do przechowywania pożywkę Amesa zawierającą NaHCO3 (~ 200 mL）, a następnie umieścić ją w łaźni wodnej (30-32°C) i nasycić mieszaniną gazów 5% CO2/95% O2.</li>
<li>Napełnić butelkę ~ 110 mL pożywki Amesa zawierającej HEPES, umieścić na lodzie i nasycić 100% O2.</li>
<li>Pozostałą pożywkę Amesa zawierającą NaHCO3 umieścić w podgrzewanym zbiorniku na górze klatki Faradaya i nasycić mieszaniną gazów 5% CO2/95% O2. Do zatrzymania gazu w przestrzeni nad roztworem można użyć Parafilmu.</li>
<li>Przygotować agarozę o niskiej temperaturze żelowania (3%), dodając 0,75 g (Sigma; Cat#A0701) do 25 mL pożywki Amesa z HEPES, a następnie podgrzać roztwór do ~ 115°C, aby stopić agarozę. Mieszać do momentu, aż roztwór stanie się klarowny i pozbawiony pęcherzyków powietrza, a następnie przechowywać w łaźni wodnej (~ 42°C).</li>
<li>Napełnić pipetę rejestrującą wewnętrznym roztworem K-Asp i sprawdzić oporność końcówki.</li>
</ol>
4. Rozpoczęcie eksperymentu
<ol>
<li>	Uśmierć mysz i szybko usuń oczy za pomocą zakrzywionych nożyczek. Wszystkie procedury należy przeprowadzać w goglach podczerwonych, aby zapobiec blaknięciu pigmentu wzrokowego.</li>
<li>	Umieść oczy na kawałku papieru filtracyjnego, aby zapobiec ich toczeniu się, a następnie, trzymając oko pęsetą, wykonaj nacięcie w rogówce za pomocą cienkiego, obustronnego ostrza.</li>
<li>	Natychmiast po przebiciu gałki ocznej przenieś oko do naczynia wypełnionego pożywką Ameśs.</li>
<li>	Wykorzystując nacięcie w rogówce jako punkt wejścia, za pomocą małych nożyczek wytnij pozostałe części rogówki, po czym usuń soczewkę i ciało szkliste. Należy uważać, aby siatkówka pozostała przytwierdzona do oka; tak przygotowaną gałkę oczną przechowuj w ciemności w temperaturze 32° C w pożywce Ameśs równoważonej z 5% CO2/95% O2.</li>
</ol>
5. Krojenie
<ol>
<li>Przetnij połowicznie jedną z czarek ocznych i oddziel siatkówkę od nabłonka pigmentowego siatkówki. Usuń brzegi siatkówki, aby tkanka mogła równo przylegać.</li>
<li>Za pomocą małej szklanej pipety Pasteura z lateksową gruszką napełnij 35 mm szalkę Petriego roztopionym agarem, a następnie przeciągnij pęsetą przez agar, aby sprawdzić jego konsystencję.</li>
<li>Gdy agar zacznie twardnieć:
<ol class="lalpha">
<li>Przenieś siatkówkę na powierzchnię agaru.</li>
<li>Użyj skręconego kawałka chusteczki Kimwipe, aby wchłonąć nadmiar roztworu wokół siatkówki.</li>
<li>Nanieś 2-3 krople agaru bezpośrednio na siatkówkę i szybko umieść nad nią plastikowy cylinder, aby stworzyć wokół niej ściankę. Następnie wlewaj dodatkowy roztopiony agar po ściankach plastikowego cylindra, centrując siatkówkę wewnątrz agaru.</li>
<li>Przenieś szalkę Petriego do kąpieli w lodowatej wodzie w celu schłodzenia.</li></ol></li>
<li>Po około 45 sekundach wyjmij tkankę z kąpieli w lodowatej wodzie i za pomocą tłoka wypchnij blok agaru z plastikowego cylindra, naciskając od strony przeciwnej do siatkówki.</li>
<li>Użyj jednostronnego ostrza do golenia, aby wyciąć mały blok agaru zawierający siatkówkę, a następnie przyklej blok superglue do ogranicznika agaru na dysku do preparatów.</li>
<li>Przenieś dysk do preparatów do tacy wibracyjnego mikrotomu i wlej do tacy lodowaty roztwór Ames HEPES, tak aby blok z siatkówką został całkowicie zanurzony.</li>
<li>Przekroje siatkówki o grubości ~ 200 μm można wycinać przy maksymalnej częstotliwości wibracji ostrza i prędkości posuwu ustawionej tak, aby przecięcie siatkówki w każdym przekroju trwało od 4 do 5 sekund.</li>
<li>Użyj ostrza skalpela nr 11, aby pojedynczo usuwać każdy użyteczny przekrój.</li>
<li>Dobre przekroje zawierające siatkówkę umieszcza się w komorach rejestracyjnych i dociąża kotwicami do przekrojów z nylonowymi nićmi przebiegającymi nad nimi. Nitki nylonowe dociskają agar otaczający siatkówkę, pozostawiając siatkówkę odsłoniętą do rejestracji.</li>
<li>Przenieś komorę rejestracyjną na stolik mikroskopu pionowego, zasłoń zasłonę i włącz podczerwone źródło światła, aby obejrzeć przekrój za pomocą kamery czułej na podczerwień.</li>
</ol>
6. Rejestracja
<ol>
<li>Po zidentyfikowaniu odpowiedniego skrawka siatkówki (z nienaruszonymi fotoreceptorami i właściwym kątem cięcia) należy rozpocząć perfuzję siatkówki z prędkością powyżej 5 mL/min podgrzanym do 35–37°C podłożem Amesa, równoważonym z 5% CO2/95% O2.</li>
<li>W wyniku procesu krojenia mogą być widoczne uszkodzenia powierzchniowe. Tę cienką warstwę komórek można zazwyczaj usunąć za pomocą pipety z uciętą końcówką, delikatnie odsysając martwe ciała komórek. Pozwoli to zazwyczaj na odsłonięcie żywych komórek znajdujących się poniżej. Należy zidentyfikować zdrowe ciało komórki znajdujące się w interesującej nas warstwie.</li>
<li>Należy napełnić mikropipetę wewnętrznym roztworem KAsp, przyłożyć dodatnie (zewnętrzne) ciśnienie przez końcówkę pipety, a następnie opuścić końcówkę pipety do komory rejestracyjnej i na poziom komórki za pomocą mikromanipulatora.</li>
<li>Przesunąć końcówkę pipety tak, aby spowodowała ona wgłębienie w błonie komórkowej, a następnie przyłożyć delikatne ujemne (wewnętrzne) ciśnienie w celu utworzenia uszczelnienia o wysokiej rezystancji. Tryb whole-cell można uzyskać poprzez przyłożenie ujemnego ciśnienia do elektrody w celu przebicia się do wnętrza komórki.</li>
<li>Stymulacja tkanki siatkówki za pomocą diod LED może następnie wywołać odpowiedzi na światło.</li>
<li>Należy sfotografować komórkę, z której dokonano pomiaru, wywołując fluorescencję fluoroforu zawartego w wewnętrznym roztworze pipety.</li>
</ol>

7. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig1.jpg" alt="Wykres potencjału błonowego w funkcji czasu, przedstawiający dane dotyczące aktywności elektrycznej w elektrofizjologii neuronów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przedstawiono tutaj potencjały wywołane światłem w zaadaptowanym do ciemności neuronie siatkówki w odpowiedzi na błyski światła o rosnącym natężeniu.
<img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig2.jpg" alt="Mikroskopia neuronów siatkówki, komórki bipolarne czopkowe i pręcikowe, obrazowanie fluorescencyjne, badanie wzroku." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Obraz fluorescencyjny z przekroju siatkówki, w którym komórki zostały wypełnione fluorophorem, Lucifer Yellow. Wywołana fluorescencja pokazuje morfologię komórek, z których wykonano rejestracje patch-clamp.

<ol><li>Weblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> J Physiol. 280, 449-470 (1978).</li>
<li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connections+among+retina+neurons+in+living+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Synaptic connections among retina neurons in living slices.</a> J Neurosci Methods. 20, 139-149 (1987).</li>
<li>Rieke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+contrast+adaptation+in+salamander+bipolar+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal contrast adaptation in salamander bipolar cell.</a> J Neurosci. 21, 9445-9454 (2001).</li>
<li>Armstrong-Gold, C., &amp, R. ieke, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bandpass+filtering+at+the+rod+to+second-order+cell+synapse+in+salamander+%28Ambystoma+tigrinum%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bandpass filtering at the rod to second-order cell synapse in salamander (Ambystoma tigrinum) retina.</a> J Neurosci. 23, 3796-3806 (2003).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li>
<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Rejestracje z przekrojów siatkówek kręgowców są przeprowadzane od dziesięcioleci1,2 i okazały się bardzo skuteczne w pogłębianiu zrozumienia sposobu, w jaki obwody siatkówkowe kodują padające światło. Przewagą cięcia za pomocą wibrotomu w porównaniu z cięciem bezpośrednim za pomocą żyletki jest fakt, że przekroje siatkówki ulegają mniejszym uszkodzeniom powierzchniowym. Dzięki zastosowaniu pipety ssącej można łatwo usunąć te uszkodzenia i skierować badanie na zdrowe komórki znajdujące się tuż pod powierzchnią,...

<table><tbody><tr><td>Wytwornica mikroelektrod (puller)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Szkło borokrzemowe</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Przewody polietylenowe</td><td>Intramedic</td><td>PE205</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze żelowania</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Amesa&amp;rsquo;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr></tbody></table>

rejestracja metodą patch-clamp z neuronów siatkówki myszy w preparacie skrawka adaptowanego do ciemności

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Doświadczenie wzrokowe rozpoczyna się w momencie, gdy pigment wzrokowy w fotoreceptorach siatkówki pochłania fotony energii świetlnej, co inicjuje kaskadę zdarzeń wewnątrzkomórkowych prowadzących do zamknięcia kanałów sterowanych cyklicznymi nukleotydami w błonie komórkowej. Wynikająca z tego zmiana potencjału błonowego prowadzi z kolei do zmniejszenia ilości uwalnianego neuroprzekaźnika zarówno z zakończeń synaptycznych pręcików, jak i czopków. Aby zmierzyć, w jaki sposób wywołana światłem zmiana potencjału błonowego fotoreceptorów wpływa na aktywność w dalszych obszarach siatkówki, naukowcy od dziesięcioleci wykonują rejestracje elektrofizjologiczne z preparatów skrawków siatkówki1,2. W przeszłości skrawki te wycinano ręcznie żyletką z tkanki siatkówki przymocowanej do papieru filtrującego; w ostatnich latach opracowano inną metodę krojenia, w której tkanka siatkówki zostaje zatopiona w agarze o niskiej temperaturze żelowania, a następnie pocięta w chłodnym roztworze za pomocą wibrotomu3,4. Metoda ta pozwala na uzyskanie skrawków siatkówki z mniejszymi uszkodzeniami powierzchniowymi i bardzo silnymi odpowiedziami wywołanymi światłem. W niniejszej pracy dokumentujemy, w jaki sposób procedurę tę można przeprowadzić w świetle podczerwonym, aby uniknąć blaknięcia pigmentu wzrokowego.

W niniejszej pracy opisujemy procedurę przygotowywania adaptowanych do ciemności skrawków siatkówki mysiej do pomiarów elektrofizjologicznych.

Rejestracja metodą patch-clamp z neuronów siatkówki myszy w preparacie skrawka adaptowanego do ciemności

Nasze doświadczenie wzrokowe rozpoczyna się w momencie, gdy pigment wzrokowy w fotoreceptorach siatkówki pochłania fotony energii świetlnej i inicjuje kaskadę...

Nasze doświadczenie wzrokowe rozpoczyna się w momencie, gdy pigment wzrokowy w fotoreceptorach siatkówki pochłania fotony energii świetlnej, co ostatecznie prowadzi do zamknięcia kanałów sterowanych cyklicznymi nukleotydami w błonie komórkowej. Hamuje to uwalnianie neuroprzekaźnika glutaminianu zarówno z czopków, jak i pręcików. Uwolniony glutaminian jest wykrywany przez komórki siatkówki znajdujące się niżej w drodze sygnałowej, co pozwala na badanie sygnałów przekaźniczych.Oczy są usuwane z uśpionej myszy. S są izolowane, zatapiane w bloku agaru i cięte przy użyciu wibracyjnego mikrotomu. Następnie skrawki siatkówki są umieszczane pod mikroskopem i stymulowane oświetleniem LED.W międzyczasie wykonuje się rejestracje metodą patch clamp w celu pomiaru generowanych prądów lub potencjałów synaptycznych. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą zazwyczaj napotykają trudności ze względu na dodatkowe komplikacje związane z pracą w ciemności. Możliwość wizualizacji całego procesu pozwoli zatem uzyskać praktyczne wyczucie, które w inny sposób byłoby trudne do opisania.Procedurę rozpoczyna się od pokrycia warstwą chlorku srebra elektrod rejestrujących i referencyjnych, które będą wykorzystywane w badaniu. Zanurz elektrody w roztworze 1 M NaCl. Następnie, używając źródła zasilania o napięciu 15 V z przebiegiem sinusoidalnym o częstotliwości 1 Hz, przyłóż do nich napięcie 15 V przez około 20 sekund.Za pomocą mikropipetowania (pullera), przygotuj pipety do patch-clampu z polerowanego ogniem szkła krzemionkowego BO, dobierając oporność końcówki pipety w zależności od rozmiaru komórek docelowych. Dla ciał komórkowych o średnicy około 20 µm zastosuj pipety o oporności końcówki od 5 do 10 MΩ. W przypadku ciał komórkowych o średnicy około 5 µm zastosuj oporność końcówki od 12 do 15 MΩ.Aby przygotować elektrody odniesienia do uziemienia, należy za pomocą strzykawki napełnić rurkę polietylenową 3,5% roztworem agaru przygotowanym w 1 mM chlorku sodu. Następnie należy przygotować następujące roztwory zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym protokole pisemnym: roztwór kąpieli zewnętrznej, roztwór do krojenia, wewnętrzny roztwór pipety z aspartanianem potasu oraz zatyczkę z agaru.Wszystkie roztwory przechowywać w temperaturze 4°C do momentu ich użycia. W dniu przeprowadzenia eksperymentu odmierzyć około 1,5 ml wewnętrznego roztworu aspar긴ianu potasu. Następnie dodać rozcieńczony Fluor.Wlej około 50 milliliters pożywki Aims zawierającej wodorowęglan sodu do światłoszczelnego pojemnika do przechowywania. Podłącz plastikową rurkę do butli z gazem zawierającym 5% carbon dioxide i 95% oxygen, aby zrównoważyć pożywkę Aims z gazem, a następnie umieść pojemnik w kąpieli wodnej o temperaturze od 30 do 32 degrees Celsius. Następnie napełnij butelkę 110 milliliters pożywki Aims zawierającej HEPES i umieść ją w lodzie.Wyrównaj skład pożywki, przedmuchując roztwór 100%tlenem. Pozostałą pożywkę Aimesa zawierającą wodorowęglan sodu umieść w ogrzewanym zbiorniku na górze klatki Faradaya. Owiń parafilmem rurkę i górną część butelki, aby zatrzymać gaz w przestrzeni nad roztworem i wyrównać go z mieszaniną 5%dwutlenku węgla i 95%tlenu.Używając szklanej rurki do napowietrzania, przygotuj 3% agar o niskiej temperaturze żelowania, dodając 0,75 g do 25 ml pożywki aims przy intensywnym ogrzewaniu. Roztwór należy podgrzać do około 115 °C podczas mieszania. Gdy roztwór stanie się klarowny i pozbawiony pęcherzyków powietrza, umieść stopiony roztwór agaru w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C.Przygotuj komorę pomiarową na mikroskopie odwróconym. Nasuń pięciocentymetrowy mostek agarowy na elektrodę odniesienia srebro/chlorek srebra i umieść go w komorze pomiarowej. Opór końcówki pipety można zmierzyć, napełniając pipetę roztworem wewnętrznym, umieszczając ją w uchwycie do pipet, a następnie wprowadzając uchwyt do głowicy wzmacniacza i zanurzając pipetę w roztworze. Aby zachować barwnik wzrokowy do pomiarów fizjologicznych, wszystkie procedury powinny być wykonywane w świetle podczerwonym przy użyciu gogli podczerwonych, jednak w niniejszym materiale wszystkie czynności zostaną przedstawione w świetle widzialnym.Po uśmierceniu myszy należy za pomocą zakrzywionych nożyczek szybko usunąć gałki oczne. Gałki oczne należy umieścić na fragmencie papieru filtracyjnego, aby zapobiec ich toczeniu się. Następnie należy unieruchomić gałkę oczną pęsetą i za pomocą cienkiego ostrza dwustronnego wykonać nacięcie w rogówce.Niezwłocznie po nakłuciu gałki ocznej należy przenieść oko do 60 mm szalki Petriego wypełnionej pożywką aims. Wykorzystując nacięcie w rogówce jako punkt wejścia, należy za pomocą małych nożyczek odciąć pozostałe fragmenty rogówki.Następnie należy usunąć soczewkę oraz ciało szkliste, upewniając się, że siatkówka pozostała przytwierdzona do gałki ocznej. Umieść ją w nieprzepuszczającym światła pojemniku wypełnionym pożywką AIMS, równoważoną z 5% carbon dioxide w 95% oxygen w temperaturze 32 degrees celsius.Następnie przekrój połowicznie jedną z czaszek gałki ocznej za pomocą ostrza skalpela nr 10. Oddziel siatkówkę od nabłonka pigmentowego siatkówki.Usuń krawędzie siatkówki, aby tkanka mogła leżeć płasko. Używając małej szklanej pipety Pasteura z lateksową gruszką, napełnij 35 milimetrową szalkę Petriego roztopionym agarem o niskiej temperaturze żelowania i przeciągnij pęsetą przez agar, aby sprawdzić jego konsystencję. Gdy agar zacznie tężeć, przenieś siatkówkę na jego powierzchnię.Następnie, nie dotykając siatkówki, należy użyć zwiniętego kawałka chusteczki Kim wipe, aby wchłonąć nadmiar roztworu wokół niej. Nanieś dodatkowe dwie do trzech kropli agaru bezpośrednio na siatkówkę i szybko ustaw plastikowy cylinder, aby stworzyć wokół niej ściankę, utrzymując siatkówkę blisko centrum cylindra. Wpuść dodatkowy roztopiony agar, a następnie przenieś szalkę Petriego do kąpieli w lodowatej wodzie w celu schłodzenia. Po 30 sekundach wyjmij tkankę i użyj tłoka, aby wypchnąć blok agaru, naciskając od strony przeciwnej do siatkówki.Używając jednostronnego ostrza żyletki, wyciąć mały blok agaru zawierający siatkówkę i przykleić go za pomocą kleju kropelkowego do ogranicznika z agaru na dysku z preparatem. Przenieść dysk z preparatem do uchwytu wibracyjnego mikrotomu i wlać do uchwytu lodowate roztwory AIMS, zapewniając całkowite zanurzenie bloku z siatkówką. Wycinać przekroje siatkówki o grubości około 200 micronów, stosując maksymalną częstotliwość wibracji ostrza i prędkość posuwu ustawioną tak, aby przecięcie siatkówki trwało od czterech do pięciu sekund.Za pomocą ostrza skalpela nr 11 wycinaj z bloku po jednym użytkowym plastrze na raz. Umieść plastry zawierające siatkówkę w komorach rejestracyjnych i unieruchom je. Używając kotwic do plastrów, przeprowadź nylonowe nici przez kotwicę stabilizującą plaster.Przytrzymaj agar otaczający siatkówkę, pozostawiając siatkówkę odsłoniętą. W celu przeprowadzenia pomiarów przenieś komorę rejestracyjną na stolik mikroskopu pionowego.Zasłoń kurtynę i włącz źródło światła podczerwonego, aby obejrzeć skrawk na kamerze czułej na podczerwień. Pod mikroskopem zidentyfikuj skrawek siatkówki z nienaruszonymi fotoreceptorami pod odpowiednim kątem cięcia. Niektóre uszkodzenia powierzchni mogą być widoczne w wyniku procesu skrawania.Używając pipety ze ściętą końcówką, delikatnie odessaj martwe ciała komórek. Aby usunąć tę cienką warstwę komórek, po odsłonięciu zdrowej warstwy żywych komórek, zidentyfikuj ciało komórki znajdujące się w interesującej nas warstwie. Przesuń końcówkę pipety tak, aby lekko wgniotła błonę komórkową, a następnie zastosuj delikatne podciśnienie (nacisk do wewnątrz), aby uzyskać szczelną połączenie o wysokiej rezystancji. Tryb whole-cell można osiągnąć poprzez przyłożenie podciśnienia do elektrody w celu przerwania ciągłości błony komórkowej.Następnie stymuluj tkankę siatkówki światłem za pomocą diod LED, aby wywołać odpowiedzi. Po zakończeniu rejestracji wykonaj zdjęcie, używając odpowiedniego światła wzbudzenia dla fluoroforu, który przedostał się do komórki z wewnętrznego roztworu pipety. Przedstawiono tutaj potencjały wywołane światłem w ciemnoadaptowanym neuronie siatkówki w odpowiedzi na błyski światła o rosnącym natężeniu.Rysunek ten przedstawia obraz fluorescencyjny wykonany z przekroju siatkówki, w którym komórki zostały wypełnione barwnikiem Lucifer yellow; wywołana fluorescencja ukazuje morfologię komórek, z których wykonano rejestracje patch-clamp. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo lepiej rozumieć niektóre z trudności związanych z wykonywaniem rejestracji patch-clamp z przekrojów siatkówki adaptowanej do ciemności. Celem tej procedury jest pomiar odpowiedzi wywołanych światłem w kontrolowanych warunkach oświetlenia.Aby to osiągnąć, musimy najpierw wyizolować siatkówkę, zatopić ją w agarze, a następnie przygotować skrawki siatkówki, z których będziemy mogli wykonać rejestracje z pojedynczych komórek.

patch-clamp-recordings-from-mouse-retinal-neurons-dark-adapted-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestracje Patch Clamp z neuronów siatkówki mysich w preparacie plastrykowym przystosowanym do ciemności

W niniejszym filmie przedstawiono proces rejestracji metodą voltage clamp w całej komórce (whole-cell) w skrawku siatkówki wodnego salamandry tygrysiej. Demonstrujemy przygotowanie skrawka oraz sposób przeprowadzania rejestracji metodą patch clamp podczas stymulacji wizualnej siatkówki.

Rejestracja w konfiguracji whole-cell pobudzeniowych prądów synaptycznych wywołanych światłem w skrawku siatkówki

Niniejszy artykuł zawiera opis sposobu wycinania i rejestrowania aktywności z izolowanego preparatu siatkówki myszy. W szczególności opisujemy, jak rejestrować odpowiedzi na światło z populacji komórek zwojowych znakowanych fluorescencyjnie, a następnie identyfikować i analizować ich morfologię.<br...

Izolowany preparat siatkówki do rejestracji odpowiedzi świetlnej genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki

W niniejszej pracy opisujemy protokół przygotowania skrawków siatkówki zatopionych w agarze, które nadają się do elektrofizjologii oraz obrazowania Ca2+. Metoda ta pozwala na badanie synaps wstążkowych w mikroobwodach siatkówki przy użyciu bezpośrednich rejestracji patch-clamp z pojedynczych przedsynaptycznych zakończeń nerwowych.

Pomiary pojemności metodą patch-clamp oraz obrazowanie Ca2+ w pojedynczych zakończeniach nerwowych w skrawkach siatkówki

Opisujemy stosunkowo prostą metodę rejestracji transretinalnego elektroretinogramu (ERG) w celu uzyskania odpowiedzi fotoreceptorowych pręcików i czopków z nienaruszonej siatkówki myszy. Podejście to wykorzystuje blokadę przekaźnictwa synaptycznego z fotoreceptorów w celu wyizolowania ich odpowiedzi na światło i zarejestrowania ich za pomocą elektrod polowych umieszczonych w poprzek wyizolowanej, rozłożonej płasko siatkówki.

Rejestracja transretinalnego ERG z siatkówki myszy: fotoreakcje czopków i pręcików

Ten film demonstruje technikę całokomórkowego patch-clamp do elektrofizjologicznego zapisu z płaskiej siatkówki myszy. Cienka szklana pipeta z elektrodą służy do zbliżania się do gwiazdotwórczych komórek amakrynowych (SAC) w siatkówce. Po uformowaniu uszczelki stosuje się ssanie w celu pęknięcia membrany i utworzenia konfiguracji zacisku krosowego całej komórki. Na koniec mierzy się przepływ jonów przez receptory synaptyczne SAC za pomocą konfiguracji.

Ustanawianie opaski krosowej całej komórki do zapisu elektrofizjologicznego z siatkówki myszy z płaskim mocowaniem

Ten film demonstruje rejestrację wywołanych światłem reakcji postsynaptycznych w dostosowanym do ciemności preparacie tkanki siatkówki myszy. Wycinek siatkówki umieszcza się w komorze rejestrującej, a pipeta rejestrująca służy do ustalenia ciągłości elektrycznej z komórką zwojową siatkówki. Impulsy świetlne są stosowane do generowania pobudzających potencjałów postsynaptycznych w komórkach zwojowych, które są rejestrowane przez pipetę.

Wywołane światłem reakcje postsynaptyczne w neuronach wycinków siatkówki myszy

Opisujemy przygotowanie cienkich wycinków siatkówki z wodnych salamander tygrysich (Ambystoma tigrinum) i wyjaśniamy, jak używamy tych wycinków do badania przetwarzania synaptycznego w siatkówce, uzyskując podwójne zapisy napięcia całego ogniwa z fotoreceptorów oraz komórek poziomych i dwubiegunowych drugiego rzędu.

Jednoczesne zapisy całych komórek z fotoreceptorów i neuronów drugiego rzędu w preparacie plastra siatkówki

Ten artykuł wideo ilustruje przygotowanie, procedury łatania ciał komórkowych oraz sposób implementacji dynamicznych zapisów zaciskowych z komórek zwojowych w całych siatkówkach myszy. Technika ta pozwala na zbadanie dokładnego udziału pobudzających i hamujących wejść synaptycznych oraz ich względnej wielkości i czasu na impulsy neuronalne.

Implementacja dynamicznego zacisku z przewodnictwem synaptycznym i sztucznym w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Pokażemy, jak przygotować wycinki siatkówki z oka myszy i rejestrować reakcje świetlne w neuronach siatkówki. Cała procedura przeprowadzana jest w warunkach przystosowanych do ciemności.

Rejestrowanie wywołanych światłem odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach w adaptowanych do ciemności, mysich preparatach siatkówki przy użyciu technik patch clamp

Ten protokół pokazuje, jak przeprowadzić zapis klamry całokomórkowej na neuronach siatkówki z preparatu do montażu płaskiego.

Zapis patch clamp komórek amakrynowych Starburst w płaskim preparacie bezkofeinowej siatkówki myszy

Opracowaliśmy poziome przygotowanie siatkówki dorosłego ssaka z płaszczyzną przekroju równoległą do powierzchni siatkówki. Pola dendrytyczne neuronów siatkówki o orientacji niepromieniowej nie zostały obcięte, co pozwoliło na badanie przetwarzania sygnału za pomocą patch-clamp i technik obrazowania.

Przygotowanie poziomych wycinków siatkówki dorosłej myszy do badań elektrofizjologicznych

Naucz się techniki patch clamp w ciemno przystosowanych plasterkach siatkówki myszy. Metoda umożliwia rejestrację odpowiedzi elektrofizjologicznych neuronów siatkówki na bodźce świetlne LED.

Rejestracja metodą patch-clamp z neuronów siatkówki myszy w preparacie skrawka adaptowanego do ciemności

Przeglądaj więcej filmów