Nagrania patch clamp z neuronów siatkówki myszy w dostosowanym do ciemności preparacie plasterków

Nasze doświadczenie wzrokowe zaczyna się, gdy pigment wzrokowy w naszych fotoreceptorach siatkówki pochłania fotony energii świetlnej, co ostatecznie prowadzi do zamknięcia cyklicznych kanałów bramkowanych nukleotydami w błonie komórkowej. To hamuje uwalnianie neuroprzekaźnika glutaminianu zarówno z pręcików, jak i czopków. Uwolniony glutaminian jest wykrywany przez komórki siatkówki w celu zbadania dalszych sygnałów.

Oczy są usuwane z myszy poddanej eutanazji. S są izolowane, osadzane w bloku agaru i krojone za pomocą wibrującego mikrotomu. Następnie plastry siatkówki umieszcza się pod mikroskopem i stymuluje oświetleniem LED.

Podczas gdy zapisy patch clamp są wykonywane w celu zmierzenia generowanych prądów lub potencjałów synaptycznych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności z powodu dodatkowej złożoności pracy w ciemności. Tak więc możliwość wizualizacji całego procesu zapewni wrażenie, które w inny sposób jest trudne do opisania.

Rozpocznij tę procedurę od pokrycia elektrod rejestrujących i referencyjnych, które będą używane, warstwą chlorku srebra. Zanurz elektrody w jednym molowym chlorku sodu. Następnie za pomocą 15-woltowego źródła zasilania z jednohercową falą sinusoidalną przełącz między nimi 15 woltów przez około 20 sekund.

Za pomocą ściągacza do mikropipet przygotuj pipety z polerowanego ogniowo szkła krzemionkowego BO, dobierając rezystancję końcówki pipety na podstawie wielkości komórek docelowych dla ciał komórek o średnicy około 20 mikronów. Użyj rury PET o rezystancji końcówki od pięciu do 10 megaomów do korpusów komórek. Po średnicy około pięciu mikronów użyj rezystancji końcówki od 12 do 15 megaomów.

Aby przygotować uziemiające elektrody odniesienia, użyj strzykawki do napełnienia rurki polietylenowej 3,5% roztworem agaru przygotowanym w jednym milimolowym chlorku sodu. Następnie przygotuj następujące roztwory zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym pisemnym protokole. Roztwór do krojenia roztworu do kąpieli zewnętrznej, roztwór wewnętrzny pipety asparaginianu potasu i osłona agarowa.

Przechowuj wszystkie roztwory w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą potrzebne. W dniu eksperymentu Thor około 1,5 mililitra wewnętrznego roztworu asparaginianu potasu. Następnie dodaj rozcieńczony fluor.

Wlej około 50 mililitrów pożywki zawierającej wodorowęglan sodu do lekko szczelnego pojemnika do przechowywania. Podłącz plastikową rurkę do zbiornika gazu zawierającego 5% dwutlenku węgla i 95% tlenu, aby zrównoważyć media celownicze z gazem, a następnie umieść pojemnik w łaźni wodnej o temperaturze od 30 do 32 stopni Celsjusza. Następnie napełnij butelkę 110 mililitrami celu, podłożem zawierającym groszek i umieść ją na lodzie.

Wyrównaj pożywkę, bulgocząc roztwór ze 100% gazowym tlenem. Umieść pozostałą pożywkę zawierającą wodorowęglan sodu w podgrzewanym zbiorniku na górze klatki Faradaya. Owiń paraformę wokół rurki i górnej części butelki, aby uwięzić gaz w przestrzeni nad roztworem i zrównoważyć z 5% dwutlenkiem węgla, 95% gazowym tlenem.

Używając szklanej rurki dyspersyjnej powietrza, przygotuj 3% niskotemperaturowe żelowanie aros, dodając 0,75 grama do 25 mililitrów pożywki celowniczej z ciepłem sterty. Roztwór ma około 115 stopni Celsjusza podczas mieszania. Gdy roztwór stanie się klarowny bez pęcherzyków, umieść stopiony roztwór agaru w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza.

Ustaw komorę zapisu na odwróconym mikroskopie. Nasuń pięciocentymetrowy mostek agarowy na srebrną elektrodę referencyjną z chlorku srebra i umieść ją w komorze nagrywającej. Rezystancję końcówki pipety można zmierzyć, napełniając pipetę roztworem wewnętrznym, umieszczając ją na uchwycie pipety, umieszczając uchwyt na pipetę w stopniu głowicy wzmacniacza i opuszczając pipetę do roztworu, aby zachować wizualny pigment do zapisów fizjologicznych, wszystkie procedury należy wykonywać w świetle podczerwonym za pomocą gogli na podczerwień, ale wszystkie procedury zostaną pokazane tutaj w świetle pomieszczenia.

Po uśmierceniu myszy użyj zakrzywionych nożyczek, aby szybko usunąć oczy. Umieść oczy na kawałku bibuły filtracyjnej, aby zapobiec ich toczeniu się. Następnie przytrzymaj oko za pomocą kleszczy i użyj cienkiego dwustronnego ostrza, aby zrobić szczelinę w rogówce.

Jak tylko gałka oczna zostanie przebita. Przenieś oko na 60-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną podłożem celowniczym. Używając szczeliny w rogówce jako punktu wejścia, użyj małych nożyczek, aby odciąć pozostałe części rogówki.

Następnie usuń soczewkę i ciało szkliste, upewniając się, że siatkówka pozostaje przymocowana do muszli ocznej. Umieść go w lekkim, szczelnym pojemniku wypełnionym celami. Medium zrównoważone 5% dwutlenkiem węgla w 95% tlenie w temperaturze 32 stopni Celsjusza.

Następna sekcja hemis sec. Jedna z muszli ocznych za pomocą ostrza skalpela numer 10. Oddziel siatkówkę od nabłonka barwnikowego siatkówki.

Usuń krawędzie siatkówki, aby tkanka mogła żyć płasko. Użyj małych szklanych pipet do makaronu z lateksową gruszką, aby napełnić 35-milimetrową szalkę Petriego stopionym agarem o niskiej temperaturze żelowania i przeciągnij kleszcze przez agar, aby sprawdzić jego konsystencję. Gdy agar zacznie krzepnąć, przenieś siatkówkę na wierzch agaru.

Następnie, nie dotykając siatkówki, użyj skręconego kawałka chusteczki Kim, aby wchłonąć nadmiar roztworu wokół niej. Umieść dodatkowe dwie do trzech kropli agaru bezpośrednio na siatkówce i szybko umieść plastikowy cylinder, aby utworzyć wokół niego ścianę, jednocześnie utrzymując siatkówkę w pobliżu środka cylindra, wlej dodatkowo stopiony agar, przenieś szalkę Petriego do lodowatej kąpieli wodnej w celu ostygnięcia. Po 30 sekundach usuń tkankę i za pomocą tłoka wyciśnij blok agaru, popychając go ze strony najbardziej oddalonej od siatkówki.

Użyj jednostronnej żyletki, aby wyciąć mały blok agaru zawierający siatkówkę i przyklej blok na miejscu do podkładki agaru na krążku próbki. Przenieś krążek próbki do wibrującego mikrotomu i wlej do drzewa lodowate stosy celów, pozwalając na całkowite zanurzenie bloku z siatkówką. Pokrój plastry siatkówki o grubości około 200 mikronów, używając maksymalnej szybkości wibracji ostrza z prędkością ostrza ustawioną do przodu tak, aby przecięcie siatkówki zajęło od czterech do pięciu sekund. Raz.

Użyj ostrza skalpela numer 11, aby pojedynczo odciąć każdy nadający się do użytku plasterek z bloku. Umieść plastry zawierające siatkówkę w komorach nagrywających i przytrzymaj je. Za pomocą plastra zakotwicza nylonowe nici przecinające kotwicę plastru.

Przytrzymaj agar otaczający siatkówkę, pozostawiając siatkówkę niezakłóconą. Do nagrań. Przenieść komorę zapisu na stolik mikroskopu pionowego.

Zamknij kurtynę i włącz źródło światła podczerwonego, aby view wycinek na kamerze czułej na podczerwień. Pod mikroskopem zidentyfikuj wycinek siatkówki z nienaruszonymi fotoreceptorami pod odpowiednim kątem cięcia. W wyniku procesu krojenia mogą być widoczne pewne uszkodzenia powierzchni.

Za pomocą pipety ze złamaną końcówką delikatnie odessaj martwe ciała komórek Aby usunąć tę cienką warstwę komórek, po ujawnieniu zdrowej warstwy żywych komórek, zidentyfikuj ciało komórki, którego pozycja znajduje się w warstwach będących przedmiotem zainteresowania. Przesuń końcówkę pipety tak, aby wgłębiła się w błonę komórkową i zastosuj delikatny, ujemny lub wewnętrzny nacisk, aby uzyskać uszczelnienie o wysokiej odporności. Tryb całego ogniwa można osiągnąć, wywierając podciśnienie na elektrodę, aby włamać się do ogniwa.

Następnie stymuluj tkankę siatkówki światłem za pomocą diod LED, aby wywołać reakcje. Na końcu nagrania uchwyć obraz za pomocą odpowiedniego światła wzbudzającego dla fluoru, który dializował się do komórki z wewnętrznego roztworu pipety. Pokazano tu potencjały świetlne przystosowanych do ciemności neuronów siatkówki do błysków światła o rosnącej sile.

Ten rysunek jest obrazem fluorescencyjnym wykonanym z wycinka siatkówki, w którym komórki zostały wypełnione żółtą fluorescencją wywołaną Fluor Lucifer, która pokazuje morfologię komórek, z których wykonano zapisy plastrów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś lepiej zrozumieć niektóre zawiłości tworzenia nagrań z zaciskiem krosowym z ciemnych, dostosowanych wycinków siatkówki. Celem tej procedury jest pomiar reakcji wywołanych światłem w kontrolowanym oświetleniu.

W tym celu musimy najpierw wyizolować siatkówkę, zatopić ją w świdraczu, a następnie przygotować wycinki siatkówki, z których możemy dokonać nagrań pojedynczych komórek.