Wizualizacja nerwów segmentowych larw w preparatach larw Drosophila w 3^rd stadium zasiedlenia

Transport aksonalny można badać poprzez wizualizację nerwów segmentowych larwy. Trzecie stadium larwy Drosophila. Najpierw przeprowadza się sekcję larwy, odsłaniając OUN bez uszkadzania płatów optycznych, zwoju brzusznego i nerwów segmentowych.

Drugim krokiem procedury jest utrwalenie lawy w formaldehydzie przed inkubacją z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc oraz z przeciwciałem drugorzędowym przez godzinę w ciemności. Następnie lawę osadza się na szkiełku przedmiotowym i analizuje defekty transportu aksonalnego. Lokalizację oraz rozkład białek można zbadać za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Chociaż metoda ta pozwala uzyskać wgląd w transport aksonalny, można ją również zastosować w innych układach, takich jak morfologia synaps i mięśni. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ na początku wykonanie dopuszczalnej dyssekcji jest wymagające, zwłaszcza w zakresie zachowania nienaruszoności nerwów segmentowych mózgu i mięśni. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować jednokrotny bufor utrwalający do dyssekcji, jednokrotny PBT oraz 5% roztwór BSA.

Zgodnie ze szczegółami zawartymi w tabeli przedstawionej przed sekcją, przygotuj czystą parę pęset nr 5, czystą parę nożyczek chirurgicznych o prostych ostrzach oraz piny, aby rozpocząć sekcję. Użyj mikrolyżeczki, aby zebrać larwy trzeciego stadium z określonym genotypem na szalkę Petriego. Następnie przemyj larwy w szalce Petriego wypełnionej wodą dejonizowaną, aby usunąć cały pokarm.

Następnie umieść larwę na szalce Petriego grzbietem do góry. Przypnij larwę w części przedniej i tylnej. Na przypiętą larwę nanieś kroplę jednorazowego buforu do sekcji za pomocą pęsety.

Utnij larwę w linii środkowej grzbietu w pobliżu końca tylnego. Za pomocą nożyczek odetnij kutykulę larwy od końca tylnego aż do końca przedniego. Nanieś kroplę nowego jednokrotnego buforu do sekcji na rozsektowaną larwę.

Używając szpilki, uchwyć jedną krawędź boczną kutykuli w pobliżu środka larwy i przymocuj kutykulę drugą szpilką. Do drugiej krawędzi bocznej kutykuli używa się dwóch szpilek po każdej stronie bocznej, zgodnie z rysunkiem. Następnie ostrożnie usuń jelito, ciała tłuszczowe i tchawice, pozostawiając jedynie mózg z dwoma płatami optycznymi i zwojami brzusznymi.

Po przymocowaniu nerwów segmentowych przeprowadza się utrwalanie i barwienie przeciwciałami, podczas gdy larwy pozostają przytwierdzone do szalki zabezpieczającej. Inkubuj wypreparowane larwy w 50 µL utrwalacza przez 30 minut. Wymieniając utrwalacz co 15 minut, a po zakończeniu utrwalania, płucz larwy w 1x PBT przez 30 minut.

Podczas wymiany buforu co 10 minut należy pamiętać, aby larwy były przez cały czas zanurzone w buforze. Roztwór przeciwciała pierwszorzędowego należy przygotować poprzez jego rozcieńczenie do odpowiedniego stężenia w 5%BSA. Optymalne stężenia różnią się w zależności od stosowanych przeciwciał.

Przygotuj komorę wilgotną, wyściełając plastikowe naczynie chusteczką KimWipe nasączoną wodą. Wymień ostatnią chusteczkę PBT.

Przemyj roztworem przygotowanego przeciwciała pierwszorzędowego i inkubuj w komorze wilgotnej w temperaturze czterech stopni Celsius overnight następnego dnia. Przemyj wypreparowane larwy w jednokrotnym PBT przez 30 minut, wymieniając bufor co 10 minut. Przygotuj przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczając je do odpowiedniego stężenia w 5%BSA roztworze.

Następnie owiń wilgotną komorę folią, ponieważ niektóre przeciwciała wtórne są światłoczułe. Inkubuj larwy w roztworze przeciwciał wtórnych w temperaturze 25 °C przez jedną godzinę. Po zakończeniu inkubacji z przeciwciałami wtórnymi płucz larwy w 1x PBT przez 30 minut, wymieniając bufor co 10 minut, a następnie przejdź do montowania i wizualizacji wypreparowanych larw przed umieszczeniem ich na szkiełku przedmiotowym.

Przygotuj preparat, nakładając dwie pionowe linie lakieru do paznokci na środku szkiełka, pozostawiając odstęp wystarczająco duży, aby zmieściło się w nim szkiełko nakrywkowe, zgodnie z przedstawionym schematem. Pozostaw lakier do całkowitego wyschnięcia. Po wyschnięciu lakieru nanieś kroplę buforu montażowego w przestrzeni między pionowymi liniami lakieru na szkiełku, jak pokazano na tym obrazie.

Preparat jest teraz gotowy do montowania. Wyjmij larwy po upływie ostatniego czasu inkubacji w PBT. Przepłucz je i delikatnie usuń piny boczne z larwy.

Należy uważać, aby nie przerwać kutykuli. Usuń dwa pozostałe piny, pochwyć larwę pęsetą i umieść ją na przygotowanym szkiełku. Upewnij się, że larwa nie została odwrócona i jest zorientowana stroną brzuszną do góry.

Ostrożnie połóż szkiełko nakrywkowe stroną górną do góry i uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci, zgodnie z ilustracją. Larwy są teraz gotowe do wizualizacji pod mikroskopem fluorescencyjnym. Ten reprezentatywny obraz przedstawia larwę typu dzikiego, zabarwioną przeciwciałami przeciwko białku pęcherzyków synaptycznych, cystine string protein.

Nerwy segmentowe u much lava są barwione równomiernie. Tutaj przedstawiono mutant białka motorycznego lava, który został zabarwiony przeciwciałami przeciwko CSP. Nerwy segmentowe wykazują masywne akumulacje, które intensywnie barwią się na CSP.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu nerwów segmentowych przytwierdzonych do mózgu oraz o pozostawieniu mięśni w nienaruszonym stanie. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć zasady przeprowadzania sekcji. Wykonaj utrwalenie i immunostaining larwalnych nerwów segmentowych w celu zbadania transportu aksonalnego przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.