Wizualizacja nerwów segmentowych larw w preparatach larwalnych Drosophila w 3^stadium rozwojowym

Transport aksonalny można badać, wizualizując nerwy segmentowe larw. Trzecia postać w stadium rozwojowym drosophila. Larwa jest najpierw preparowana, odsłaniając OUN bez uszkadzania płatów optycznych, zwoju brzusznego i nerwów segmentowych.

Drugim krokiem procedury jest utrwalenie lawy w formaldehydzie przed inkubacją z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc i przeciwciałem drugorzędowym przez godzinę w ciemności. Lawa jest następnie montowana na szklanym szkiełku i defektach transportu aksonalnego. Lokalizację i dystrybucję białek można badać za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w transport aksonalny, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak synapsy i morfologia mięśni. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ początkowo trudno jest przeprowadzić tę dopuszczalną sekcję, zwłaszcza w celu utrzymania nienaruszonych nerwów i mięśni segmentowych mózgu. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować jeden raz utrwalacz buforu rozwarstwiającego, jeden raz PBT i 5% roztwór BSA.

Jak wyszczególniono w tabeli pokazanej przed sekcją, zbierz czystą parę bicepsów numer pięć, czystą parę nożyczek z wentylatorem z prostymi ostrzami i szpilek, aby rozpocząć sekcję, użyj mikro łyżki, aby zebrać wędrujące. Trzecie w larwach gwiazd o określonym genotypie na szalce Petriego. Następnie umyj larwy, płucząc je na szalce Petriego wypełnionej wodą dejonizowaną, aby pozbyć się całego pokarmu.

Następnie umieść lawę na szalce S guard grzbietem do góry. Przypnij lawę z przodu i z tyłu. Na końcach umieść kroplę jednorazowego bufora preparacyjnego na przypiętej lawie za pomocą cienkich nożyczek.

Ściśnij lawę na grzbietowej linii środkowej w pobliżu tylnego końca. Za pomocą nożyczek odetnij naskórek lawy od tylnego końca do przedniego końca. Umieść kroplę nowego jednorazowego bufora do rozwarstwiania na rozciętej lawie.

Za pomocą szpilki wybierz jedną boczną krawędź naskórka w pobliżu środka lawy i przypnij naskórek za pomocą innej szpilki. Szpilka. Druga boczna krawędź naskórka, po każdej stronie bocznej stosuje się dwa kołki, jak pokazano na schemacie. Teraz ostrożnie usuń jelito i ciała tłuszczowe i traia, pozostawiając tylko mózg z dwoma płatami optycznymi i zwojami brzusznymi.

Z przyczepionymi nerwami segmentalnymi wykonuje się następnie utrwalanie i barwienie przeciwciał z larwami przyczepionymi do naczynia ochronnego. Wyprofilowane larwy inkubować w 50 mikrolitrach utrwalacza przez 30 minut. Wymieniając utrwalacz co 15 minut po utrwaleniu, płukać larwy jednorazowo PBT przez 30 minut.

Wymieniając bufor co 10 minut, należy pamiętać, że larwy powinny być zawsze zanurzone w buforze. Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała, rozcieńczając go do odpowiedniego stężenia w 5% roztworze BSA. Optymalne stężenia różnią się dla różnych przeciwciał.

Zbuduj wilgotną komorę, wykładając plastikowe naczynie Kimem. Wytrzyj namoczone w wodzie. Wymień ostatni raz PBT.

Spłukać przygotowanym roztworem przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc następnego dnia. Wypreparowane larwy należy płukać jednorazowo PBT przez 30 minut, wymieniając bufor co 10 minut. Przygotować przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczając je do odpowiedniego stężenia w 5% roztworze BSA.

I owiń wilgotną komorę folią, ponieważ niektóre przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło. Inkubować larwy z roztworem przeciwciał drugorzędowych w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez godzinę. Po zakończeniu inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym, przepłucz larwy w jednorazowym PBT przez 30 minut, wymieniając bufor co 10 minut i przystąp do montowania i wizualizacji wypreparowanych larw przed zamontowaniem lawy na szkiełku.

Przygotuj szkiełko, rozprowadzając dwie pionowe linie lakieru do paznokci na środku w miejscu wystarczająco dużym, aby można było na nim usiąść na szkiełku nakrywkowym, jak pokazano na schemacie. Pozostaw lakier do paznokci do całkowitego wyschnięcia, gdy lakier do paznokci wyschnie. Umieść kroplę bufora montażowego w przestrzeni między pionowymi liniami lakieru do paznokci na szkiełku, jak pokazano na tym obrazku.

Prowadnica jest teraz gotowa do montażu. Odzyskaj larwy po ostatnim raz PBT. Opłucz i delikatnie usuń boczne kołki z lawy.

Uważaj, aby nie rozerwać ostrożnie naskórka. Usuń dwa pozostałe kołki i podnieś lawę kleszczami i umieść ją na przygotowanym szkiełku. Upewnij się, że lawa nie jest przewrócona i jest zorientowana brzusznie.

Stroną do góry delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe na wierzchu i uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci, jak pokazano tutaj. Larwy są teraz gotowe do wizualizacji pod mikroskopem fluorescencyjnym. Ten reprezentatywny obraz przedstawia lawę typu dzikiego zabarwioną przeciwciałami przeciwko synaptycznemu białku pęcherzowemu, białku strunowym cystyny.

Nerwy segmentowe lawy są gładko poplamione. Tu. Zmutowana lawa z białkiem motorycznym została wybarwiona przeciwciałami przeciwko CSP. Nerwy segmentowe wykazują masywne nagromadzenia, które barwią się jasno dla CSP.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zachowaniu nerwów segmentowych przyczepionych do mózgu i utrzymaniu mięśni w stanie nienaruszonym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić analizę. Napraw barwnik immunologiczny jako trzeci i rozpocznij larwalne nerwy segmentowe, aby zbadać transport aksonalny za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.