Name: Wizualizacja nerwów segmentowych larw w preparatach larwalnych Drosophila w 3stadium rozwojowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji nerwów segmentowych larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie transportu aksonalnego i lokalizacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SG jest wspierany przez fundusze z State University of New York at Buffalo oraz John R. Oishei Foundation.

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
 <li>Przygotuj 1x bufor do sekcji, wykorzystując 128 mM NaCl, 4mM CaCl2, 4mM MgCl2, 2 mM KCl, 5mM HEPES oraz 36mM sacharozy. Dostosuj pH roztworu do 7,2 i poddaj sterylizacji przez filtrację.</li>
	<li>Przygotuj utrwalacz poprzez rozcieńczenie 16% formaldehydu w 1x buforze do sekcji w stosunku 1:1.</li>
	<li>Przygotuj 1x PBT, używając 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) o pH 7,2 oraz Triton X-100 w stosunku 1:100.</li>
	<li>Przygotuj 5% albuminę surowiczą bydlęcą (BSA) z 0,01% azotkiem sodu (Na Azide) w 1x PBS.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do sekcji
<ol>
 <li>Do sekcji wykorzystuje się foremki z Sylgardu. Przygotuj foremki, wlewając mieszaninę bazy elastomeru silikonowego Sylgard 184 i czynnika utwardzającego do szalki Petriego. Przed użyciem pozwól mieszaninie całkowicie stwardnieć i wyschnąć.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem sekcji przygotuj czystą pęsetę nr 5, czyste nożyczki Vannasa z prostym ostrzem oraz piny.</li>
</ol>
3. Disekcja 3rd Przepoczwyki larwalne
<ol>
 <li>Zbierz wędrujące larwy trzeciego (3.) stadium konkretnego genotypu na szalkę Petriego.</li>
	<li>Przemyj larwy wodą dejonizowaną, aby usunąć resztki pokarmu.</li>
	<li>Umieść larwę na podłożu z Sylgardu stroną grzbietową do góry. Przytwierdź larwę szpilkami w części przedniej i tylnej.</li>
	<li>Nanieś kroplę 1x buforu do sekcji na przytwierdzoną larwę. Za pomocą precyzyjnych nożyczek wykonaj nacięcie w linii środkowej grzbietu w pobliżu końca tylnego. Nożyczkami rozetnij kutykulę larwy od końca tylnego aż do końca przedniego.</li>
	<li>Nanieś kroplę świeżego 1x buforu do sekcji na sekcjonowaną larwę. Za pomocą szpilki chwyć jedną krawędź boczną kutykuli w okolicy środka larwy i przytwierdź ją. Drugą szpilką przytwierdź drugą krawędź boczną kutykuli, zgodnie z rysunkiem. Po każdej stronie bocznej należy użyć dwóch szpilek. Patrz schemat poniżej.</li>
	<li>Ostrożnie usuń jelita, ciała tłuszczowe i tchawki, pozostawiając jedynie mózg z dwoma płatami optycznymi oraz zwoje brzuszne z przyczepionymi nerwami segmentowymi. Pozostałą część procedury wykonuje się na podłożu z Sylgardu.</li>
</ol>
4. Fixacja wypreparowanej larwy
<ol>
	<li>Inkubować wypreparowaną larwę w utrwalaczu przez 30 minut, wymieniając utrwalacz co 15 minut.</li>
	<li>Po utrwaleniu płukać larwę w 1x PBT przez 30 minut, wymieniając bufor co 10 minut. Należy pamiętać, aby larwa zawsze znajdowała się w buforze.</li>
</ol>
5. Barwienie przeciwciałami wypreparowanej larwy
<ol>
	<li>Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczając je do odpowiedniego stężenia w 5% BSA z azotkiem sodu w 1x PBT. Optymalne stężenia będą się różnić w zależności od rodzaju przeciwciała.</li>
	<li>Ostatnie płukanie w 1x PBT zastąpić przygotowanym roztworem przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować w komorze wilgotnej w temperaturze 4°C przez noc. Komorę wilgotną przygotowuje się, wyścielając plastikowy pojemnik chusteczkami kim-wipes nasączonymi wodą.</li>
	<li>Następnego dnia preparat z wypreparowaną larwą płukać w 1x PBT przez 30 minut, wymieniając bufor co 10 minut.</li>
	<li>Przygotować przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczając je do odpowiedniego stężenia w 5% BSA z azotkiem sodu w 1x PBT, a następnie inkubować larwę w roztworze przeciwciała drugorzędowego w temperaturze 25°C przez godzinę. Komorę wilgotną owinąć folią aluminiową, aby zapobiec dostępowi światła, ponieważ przeciwciała drugorzędowe są światłoczułe.</li>
	<li>Po inkubacji larwę płukać w 1x PBT przez 30 minut, wymieniając bufor co 10 minut.</li>
</ol>
6. Montowanie i wizualizacja wypreparowanej larwy
<ol>
	<li>Przed zamocowaniem larwy na szkiełku, przygotuj szkiełko, nanosząc dwie pionowe linie lakieru do paznokci na środku, pozostawiając wystarczającą przestrzeń na położenie szkiełka nakrywkowego (patrz schemat). Pozostaw lakier do całkowitego wyschnięcia.</li>
	<li>W przestrzeni między pionowymi liniami lakieru na szkiełku umieść kroplę buforu montażowego (patrz schemat). Szkiełko jest teraz gotowe do zamocowania próbki. <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.2.1.jpg" alt="Schemat przygotowania szkiełka szklanego z aplikacją lakieru do paznokci dla ustawienia eksperymentalnego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1 step 6.2"> <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.2.2.jpg" alt="Schemat metody montażu lakierem do paznokci, przygotowanie próbki do mikroskopii, uszczelnianie krawędzi buforem." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2 step 6.2"></li>
	<li>Po ostatnim płukaniu w 1x PBT ostrożnie usuń piny boczne. Należy uważać, aby nie przerwać kutykuli.</li>
	<li>Ostrożnie usuń dwa pozostałe piny, podnieś larwę pęsetą i ułóż ją poziomo na przygotowanym szkiełku. Upewnij się, że larwa nie jest odwrócona i jest zorientowana stroną brzuszzną do góry.</li>
	<li>Delikatnie nałóż na wierzch szkiełko nakrywkowe i uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci (patrz schemat). Larwa jest teraz gotowa do wizualizacji pod mikroskopem fluorescencyjnym. <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.5.jpg" alt="Ustawienie montażu larw na szkiełku; schemat; użyto lakieru do paznokci, buforu montażowego i szkiełka nakrywkowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1 step 6.5"></li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2128/2128fig1.jpg" alt="Mikrografia z pomiarem elektronowym nanowłókien, skala 20μm, analiza powierzchni materiału, mikroskopia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1: Reprezentatywny obraz nerwów segmentowych larwy typu dzikiego z użyciem przeciwciał przeciwko białku pęcherzyków synaptycznych, cysteinowej białku sznurowej (CSP, Zinsmaier et al.1994 ). Zauważmy, że nerwy segmentowe są barwione gładko. Pasek=20μm
<img src="/files/ftp_upload/2128/2128fig2.jpg" alt="Struktura włókien, obraz mikroskopowy, oznakowane włókna, skala 20 µm, analiza mikroskopowa, badanie materiału." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2: Reprezentacyjny obraz nerwów segmentowych larwy z mutacją białka motorycznego z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko białku pęcherzyków synaptycznych – cysteine string protein (CSP). Należy zauważyć, że w nerwach segmentowych widoczne są masywne akumulacje, które silnie barwią się na CSP (strzałki).

<ol><li>Gunawardena, S., Goldstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Axonal+Transport+and+Neuronal+Viability+by+Amyoid+Precursor+Protein+Mutations+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila.</a> Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).</li>
<li>Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralysis+and+early+death+in+cysteine+string+protein+mutants+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila.</a> Science. 263, 977-980 (1994).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Nerwy segmentowe larw Drosophila stanowią wydajny system do badania mechanizmów transportu aksonalnego. Jeśli sekcja larwy w 3cim stadium rozwojowym zostanie przeprowadzona prawidłowo, wszystkie elementy OUN, ObW oraz powiązanego poziomu tkankowego, takiego jak mięśnie i NMJ, mogą zostać zbadane w obrębie jednej larwy. Niniejszy protokół został zaadaptowany na podstawie metody opublikowanej przez Hurda i Saxtona (1996). Protokół ten można również dostosować do testowania innych przeciwciał neuronalnyc...

<table><tbody><tr><td>Pinceta Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Igły Minutien, stal nierdzewna</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki McPherson-Vannas z prostym ostrzem 8cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>50822236</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield, medium montażowe</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Elastomer silikonowy Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>4026148</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyd, 16%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>dCSP3</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja nerwów segmentowych larw w preparatach larw drosophila w 3rd stadium zasiedlenia

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster staje się potężnym systemem modelowym do badania rozwoju i funkcji układu nerwowego, przede wszystkim ze względu na dogodną genetykę i w pełni zsekwencjonowany genom. Ponadto układ nerwowy larw stanowi idealny system modelowy do badania mechanizmów transportu aksonalnego, ponieważ larwalne nerwy segmentalne zawierają pęczki aksonów, których ciała komórkowe znajdują się w mózgu, a zakończenia nerwowe rozciągają się wzdłuż ciała. W niniejszej pracy opisujemy procedurę wizualizacji białek pęcherzyków synaptycznych w larwalnych nerwach segmentalnych. Przy prawidłowym wykonaniu wszystkie elementy układu nerwowego, wraz z powiązanymi tkankami, takimi jak mięśnie i połączenia nerwowo-mięśniowe (NMJ), pozostają nienaruszone, nieuszkodzone i gotowe do wizualizacji. Larwy w 3rd stadium rozwoju niosące różne mutacje są preparowane, utrwalane, inkubowane z przeciwciałami przeciwko białkom pęcherzyków synaptycznych, wizualizowane i porównywane z larwami typu dzikiego. Procedurę tę można dostosować do kilku różnych przeciwciał synaptycznych lub neuronalnych, a zmiany w rozkładzie wielu różnych białek można łatwo zaobserwować w larwalnych nerwach segmentalnych.

Drosophila melanogaster larwy stanowią idealny model badawczy do analizy mechanizmów transportu aksonalnego w nerwach segmentowych larw. Stosując tę procedurę, 3Badania i rozwój larwy w stadium poczwarki niosące różne mutacje można porównać z larwami typu dzikiego.

Wizualizacja nerwów segmentowych larw w preparatach larw Drosophila w 3rd stadium zasiedlenia

*Drosophila melanogaster* wyłania się jako potężny system modelowy do badania rozwoju i funkcji układu nerwowego, w szczególności ze względu na ...

Transport aksonalny można badać poprzez wizualizację nerwów segmentarnych larwy. Larwa drosophila w trzecim stadium rozwojowym. W pierwszej kolejności przeprowadza się sekcję larwy, odsłaniając OUN bez uszkadzania płatów optycznych, zwoju brzusznego oraz nerwów segmentarnych.Drugim krokiem procedury jest utrwalenie larwy w formaldehydzie przed inkubacją z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc oraz z przeciwciałem drugorzędowym przez godzinę w ciemności. Następnie larwę montuje się na szkiełku przedmiotowym, aby zbadać defekty transportu aksonalnego. Lokalizację oraz rozkład białek można przeanalizować za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w transport aksonalny, można ją również zastosować w innych układach, takich jak morfologia synaps i mięśni. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ na początku przeprowadzenie dopuszczalnej sekcji jest wymagające, zwłaszcza w zakresie zachowania nienaruszonych nerwów segmentowych mózgu oraz mięśni. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować jednokrotny bufor utrwalający do sekcji, jednokrotny PBT oraz 5% BSA.Zgodnie ze szczegółami zawartymi w tabeli przedst

visualization-larval-segmental-nerves-3rd-instar-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wizualizacja segmentalnych nerw larw w preparatach larw Drosophila w 3cim stadium rozwojowym

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

Niniejszy protokół opisuje sekcję larw Drosophila in vivo w celu obrazowania ruchu pęcherzyków aksonalnych znakowanych białkiem GFP wzdłuż szyn mikrotubularnych.

In vivo wizualizacja pęcherzyków synaptycznych w aksonach segmentowych larw Drosophila

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Opisano metodę immunobarwienia i wizualizacji organów chordotonalnych w larwach i poczwarkach Drosophila melanogaster.

Wizualizacja proprioceptorów w larwach i poczwarkach Drosophila

Ten film opisuje gruczoł pierścieniowy Drosophila, złożoną strukturę endokrynną ważną dla biosyntezy i wydzielania ekdysteroidów i innych hormonów. Przedstawiony protokół demonstruje jego rozwarstwienie, utrwalenie i barwienie immunologiczne.

Rozwarstwienie gruczołu pierścieniowego larw: izolacja rozwojowych narządów endokrynnych od Drosophila

Źródło: Jeong, S. Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wizualizację projekcji aksonalnych w zarodkach Drosophila. Znakowanie immunologiczne neuronów ruchowych, precyzyjna sekcja w celu odsłonięcia struktur neuronalnych oraz mikroskopia kontrastowa z różnicową interferencją łącznie ujawniają szczegółową architekturę neuronów, podkreślając wzorce projekcji aksonalnej.

Wizualizacja wzorców projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Opisano paradygmat uszkodzeń wykorzystujący brzuszny rdzeń nerwowy larw Drosophila do badania regeneracji i naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Dźganie, a następnie laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna w próbkach poklatkowych i utrwalonych, w połączeniu z analizą ilościową za pomocą celowo opracowanego oprogramowania i genetyki, są wykorzystywane do badania molekularnych mechanizmów regeneracji i naprawy OUN.

Paradygmat urazów do badania naprawy ośrodkowego układu nerwowego u Drosophila

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Opisujemy protokół preparacji, utrwalania i barwienia immunologicznego organów steroidogennych u larw Drosophila i dorosłych samic w celu zbadania biosyntezy hormonów steroidowych i ich mechanizmu regulacyjnego. Oprócz narządów steroidogennych wizualizujemy unerwienie narządów steroidogennych, a także steroidogennych komórek docelowych, takich jak komórki macierzyste linii rozrodczej.

Protokoły wizualizacji narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów z barwieniem immunologicznym u muszki owocowej Drosophila melanogaster

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Tutaj omawiamy proces przygotowania, sekcji, montażu i obrazowania żywych mózgów eksplantatów z larw trzeciego stadium rozwojowego Drosophila melanogaster, aby obserwować dynamikę komórkową i subkomórkową w warunkach fizjologicznych.

Obrazowanie żywymi komórkami mózgów larwalnych Drosophila melanogaster

Poznaj metodę wizualizacji nerwów segmentowych larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie transportu aksonalnego i lokalizacji białek.

Wizualizacja nerwów segmentowych larw w preparatach larw Drosophila w 3^rd stadium zasiedlenia

Przeglądaj więcej filmów