Indukcja i ocena rekombinacji przełączającej klasy w oczyszczonych komórkach B myszy

Podczas humoralnej odpowiedzi immunologicznej limfocyty B aktywowane przez antygen proliferują i wydzielają przeciwciała w miarę postępu odpowiedzi. W celu oceny proliferacji i przełączania klas przeciwciał domyślny izotyp przeciwciał IgM zostaje zastąpiony bardziej zróżnicowanymi izotypami IgG, IgA lub IgE. W warunkach in vitro limfocyty B ze śledziony myszy eksperymentalnej są izolowane przy użyciu magnetycznej separacji komórek.

Komórki barwi się fluorescencyjnym barwnikiem CFSE w celu monitorowania proliferacji stymulowanej traktowaniem bakteryjnym L-P-S-L-P-S; stymulacja ta indukuje również przełączenie klasy na izotyp IgG3, co wraz z proliferacją może być monitorowane za pomocą cytometrii przepływowej. Dzisiaj zaprezentuję technikę izolacji i aktywacji czystych limfocytów B ze śledziony. Technika ta może być wykorzystana do badania rekombinacji przełączenia klasy i proliferacji in vitro, a także do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odporności limfocytów B, w tym dotyczące funkcji i regulacji cytydyny deaminazy indukowanej aktywacją.

Zacznij od namoczenia uśpionej myszy w 70% etanolu. Mysz powinna być w wieku od 8 do 12 tygodni, aby zapewnić pełną dojrzałość układu odpornościowego. Używając sterylnych nożyczek, wykonaj nacięcie przez skórę i mięśnie w okolicy lewego podżeleżia brzucha. Za pomocą nożyczek lub pęsety wyizoluj śledzionę z sąsiednich tkanek.

Następnie przekrój śledzionkę w PBS na trzy duże części. Potem, używając gumowego końca tłoka strzykawki o objętości 1 mL, delikatnie rozgnieć śledzionkę przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm do PBS. Pamiętaj, aby stosować ruchy pchające, a nie rozcierające.

Ponieważ rozcieranie może prowadzić do rozerwania większych komórek proliferujących, odwiruj komórki z prędkością nieprzekraczającą 350 G przez pięć minut. Następnie zawieś osad w PBS.

Policz resuspenderowane komórki za pomocą hemocytometru w sterylnej polistyrenowej probówce o pojemności pięciu mililitrów. Przygotuj zawiesinę o stężeniu 1 × 10⁸ komórek na mililitr w PBS z 5% normalnym surowicą szczurzą. Do każdej probówki można dodać maksymalnie dwa mililitry.

Następnie dodaj 50 µL koktajlu do negatywnej selekcji komórek B myszy (EP negative selection Mouse B-cell enrichment cocktail) na każdy mililitr komórek. Następnie zamknij probówki i umieść je w lodówce na 15 minut.

Dodaj 100 µL koktajlu selekcyjnego EP z biotyną na każdy mililitr komórek. Zakręć probówki i pozostaw w lodówce na 15 minut. Po inkubacji z koktajlem selekcyjnym zmieszaj nanocząsteczki magnetyczne EP z biotyną i dodaj 100 µL na każdy mililitr komórek. Wymieszaj zawartość pipetą, zakręć probówki i pozostaw je w lodówce na pięć minut.

Dopełnić roztwór buforem PBS do objętości 2,5 milliliters i umieścić w magnesie cept przez pięć minut. Odwrócić magnes z probówką i szybko przelać zawartość do nowej probówki polistyrenowej. Nie wstrząsać probówką, ponieważ ujemnie wyselekcjonowane komórki będą magnetycznie związane ze ściankami probówki. Aby dodatkowo zwiększyć czystość zawiesiny komórkowej, umieścić nową probówkę z komórkami w magnesie na pięć minut, a następnie ponownie przelać do nowej probówki.

Ten krok może zmniejszyć całkowitą odzyskowalność komórek. Czystość limfocytów B można ocenić za pomocą analizy cytometrycznej markerów powierzchniowych limfocytów B. Po wzbogaceniu więcej niż 95% komórek powinno być B two 20 pozytywnych.

Ponownie zawiesić wyizolowane komórki w ciepłym PBS uzupełnionym o 0,1% BSA, aby uzyskać końcowe stężenie 1 miliona komórek na mililitr, korzystając z 5 milimolarnego roztworu stokowego barwnika CFSE rozpuszczonego w sterylnym dimetylosulfoksydzie. Dodać dwa mikrolitry na każdy mililitr komórek w probówce. CFSE służy do monitorowania podziałów komórek stymulowanych.

Proces kluczowy dla przełączania izotypu. Stężenie końcowe 10 µM jest optymalne do barwienia pierwotnych limfocytów B. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut w ciemności.

Należy pamiętać, że CFSE jest światłoczuły i w miarę możliwości powinien być przechowywany w ciemności. Po inkubacji należy przerwać barwienie, dodając do komórek taką samą objętość serum cielęcego oraz inkubując na lodzie. W celu wypłukania komórek należy uzupełnić probówki pożywką hodowlaną; aby zniwelować lepkość serum cielęcego i umożliwić utworzenie osadu komórkowego, należy dodać co najmniej pięciokrotność objętości pożywki, a następnie odwirować przy 350 G przez pięć minut. Komórki należy wypłukać dwukrotnie w pożywce hodowlanej; są one teraz gotowe do stymulacji.

Przygotować pożywkę do hodowli limfocytów B in vitro, uzupełniając RPMI 1640 o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 50 micromolar Beto me capita ethanol. Następnie przygotować pożywkę stymulującą, dodając LPS do końcowego stężenia 50 micrograms per milliliter. Odmierzyć 125 microliters pożywki stymulującej do każdego dołka płaskodنnej płytki tkankowej z 96 dołkami.

Przygotować barwione przeciwciałem CFS E komórki B w pożywce hodowlanej bez LPS w końcowym stężeniu 3,2 × 10⁶ komórek/ml. Dodać 125 µl zawiesiny komórkowej do studni zawierających pożywkę stymulującą i wymieszać, delikatnie pipetując. Każda studnia zawiera obecnie 400 000 komórek w końcowym stężeniu LPS wynoszącym 25 µg/ml.

Zapewnia to optymalny poziom proliferacji komórek oraz przełączania klas przeciwciał. Choć wartości te można modyfikować zgodnie z potrzebami, komórki należy inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 72 do 96 godzin. Po 48 godzinach pod mikroskopem będą wyraźnie widoczne skupiska dużych proliferujących limfocytów B, co pozwoli na analizę przełączania klas.

Wyjmij komórki z inkubatora i przemyj je dwukrotnie w 1 ml buforu do barwienia, aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu przeciwciał. Odwiruj komórki przy 350 G, aby uzyskać osad. Następnie resuspenduj komórki w 100 µL buforu do barwienia z dodatkiem 5% normalnego surowicy mysiej oraz 1 µg blokera Fc na milion komórek i inkubuj przez 15 minut w lodzie bez przemywania. Dodaj znakowane fluorescencyjnie przeciwciało anty-US IgG3 w stężeniu 1 µg na milion komórek, inkubuj przez 30 minut w lodzie, przemyj komórki dwukrotnie i resuspenduj je w 200–300 µL buforu do barwienia.

Komórki są teraz gotowe do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. CFSE jest optymalnie wzbudzany przy 492 nanometrach przez laser argonowy i emituje światło przy 517 nanometrach. Widmo wzbudzenia i emisji przeciwciała IgG 3 zależy od połączonego z nim barwnika fluorescencyjnego.

Po wzbogaceniu magnetycznym zawiesina komórkowa powinna wyglądać jak jednorodna populacja nieodróżnialnych, małych, okrągłych komórek. Po 48 do 72 godzinach stymulacji wyraźnie widoczne będą izolowane skupiska powiększonych komórek proliferujących. Duża część komórek nieproliferujących będzie wyglądać na małe i ziarniste w miarę jak ulegają one apoptozie.

CSR można zazwyczaj wykryć na najwyższym poziomie od 72 do 96 godzin po stymulacji, zanim większość komórek zacznie obumierać. Na tym etapie komórki powinny przejść szereg podziałów, a komórki po przełączeniu powinny pojawić się w późniejszej populacji komórek potomnych. Po zastosowaniu tych protokołów można wykorzystać inne techniki, takie jak rna, AI mediated gene knockdown, aby zbadać wpływ dowolnego genu na funkcję ID oraz proces rekombinacji przełączenia klasy.