Name: Indukcja i ocena rekombinacji przełączników klas w oczyszczonych mysich komórkach B (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj metodę indukcji i analizy rekombinacji przełączników klas w oczyszczonych mysich komórkach B przy użyciu LPS i cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia badanie proliferacji i odpowiedzi immunologicznej in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni laboratorium Martina za pomocne dyskusje. Niniejsza publikacja jest finansowana z grantu Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (MOP-89783). A.M. otrzymuje wsparcie w ramach Canada Research Chair Tier II Award.

Krok I: Izolacja limfocytów B śledziony za pomocą wzbogacania magnetycznego
<ol>
 <li>Myszy eksperymentalne powinny być w wieku od 8 do 12 tygodni, aby zapewnić pełną dojrzałość układu odpornościowego.</li>
 <li>Uśmierć mysz metodą zwichnięcia karku i zanurz w 70% etanolu. Chirurgicznie usuń śledzionę, wykonując nacięcie skóry i mięśni w lewym podżebrzu brzucha, a następnie podziel ją na trzy duże fragmenty w roztworze soli fosforanowej (PBS). Upewnij się, że wszystkie narzędzia i odczynniki są sterylne.</li>
 <li>Używając gumowego końca tłoka strzykawki o pojemności 1 ml, delikatnie rozgnieć śledzionę przez 70 μm sitko do komórek do PBS. Należy stosować ruchy naciskające, a nie rozcierające, ponieważ rozcieranie może doprowadzić do rozerwania większych komórek (np. komórek proliferujących).</li>
 <li>Odwiruj komórki z siłą nieprzekraczającą 350 g przez 5 minut, a następnie resuspenduj osad w PBS. Policz resuspendowane komórki za pomocą komory countingowej (hemocytometru).</li>
 <li>Przygotować zawiesinę o stężeniu 1x108 komórek/ml w PBS z 5% normalnym surowicą szczura w sterylnej polistyrenowej probówce 5 ml z zakrętką (maksymalna objętość 2 ml na probówkę).</li>
 <li>Dodaj 50 μL koktajlu EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment na każdy mL komórek. Przemieszać mieszaninę za pomocą pipety, zakręcić probówki i umieścić w lodówce na 15 minut.</li>
 <li>Dodaj 100 μL EasySep Biotin Selection Cocktail na każdy ml komórek. Przenieść mieszaninę pipetą, zakręcić probówki i umieścić w lodówce na 15 minut.</li>
 <li>Dodaj 100 μL nanocząsteczek magnetycznych EasySep (należy upewnić się, że nanocząsteczki są dobrze wymieszane, a roztwór jest jednorodny) na każdy ml komórek. Pipetować mieszaninę, zamknąć probówki i umieścić w lodówce na 5 minut.</li>
 <li>Uzupełnić roztwór buforem PBS do objętości 2,5 ml i umieścić w magnesie EasySep na 5 minut. Odwrócić magnes oraz probówkę i szybko przelać zawartość do nowej probówki polistyrenowej. Nie potrząsać probówką, ponieważ komórki wyselekcjonowane negatywnie będą magnetycznie związane ze ściankami naczynia.</li>
 <li>Aby dodatkowo zwiększyć czystość zawiesiny komórkowej, probówkę można ponownie umieścić w magnesie na kolejne 5 minut, a następnie przelać jej zawartość do nowej probówki. Może to doprowadzić do zmniejszenia całkowitej odzyskiwalności komórek.</li>
 <li>Czystość limfocytów B można ocenić za pomocą analizy cytometrycznej markerów powierzchniowych limfocytów B. Po wzbogaceniu konsekwentnie obserwujemy czystość na poziomie &gt;95% komórek B220-dodatnich.</li>
</ol>
Krok II: Barwienie komórek CFSE
<ol>
 <li>Resuspender wyizolowane komórki w ogrzanym PBS uzupełnionym o 0,1% albuminy surowicy bydlęcej do stężenia końcowego 1 x 106 komórek na ml.</li>
 <li>Przygotować 5 mM roztwór zapasu CFSE (rozcieńczony w sterylnym dimetylosulfoksydzie) i dodać 2μL na każdy ml komórek w probówce. Końcowe stężenie 10μM jest optymalny do barwienia pierwotnych limfocytów B.</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 37°C przez 10 minut w ciemności (uwaga: CFSE jest wrażliwy na światło i w miarę możliwości należy go przechowywać w ciemności).</li>
 <li>Zatrzymaj barwienie, dodając do komórek taką samą objętość surowicy z cielęcej wołowiny i inkubując na lodzie przez 5 minut.</li>
 <li>Przemyj komórki, dopełniając probówki pożywką hodowlaną (patrz krok III w celu uzyskania receptury) i wirując przy 350 g. Należy pamiętać, że w celu zniwelowania lepkości surowicy cielęcej oraz umożliwienia utworzenia osadu komórkowego, należy dodać co najmniej pięciokrotność objętości pożywki w stosunku do objętości zawiesiny.</li>
 <li>Przemyć komórki dwukrotnie w medium hodowlanym. Komórki są teraz gotowe do stymulacji.</li>
</ol>
Krok III: Stymulacja komórek LPS
<ol>
 <li>Przygotuj swój in vitro pożywka do hodowli limfocytów B poprzez uzupełnienie RPMI 1640 o 10% płodowej surowicy cielęcej oraz 50 μM β-merkaptoetanol </li>
 <li>Przygotować podłoże do stymulacji, dodając LPS do stężenia końcowego wynoszącego 50μg/mLAliquot (podzielenie na porcje) 125 μL pożywki stymulującej do każdego dołka płaskodنnej 96-dołkowej płytki do hodowli tkanek.</li>
 <li>Przygotuj barwione CFSE limfocyty B w medium hodowlanym bez LPS w stężeniu końcowym 3,2 x 10^6/ml6 komórek/ml. Dodać 125 μL zawiesiny komórkowej do studni zawierających medium stymulujące i wymieszać, delikatnie pipetując.</li>
 <li>Każda studnia zawiera teraz 4 x 105 komórki w końcowym stężeniu LPS wynoszącym 25 μg/mLZapewnia to optymalne poziomy proliferacji komórek i przełączania klas przeciwciał, choć wartości te można modyfikować zgodnie z potrzebami.</li>
 <li>Inkubować komórki w temperaturze 37°C oraz 5% CO22 przez 72 do 96 godzin. Po 48 godzinach pod mikroskopem będą wyraźnie widoczne skupiska dużych proliferujących limfocytów B.</li>
</ol>
Krok IV: Analiza cytometryczna przepływowa przełączania klas
<ol>
 <li>W momencie przejścia do analizy przełączania klas, należy wyjąć komórki z warunków hodowli i dwukrotnie przemyć je 1 ml buforu barwiącego (PBS z 2% surowicą cielęcą).</li>
 <li>Aby zapobiec niespecyficznemu barwieniu przeciwciałami komórek, należy odwirować komórki z prędkością 350 g w celu uzyskania osadu, a następnie inkubować je w 100μL buforu barwiącego z dodatkiem 5% normalnego surowicy mysiej i 1μg FcBlock w ilości na 10^6 komórek przez 15 minut na lodzie. Blokowanie komórek powinno być przeprowadzane na lodzie.</li>
 <li>Bez przemywania komórek dodać 1μg na 106 komórki przeciwciałem anty-mouse IgG3 znakowanym fluorescencyjnie i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4°C w celu barwienia komórek. </li>
 <li>Wypłukać komórki dwukrotnie poprzez wirowanie, a następnie resuspendować w 200-300 μL buforu barwiącego. Komórki są teraz gotowe do analizy metodą cytometrii przepływowej.</li>
 <li>CFSE jest optymalnie wzbudzany przy 492 nm (za pomocą lasera argonowego) i emituje światło przy 517 nm. Widmo wzbudzenia i emisji przeciwciała IgG3 jest zależne od zastosowanego koniugatu barwnika fluorescencyjnego.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
Po wzbogaceniu magnetycznym zawiesina komórkowa powinna wyglądać jak homogenna populacja nierozróżnialnych, małych, okrągłych komórek (Rycina 1A). Po 48–72 godzinach stymulacji wyraźnie widoczne będą izolowane skupiska powiększonych komórek proliferujących (Rycina 1B). Duża proporcja komórek nieproliferujących będzie wyglądać na małe i ziarniste, gdyż będą one przechodzić proces apoptozy.
CSR można zazwyczaj wykryć na najwyższym poziomie między 72. a 96. godziną po stymulacji, zanim większość komórek zacznie obumierać 7. Na tym etapie komórki powinny przejść szereg podziałów, przy czym komórki z przełączonym izotypem pojawiają się w późniejszej populacji komórek potomnych. Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej obrazujący rozcieńczenie CFSE oraz ekspresję powierzchniową IgG3 po 96 godzinach stymulacji LPS przedstawiono na rysunku 2.
Tabela 1. Koktajle do przełączania izotypów. Uwaga: Wartości stężeń stymulatorów są jedynie rekomendacjami. Może być konieczne przeprowadzenie miareczkowania.
<table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <td>Pożądany izotyp</td>
 <td>Koktajl stymulujący</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IgG1 i IgE</td>
 <td>LPS (25μg/mL) i IL-4 (10 ng/mL)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IgG1 i IgE</td>
 <td>Anti-CD40 (10μg/mL) i IL-4 (10 ng/mL)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IgG2a</td>
 <td>LPS (25μg/mL) i IFN-γ (10 ng/mL)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IgG2b i IgG3</td>
 <td>LPS (25μg/mL)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IgA</td>
 <td>LPS (25μg/mL), TGF-β (2 ng/mL) i IL-5 (1.5 ng/mL)</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
<img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig1.jpg" alt="Analiza proliferacji komórek; obraz mikroskopowy pokazujący różnice w gęstości komórek między próbkami A i B." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Izolacja i stymulacja LPS komórek B śledziony. (a) Magnetycznie wzbogacone komórki B śledziony przed stymulacją LPS. (b) 48 godzin po stymulacji 25 μg/mL LPS. Proliferujące komórki widoczne są jako skupiska na tle komórek blastycznych i apoptotycznych.
<img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig2.jpg" alt="Analiza cytometrii przepływowej przedstawiająca histogram liczby komórek CFSE oraz wykres rozproszenia IgG3 dla znakowania komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Proliferacja i rekombinacja przełączania klas po 96 godzinach. (a) Rozcieńczenie CFSE dla komórek stymulowanych LPS po 96 godzinach hodowli. Każdy oddzielny szczyt reprezentuje rozcieńczenie fluorescencji CFSE odpowiadające pojedynczemu podziałowi komórki. (b) Ekspresja IgG3 wykazująca pojawienie się populacji dodatniej pod kątem IgG3 po kilku rundach podziałów komórkowych.

<ol><li>Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+differentiation+and+isotype+switching+is+related+to+division+cycle+number%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number.</a> J Exp Med. 184, 277-281 (1996).</li>
<li>McCall, M. N., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+recombination+and+germ-line+transcription+are+division-regulated+events+in+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes.</a> Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).</li>
<li>Manis, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+links+DNA+damage-response+pathways+to+immunoglobulin+heavy+chain+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination.</a> Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).</li>
<li>de Yebenes, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-181b+negatively+regulates+activation-induced+cytidine+deaminase+in+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells.</a> J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).</li>
<li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li>
<li>Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNF8%2FRNF168+ubiquitin+ligase+cascade+facilitates+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).</li>
<li>Zaheen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+constrains+germinal+center+size+by+rendering+B+cells+susceptible+to+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis.</a> Blood. 114, 547-554 (2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class-switch+recombination%3A+interplay+of+transcription%2C+DNA+deamination+and+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair.</a> Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).</li>
<li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli+that+enhance+IgA+class+switching+increase+histone+3+acetylation+at+S+alpha%2C+but+poorly+stimulate+sequential+switching+from+IgG2b%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b.</a> Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).</li>
<li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+class+switching+differs+among+SJL%2C+C57BL%2F6+and+129+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice.</a> Int Immunol. 19, 545-556 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Opisany powyżej protokół stanowi standardowy test do analizy ekspresji i funkcji AID podczas przełączania klas w pierwotnych komórkach B myszy. Protokół ten wykorzystuje bakteryjne LPS do indukcji przełączania z IgM na IgG3, choć można wprowadzić modyfikacje w pożywce stymulującej, aby wywołać przełączanie na inne izotypy (podsumowano w Tabeli 1 8, 9).
Zauważyliśmy, że z nieznanych jeszcze przyczyn surowica cielęca może wpływać na poziom przełączania klas obserwowany in vitro. Aby ...

<table><tbody><tr><td>Fosforanowy bufor solny (PBS)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wzbogacania limfocytów B myszy EasySep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19754</td><td></td></tr><tr><td>Probówki polistyrenowe</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do badania proliferacji komórek CellTrace CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Surowica z cieląt</td><td>Hyclone</td><td>SH30072.03</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy z &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6529</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica mysia</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>011-000</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone przeciwciała szczurze anty-mysie CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała szczurze anty-mysie IgG3</td><td>BD Biosciences</td><td>553401</td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja i ocena rekombinacji przełączającej klasy w oczyszczonych komórkach b myszy

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Odporność humoralna to gałąź układu odpornościowego podtrzymywana przez limfocyty B i pośrednicząca poprzez sekrecję przeciwciał. Po aktywacji limfocytów B locus immunoglobulin przechodzi szereg modyfikacji genetycznych, aby zmienić zdolność wiązania i funkcję efektorową wydzielanych przeciwciał. Proces ten jest podkreślony przez zdarzenie rekombinacji genomicznej znane jako rekombinacja przełączająca klasę (CSR), w której domyślny izotyp przeciwciał IgM zostaje zastąpiony przez jeden z izotypów IgG, IgA lub IgE. Każdy izotyp posiada odmienne funkcje efektorowe, co sprawia, że CSR jest kluczowy dla utrzymania odporności. Dywersyfikacja locus immunoglobulin jest pośredniczona przez enzym cytidynodeaminazę indukowaną aktywacją (AID). Schematyczny film szczegółowo opisujący ten proces jest dostępny online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). Aktywność AID oraz szlak CSR są powszechnie badane w celu oceny funkcji limfocytów B i odporności humoralnej u myszy. Protokół przedstawiony w niniejszym raporcie opisuje metodę izolacji limfocytów B ze śledzion u myszy i ich późniejszą stymulację bakteryjnym lipopolisacharydem (LPS) w celu indukowania przełączenia klasy na IgG3 (inne izotypy przeciwciał przedstawiono w Tabeli 1). Dodatkowo, do monitorowania podziałów komórkowych stymulowanych komórek, procesie kluczowym dla przełączania izotypów, wykorzystano fluorescencyjny barwnik do barwienia komórek — karboksyfluoresceiny ester succinimidylowy (CFSE) 1, 2. Regulacja AID oraz mechanizm, według którego zachodzi CSR, pozostają niejasne, dlatego testy przełączania klas in vitro stanowią wiarygodną metodę badania tych procesów w różnych modelach mysich. Testy te były wcześniej wykorzystywane w kontekście niedoboru genów z użyciem myszy z knockautem 3. Co więcej, przełączaniu B komórek in vitro może poprzedzać transdukcja wirusowa w celu modulacji ekspresji genów poprzez wyciszanie RNA (knockdown) lub ekspresję transgenu 4-6. Dane z tego rodzaju eksperymentów wpłynęły na nasze zrozumienie aktywności AID, rozdzielczości reakcji CSR oraz odporności humoralnej u myszy.

Po ekspozycji na antygen subpopulacje aktywowanych limfocytów B przechodzą proces znany jako rekombinacja przełączająca klasę (CSR), aby wytworzyć izotypy przeciwciał o odrębnych funkcjach efektorowych. Protokół opisany w niniejszym raporcie wyjaśnia, w jaki sposób CSR można indukować i analizować in vitro w celu badania funkcji limfocytów B.

Indukcja i ocena rekombinacji przełączającej klasy w oczyszczonych komórkach B myszy

Odporność humoralna to gałąź układu odpornościowego utrzymywana przez limfocyty B i zapośredniczona przez wydzielanie przeciwciał. Po aktywacji limfocytów B...

Podczas humoralnej odpowiedzi immunologicznej limfocyty B aktywowane przez antygen proliferują i wydzielają przeciwciała w miarę postępu odpowiedzi. W celu oceny proliferacji i przełączania klas przeciwciał domyślny izotyp przeciwciał IgM zostaje zastąpiony bardziej zróżnicowanymi izotypami IgG, IgA lub IgE. W warunkach in vitro limfocyty B ze śledziony myszy eksperymentalnej są izolowane przy użyciu magnetycznej separacji komórek.Komórki barwi się fluorescencyjnym barwnikiem CFSE w celu monitorowania proliferacji stymulowanej traktowaniem bakteryjnym L-P-S-L-P-S; stymulacja ta indukuje również przełączenie klasy na izotyp IgG3, co wraz z proliferacją może być monitorowane za pomocą cytometrii przepływowej. Dzisiaj zaprezentuję technikę izolacji i aktywacji czystych limfocytów B ze śledziony. Technika ta może być wykorzystana do badania rekombinacji przełączenia klasy i proliferacji in vitro, a także do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odporności limfocytów B, w tym dotyczące funkcji i regulacji cytydyny deaminazy indukowanej aktywacją.Zacznij od namoczenia uśpionej myszy w 70% etanolu. Mysz powinna być w wieku od 8 do 12 tygodni, aby zapewnić pełną dojrzałość układu odpornościowego. Używając sterylnych nożyczek, wykonaj nacięcie przez skórę i mięśnie w okolicy lewego podżeleżia brzucha. Za pomocą nożyczek lub pęsety wyizoluj śledzionę z sąsiednich tkanek.Następnie przekrój śledzionkę w PBS na trzy duże części. Potem, używając gumowego końca tłoka strzykawki o objętości 1 mL, delikatnie rozgnieć śledzionkę przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm do PBS. Pamiętaj, aby stosować ruchy pchające, a nie rozcierające.Ponieważ rozcieranie może prowadzić do rozerwania większych komórek proliferujących, odwiruj komórki z prędkością nieprzekraczającą 350 G przez pięć minut. Następnie zawieś osad w PBS.Policz resuspenderowane komórki za pomocą hemocytometru w sterylnej polistyrenowej probówce o pojemności pięciu mililitrów. Przygotuj zawiesinę o stężeniu 1 × 10⁸ komórek na mililitr w PBS z 5% normalnym surowicą szczurzą. Do każdej probówki można dodać maksymalnie dwa mililitry.Następnie dodaj 50 µL koktajlu do negatywnej selekcji komórek B myszy (EP negative selection Mouse B-cell enrichment cocktail) na każdy mililitr komórek. Następnie zamknij probówki i umieść je w lodówce na 15 minut.Dodaj 100 µL koktajlu selekcyjnego EP z biotyną na każdy mililitr komórek. Zakręć probówki i pozostaw w lodówce na 15 minut. Po inkubacji z koktajlem selekcyjnym zmieszaj nanocząsteczki magnetyczne EP z biotyną i dodaj 100 µL na każdy mililitr komórek. Wymieszaj zawartość pipetą, zakręć probówki i pozostaw je w lodówce na pięć minut.Dopełnić roztwór buforem PBS do objętości 2,5 milliliters i umieścić w magnesie cept przez pięć minut. Odwrócić magnes z probówką i szybko przelać zawartość do nowej probówki polistyrenowej. Nie wstrząsać probówką, ponieważ ujemnie wyselekcjonowane komórki będą magnetycznie związane ze ściankami probówki. Aby dodatkowo zwiększyć czystość zawiesiny komórkowej, umieścić nową probówkę z komórkami w magnesie na pięć minut, a następnie ponownie przelać do nowej probówki.Ten krok może zmniejszyć całkowitą odzyskowalność komórek. Czystość limfocytów B można ocenić za pomocą analizy cytometrycznej markerów powierzchniowych limfocytów B. Po wzbogaceniu więcej niż 95% komórek powinno być B two 20 pozytywnych.Ponownie zawiesić wyizolowane komórki w ciepłym PBS uzupełnionym o 0,1% BSA, aby uzyskać końcowe stężenie 1 miliona komórek na mililitr, korzystając z 5 milimolarnego roztworu stokowego barwnika CFSE rozpuszczonego w sterylnym dimetylosulfoksydzie. Dodać dwa mikrolitry na każdy mililitr komórek w probówce. CFSE służy do monitorowania podziałów komórek stymulowanych.Proces kluczowy dla przełączania izotypu. Stężenie końcowe 10 µM jest optymalne do barwienia pierwotnych limfocytów B. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut w ciemności.Należy pamiętać, że CFSE jest światłoczuły i w miarę możliwości powinien być przechowywany w ciemności. Po inkubacji należy przerwać barwienie, dodając do komórek taką samą objętość serum cielęcego oraz inkubując na lodzie. W celu wypłukania komórek należy uzupełnić probówki pożywką hodowlaną; aby zniwelować lepkość serum cielęcego i umożliwić utworzenie osadu komórkowego, należy dodać co najmniej pięciokrotność objętości pożywki, a następnie odwirować przy 350 G przez pięć minut. Komórki należy wypłukać dwukrotnie w pożywce hodowlanej; są one teraz gotowe do stymulacji.Przygotować pożywkę do hodowli limfocytów B in vitro, uzupełniając RPMI 1640 o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 50 micromolar Beto me capita ethanol. Następnie przygotować pożywkę stymulującą, dodając LPS do końcowego stężenia 50 micrograms per milliliter. Odmierzyć 125 microliters pożywki stymulującej do każdego dołka płaskodنnej płytki tkankowej z 96 dołkami.Przygotować barwione przeciwciałem CFS E komórki B w pożywce hodowlanej bez LPS w końcowym stężeniu 3,2 × 10⁶ komórek/ml. Dodać 125 µl zawiesiny komórkowej do studni zawierających pożywkę stymulującą i wymieszać, delikatnie pipetując. Każda studnia zawiera obecnie 400 000 komórek w końcowym stężeniu LPS wynoszącym 25 µg/ml.Zapewnia to optymalny poziom proliferacji komórek oraz przełączania klas przeciwciał. Choć wartości te można modyfikować zgodnie z potrzebami, komórki należy inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 72 do 96 godzin. Po 48 godzinach pod mikroskopem będą wyraźnie widoczne skupiska dużych proliferujących limfocytów B, co pozwoli na analizę przełączania klas.Wyjmij komórki z inkubatora i przemyj je dwukrotnie w 1 ml buforu do barwienia, aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu przeciwciał. Odwiruj komórki przy 350 G, aby uzyskać osad. Następnie resuspenduj komórki w 100 µL buforu do barwienia z dodatkiem 5% normalnego surowicy mysiej oraz 1 µg blokera Fc na milion komórek i inkubuj przez 15 minut w lodzie bez przemywania. Dodaj znakowane fluorescencyjnie przeciwciało anty-US IgG3 w stężeniu 1 µg na milion komórek, inkubuj przez 30 minut w lodzie, przemyj komórki dwukrotnie i resuspenduj je w 200–300 µL buforu do barwienia.Komórki są teraz gotowe do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. CFSE jest optymalnie wzbudzany przy 492 nanometrach przez laser argonowy i emituje światło przy 517 nanometrach. Widmo wzbudzenia i emisji przeciwciała IgG 3 zależy od połączonego z nim barwnika fluorescencyjnego.Po wzbogaceniu magnetycznym zawiesina komórkowa powinna wyglądać jak jednorodna populacja nieodróżnialnych, małych, okrągłych komórek. Po 48 do 72 godzinach stymulacji wyraźnie widoczne będą izolowane skupiska powiększonych komórek proliferujących. Duża część komórek nieproliferujących będzie wyglądać na małe i ziarniste w miarę jak ulegają one apoptozie.CSR można zazwyczaj wykryć na najwyższym poziomie od 72 do 96 godzin po stymulacji, zanim większość komórek zacznie obumierać. Na tym etapie komórki powinny przejść szereg podziałów, a komórki po przełączeniu powinny pojawić się w późniejszej populacji komórek potomnych. Po zastosowaniu tych protokołów można wykorzystać inne techniki, takie jak rna, AI mediated gene knockdown, aby zbadać wpływ dowolnego genu na funkcję ID oraz proces rekombinacji przełączenia klasy.

induction-assessment-class-switch-recombination-purified-murine-b

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Indukcja i ocena rekombinacji zmian klasy w oczyszczonych komórkach B mysich

Opisano wydajny system analizy struktury i funkcji genu w kulturze ex vivo limfocytów B śledziony. Metoda ta wykorzystuje produkcję rekombinowanych retrowirusów w wolnej od komórek pomocniczych (helper-free), ekotropowej linii komórkowej pakującej. Osiągnięto stabilną, dziedziczną ekspresję badanego genu w pierwotnych limfocytach, co prowadzi do generowania przeciwciał powierzchniowych na komórkach B przechodzących rekombinację zmiany klasy.

Produkcja rekombinowanych retrowirusów i infekcja limfocytów B

Opisujemy sposób przeprowadzania infekcji retrowirusowych lub lentiwirusowych konstruktami do nadekspresji lub zawierającymi shRNA w ludzkiej linii komórek B Ramos oraz metodę pomiaru hipermutacji somatycznej w tych komórkach.

Ocena hipermutacji somatycznej w limfocytach B linii Ramos po nadekspresji lub wyciszeniu specyficznych genów

Analiza in vitro rekombinacji przełączników klas u myszy jest trudna ze względu na cytofilne cząsteczki IgE związane z receptorami Fc na powierzchni komórek B.  Opisujemy metodę wykrywania IgE za pomocą rozszczepienia IgE związanego powierzchniowo za pośrednictwem trypsyny przed utrwaleniem i przepuszczalnością w celu barwienia fluorescencji cytoplazmatycznej.

Wykrywanie prawdziwych mysich komórek linii B z ekspresją IgE

Transfer limfocytów bm12 do biorcy C57BL/6 jest ustalonym modelem tocznia rumieniowatego układowego. Tutaj opisujemy, jak zainicjować chorobę za pomocą tego modelu i jak scharakteryzować komórki pomocnicze pęcherzyków T, komórki B centrum rozrodczego i komórki plazmatyczne za pomocą cytometrii przepływowej.

Indukowany model tocznia rumieniowatego układowego (SLE) bm12 u myszy C57BL/6

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Czynniki epigenetyczne mogą wchodzić w interakcje z programami genetycznymi, aby modulować ekspresję genów i regulować funkcję komórek B. Łącząc stymulację komórek B in vitro, qRT-PCR oraz wysokoprzepustowe sekwencje mikroRNA i sekwencje mRNA, możemy analizować epigenetyczną modulację miRNA i ekspresję genów w komórkach B.

Analiza całego genomu modulacji mikroRNA i mRNA za pośrednictwem inhibitora HDAC w komórkach B indukowanych do rekombinacji DNA ze zmianą klasy i różnicowania komórek plazmatycznych

W tym artykule opisujemy protokół charakteryzujący odpowiedzi immunoglobuliny (Ig) zależnej od T i niezależnej od T u myszy za pomocą testu ELISA. Ta metoda stosowana samodzielnie lub w połączeniu z cytometrią przepływową pozwoli naukowcom zidentyfikować różnice w odpowiedziach izotypu Ig za pośrednictwem komórek B u myszy po immunizacji antygenu T zależnej i niezależnej od T.

Charakterystyka odpowiedzi izotypu immunoglobuliny zależnej i niezależnej od grasicy u myszy przy użyciu testu immunoenzymatycznego

Tutaj opisujemy metodę retrowirusowej nadekspresji i adoptywnego transferu mysich komórek B-1a w celu zbadania in vivo migracji i lokalizacji komórek B-1a. Protokół ten można rozszerzyć o różne dalsze testy funkcjonalne, w tym kwantyfikację lokalizacji komórek B-1a dawcy lub analizę czynników wydzielanych przez komórki dawcy po transferze adopcyjnym.

Retrowirusowa nadekspresja CXCR4 na mysich komórkach B-1A i transfer adoptywny w celu ukierunkowanej migracji komórek B-1A do szpiku kostnego i produkcji IgM

Prezentowany tutaj jest test do ilościowego określenia hipermutacji somatycznej w locus genu ciężkiego łańcucha immunoglobuliny przy użyciu komórek B centrum zarodkowego z mysich plastrów Peyera.

Analiza hipermutacji somatycznej w intronie JH4 komórek B centrum rozrodczego z mysich plastrów Peyera

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

W tym protokole opisany jest model adoptywnego transferowego zapalenia jelita grubego dla antygenu mikrobioty jelitowej z limfocytów T. Limfocyty T CD4 + izoluje się od myszy transgenicznych CBir1 TCR. Są one specyficzne dla immunodominującego antygenu mikrobioty jelitowej CBir1 flageliny, który jest przenoszony do myszy biorcy Rag1-/-, prowadząc do zapalenia jelit.

Indukcja zapalenia jelit przez adoptywny transfer transgenicznych limfocytów T CD4 + CBir1 TCR do myszy z niedoborem odporności

Poznaj metodę indukcji i analizy rekombinacji przełączników klas w oczyszczonych mysich komórkach B przy użyciu LPS i cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia badanie proliferacji i odpowiedzi immunologicznej in vitro.

Indukcja i ocena rekombinacji przełączającej klasy w oczyszczonych komórkach B myszy

Przeglądaj więcej filmów