Badania przesiewowe RNAi pod kątem czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie wirusem krowianki przy użyciu komórek Drosophila
August 25th, 2010
Nowe czynniki gospodarza związane z infekcją wirusową można zidentyfikować poprzez badanie przesiewowe RNAi w całym genomie komórkowym. Model hodowli komórek Drosophila jest szczególnie podatny na to podejście ze względu na łatwość i wydajność RNAi. Tutaj demonstrujemy tę technikę na przykładzie wirusa krowianki.
Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie wysokoprzepustowych badań przesiewowych RNAI w celu zidentyfikowania czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję wirusową. Osiąga się to poprzez pierwsze zubożenie interesujących genów przez RNAI w 384 płytkach dołkowych. Następnie komórki są prowokowane barwnikiem wirusa będącego przedmiotem zainteresowania dla białek wirusowych i mierzone pod kątem infekcji wirusowej za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.
Na koniec przeprowadzana jest automatyczna analiza obrazu w celu zidentyfikowania genów kandydujących do walidacji i dalszych badań. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują zmiany w infekcji poprzez ilościowe określenie odsetka zakażonych komórek za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Pozwala to na odkrycie nowych czynników komórkowych zaangażowanych w infekcję wirusową.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w interakcje wirusa z gospodarzem, można ją również zastosować do badania dowolnego systemu, który skorzystałby na wykorzystaniu wizualnego odczytu interesującego procesu komórkowego. Osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, powinny spodziewać się stromej krzywej uczenia się, ponieważ osiągnięcie powtarzalnych infekcji przy jednoczesnej minimalizacji zmienności wymaga znacznej optymalizacji Aby zapewnić powtarzalność wyników, konieczne jest użycie jednego numeru partii dla każdego odczynnika użytego w całym ekranie. Wyhoduj komórki S 2D RSC drosophila i kompletne podłoże Schneidera w temperaturze 25 stopni Celsjusza komórki powinny być w fazie logarytmicznej.
W przypadku eksperymentów w okapie z przepływem laminarnym należy usunąć częściowo przylegające komórki z kolby za pomocą rygorystycznego pipetowania. Możesz liczyć na to, że cytometr hemocytometryczny przeniesie 125% komórek potrzebnych do eksperymentu do 50-mililitrowej stożkowej probówki o stężeniu 300 G przez pięć minut. Odessać super nazwany ponownie zawiesić osad w końcowym stężeniu 1,7 razy 10 do sześciu komórek na mililitr w surowicy wolnej od pożywki Schneidera.
Używaj wysterylizowanego i zagruntowanego automatycznego systemu obsługi cieczy. W tym miejscu matryca dobrze pasuje, aby zminimalizować zmienność płyty. Dodać 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki 384-dołkowej płytki przed Eloqua z 250 nanogramami na dołek dwuniciowych komórek wirowych RNA na płytki w temperaturze 300 G przez jedną minutę.
Inkubuj płytki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 45 minut. Do każdego dodać 20 mikrolitrów kompletnej pożywki Schneidera. Dobrze odwirowywać pożywkę o stężeniu 300 G przez jedną minutę, aby zminimalizować skutki parowania.
Przechowuj talerze i nawilżone, szczelne pojemniki wyłożone ręcznikami papierowymi nasączonymi wodą. Inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez trzy dni, aby umożliwić uzyskanie silnych efektów nokautujących w dwustopniowej komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL. Przed zakażeniem komórek należy przefiltrować surowy zapas wirusa krowianki przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,8 mikrona.
Aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe. Rozcieńczyć wirusa w pożywce Schneidera 2% surowicą, aby uzyskać wielokrotność infekcji. Skrócony MOI dwóch liczb pierwszych.
Wysterylizowany studzienka łączy się z rozcieńczonym wirusem, aż rurka będzie wolna od pęcherzyków powietrza. Za pomocą wysterylizowanego aspiratora wielokanałowego z kolektorem próżniowym delikatnie usuń pożywkę z płytek dwuniciowych komórek drosophila traktowanych RNA. Dozować 30 mikrolitrów rozcieńczonego wirusa do każdej płytki.
Dobrze odwirować płytki o sile 300 G przez jedną minutę. Włóż płytki do nawilżonego pojemnika i inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 48 godzin. W BSL dwie komory bezpieczeństwa biologicznego zasysają pożywkę z płytki.
Następnie za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 15 mikrolitrów 4% roztworu formaldehydu do każdej płytki. Dobrze inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Usuń płyn za pomocą aspiratora wielokanałowego.
Użyj WELLMADE, aby dodać 30 mikrolitrów PBST do każdego. Dobrze inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wykonaj drugie 10-minutowe mycie PBST w ten sam sposób.
Usunięcie cieczy po bloku inkubacyjnym i 30 mikrolitrów PBST z 2% roztworem blokującym VSA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Użyj wielokanałowego pipetera wielokrotnego, aby dodać do każdego z nich 15 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym.
Dobrze odwiruj talerze o wadze 300 G przez jedną minutę. Uszczelnij każdą płytkę przezroczystym sufitem Folię inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Użyj dobrze dopasowanego i wielokanałowego aspiratora, aby umyć komórki w PBST trzy razy przez 10 minut przy każdym myciu.
Użyj pipetera wielokanałowego, aby dodać do każdego z nich 15 mikrolitrów znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała wtórnego z barwnikiem jądrowym. Dobrze przykryj folią, aby chronić przed światłem, inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez godzinę. Umyj komórki PBST trzy razy, tak jak poprzednio, przez 10 minut przy każdym myciu.
Dodaj 30 mikrolitrów PBST do komórek i uszczelnij przezroczystym sufitem. Zafoliuj i przykryj folią. Szczelnie zamknięte płytki należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do trzech tygodni przed obrazowaniem pod mikroskopem automatycznym.
Niezakażone studzienki nie wykazują żadnych zabarwień na obecność białek wirusa krowianki, podczas gdy reprezentatywna zainfekowana studzienka zawiera komórki. Barwienie dodatnie dla białka beta GCSE z ekspresją krowianki, mierzone za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Oprogramowanie do automatycznej analizy obrazu określa ilościowo infekcję na każdym obrazie przy użyciu parametrów ustawionych przez użytkownika.
Na reprezentatywnym obrazie całkowita liczba jąder komórkowych i liczba komórek wyrażających antygen wirusowy są liczone na podstawie wielkości i intensywności barwienia powyżej lokalnego tła. Barwienie nici służy jako pozytywna kontrola silnego zubożenia RNAi docelowych genów. Knockdown tego czynnika antyapoptotycznego prowadzi do dramatycznej śmierci komórki.
Knockdown lucyferazy służy jako negatywna kontrola efektu podwójnej nici. Leczenie RNA na infekcję Zubożenie lucyferazy nie ma wpływu na infekcję w porównaniu z komórkami nieleczonymi. Knockdown białka beta galacto służy jako pozytywna kontrola zmniejszenia infekcji.
Ponieważ test wykorzystuje poziomy białka beta galakto jako odczyt infekcji, wyczerpanie beta galakto powoduje zmniejszenie odsetka zakażonych komórek. Knockdown czynnika komórkowego RAB five powoduje zmniejszenie odsetka zakażonych komórek. Ponieważ wiadomo, że RAB 5 uczestniczy w endocytozie, czynnik ten prawdopodobnie przyczynia się do wnikania wirusa krowianki.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać badań przesiewowych RNAi u muszki w celu identyfikacji czynników gospodarza, które przyczyniają się do infekcji wirusowej, w tym wykonywania RNAi, zakażenia wirusem krowianki, barwienia obrazowania i analizy 384. Well Plates nie zapomina, że praca z wirusem DIA może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie fartuchów laboratoryjnych i okularów ochronnych. Żywy wirus należy otwierać wyłącznie w dwustopniowej szafie bezpieczeństwa biologicznego BSL, a wszystko, co ma kontakt z żywym wirusem, powinno być wysterylizowane w 10% wybielaczu przed usunięciem.
Przegląd
To badanie demonstruje metodę wysokowydajnego przesiewowego badania RNAi w celu identyfikacji czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję wirusową przy użyciu modelu kultury komórek Drosophila. Technikę tę ilustruje wyzwanie komórek wirusem ospy prawdziwej, umożliwiające ilościową ocenę infekcji za pomocą mikroskopi fluorescencyjnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Wirologia
- Biologia komórki
Tło
- Badanie RNAi jest potężnym narzędziem do badania funkcji genów.
- Komórki Drosophila są odpowiednie do przesiewowych analiz.
- Rozumienie interakcji gospodarz-wirus jest kluczowe dla opracowywania strategii przeciwwirusowych.
- Mikroskopia immunofluorescencyjna zapewnia wizualną ocenę infekcji.
Cel badania
- Aby zidentyfikować nowe czynniki gospodarza, które wpływają na infekcję wirusową.
- Aby zoptymalizować protokoły badania RNAi pod kątem reprodykowalności.
- Aby zademonstrować zastosowanie tej metody przy użyciu wirusa ospy prawdziwej.
Stosowane metody
- Wyczerpywanie genów docelowych za pomocą RNAi w 384-otworowym płytkach.
- Infekcja komórek wirusem ospy prawdziwej i pomiar białek wirusowych.
- Mikroskopia immunofluorescencyjna do ilościowego określania poziomu infekcji.
- Automatyczna analiza obrazów w celu zidentyfikowania genów kandydackich do dalszej walidacji.
Główne wyniki
- Skuteczne zidentyfikowanie czynników komórkowych wpływających na wejście wirusa ospy prawdziwej.
- Wyłączenie określonych genów powodowało mierzalne zmiany w wskaźnikach infekcji.
- Wykazano znaczenie używania spójnych reagentów dla reprodykowalności.
- Udzielono ram do przyszłych badań nad interakcjami gospodarz-patogen.
Wnioski
- Metoda badania RNAi jest skuteczna w identyfikacji czynników gospodarza w infekcjach wirusowych.
- To podejście może być dostosowane do różnych systemów biologicznych.
- Konieczna jest dalsza walidacja zidentyfikowanych genów, aby zrozumieć ich role w infekcji.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Identifying host factors that facilitate viral infection enables target de-risking in antiviral discovery by revealing non-viral proteins essential for pathogen propagation. This RNAi screening approach in Drosophila cells provides a scalable, genetically tractable system to interrogate conserved host-pathogen interactions with predictive relevance to human cells. The method supports early-stage target validation and mechanistic insight, informing portfolio prioritization for antiviral therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying host genes whose knockdown modulates viral infection phenotypes.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of host factors in a reproducible, high-throughput format.
- Predictive Value: Identifies evolutionarily conserved host pathways with translational relevance to human viral infection, aiding target confidence assessment.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantitative infection readouts via immunofluorescence microscopy, enabling reliable compound or genetic perturbation screening.
- Scalability: Utilizes 384-well plate format compatible with automated liquid handling and imaging systems for genome-scale applications.
- Reproducibility: Emphasizes reagent lot consistency and optimized infection conditions to minimize variability across screens.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Identifies host factors (e.g., RAB5) implicated in vaccinia virus entry that are also limiting in human cells, supporting cross-species translational validity.
- Mechanistic De-risking: Clarifies early infection steps such as endocytosis, enabling mechanistic hypothesis testing before compound investment.
- Translational Continuity: Bridges Drosophila findings to mammalian systems, supporting risk-adjusted advancement of host-targeted antiviral candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification through mechanistic validation, enabling progression from phenotypic screening to pathway de-risking in antiviral programs.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-free identification of host factors influencing viral entry, replication, or egress via loss-of-function screening.
- Screening: Delivers quantitative, image-based infection metrics suitable for primary and secondary screen hit confirmation.
- Analytics: Generates percentage of infected cells data, enabling statistical comparison of knockdown conditions and hit selection.
- Translational Research: Connects Drosophila cell findings to human infection models through conserved host factor validation, supporting preclinical rationale.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable RNAi-infection platform applicable to multiple viruses, reducing redevelopment costs across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen interactions by linking gene function to infection phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized cell preparation, virus titration, and fixed-cell storage for delayed imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by validating target dependency in a physiologically relevant infection context.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of host-directed antivirals with higher predicted clinical success rates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNAi transfection, viral handling in BSL-2, and immunofluorescence microscopy.
- Dependent on automated liquid handling systems, fluorescence microscopes, and image analysis software for throughput.
- Necessitates cross-team standardization of reagent lots, virus stocks, and infection protocols to ensure screen consistency.
- Involves adaptation considerations when translating Drosophila findings to mammalian or primary cell systems.
- Limited by the need for optimization of virus MOI and infection timing to balance signal strength and cytotoxicity.
