Name: Badania przesiewowe RNAi pod kątem czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie wirusem krowianki przy użyciu komórek Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-25T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Poznaj metodę przesiewowego badania RNAi w celu identyfikacji czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie wirusem krowianki przy użyciu komórek Drosophila. Technika obejmuje immunofluorescencję i automatyczną analizę obrazu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana grantami z NIAID (R01AI074951, U54AI057168) oraz Penn Genome Frontiers Institute dla SC; z NIH T32HG000046 dla TSM; z NIH T32GM07229 i T32AI007324 dla LRS.

Część 1: RNAi w płytkach 384-dołkowych
<ol>
 <li>Standaryzacja odczynników stosowanych podczas przesiewu jest niezbędna. Testujemy poszczególne partie pożywki Schneidera, płodowej surowicy bydlęcej oraz odczynników barwiących. Następnie rozdzielamy je na alykwoty i używamy tej samej partii przez cały okres przesiewu.</li>
 <li>W przypadku każdego testu najlepiej jest sprawdzić kilka różnych linii komórkowych, aby ustalić, która z nich jest najbardziej odpowiednia dla uzyskanego odczytu biologicznego. My zazwyczaj stosujemy linię S2-DRSC.</li>
 <li>Hodowla Muszka owocówka komórki w 25°C w pełnej pożywce Schneidera.
 <ol class="lalpha">
 <li>pożywka Schneidera</li>
 <li>10% nieaktywnej termicznie FBS</li>
 <li>1X L-glutamina</li>
 <li>1X antybiotyki penicylina/streptomycyna</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Muszka owocówka Komórki są półprzylegające i są pasażowane co cztery dni bez trypsynizacji poprzez odpipetowanie komórek z kolby i rozcieńczenie ich w stosunku 1:10 w nowej kolbie. Do eksperymentów należy wykorzystać komórki w fazie logarytmicznej. </li>
 <li>Zmienność między płytkami oraz z dnia na dzień jest minimalizowana dzięki zastosowaniu automatycznego systemu dozowania cieczy we wszystkich etapach dodawania odczynników do płytek wielodołkowych. Używamy urządzenia WellMate (Matrix). </li>
 <li>Przygotuj dreny WellMate.
 <ol class="lalpha">
 <li>Okapy rozpylające i WellMate przemyć 70% etanolem.</li>
 <li>Wyjąć przewody z opakowania i spryskać 70% etanolem.</li>
 <li>Włóż kasetę z przewodami w pozycję dozującą w urządzeniu WellMate.</li>
 <li>Napełnij przewód 25 ml 70% etanolu w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Sterylizować dreny w etanolu przez 15 minut, a następnie przepłukać kolejnymi 25 ml etanolu.</li>
 <li>Przepłucz dreny, przepuszczając przez nie 50 ml sterylnego PBS.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Odseparuj komórki z kolby i policz je. Odwiruj komórki, aby uzyskać o 25% więcej niż jest wymagane (300xg, 5 min). Liczba komórek wysiewanych do każdego dołka musi zostać zoptymalizowana w zależności od czasu trwania analizy. W przypadku przeprowadzania zautomatyzowanej analizy obrazu, idealna dla segmentacji obrazu jest pojedyncza warstwa komórek bez ich skupiania się.</li>
 <li>Resuspender osad z komórek w bezserykowym medium Schneidera w stężeniu 1,7x106 komórek/ml</li>
 <li>Przesiewanie przeprowadzamy w płytkach 384-dołkowych, w których wcześniej rozdzielono komercyjnie dostępną bibliotekę dsRNA w stężeniu 250 ng/dołek. Kilka dołków w każdej płytce pozostaje pustych w celu dodania kontroli, które nanosi się ręcznie. Jako kontrolę negatywną stosujemy dsRNA przeciwko lucyferazie. Jako kontrolę skutecznego RNAi stosujemy dsRNA przeciwko Thread (dIAP). Wyciszenie tego czynnika antyapoptotycznego prowadzi do gwałtownej śmierci komórek, co stanowi szybką wizualną metodę oceny jakości wyciszenia. Na koniec, jako kontrolę pozytywną, stosujemy dsRNA przeciwko reporterowi wirusowemu (w tym przypadku beta-galaktosemidazie), aby potwierdzić możliwość zahamowania infekcji wirusowej przy użyciu naszego odczytu testowego. W przypadku nanoszenia dsRNA do płytki w momencie wysiewania komórek, rozdzielić 1 μl nanieść dsRNA w róg dołka, aby ułatwić wizualizację, a następnie odwirować dsRNA na dno dołka (300xg, 1 min) przed dodaniem komórek.</li>
 <li>Użyj urządzenia WellMate, aby dodać 10 μL przygotowane powyżej komórki do każdego dołka.</li>
 <li>Osadź komórki na płytkach poprzez wirowanie z prędkością 300 x g przez 1 min.</li>
 <li>Inkubować w 25°C inkubator przez 45 minut.</li>
 <li>Dodaj 20 μL uzupełnić pożywkę Schneidera i wirować z prędkością 300xg przez 1 min.</li>
 <li>Umieść płytki w nawilżonych pojemnikach Tupperware wyłożonych nasączonymi wodą ręcznikami papierowymi. Objętość pojedynczej studzienki w płytce 384-dołkowej jest niewielka, w związku z czym parowanie może znacząco wpłynąć na procesy biologiczne, co z kolei może prowadzić do artefaktów w odczytach z zewnętrznych studzienek. Aby temu zapobiec, płytki należy przechowywać w warunkach wysokiej wilgotności.</li>
 <li>Inkubować przez trzy dni, aby zapewnić skuteczny knockdown. W tym czasie nie ma potrzeby wymiany pożywki ani otwierania pojemników z nawilżaczem.</li>
</ol>
Część 2: Zakażanie wirusem Vaccinia
<ol>
 <li>Sterylizować wielokanałowy aspirator w preparacie Quatricide przez 15 minut, a następnie opłukać w 70% etanolu.</li>
 <li>Przygotować urządzenie WellMate zgodnie z powyższym opisem.</li>
 <li>Przygotować pożywkę Schneidera z 2% FBS do infekcji, rozcieńczając pożywkę kompletną w stosunku 1:5 w pożywce bezsurowiczej.</li>
 <li>Przefiltrować surowy zapas wirusa przez filtr strzykawkowy 0,8 µm w celu usunięcia szczątków komórkowych lub użyć wirusa oczyszczonego.</li>
 <li>Rozcieńczyć wirusa vaccinia w pożywce Schneidera z 2% surowicy, aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) równą 2.</li>
 <li>Usunąć PBS z przewodów WellMate i przepłukać je rozcieńczonym wirusem, aż w przewodach nie będzie pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Używając wysterylizowanego wielokanałowego aspiratora i kolektora próżniowego, delikatnie usunąć pożywkę z płytek z komórkami Drosophila traktowanymi dsRNA.</li>
 <li>Nanieść 30 μL wirusa na studzienkę na płytkach za pomocą urządzenia WellMate.</li>
 <li>Wirować płytki przez 1 minutę przy 300xg.</li>
 <li>Sterylizować przewodów WellMate. Przepłukać je 25 mL 10% roztworu wybielacza, odczekać 10 minut, a następnie przepłukać kolejnymi 25 mL 10% roztworu wybielacza.</li>
 <li>Przepłukać przewodów 50 mL wody, a następnie 50 mL 70% etanolu. Schować przewodów do opakowania.</li>
 <li>Przenieść płytki do nawilżonego pojemnika Tupperware. Inkubować w temperaturze 25°C przez 48 godzin.</li>
</ol>
Część 3: Barwienie płytek
<ol>
 <li>Utrwal płytki w 15 μL 4% formaldehydu/PBS przez 10 minut. Na każdym etapie ciecz jest usuwana za pomocą aspiratora wielokanałowego i kolektora próżniowego. Po utrwaleniu płytek nie jest już wymagane stosowanie sterylnego sprzętu i odczynników.</li>
 <li>Usuń utrwalacz i za pomocą WellMate dodaj 30 μL PBST (PBS + 0,1% Triton-X). Inkubuj przez 10 minut i powtórz czynność. Obsługuj WellMate zgodnie z powyższym opisem, z wyjątkiem tego, że dreny nie muszą być sterylizowane.</li>
 <li>Do wykrywania infekcji vaccinia stosujemy reporter β-galaktozydazy sterowany wczesnym/późnym promotorem vaccinia.</li>
 <li>Usuń ciecz i inkubuj komórki w roztworze blokującym (PBST z 2% BSA) przez 10 minut.</li>
 <li>Rozcieńcz przeciwciało pierwotne w roztworze blokującym, usuń ciecz i dodaj 15 μL przeciwciała do każdej studni za pomocą wielokanałowej pipety wielokrotnej (Matrix).</li>
 <li>Odwiruj płytki (300xg, 1 min), przykryj przezroczystą naklejką i inkubuj w 4°C przez noc.</li>
 <li>Usuń przeciwciało pierwotne i za pomocą WellMate przemyj studnie w PBST 3 razy, po 10 minut każdy raz.</li>
 <li>Rozcieńcz fluorescencyjnie znakowane przeciwciało wtórne (FITC) oraz barwnik jądrowy w roztworze blokującym i dodaj 15 μL do studni za pomocą wielokanałowej pipety wielokrotnej.</li>
 <li>Inkubuj płytki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem.</li>
 <li>Przemyj studnie w PBST 3 razy, po 10 minut każdy raz, używając WellMate.</li>
 <li>Zapieczętuj płytkę przezroczystą naklejką, przykryj i przechowuj w 4°C do trzech tygodni.</li>
</ol>
Część 4: Obrazowanie i analiza obrazu
<ol>
 <li>Do obrazowania płytek należy użyć automatycznego mikroskopu przy powiększeniu 20X.</li>
 <li>Należy wykonać zdjęcia wszystkich jąder komórkowych (DAPI) oraz zainfekowanych komórek (FITC). Czas ekspozycji dla każdego kanału należy zoptymalizować indywidualnie, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny.</li>
 <li>Funkcję automatycznego ostrzenia należy dopracować, wykonując stos obrazów Z (Z stack) w odstępach 1um, obejmujący płaszczyzny powyżej i poniżej przewidywanej płaszczyzny ostrości. Po zlokalizowaniu optymalnej płaszczyzny ostrości należy odpowiednio dostosować ustawienia autofokusa.</li>
 <li>Należy obrazować całą płytkę, wykonując co najmniej trzy zdjęcia na studnię zarówno w kanale Hoechst (DAPI), jak i kanale wirusowym (FITC). Miejsca należy wybierać z kilku różnych obszarów w obrębie jednej studni, aby uzyskać obrazy reprezentatywne dla całej studni.</li>
 <li>Należy użyć oprogramowania MetaXpress do utworzenia dziennika w celu segmentacji obrazu oraz modułów Count Nuclei do obliczenia całkowitej liczby komórek wykazujących pozytywne barwienie jąder (całkowita liczba komórek) oraz infekcji (FITC) dla każdej płytki.</li>
 <li>Należy obliczyć procent infekcji (100*FITC pozytywne/całkowita liczba komórek) i zastosować transformację logarytmiczną.</li>
 <li>W celu identyfikacji kandydatów stosuje się odporny wskaźnik Z (robust Z score) oparty na medianie i rozstępie międzykwartylowym każdej płytki. Metoda ta jest niewrażliwa na wartości odstające i dane niesymetryczne, co zapewnia większą moc w identyfikowaniu nawet słabych lub umiarkowanych trafień 10. Dla każdej płytki od danych poddanych transformacji logarytmicznej odejmuje się medianę. Następnie otrzymane wartości dzieli się przez 0,74 razy rozstęp międzykwartylowy (różnica między wartościami 75th percentyla a 25th percentyla). Współczynnik 0,74 jest stosowany w celu przybliżenia standardowego rozkładu normalnego.</li>
 <li>Odporny wskaźnik Z jest miarą odległości w odchyleniach standardowych od mediany płytki. Na przykład, wartość robust Z-score równa 2 wskazuje, że % infekcji w studni oddalony jest o ok. 2 odchylenia standardowe od mediany płytki lub p&lt;0,05.</li>
 <li>Liczbę komórek należy przeanalizować w celu identyfikacji kandydatów cytotoksycznych. Oblicza się odporny wskaźnik Z dla liczby jąder. Kandydaci z wartością robust Z&lt;-2 w badaniach powtórzonych są uznawani za cytotoksyczne.</li>
 <li>Studnie, w których odporny wskaźnik Z dla procenta infekcji wynosi &gt;2 lub &lt;-2 w badaniach powtórzonych (p&lt;0,0025) przy braku cytotoksyczności, są uznawane za potencjalnych kandydatów z przesiewu pierwotnego.</li>
 <li>Kandydaci pozytywni są walidowani przy użyciu niezależnych odczynników. dsRNA są generowane przeciwko interesującym genom z innego regionu mRNA i testowane w opisany wyżej sposób.</li>
 <li>Geny, dla których dwa niezależne dsRNA wykazują ten sam fenotyp, mogą zostać zakwalifikowane do dalszych badań.</li>
</ol>
Część 5: Reprezentatywne obrazy i interpretacja wskaźników zakażenia
<img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig1.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna: komórki niezakażone vs zakażone vaccinia, analiza wpływu infekcji wirusowej, badanie porównawcze." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. W studzienkach niezinfekowanych nie obserwuje się żadnego barwienia białek wirusa vaccinia, podczas gdy reprezentatywna zainfekowana studzienka zawiera komórki wykazujące pozytywne barwienie na białko beta-galaktozydazy (βgal) ekspresjonowane przez vaccinia, zmierzone za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Wirus = kolor zielony, jądra komórkowe = kolor niebieski.
<img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig2.jpg" alt="Analiza komórkowa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; wykrywanie jąder komórkowych i infekcji vaccinia; wyniki przetwarzania obrazu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Automatyczne oprogramowanie do analizy obrazu ilościowo określa stopień infekcji na każdym obrazie przy użyciu parametrów ustawionych przez użytkownika. Na reprezentatywnym obrazie całkowita liczba jąder komórkowych oraz liczba komórek wykazujących ekspresję antygenu wirusowego są zliczane na podstawie wielkości i intensywności barwienia powyżej lokalnego tła.
<img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig3.jpg" alt="eksperyment z dsRNA; obraz z mikroskopu fluorescencyjnego porównujący wyniki grupy nieleczonej i grupy z wyciszeniem genu thread." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Wyciszenie genu thread (dIAP) służy jako kontrola pozytywna dla skutecznego wyciszenia genów docelowych za pomocą RNAi. Wyciszenie tego czynnika antyapoptotycznego prowadzi do gwałtownej śmierci komórek. Jądra komórkowe=niebieskie.
<img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig4.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna porównująca próbki komórek niepoddane działaniu dsRNA przeciwko tym traktowanym dsRNA przeciwko lucyferazie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4. Wyciszenie ekspresji lucyferazy służy jako kontrola negatywna dla wpływu traktowania dwuniciowym RNA na infekcję. Deplecja lucyferazy nie wpływa na infekcję w porównaniu z komórkami niepoddanymi działaniu dsRNA. Wirus = zielony, jądra komórkowe = niebieskie.
<img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig5.jpg" alt="wyniki eksperymentu dsRNA lucyferaza vs βgal; obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; analiza wyciszania genów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> Rycina 5. Knockdown białka βgal służy jako kontrola pozytywna dla redukcji infekcji, ponieważ w teście poziomy białka βgal są wykorzystywane jako wskaźnik infekcji. Deplecja βgal skutkuje zmniejszeniem odsetka zainfekowanych komórek. Wirus = zielony, jądra = niebieskie.
<img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig6.jpg" alt="Efekty interferencji RNA; obrazy mikroskopowe; dsRNA lucyferazy, Rab5; analiza fluorescencji komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> Rycina 6. Wyciszenie ekspresji czynnika komórkowego Rab5 prowadzi do zmniejszenia odsetka zainfekowanych komórek. Ponieważ wiadomo, że Rab5 uczestniczy w endocytozie, czynnik ten prawdopodobnie przyczynia się do krowianka wnikanie wirusa. Jest to przykład wartości odstającej z przesiewu. Wirus = zielony, jądra komórkowe = niebieskie.

<ol><li>Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+high-throughput+RNAi+screens+in+cultured+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells.</a> Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).</li>
<li>Chotkowski, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus+infection+of+Drosophila+melanogaster+induces+a+protective+RNAi+response%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response.</a> Virology. 377, 197-206 (2008).</li>
<li>Blondel, D., Petitjean, A. M., Dezelee, S., Wyers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+in+Drosophila+melanogaster+cells%3A+regulation+of+viral+transcription+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus in Drosophila melanogaster cells: regulation of viral transcription and replication.</a> J Virol. 62, 277-284 (1988).</li>
<li>Sessions, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+insect+and+human+dengue+virus+host+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of insect and human dengue virus host factors.</a> Nature. 458, 1047-1050 (2009).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+RNAi+screening+in+Drosophila+S2+cells%3A+what+have+we+learned+about+host-pathogen+interactions%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic RNAi screening in Drosophila S2 cells: what have we learned about host-pathogen interactions?</a> Curr Opin Microbiol. 11, 262-270 (2008).</li>
<li>Hao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+RNAi+screen+identifies+host+genes+important+for+influenza+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication.</a> Nature. 454, 890-893 (2008).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPI+activity+coupled+with+fatty+acid+biosynthesis+is+required+for+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">COPI activity coupled with fatty acid biosynthesis is required for viral replication.</a> PLoS Pathog. 2, e102-e102 (2006).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+reveals+a+specific+sensitivity+of+IRES-containing+RNA+viruses+to+host+translation+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen reveals a specific sensitivity of IRES-containing RNA viruses to host translation inhibition.</a> Genes Dev. 19, 445-452 (2005).</li>
<li>Moser, T. S., Jones, R. G., Thompson, C. B., Coyne, C. B., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Kinome+RNAi+Screen+Identified+AMPK+as+Promoting+Poxvirus+Entry+through+the+Control+of+Actin+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A Kinome RNAi Screen Identified AMPK as Promoting Poxvirus Entry through the Control of Actin Dynamics.</a> PLoS Pathog. 6, e1000954-e1000954 (2010).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells%3A+a+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przesiewowe badania RNAi w całym genomie Drosophila stanowią solidną i wydajną metodę badania komórkowych komponentów infekcji wirusowej. Liczne wirusy ssaków infekują komórki Drosophila, co może być wykorzystane do identyfikacji składników wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza oraz białkowych czynników gospodarza niezbędnych do replikacji wirusa, które mogą stanowić nowe cele terapeutyczne. Przed przeprowadzeniem przesiewu test musi zostać starannie zoptymalizowany pod kątem typu komórek, ich liczby oraz poziomu infekcji, a także musi być odpowiednio kontrolowany, z uwzględnieniem zarówno pozytywnych, jak i negatywnych celów wirusowych i komórkowych11. Ważne jest, aby przed rozpoczęciem przesiewu zapewnić wystarczającą separację między kontrolami pozytywnymi a negatywnymi, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny testu. Po przeprowadzeniu przesiewu kandydatów można podzielić na kategorie funkcjonalne, aby ustalić, które mechanizmy gospodarza przyczyniają się do infekcji. W przypadku wirusów ssaków, takich jak vaccinia, w ramach analizy wtórnej należy określić udział homologów ssaków za pomocą RNAi. Razem te solidne metody przesiewowe pozwolą nam uzyskać wgląd w złożone mechanizmy, za pomocą których wirusy oddziałują z komórkami gospodarza.

<table><tbody><tr><td>&lt;silny&gt;Hodowla komórkowa&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;podłoża do hodowli tkanek</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11720</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 100X</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna (pen/strep)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Przesiewy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genomowa biblioteka dsRNA</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>płytki 384-dołkowe, czarne z przezroczystym dnem</td><td>Corning</td><td>3712</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelki aluminiowe</td><td>Corning</td><td>6569</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste uszczelki</td><td>Denville Scientific</td><td>B1212-4</td><td></td></tr><tr><td>Witaj kolego</td><td>Matlab</td><td>201-10001</td><td></td></tr><tr><td>kolektor 24-pinowy</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-101</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała wtórne znakowane fluorescencyjnie</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>zautomatyzowany mikroskop ImageXpressMicro</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie do analizy obrazów MetaXpress</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przesiew rnai w poszukiwaniu czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję wirusem vaccinia z wykorzystaniem komórek drosophila

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Patogeny wirusowe stanowią istotne zagrożenie dla zdrowia publicznego; wirusy nie tylko mogą wywoływać naturalne epidemie chorób ludzkich, ale niepokój budzi również możliwość ich wykorzystania w bioterroryzmie. Lepsze zrozumienie czynników komórkowych wpływających na infekcję ułatwiłoby opracowanie niezwykle potrzebnych środków terapeutycznych. Ostatnie postępy w technologii interferencji RNA (RNAi), w połączeniu z pełnym sekwencjonowaniem genomów kilku organizmów, doprowadziły do optymalizacji szerokozakresowych, komórkowych przesiewów utraty funkcji (loss-of-function screens) w skali całego genomu. Komórki Drosophila są szczególnie podatne na przesiewy w skali genomu ze względu na łatwość i efektywność stosowania RNAi w tym systemie 1. Co ważne, szeroka gama wirusów może infekować komórki Drosophila, w tym szereg wirusów ssaków o znaczeniu medycznym i rolniczym 2,3,4. Poprzednie przesiewy RNAi w Drosophila pozwoliły zidentyfikować czynniki gospodarza niezbędne dla różnych etapów infekcji wirusowej, w tym dla wniknięcia, translacji i replikacji RNA 5. Ponadto wiele czynników komórkowych wymaganych do replikacji wirusowej w hodowlach komórkowych Drosophila jest również ograniczające w komórkach ludzkich zainfekowanych tymi wirusami 4,6,7,8, 9. Dlatego identyfikacja czynników gospodarza wykorzystywanych podczas infekcji wirusowej dostarcza nowych celów dla terapii przeciwwirusowych. Przedstawiamy tutaj uogólniony protokół wysokoprzepustowego przesiewu RNAi w celu identyfikacji czynników komórkowych zaangażowanych w infekcję wirusową, posługując się wirusem vaccinia jako przykładem.

Nowe czynniki gospodarza zaangażowane w infekcje wirusowe można zidentyfikować za pomocą komórkowego przesiewu RNAi w celu utraty funkcji w skali całego genomu. Model hodowli komórkowej Drosophila jest szczególnie podatny na to podejście ze względu na łatwość i wydajność RNAi. W niniejszym materiale prezentujemy tę technikę, posługując się wirusem vaccinia jako przykładem.

Przesiew RNAi w poszukiwaniu czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję wirusem Vaccinia z wykorzystaniem komórek Drosophila

Patogeny wirusowe stanowią istotne zagrożenie dla zdrowia publicznego; wirusy mogą nie tylko wywoływać naturalne epidemie chorób ludzkich, ale ich potencjalne wykorzystanie w ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie wysokoprzepustowego przesiewu RNAi do identyfikacji czynników gospodarza uczestniczących w infekcji wirusowej. Osiąga się to poprzez uprzednie wyciszenie wybranych genów za pomocą RNAi w płytkach 384-dołkowych. Następnie komórki poddawane są ekspozycji na odpowiedni wirus, barwione pod kątem białek wirusowych, a poziom infekcji wirusowej jest mierzony za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.Na koniec przeprowadza się zautomatyzowaną analizę obrazu w celu zidentyfikowania genów kandydatów do walidacji i dalszych badań. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące zmiany w przebiegu infekcji poprzez ilościowe określenie procentowego udziału zainfekowanych komórek z wykorzystaniem mikroskopii immunofluorescencyjnej. Pozwala to na odkrycie nowych czynników komórkowych zaangażowanych w infekcję wirusową.Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat oddziaływań między wirusem a gospodarzem, można ją również zastosować do badania każdego układu, w którym pomocny byłby wizualny odczyt interesującego procesu komórkowego. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą powinny spodziewać się trudności w początkowym etapie nauki, ponieważ uzyskanie powtarzalnych infekcji przy jednoczesnym minimalizowaniu zmienności wymaga znacznej optymalizacji. Aby zapewnić powtarzalność wyników, niezbędne jest stosowanie odczynników z jednej serii dla każdego z nich w całym przebiegu przesiewu. Hodować komórki drosofili S 2D RSC w medium Schneidera z dodatkiem Complete Medium w temperaturze 25 °C; komórki powinny znajdować się w fazie logarytmicznej.W przypadku eksperymentów przeprowadzanych w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy oddzielić półprzyległe komórki z kolby poprzez intensywne pipetowanie. Po odliczeniu komórek za pomocą komory licznej (hemocytometru), przenieść 125% komórek wymaganych do eksperymentu do 50 mililitrowej probówki stożkowej i odwirować przy 300 G przez pięć minut. Odessać nadsącz i resuspendować osad w bezserowym medium Schneidera do końcowego stężenia 1,7 × 10⁶ komórek na mililitr.Należy użyć wysterylizowanego i przygotowanego zautomatyzowanego systemu do obsługi cieczy. W tym przypadku zastosowano matrycę dopasowaną do studni, aby zminimalizować zmienność między płytkami. Do każdej studni płytki 384-dołkowej, uprzednio pokrytej 250 nanogramami na studnię dwuniciowego RNA, należy dodać 10 µL zawiesiny komórek. Komórki należy odwirować na płytkach przy 300 G przez jedną minutę.Inkubować płytki w temperaturze 25 °C przez 45 minut. Do każdego dołka dodać 20 µL kompletnego medium Schneidera. Wirować medium w dołkach z prędkością 300 G przez jedną minutę, aby zminimalizować skutki parowania.Przechowywać płytki oraz nawilżone, szczelnie zamknięte pojemniki wyłożone ręcznikami papierowymi nasączonymi wodą. Inkubować w temperaturze 25 °C przez trzy dni w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy BSL 2, aby uzyskać silny efekt knockdownu. Przed zakażeniem komórek przefiltrować surowy zapas wirusa vaccinia przez filtr strzykawkowy o rozmiarze porów 0,8 µm.Aby usunąć szczątki komórkowe. Rozcieńczyć wirusa w medium Schneidera z 2% serum, aby uzyskać wielokrotność zakażenia (ang. multiplicity of infection, w skrócie MOI) równą 2.Zesterylizowaną studzienkę napełnia się rozcieńczonym wirusem, aż w rurkach nie będzie pęcherzyków powietrza. Używając wysterylizowanego wielokanałowego aspiratora z kolektorem próżniowym, delikatnie usuwa się medium z płytek z komórkami drosofilid traktowanymi dwuniciowym RNA. Do każdej płytki dozuje się 30 µL rozcieńczonego wirusa.Następnie odwiruj płytki przy 300 G przez jedną minutę. Przełóż płytki z powrotem do nawilżonego pojemnika i inkubuj w temperaturze 25 °C przez 48 godzin. W komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL 2 odessij pożywkę z płytki.Następnie za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 15 µL utrwalacza z 4% formaldehydem do każdej płytki. Inkubuj studni przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usuń ciecz za pomocą aspiratora wielokanałowego.Za pomocą WELLMADE dodaj 30 µL PBST do każdego dołka. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. W ten sam sposób przeprowadź drugie 10-minutowe przemywanie PBST.Usunięcie cieczy po bloku inkubacyjnym i dodanie 30 µL PBST z 2% roztworem blokującym VSA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Za pomocą wielokanałowego pipetowca powtarzalnego dodać 15 µL przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym do każdej próbki.Odwiruj płytki z dołkami przy 300 G przez jedną minutę. Uszczelnij każdą płytkę przezroczystą folią uszczelniającą i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Użyj urządzenia WellMate oraz aspiratora wielokanałowego, aby trzykrotnie przemyć komórki w PBST, przez 10 minut podczas każdego przemywania.Za pomocą pipety wielokanałowej nanieść 15 µL znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała wtórnego z barwnikiem jądrowym do każdej studni. Przykryć płytki folią aluminiową, aby chronić je przed światłem, i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Przemyć komórki roztworem PBST trzykrotnie, analogicznie jak poprzednio, przez 10 minut podczas każdego przemycia.Do komórek należy dodać 30 µL PBST, a następnie uszczelnić je przezroczystą folią samoprzylepną. Całość należy przykryć folią aluminiową. Uszczelnione płytki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do trzech tygodni przed wykonaniem obrazowania na mikroskopie automatycznym.Studzienki niezinfekowane nie wykazują żadnego barwienia na białka wirusa vaccinia, natomiast reprezentatywna studzienka zinfekowana zawiera komórki wykazujące pozytywne barwienie na ekspresyjne białka beta GCSE wirusa vaccinia, co zmierzono za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Oprogramowanie do zautomatyzowanej analizy obrazu kwantyfikuje stopień infekcji na każdym obrazie, korzystając z parametrów ustawionych przez użytkownika.Na reprezentatywnym obrazie oblicza się całkowitą liczbę jąder komórkowych oraz liczbę komórek wykazujących ekspresję antygenu wirusowego, opierając się na wielkości i intensywności barwienia powyżej lokalnego tła. Wyciszenie ekspresji białka thread służy jako kontrola pozytywna dla skutecznej deplecji genów docelowych za pomocą RNAi. Knockdown tego czynnika antyapoptotycznego prowadzi do gwałtownej śmierci komórek.Wyciszenie lucyferazy służy jako kontrola negatywna dla wpływu traktowania dwuniciowym RNA na infekcję. Deplecja lucyferazy nie wpływa na infekcję w porównaniu z komórkami niepoddanymi traktowaniu. Wyciszenie białka beta-galaktozy służy jako kontrola pozytywna dla redukcji infekcji.Ponieważ w teście poziom białka beta-galaktozoorydazy służy jako wskaźnik infekcji, wyczerpanie beta-galaktozoorydazy prowadzi do spadku procentowej liczby zainfekowanych komórek. Wyciszenie czynnika komórkowego RAB5 powoduje zmniejszenie odsetka zainfekowanych komórek. Ponieważ wiadomo, że RAB5 uczestniczy w endocytozie, czynnik ten prawdopodobnie przyczynia się do wnikania wirusa vaccinia.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykorzystać przesiewy RNAi u drosophila do identyfikacji czynników gospodarza przyczyniających się do infekcji wirusowej, w tym przeprowadzać RNAi, zakażać wirusem vaccinia, wykonywać barwienie i obrazowanie oraz analizować płytki 384-dołkowe. Należy pamiętać, że praca z wirusem DIA może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie fartuchów laboratoryjnych i okularów ochronnych. Żywy wirus powinien być otwierany wyłącznie w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy BSL 2, a wszystkie materiały mające kontakt z żywym wirusem powinny zostać wysterylizowane w 10% roztworze wybielacza przed utylizacją.

rnai-screening-for-host-factors-involved-vaccinia-virus-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Badanie RNAi czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję wirusem Vaccinia przy użyciu komórek Drosophila

Wykazano, że interferencja RNA jest bardzo skuteczną metodą analizy funkcji genów w rozwoju tchawki Drosophila. Przedstawiono szczegółowy protokół stosowany w laboratorium Jiang do wstrzykiwania dsRNA do embrionów muchy w celu wyciszenia ekspresji genów. Technika ta daje możliwość przesiewania genów niezbędnych do rozwoju tkanek i narządów u Drosophila.

Interferencja RNAi poprzez wstrzykiwanie dsRNA do embrionów Drosophila

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Prezentujemy sposób wykorzystania techniki karmienia RNAi do wyciszania genów docelowych oraz oceny fenotypu wielkości ciała u C. elegans. Metoda ta może zostać zastosowana w szeroko zakrojonych badaniach przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnych, interesujących komponentów genetycznych, takich jak te zaangażowane w regulację wielkości ciała poprzez sygnalizację DBL-1/TGF-β.

Wykorzystanie strategii karmienia w celu indukowania interferencji RNA do przesiewowej analizy genów zaangażowanych w regulację wielkości ciała u nicienia C. elegans

W tym filmie opisujemy procedurę polegającą na wykonaniu nano-iniekcji jednoniciowego wirusa RNA o pozytywnym sensie do dorosłego samca muszki Drosophila, a następnie badaniu odpowiedzi przeciwwirusowych zainicjowanych w wyniku infekcji. Analiza reakcji łańcuchowej polimerazy identyfikuje regulację w górę określonych genów u zakażonych muszek, które wskazują na aktywację szlaków odpowiedzi immunologicznej, w tym interferencji RNA i sygnalizacji JAK/STAT.

Nanoiniekcja wirusa do klatki piersiowej w celu zbadania interakcji gospodarz-wirus u dorosłych much

Celem tej publikacji jest wizualizacja i dyskusja na temat etapów działania protokołu Enhanced Northern Blot na RNA ekstrahowanym z zarodków, komórek i tkanek Drosophila melanogaster. Protokół ten jest szczególnie przydatny do skutecznego wykrywania małych gatunków RNA.

Ulepszone wykrywanie małych gatunków RNA w Northern Blot u Drosophila melanogaster

Tutaj opisujemy protokół do wykorzystania wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi w celu odkrycia celów gospodarza, które mogą być manipulowane w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi, w szczególności terapii wirusem rabodu i krowianki, ale można go łatwo dostosować do innych platform wirusów onkolitycznych lub do odkrywania genów gospodarza, które ogólnie modulują replikację wirusa.

Badania przesiewowe RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza, które modulują terapię wirusem onkolitycznym

Ta metoda pokazuje, jak wizualizować inwazję patogenów na komórki owadów za pomocą trójwymiarowych (3D) modeli. Hemocyty larw Drosophila były zakażone patogenami wirusowymi lub bakteryjnymi, zarówno ex vivo, jak i in vivo. Zainfekowane hemocyty zostały następnie utrwalone i wybarwione w celu obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego, a następnie rekonstrukcji komórkowej 3D.

Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do infekcji mikrobiologicznej i analizy

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Ten protokół opisuje, jak ustalić infekcję wirusową in vivo u Drosophila melanogaster przy użyciu metody nanoiniekcji i podstawowych technik analizy interakcji wirus-gospodarz.

Ustalenie infekcji wirusowej i analiza interakcji gospodarz-wirus u Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje test fagocytozy in vivo u dorosłych Drosophila melanogaster w celu ilościowego określenia rozpoznawania fagocytów i usuwania infekcji mikrobiologicznych.

Ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej muszki owocowej, Drosophila melanogaster, przy użyciu testu fagocytozy in vivo

Prezentujemy protokół wykorzystujący zaawansowane podejście genetyczne do badań przesiewowych w kierunku mutantów wykazujących neurodegenerację u Drosophila melanogaster. Obejmuje on test wspinaczkowy, analizę histologiczną, mapowanie genów i sekwencjonowanie DNA, aby ostatecznie zidentyfikować nowe geny związane z procesem neuroprotekcji.

Genetyczne badania przesiewowe in vivo w celu identyfikacji nowych genów neuroprotekcyjnych u Drosophila melanogaster

Poznaj metodę przesiewowego badania RNAi w celu identyfikacji czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie wirusem krowianki przy użyciu komórek Drosophila. Technika obejmuje immunofluorescencję i automatyczną analizę obrazu.

Badania przesiewowe RNAi pod kątem czynników gospodarza zaangażowanych w zakażenie wirusem krowianki przy użyciu komórek Drosophila (Wideo) | JoVE Journal

Przesiew RNAi w poszukiwaniu czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję wirusem Vaccinia z wykorzystaniem komórek Drosophila

Przeglądaj więcej filmów