Name: Kinematyka i wyznaczanie siły reakcji gruntu: demonstracja określająca ilościowo zdolności lokomotoryczne młodych dorosłych, szczurów w średnim wieku i geriatrycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-22T17:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj metodę pomiaru sił reakcji gruntu i kinematycznej analizy kończyn tylnych u szczurów. Technika ta dostarcza obiektywnych, ilościowych danych do oceny zdolności lokomotorycznych w modelach chorób neurologicznych i ortopedycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te zostały wsparte grantem Discovery przyznanym AAW przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada.

1. Wymagania wstępne do biomechanicznych analiz lokomocji
Przed zakupem kosztownego sprzętu do analizy lokomocji oraz planowaniem eksperymentów, w których przeprowadzana będzie ocena kinematyczna i/lub kinetyczna lokomocji, niezbędne jest, aby badacz zapoznał się z technicznymi i praktycznymi aspektami analiz biomechanicznych, zachowań sensoromotorycznych, warunkowania instrumentalnego zwierząt oraz obsługi, przechowywania i zarządzania dużymi ilościami zdigitalizowanych danych. Chociaż wymagania te wydają się wielu osobom oczywiste, dopiero po rozpoczęciu tego typu eksperymentów stażyści uświadamiają sobie techniczne i praktyczne trudności związane z przeprowadzaniem stosunkowo szczegółowej analizy lokomocji. Autorzy zalecają, aby badacze zapisali się na kurs z podstaw biomechaniki, zaznajomili się z językiem programowania wymaganym do zarządzania danymi lub zatrudnili osobę posiadającą taką wiedzę, a co równie ważne, poświęcili znaczną ilość czasu na interakcję, obsługę i pracę ze zwierzętami laboratoryjnymi. W celu zrozumienia analizy lokomocji oraz sensoromotorycznej analizy behawioralnej w naukach o układzie nerwowym, badaczy odsyła się do kilku ważnych pozycji literaturowych (patrz 1, 4-7).
2. Aparatura do badań kinematycznych i kinetycznych
Aparat do badań kinematycznych i kinetycznych, przydatny do gromadzenia danych obustronnych, składa się z następujących komponentów (szczegóły znajdują się w „Tabeli specyficznych odczynników i sprzętu”):
<ul>
	<li>Ciche pomieszczenie o odpowiedniej wielkości (niekoniecznie wygłuszone, lecz zlokalizowane w miejscu o niskim natężeniu ruchu)</li>
	<li>Radio do generowania „szumu” w tle, aby ograniczyć rozpraszające hałasy docierające do zwierząt z zewnątrz pomieszczenia</li>
	<li>Przezroczysty, zamknięty tor z pleksiglasu o płaskiej powierzchni (180 cm długości X 20 cm szerokości X 60 cm wysokości) z kwadratowym otworem (11 cm X 11 cm) umieszczonym w centrum toru, w równej odległości od obu końców</li>
	<li>Kawałek pleksiglasu (10,5 cm X 10,5 cm)</li>
	<li>Dwustronna taśma klejąca</li>
	<li>Odblaskowa taśma klejąca 3M do markerów skórnych</li>
	<li>Dziurkacz do tworzenia markerów skórnych</li>
	<li>Aparat do anestezji izofluranem, niezbędny do znieczulenia zwierząt w celu ich ogolenia przed umieszczeniem markerów skórnych</li>
	<li>Płatki Cheerios w celu zachęcenia zwierzęcia do poruszania się wzdłuż toru</li>
	<li>Platforma siłomierzowa AMTI HE6X6</li>
	<li>Dostosowany system Vicon Motus (oprogramowanie, komputer itp.)</li>
	<li>4 kamery wideo (częstotliwość próbkowania co najmniej 60 Hz) oraz statywy z odpowiednimi kablami połączeniowymi</li>
	<li>4 lampy halogenowe montowane na kamerach, zapewniające optymalne oświetlenie badanego zwierzęcia oraz odblaskowych markerów skórnych</li>
	<li>Ramka lub objętość kalibracyjna o odpowiednim rozmiarze, niezbędna do kalibracji pozycji x, y, z w systemie Vicon Motus na rzeczywiste miary odległości</li>
</ul>
3. Trenowanie zwierząt
Przed rozpoczęciem gromadzenia danych każde zwierzę musi zostać przeszkolone do pokonywania zamkniętego toru o płaskiej powierzchni. Po otrzymaniu szczurów od odpowiedniego dostawcy zwierząt, należy poddać je aklimatyzacji w nowym miejscu przez 1 tydzień. W czasie aklimatyzacji do klatki szczura codziennie wkłada się kilka płatków Cheerios. Zwierzęta poddawane są ograniczeniu podaży pokarmu do poziomu zapotrzebowania energetycznego na utrzymanie, aby zapobiec otyłości i zapewnić motywację do wykonania zadania. Następnie przez 1 tydzień eksperymentator codziennie obchodzi się z każdym zwierzęciem przez 10-15 minut. W tym samym okresie każde zwierzę jest umieszczane w torze, w którego obu końcach znajdują się płatki Cheerios. Gdy zwierzę oswoi się z otoczeniem, zacznie jeść płatki. Kiedy zwierzę poczuje się swobodnie i zacznie jeść płatki w torze, eksperymentator musi przeprowadzić warunkowanie instrumentalne zwierzęcia, aby przebiegło ono całą długość toru w zamian za nagrodę pokarmową. Osiąga się to poprzez rzucanie ¼ płatka Cheerios na przeciwległy koniec toru względem pozycji szczura. Gdy szczur zje ten płatek, kolejny ¼ płatka Cheerios jest umieszczany na drugim końcu toru. Procedurę tę powtarza się codziennie przez 15-20 minut, aż szczur będzie konsekwentnie (>90% rzutów) poruszał się wzdłuż toru ze stałą prędkością (tj. bez zatrzymywania się, startowania, eksplorowania lub zmiany chodu), aby zjeść płatek, bez galopowania/skakania. Szczur powinien poruszać się wyłącznie kłusem. Nadmierne warunkowanie zwierząt do tego zadania może prowadzić do galopowania i skakania; chody te wskazują na prędkość przemieszczania się >90 cm/s. Chody skaczące i galopujące są z biomechanicznego punktu widzenia trudniejsze do interpretacji z wielu powodów (np. kryteria włączenia wiodącej kończyny itp.). W naszym doświadczeniu, gdy szczury zaczną konsekwentnie stosować galop lub skakanie, trudno jest, jeśli nie wręcz niemożliwe, skłonić je do poruszania się kłusem podczas lokomocji w torze. Prędkości >90 cm/s są rzadko obserwowane u zwierząt po urazie obwodowego lub ośrodkowego układu nerwowego. Czas potrzebny do pomyślnego ukończenia treningu jest zmienny w zależności od szczepu i płci szczurów. Szczepy Wistar, Lewis, Long-Evans i Sprague-Dawley są w stanie konsekwentnie pokonywać tor w ciągu 2 tygodni od rozpoczęcia treningu 8. W naszym doświadczeniu szczury Fischer (F-344) potrzebują zazwyczaj od 4 do 6 tygodni na opanowanie tego zadania 8.
4. Zaznaczanie pozycji stawów
Analiza kinematyczna kończyn przednich jest niewiarygodna ze względu na artefakt ruchu skóry wywołany umieszczeniem markerów skórnych na kończynach przednich, co jest szczególnie widoczne u gatunków o przykuczonej postawie, takich jak szczury 9. Zamiast tego, kinematykę kończyn przednich należy badać za pomocą kinematografii rentgenowskiej lub fluoroskopii 10-13. W związku z tym, w niniejszym opracowaniu opisano jedynie rozmieszczenie markerów pozycji stawów kończyn tylnych.
Przed rozpoczęciem gromadzenia danych każda szczur musi zostać znieczulona co najmniej 24 godziny wcześniej przy użyciu odpowiedniego środka znieczulającego do podania drogą wziewną (np. izofluran, 1,5-2% ustawione na precyzyjnym waporyzatorze), podawanego w tlenie przez maskę twarzową, a następnie należy zaznaczyć kluczowe anatomiczne punkty orientacyjne. Ze względu na krótki czas trwania procedury oraz fakt, że nie stosuje się długo działających środków znieczulających, nie ma konieczności używania urządzenia do ogrzewania zwierząt w celu utrzymania temperatury ciała zwierzęcia. Po znieczuleniu zwierzęcia zgala się kończyny tylne oraz grzbiet do poziomu grzebieni biodrowych. Następnie zwierzę umieszcza się w pozycji brzusznej, a jego kończyny tylne ustawia się w przybliżonej pozycji stojącej, wykorzystując sztywną piankę stabilizującą do podparcia. Skórę nad najbardziej kranialnymi częściami grzebieni biodrowych, krętarzem większym kości udowej, boczną guzą piszczelową, stawem skokowym oraz dystalnym i bocznym aspektem 5th kości śródstopia zaznacza się nietoksycznym markerem permanentnym. Zwierzę zostaje wybudzone z narkozy. W przypadku badań czasowych może być wymagane okresowe znieczulanie w celu ponownego ogolenia kończyn tylnych, co umożliwi późniejsze rozmieszczenie markerów refleksyjnych (patrz poniżej). Ponadto wymagane będzie codzienne odświeżanie wcześniej zaznaczonych punktów orientacyjnych (przy użyciu tego samego nietoksycznego markera), ponieważ szczury będą powoli usuwać oznaczenia w wyniku naturalnych zachowań pielęgnacyjnych.
5. Rejestracja danych
Wszystkie widoki kamer są sprawdzane w celu upewnienia się, że ich położenie jest odpowiednie i rejestrują one to samo pole widzenia. Każda kamera powinna być ustawiona pod kątem około 60-80 stopni względem siebie. Pole widzenia powinno obejmować płytę dynamometryczną w centrum oraz odcinek bieżni wystarczający do zarejestrowania dwóch kroków.
Objętość kalibracyjną umieszcza się w określonym obszarze toru. Z każdej z kamer rejestruje się pojedynczą klatkę obrazu objętości kalibracyjnej w obrębie toru. Wszystkie znaki kalibracyjne wzdłuż długości każdego z prętów zostają zdigitalizowane. Dopiero po osiągnięciu satysfakcjonującego poziomu błędu digitalizacji eksperymentator może przystąpić do gromadzenia danych lokomotorycznych. Ten etap kalibracji jest krytyczny przed rozpoczęciem zbierania danych. Jeśli kalibracja nie zostanie przeprowadzona dokładnie lub jeśli nie zostanie wykonana bezpośrednio przed sesją nagraniową, wszystkie uzyskane dane będą niedokładne i bezużyteczne. Co ważne, jeśli którakolwiek z kamer zostanie dotknięta lub przesunięta, należy przyjąć, że kalibracja systemu musi zostać powtórzona.
Bezpośrednio przed umieszczeniem zwierzęcia w torze należy zapisać jego masę ciała i przykleić wcześniej przygotowane stożkowe markery odblaskowe (z taśmy odblaskowej 3M, patrz tabela) do wyznaczonych wcześniej punktów na punktach topograficznych kończyn tylnych. Zapisanie masy ciała zwierzęcia pozwoli na retrospektywną normalizację sił reakcji podłoża do masy ciała, co jest istotnym aspektem w przypadku chęci przeprowadzenia porównań między grupami. Dodatkowo pomiar masy ciała ułatwia monitorowanie ogólnego stanu zdrowia zwierzęcia przez cały czas trwania eksperymentu. Umieszczenie markerów wymaga jedynie odpowiedniego obchodzenia się ze zwierzęciem i nie wymaga jego znieczulenia. Jeśli klej na taśmie odblaskowej jest niewystarczający, aby przylgnęła ona do skóry zwierzęcia, można użyć bardzo małej ilości nietoksycznego kleju (np. 3M VetBond Tissue Adhesive), aby ułatwić przyleganie markera do ciała zwierzęcia. Po umieszczeniu markerów na kończynach tylnych eksperymentator powinien wygodnie usiąść przy klawiaturze komputera i trzymać w ręku marker zdarzeń podłączony do systemu Vicon Motus. Wykorzystując plik kalibracyjny jako szablon, przed rozpoczęciem rejestracji należy przygotować kilka plików. Zazwyczaj konieczne jest zapisanie od 25 do 30 plików. Każdy plik powinien mieć unikalną nazwę. Każdy plik będzie reprezentował jedno zarejestrowane przebiegnięcie zwierzęcia. Wymagane jest 25 do 30 plików, aby zapewnić zgromadzenie wystarczającej liczby przebiegnięć spełniających kryterium włączenia dotyczące prędkości (tj. 60-90 cm/s). Po utworzeniu odpowiedniej liczby plików eksperymentator może rozpocząć zbieranie danych. Eksperymentator musi zachęcić szczura do przemieszczania się wzdłuż toru, rzucając ćwiartki płatków Cheerios na oba końce toru. Przy starannej koordynacji i wyczuciu czasu, marker zdarzeń jest aktywowany w momencie rozpoczęcia i tuż przed zakończeniem udanego przejścia szczura przez tor. Po zbadaniu surowego zapisu siły reakcji podłoża i odnotowaniu, czy płyta siłową uderzyły kończyny lewe czy prawe, plik jest zapisywany i zamykany. Należy zarejestrować taką samą liczbę uderzeń w płytę siłową kończynami lewymi i prawymi. Proces rejestrowania danych z danego przebiegnięcia jest powtarzany, aż zostanie zarejestrowana wystarczająca liczba przebiegnięć.
6. Analiza danych
Po zakończeniu zbierania danych dotyczących kinematyki i sił reakcji podłoża, każde podejście każdego zwierzęcia musi zostać ocenione pod kątem prędkości. Wykorzystując dwa stosunkowo stałe markery (np. skrzydła kości biodrowej), można ocenić wirtualny punkt znajdujący się pomiędzy markerami (konfiguracja ta jest wykonywana wcześniej podczas tworzenia szablonu pliku Vicon Motus). Przed obliczeniem prędkości tego „wirtualnego” punktu należy zdigitalizować markery kości biodrowej. Przy użyciu oprogramowania Vicon Motus obliczana jest prędkość tego wirtualnego punktu w kierunku X (poziomy kierunek ruchu). W ten sposób do końcowych analiz wykorzystuje się wyłącznie podejścia mieszczące się w określonym zakresie prędkości (ustalonym a priori). Stwierdzono, że zwierzęta poruszające się z prędkością 60-90 cm/s stosują spójny chód kłusem. Wymagane jest minimum 10 podejść (5 podejść, w których lewa kończyna styka się z platformą sił, oraz 5 podejść, w których prawa kończyna styka się z platformą sił). Po zidentyfikowaniu dopuszczalnych podejść dla każdego zwierzęcia należy zakończyć digitalizację pozostałych markerów skórnych.
Aby skompensować artefakty wynikające z ruchu skóry nad kolanem, pozycję kolana oblicza się metodą triangulacji (przecięcie dwóch okręgów w kinetyce 2D lub przecięcie dwóch sfer w kinetyce 3D), zgodnie z wcześniejszymi opisami. Można teraz wyznaczyć kąty, prędkości i przyspieszenia w stawach biodrowych, kolanowych i skokowych. Można również ocenić czasy fazy podparcia i wymachu, choć ich dokładność jest ograniczona przez częstotliwość próbkowania stosowanych kamer. Te oraz inne obliczenia można wykonać bezpośrednio (tj. bez eksportu) przy użyciu oprogramowania Vicon Motus KineCalc lub wyeksportować dane w formacie ASCII i przeanalizować je za pomocą dostosowanych procedur w programach takich jak MatLab.
Dane dotyczące siły reakcji podłoża są mierzone i wzmacniane przez platformę dynamometryczną AMTI, a następnie gromadzone z częstotliwością 1200 Hz za pomocą systemu Vicon Motus. W związku z tym, po zebraniu danych o sile reakcji podłoża, przy użyciu oprogramowania Vicon Motus do danych stosowany jest odpowiedni filtr cyfrowy. Ponieważ badacz określił już prędkość poruszania się i zidentyfikował poprawne próby po digitalizacji odpowiednich markerów skórnych, dane o sile reakcji podłoża, zebrane jednocześnie z danymi kinematycznymi, mogą być analizowane bezpośrednio w module Vicon Motus KineCalc lub pośrednio przy użyciu innego, dostosowanego oprogramowania. Można obliczyć szereg zmiennych dla sił w każdym z trzech kierunków ortogonalnych. Zmienne te obejmują m.in. siłę szczytową oraz pole pod krzywą (tj. impuls). Co ważne, badacz musi oddzielić dane dla kończyn prawej i lewej dla każdej próby każdego zwierzęcia. Dane pozyskane z kończyn prawych lub lewych są uśredniane dla każdego zwierzęcia i traktowane jako dane reprezentatywne dla danego osobnika. Następnie dane są analizowane z wykorzystaniem odpowiednich procedur statystycznych.
7. Reprezentatywne wyniki
Aby przedstawić użyteczność tej formy analizy lokomocji, wyznaczono kinematykę oraz siły reakcji podłoża dla młodych, dorosłych i geriatrycznych samic szczurów Wistar. Na podstawie tej analizy stwierdzono różnice związane z wiekiem u samic szczurów Wistar. W szczególności analiza siły reakcji podłoża wykazuje, że szczury geriatryczne mają ograniczoną zdolność hamowania kończynami przednimi i wykazują tendencję do częstszego wykorzystywania kończyn tylnych do stabilizacji bocznej w porównaniu z pozostałymi grupami zwierząt (Rycina 1). Analiza kinematyczna nie ujawniła istotnych statystycznie różnic między poszczególnymi grupami, choć wykazała, że dane kinematyczne można bez problemu rejestrować u szczurów w niemal każdym wieku (Rycina 2).
<img src="/files/ftp_upload/2138/2138fig1tmb.jpg" alt="Wykresy analizy chodu porównujące ruch kończyn u zwierząt młodych, w średnim wieku i starych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Zapis siły reakcji podłoża pobrany z lewych kończyn młodych (4 miesiące; n=7), w średnim wieku (13-14 miesięcy; n=7) i geriatrycznych (24 miesiące; n=5) samic szczurów Wistar. Wyniki dla prawych kończyn były podobne. Wyraźnie widać, że szczury geriatryczne rzadziej wykorzystują kończyny przednie do hamowania (* = p&lt;0.05) w porównaniu do szczurów młodych i w średnim wieku, a szczury geriatryczne mają tendencję do częstszego wykorzystywania kończyn tylnych do stabilizacji bocznej w porównaniu do szczurów młodych (**). Linie ciągłe reprezentują średnią, linie kropkowane reprezentują średnią + SE; linie przerywane reprezentują średnią - SE.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2138/2138fig1.jpg">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększony rysunek.</a>
<img src="/files/ftp_upload/2138/2138fig2tmb.jpg" alt="Analiza chodu w zależności od wieku; wykresy odległości 3D vs odchylenie; porównanie danych między grupami wiekowymi." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Kinematyczne modele szkieletowe (stick figures) lewej kończyny szczurów młodych, w średnim wieku i geriatrycznych. Modele szkieletowe reprezentują średni ruch lewej kończyny dla każdej z grup. Nie stwierdzono istotnych różnic między grupami zwierząt w zakresie kąta w stawie podczas cyklu kroku.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2138/2138fig2.jpg">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną rycinę.</a>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Niniejsza praca przedstawia metodologię oceny lokomocji z wykorzystaniem ciągłej kinematyki ilościowej oraz wyznaczania siły reakcji podłoża. Osoby zainteresowane wdrożeniem tej metodologii powinny posiadać solidną wiedzę z zakresu biomechaniki lokomocji, sensoromotoryki zwierząt oraz zarządzania i przetwarzania danych. Chociaż wyznaczanie parametrów kinematycznych i siły reakcji podłoża wymaga więcej czasu i specjalistycznej wiedzy w porównaniu z niektórymi innymi formami analizy lokomocji (np. pomiarami punktowymi, porządkowymi skalami ocen), uzyskane dane są czułe, obiektywne i ilościowe dla różnych ortopedycznych14-22 oraz neurologicznych1-3, 23-32 modeli chorób u wielu gatunków.
Przedstawiliśmy dane opisujące różnice w lokomocji u szczurów tej samej linii w różnym wieku – informacje, których nie można by uzyskać za pomocą prostszych i mniej czułych pomiarów. Ponadto analiza kinematyczna i kinetyczna lokomocji była wykorzystywana do opisu zaburzeń ruchowych w wielu schorzeniach układu nerwowego, w których inne formy oceny okazałyby się nieskuteczne.8, 23-25, 27 Stosowanie czułych metod pomiarowych staje się szczególnie istotne przy ocenie potencjalnych środków terapeutycznych w różnych modelach chorób. Jeśli test nie jest wystarczająco czuły, aby wykryć efekt potencjalnego leku, badacz ryzykuje popełnienie błędu statystycznego drugiego rodzaju (tj. wyciągnięcie wniosku o braku efektu leczenia, podczas gdy w rzeczywistości efekt ten wystąpił). Co więcej, w przypadku pomiarów końcowych oraz bardziej subiektywnych testów oceniających lokomocję, istnieje ryzyko wystąpienia błędu systematycznego. Ocena kinematyczna i kinetyczna jest całkowicie obiektywna w tym sensie, że przy założeniu wcześniejszego ustalenia odpowiednich kryteriów włączenia/wykluczenia a priori, badacz po prostu gromadzi, analizuje i stosuje odpowiednie statystyki do danych (tj. proces wyznaczania danych nie posiada komponentu subiektywnego).
Analiza kinematyczna i kinetyczna umożliwia również zastosowanie tych metod u wielu gatunków zwierząt. W rzeczywistości kinematyka, wyznaczanie siły reakcji podłoża lub obie te metody były stosowane u różnych gatunków, takich jak słonie33-35, bydło36, konie37-40, psy4, 41-45, koty21, 46-49, różne gryzonie3, 8, 50, 51, ptaki4, 52-55 oraz ryby56, 57 (lista ta w żadnym razie nie jest wyczerpująca). Jednak w doświadczeniu autorów wykorzystanie myszy jest problematyczne, ponieważ trudno jest je poddać warunkowaniu instrumentalnemu w celu poruszania się wzdłuż bieżni. Z tego powodu myszy nie poruszają się z relatywnie stałą prędkością, lecz zamiast tego przyspieszają i zwalniają podczas pokonywania bieżni. Zachowanie to można prawdopodobnie częściowo obejść, przeprowadzając myszy na bieżni mechanicznej i nagrywając wideo przemieszczającego się zwierzęcia.58 Gdyby aparat eksperymentalny do wyznaczania siły reakcji podłoża został zmodyfikowany do użytku z bieżnią mechaniczną, prawdopodobnie łatwo byłoby uzyskać jedynie pionową siłę reakcji podłoża, ponieważ pas bieżni zakłócałby wyznaczanie siły w kierunku przód-tył oraz boczno-przyśrodkowym.
Podsumowując, analiza kinematyczna i kinetyczna lokomocji jest niezawodną, czułą i obiektywną metodą, którą można zastosować w różnych modelach schorzeń ortopedycznych i neurologicznych. Co więcej, cały sprzęt stał się dostępny do użytku u gryzoni, co eliminuje wszelkie powiązane z tym powody, by nie przeprowadzać tej formy analizy behawioralnej sensoryczno-motorycznej.

<table><tbody><tr><td>Miniaturowa platforma siłowa o niskim zakresie pomiarowym</td><td>AMTI</td><td>HE6X6</td><td>http://amti.biz/PDFDownloads/0908HE6x6.pdf</td></tr><tr><td>Vicon Motus</td><td>Vicon</td><td>oprogramowanie Vicon Motus</td><td>http://www.vicon.com/applications/animal.html&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Platformę siłową można nabyć jako zintegrowany pakiet wraz z systemem Vicon Motus.</td></tr><tr><td>Vicon Motus KineCalc</td><td>Vicon</td><td>oprogramowanie Vicon Motus KineCalc</td><td>http://www.vicon.com/applications/animal.html&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Oprogramowanie zastrzeżone, kompatybilne z danymi Vicon Motus, co umożliwia bezpośrednie i konfigurowalne obliczenia danych.</td></tr><tr><td>Kamery wideo</td><td>Vicon</td><td>Zmienne w zależności od potrzeb</td><td>http://www.vicon.com/applications/animal.html&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Do dwustronnego obrazowania 2D lub 3D kinematyki kończyn tylnych podczas lokomocji szczura wymagane jest co najmniej 4 kamery. Kamery z częstotliwością próbkowania 60 Hz są wystarczające dla szczurów poruszających się z prędkością od 60 do 90 cm/s. Kamery wysokiej rozdzielczości czasowej pozwolą na identyfikację bardzo niewielkich, lecz potencjalnie istotnych różnic w koordynacji między kończynami.</td></tr><tr><td>Objętość lub klatka kalibracyjna</td><td>Vicon</td><td>Niestandardowy</td><td>http://www.vicon.com/applications/animal.html&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Należy nabyć i stosować odpowiednią objętość kalibracyjną do kalibracji współrzędnych przed każdym nagraniem wideo podczas każdego nowego cyklu zbierania danych lub w przypadku przesunięcia którejkolwiek z kamer. Wymiary tej objętości kalibracyjnej zależą od badanego pola widzenia.</td></tr><tr><td>Taśma odblaskowa</td><td>3M</td><td>ND</td><td>Można nabyć hurtowo poprzez dystrybutora 3M lub w zależności od potrzeb od firmy VICON&lt;br/&gt;http://solutions.3m.com/en_US/?WT.mc_id=www.3m.com/us&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;http://www.vicon.com/applications/animal.html</td></tr><tr><td>Cheerios</td><td>General Mills</td><td>Cheerios</td><td>http://www.cheerios.com/</td></tr><tr><td>Klej tkankowy</td><td>3M</td><td></td><td>Można nabyć za pośrednictwem dystrybutora 3M&lt;br/&gt;http://solutions.3m.com/en_US/?WT.mc_id=www.3m.com/us</td></tr></tbody></table>

wyznaczanie kinematyki i siły reakcji podłoża: demonstracja ilościowej oceny zdolności lokomocyjnych szczurów młodych, dorosłych w średnim wieku oraz geriatrycznych

Kinematics and Ground Reaction Force Determination: A Demonstration Quantifying Locomotor Abilities of Young Adult, Middle-aged, and Geriatric Rats

Zachowanie, w najszerszym ujęciu, można zdefiniować jako motoryczną manifestację procesów fizjologicznych. W związku z tym wszystkie zachowania przejawiają się poprzez układ ruchowy. W dziedzinach neuronauki i ortopedii lokomocja jest powszechnie ocenianym zachowaniem w różnych modelach chorób. Na przykład powrót funkcji lokomocyjnych po urazach układu nerwowego jest jednym z najczęściej ocenianych zachowań 1-3. Chociaż lokomocję można oceniać za pomocą różnych pomiarów punktów końcowych (np. czas potrzebny na wykonanie zadania lokomocyjnego itp.), półilościowych pomiarów kinematycznych (np. porządkowych skal ocen, takich jak skala lokomocyjna Basso Beattie i Bresnahan (BBB) itp.) oraz miar zastępczych zachowania (np. siła mięśniowa, prędkość przewodzenia nerwowego itp.), tylko kinetyka (pomiary sił) i kinematyka (pomiary segmentów ciała w przestrzeni) dostarczają szczegółowego opisu strategii, dzięki której zwierzę jest w stanie się poruszać 1. Pomiary kinematyczne i kinetyczne lokomocji gryzoni, choć nie są nowością, stały się obecnie bardziej dostępne dzięki dostępności komercyjnego sprzętu zaprojektowanego w tym celu. Co istotne, eksperymentatorzy muszą być jednak bardzo dobrze zapoznani z teorią analiz biomechanicznych oraz rozumieć zalety i ograniczenia tych form analiz przed rozpoczęciem badań, które okażą się stosunkowo pracochłonne. Celem niniejszej pracy jest opisanie metody gromadzenia danych kinematycznych oraz danych o sile reakcji podłoża przy użyciu komercyjnie dostępnego sprzętu. Opisano szczegóły konfiguracji sprzętu i aparatury, wstępne szkolenie zwierząt, kryteria włączenia i wykluczenia dopuszczalnych prób oraz metody zbierania danych. Ilustrujemy użyteczność tej techniki analizy behawioralnej, opisując kinematykę i kinetykę młodych dorosłych, średnich i geriatrycznych szczurów tej samej linii.

Lokomocja jest często badana jako wynik behawioralny w różnych modelach chorób w dziedzinach takich jak neuronauka i ortopedia. Niniejszy artykuł wideo ma na celu opisanie metody pomiaru sił reakcji podłoża oraz kinematyki u szczurów podczas swobodnej lokomocji.

Wyznaczanie kinematyki i siły reakcji podłoża: demonstracja ilościowej oceny zdolności lokomocyjnych szczurów młodych, dorosłych w średnim wieku oraz geriatrycznych

Zachowanie, w najszerszym ujęciu, można zdefiniować jako motoryczną manifestację procesów fizjologicznych. W związku z tym wszystkie zachowania manifestują się poprzez...

W niniejszym filmie zaprezentowano procedurę pomiaru sił reakcji podłoża oraz kinematyki kończyn tylnych u szczurów zachowujących się swobodnie. W pierwszej kolejności szczury są trenowane do regularnego pokonywania bieżni w celu otrzymania nagrody w postaci pożywienia. Następnie w kluczowych punktach anatomicznych kończyn tylnych umieszcza się markery odblaskowe.Nagrania wideo oraz dane dotyczące siły reakcji podłoża są zbierane podczas przemieszczania się zwierzęcia w celu otrzymania nagrody pokarmowej. Markery odblaskowe są digitalizowane, a dane przetwarzane retrospektywnie. Jakościowe i ilościowe różnice w zdolnościach lokomocyjnych obserwuje się u szczurów w różnych modelach chorobowych.Witam, nazywam się Aubrey Webb. Jestem adiunktem na Wydziale Medycyny Weterynaryjnej oraz w Instytucie Mózgu Hotchkiss na Uniwersytecie w Calgary w Calgary, Alberta, w Kanadzie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak skale oceny lokomocji i inne miary punktowe, jest fakt, że dostarcza ona czułych, obiektywnych i ilościowych danych, które pomagają zróżnicować subtelne różnice pomiędzy grupami poruszających się szczurów.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki i ortopedii, takie jak określenie efektów potencjalnego leku terapeutycznego. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię różnych modeli chorób, ponieważ ograniczone jest prawdopodobieństwo stwierdzenia braku efektu w sytuacji, gdy on występuje. Wykorzystując tę technikę, metoda ta pozwala uzyskać wgląd w lokomocję szczurów.Metodę tę można zastosować również w innych układach, takich jak różne modele chorób neurologicznych i ortopedycznych u wielu gatunków zwierząt. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ analiza biomechaniczna wymaga znacznej ilości czasu i cierpliwości, a do rozwiązywania problemów w analizie danych niezbędna jest zaawansowana wiedza z zakresu biomechaniki. Metodologia ta jest stosowana u wielu gatunków od kilku dziesięcioleci, jednak dopiero niedawno stała się dostępna do użytku u gryzoni dzięki komercyjnie dostępnemu sprzętowi. Pierwszym krokiem w pomiarze zdolności lokomocyjnych szczurów jest przeszkolenie każdego zwierzęcia w przechodzeniu przez zamknięty tor o płaskiej powierzchni.Po otrzymaniu szczurów od odpowiedniego dostawcy zwierząt, zwierzęta powinny zostać poddane aklimatyzacji w nowym środowisku przez jeden tydzień. W czasie aklimatyzacji do klatki szczura należy umieścić kilka płatków Cheerios.Zwierzęta są codziennie poddawane restrykcji kalorycznej do poziomu zapotrzebowania energetycznego niezbędnego do utrzymania masy ciała, aby zapobiec otyłości i zapewnić późniejszą motywację do wykonywania zadania. Przez jeden tydzień, każdego dnia w tym samym przedziale czasowym, należy oswoić każde zwierzę przez 10 do 15 minut, umieszczając je w tunelu z płatkami Cheerios znajdującymi się na obu końcach. Gdy zwierzęta zapoznają się z otoczeniem, zaczną spożywać płatki Cheerios.Gdy zwierzę poczuje się swobodnie, jedząc Cheeriosy wewnątrz toru, należy poddać je warunkowaniu instrumentalnemu, aby przebiegało całą długość toru w zamian za nagrodę pokarmową. Osiąga się to poprzez rzucenie jednej czwartej pierścienia Cheerios na przeciwległy koniec toru, na którym znajduje się szczur. Gdy szczur zje ten fragment, należy umieścić kolejną jedną czwartą pierścienia na drugim końcu toru.Powtarzaj tę czynność do momentu, aż szczur będzie konsekwentnie poruszał się wzdłuż bieżni ze stałą prędkością kłusa, aby zjeść płatek cheerio, bez galopowania lub skakania. Warunkowanie zwierząt do tego zadania może prowadzić do wystąpienia chodu galopującego i skaczącego, które pod względem biomechanicznym są trudniejsze do interpretacji. Teraz zobaczmy, jak przeprowadzić znakowanie pozycji stawów.Analiza kinematyki kończyn jest niewiarygodna ze względu na silnie skuloną posturę i wynikający z tego artefakt ruchu skóry spowodowany umieszczeniem markerów skórnych na czterech kończynach. Zamiast tego kinematykę kończyn przednich należy przeprowadzić za pomocą kinematografii rentgenowskiej lub fluoroskopii. W związku z tym niniejsze wideo będzie dotyczyło wyłącznie rozmieszczenia markerów pozycji stawów kończyn tylnych.Po znieczuleniu zwierzęcia należy ogolić kończyny tylne oraz grzbiet do poziomu grzebieni biodrowych. Następnie zwierzę ułożone jest w pozycji grzbietowej, a jego kończyny tylne ustawia się w przybliżonej pozycji stojącej, wykorzystując twardą piankę mocującą do stabilizacji. Za pomocą nietoksycznego permanentnego markera należy zaznaczyć: najbardziej kranialne części grzebieni biodrowych, trochanter większy kości udowej, guz boczny piszczeli, staw skokowy oraz dystalny i boczny aspekt piątej kości śródstopia.Wymagane jest codzienne odświeżanie wcześniej zaznaczonych punktów orientacyjnych anatomii, ponieważ szczury powoli usuwają znaczniki w wyniku naturalnych zachowań pielęgnacyjnych. Przejdźmy teraz do sposobu rejestrowania danych. Umieść objętość kalibracyjną w wyznaczonym obszarze toru biegowego.Z każdej z kamer rejestrowana jest pojedyncza klatka objętości kalibracyjnej w obrębie bieżni. Przed rozpoczęciem sesji nagrywania należy sprawdzić obraz z każdej kamery. Należy upewnić się, że pole widzenia jest identyczne dla wszystkich czterech kamer i obejmuje platformę dynamometryczną w centrum oraz odcinek bieżni wystarczająco długi, aby zarejestrować dwa kroki.Wszystkie skalibrowane oznaczenia wzdłuż każdego z drążków zostają zdigitalizowane. Ten etap kalibracji jest krytyczny przed rozpoczęciem zbierania danych. Jeśli kalibracja nie zostanie przeprowadzona dokładnie lub nie odbędzie się bezpośrednio przed sesją nagraniową, wszystkie uzyskane dane będą niedokładne i bezużyteczne.Dopiero po uzyskaniu satysfakcjonującego poziomu błędu digitalizacji należy przystąpić do zbierania danych lokomocyjnych bezpośrednio przed umieszczeniem zwierzęcia w tunelu biegowym. Należy zapisać jego masę ciała i przykleić stożkowe odblaskowe markery skórne do wcześniej wyznaczonych punktów na topograficznych punktach orientacyjnych kończyn tylnych. Po umieszczeniu markerów na kończynach tylnych należy usiąść przy komputerze i przygotować marker zdarzeń podłączony do systemu silników Vicon.Używając pliku z kalibracją jako szablonu, należy utworzyć kilka plików przed rozpoczęciem rejestracji. Zazwyczaj wymagane jest od 25 do 30 plików, aby zapewnić zgromadzenie wystarczającej liczby przebiegów, spełniających kryteria włączenia, oraz pomiarów prędkości. Po utworzeniu plików można rozpocząć zbieranie danych.W pierwszej kolejności zachęć szczura do przemieszczania się wzdłuż bieżni, rzucając ćwiartki płatków Cheerios na oba końce bieżni, dbając o odpowiednią koordynację i wyczucie czasu. Marker zdarzenia jest aktywowany w momencie rozpoczęcia oraz tuż przed pomyślnym pokonaniem bieżni przez szczura. Po przeanalizowaniu surowej reakcji podłoża oraz zapisu siły i odnotowaniu, czy płyta pomiarowa została uderzona przez kończyny lewe czy prawe, zapisz i zamknij plik.Należy zarejestrować równą liczbę uderzeń platformy siłową lewą i prawą kończyną. Proces rejestracji danych z danego przebiegu jest powtarzany do momentu zarejestrowania wystarczającej liczby przebiegów. Przejdźmy teraz do analizy danych z przebiegów; po zakończeniu gromadzenia danych dotyczących kinematyki i sił reakcji podłoża, każdy przebieg każdego zwierzęcia musi zostać oceniony pod kątem prędkości przy użyciu oprogramowania Vicon Modus i dwóch względnie stałych markerów.Na przykład skrzydła kątnicy mogą zostać wykorzystane do oceny wirtualnego punktu pomiędzy markerami. W ten sposób można obliczyć prędkość tego wirtualnego punktu w kierunku poziomym; do analizy włączone są wyłącznie serie biegów, w których zwierzę poruszało się z prędkością od 60 do 90 cm/s. Do analizy wymagane jest minimum 10 serii.Pięć serii, w których lewa kończyna styka się z platformą dynamometryczną, oraz pięć serii, w których prawa kończyna styka się z platformą dynamometryczną. Po zidentyfikowaniu akceptowalnych serii dla każdego zwierzęcia należy przeprowadzić digitalizację pozostałych markerów skórnych w celu skompensowania ruchu skóry. Estymacja pozycji kolana z uwzględnieniem artefaktów ponadkolanowych jest obliczana z wykorzystaniem triangulacji oraz kątów w stawach biodrowych, kolanowych i H.Określa się prędkości i przyspieszenia, a także można ocenić czasy fazy podparcia i fazy przeniesienia. Równocześnie zebrane dane dotyczące siły reakcji podłoża są analizowane przy użyciu tego samego oprogramowania, co pozwala na obliczenie wielu zmiennych dla sił w każdym z trzech kierunków ortogonalnych. Równocześnie zebrane dane dotyczące siły reakcji podłoża są analizowane przy użyciu tego samego oprogramowania, co pozwala na obliczenie wielu zmiennych dla sił w każdym z trzech kierunków ortogonalnych.W dalszej części przedstawimy reprezentatywne wyniki obrazujące użyteczność tej formy analizy lokomocji. Kinematykę oraz siły reakcji podłoża określono dla młodych, w średnim wieku i geriatrycznych samic szczurów Wistar. Na podstawie tej analizy stwierdzono różnice związane z wiekiem u samic szczurów Wistar.W szczególności analiza siły reakcji podłoża wykazuje, że szczury geriatryczne mają obniżoną zdolność hamowania czterema kończynami i wykazują tendencję do częstszego wykorzystywania kończyn tylnych do stabilizacji bocznej w porównaniu z pozostałymi grupami zwierząt, natomiast analiza kinematyczna nie ujawniła żadnych istotnych statystycznie różnic pomiędzy grupami. Dowodzi to, że dane kinematyczne można z łatwością zarejestrować u szczurów w niemal każdym wieku. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zważyć zwierzę bezpośrednio przed lub bezpośrednio po zebraniu danych oraz starannie skalibrować system przed rozpoczęciem pomiarów zgodnie z opisaną procedurą.Do odpowiedzi na dodatkowe pytania można wykorzystać inne metody, takie jak kliniczna elektrofizjologia całego organizmu. Przykładowo, czy wyniki dotyczące kinematyki i siły reakcji podłoża są powiązane z regeneracją neuronów, czy raczej z jakąś inną, szerszą formą plastyczności neuroanatomicznej, na przykład w przypadku regeneracji nerwów obwodowych? Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak zbierać dane dotyczące siły reakcji podłoża oraz kinematyki kończyn tylnych u szczurów w swobodnym zachowaniu przy użyciu komercyjnie dostępnego sprzętu.

kinematics-ground-reaction-force-determination-demonstration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Kinematyka i oznaczanie siły reakcji gruntu: Demonstracja ilościowa zdolności lokomocyjnych młodych dorosłych, dorosłych i geriatrycznych szczurów

Test rotarod jest wykorzystywany do oceny stanu motorycznego w ruchu chodu u szczurów w modelu hemi-Parkinsona.

Wykorzystanie rotarod jako metody jakościowej analizy chodu u szczura

W tym filmie opisujemy procedurę testowania śladów stóp i związaną z nią analizę, aby ocenić chód i koordynację ruchową u myszy.

Ocena chodu na podstawie analizy śladów stóp: metoda badania koordynacji ruchowej u myszy

Ćwiczenia mogą łagodzić zaburzenia zachowania związane z chorobami neurodegeneracyjnymi. Badania nad mechanizmami leżącymi u podstaw efektów za pośrednictwem ćwiczeń nasiliły się w modelach chorób, ale neurobiologiczne tło towarzyszące tym chorobom, w szczególności starzenie się, prawdopodobnie nie jest brane pod uwagę.  W tym miejscu ilustrujemy środki zwiększające prawdopodobieństwo udanego paradygmatu ćwiczeń u starszych szczurów.

Osiąganie zgodności z wymuszonymi ćwiczeniami u gryzoni: krytyczny standard oceny wpływu ćwiczeń na zaburzenia i choroby związane ze starzeniem się

W tym badaniu demonstrujemy wykorzystanie kinematycznej analizy chodu opartej na obrazowaniu w płaszczyźnie brzusznej do monitorowania subtelnych zmian w koordynacji ruchowej, jak również postępu neurodegeneracji wraz z wiekiem w modelach mysich (np. linie myszy z mutacją endofiliny).

Analiza chodu zależnych od wieku zaburzeń motorycznych u myszy z neurodegeneracją

Prezentowany tutaj jest protokół do zbierania i analizy trójwymiarowej kinematyki poruszania się czworonożnych u gryzoni do badań przedklinicznych.

Analiza kinematyczna chodu 3D do badań przedklinicznych na gryzoniach

Przedstawiono protokoły oceny autonomicznych i behawioralnych efektów pasywnego ruchu u gryzoni za pomocą pionowego ruchu windy i obrotu diabelskiego młyna.

Ocena autonomicznych i behawioralnych skutków ruchu biernego u szczurów za pomocą pionowego ruchu windy i obrotu diabelskiego młyna

Wprowadzamy metodę analizy kinematycznej, która wykorzystuje trójwymiarowy aparat do przechwytywania ruchu zawierający cztery kamery i oprogramowanie do przetwarzania danych do przeprowadzania ocen funkcjonalnych podczas podstawowych badań z udziałem modeli gryzoni.

Analiza kinematyczna 3D do oceny funkcjonalnej w szczurzym modelu uszkodzenia nerwu kulszowego

Tutaj opisujemy system RatWalker, zbudowany przez przeprojektowanie aparatu MouseWalker, aby dostosować go do zwiększonych rozmiarów i wagi szczurów. System ten wykorzystuje sfrustrowane całkowite odbicie wewnętrzne (FTIR), szybkie przechwytywanie wideo i oprogramowanie do analizy w otwartym dostępie do śledzenia i ilościowego określania parametrów chodu.

Zastosowanie systemu RatWalker do analizy chodu w genetycznym modelu szczurzym choroby Parkinsona

Udostępniamy protokół oceny zachowań motorycznych za pomocą baterii testów behawioralnych u szczurów po urazie zmiażdżenia nerwu kulszowego.

Wieloczynnikowa ocena zachowań motorycznych u szczurów po jednostronnym urazie zmiażdżenia nerwu kulszowego

Obecny protokół opisuje trójwymiarowe śledzenie/ocenę ruchu, aby zobrazować zmianę ruchu szczurów po ekspozycji na symulowane środowisko nieużywania.

Kompleksowe zrozumienie zmian chodu wywołanych bezczynnością u gryzoni

Protokół ten ustanawia pipeline oceny kinematyki tylnej kończyny szczura za pomocą testu na bieżni bez markerów z automatycznym oznaczaniem trajektorii wielostawowych opartym na głębokim uczeniu, co umożliwia powtarzalną ilościową ilościową identyfikację ruchu.

Wielostawowe synchroniczne śledzenie oparte na uczeniu głębokim do obiektywnej ilościowej kinematyki ruchowej kończyn tylnych u szczurów

Poznaj metodę pomiaru sił reakcji gruntu i kinematycznej analizy kończyn tylnych u szczurów. Technika ta dostarcza obiektywnych, ilościowych danych do oceny zdolności lokomotorycznych w modelach chorób neurologicznych i ortopedycznych.

Kinematyka i wyznaczanie siły reakcji gruntu: demonstracja określająca ilościowo zdolności lokomotoryczne młodych dorosłych, szczurów w średnim wieku i geriatrycznych (Wideo) | JoVE Journal

Wyznaczanie kinematyki i siły reakcji podłoża: demonstracja ilościowej oceny zdolności lokomocyjnych szczurów młodych, dorosłych w średnim wieku oraz geriatrycznych

Przeglądaj więcej filmów