Name: Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w zarodkach Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji układu nerwowego w zarodkach Drosophila za pomocą immunofluorescencji. Technika ta umożliwia badanie struktur neuronalnych podczas embriogenezy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

SG jest wspierany przez fundusze z State University of New York at Buffalo oraz John R. Oishei Foundation.

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotować bufor PEMFA, używając 100mM Pipes, 2mM EGTA oraz 1 mM MgSO4. Dostosować pH buforu do wartości 7,0. Bufor PEMFA należy wysterylizować przez filtrowanie i przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Przygotować PBT, dodając 1ml Triton X-100 do 100ml 1x PBS (buforu fosforanowego) (pH 7,0). Przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Przygotować 5% BSA (albuminy surowicy bydlęcej) z 0,01% NaAcide w 1x PBS (pH 7,0).</li>
	<li>Przygotować roztwór soli, używając 0,7% NaCl i 0,03% Triton X-100 w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Przygotować utrwalacz, łącząc 4 części buforu PEMFA z 1 częścią 37% formaldehydu.</li>
</ol>
2. Pobieranie embrionów
<ol>
	<li>Przygotować klatkę dla wybranego szczepu Drosophila, umieszczając &gt;100 much w plastikowej butelce z adapterem i agarową płytką pokarmową.</li>
	<li>Pozostawić klatkę z muchami w ciemności w temperaturze pokojowej przez 72 godziny, wymieniając płytki co 8-12 godzin, aby muchy zaaklimatyzowały się w klatce i nie zatrzymywały jaj.</li>
	<li>Na potrzeby eksperymentu zbierać embriony przez 12 godzin. Wyjąć szalkę Petriego z pojemnika i zastąpić ją nową. Z wyjętej szalki Petriego spłukać embriony roztworem soli fizjologicznej przy użyciu czystego pędzla.</li>
	<li>Zebrać embriony na gęstym sicie. Przepłukać roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć nadmiar drożdży.</li>
	<li>Za pomocą szpatułki ostrożnie zebrać embriony i umieścić je w małej szklanej fiolce z zakrętką. Dodać około 1ml roztworu soli fizjologicznej.</li>
</ol>
3. Usunięcie otoczki chorionowej i błon żółtkowych oraz utrwalenie
<ol>
	<li>Po zebraniu embrionów przygotować roztwór Heptane-Fix, łącząc 50% heptanu i 50% utrwalacza. Roztwór utworzy dwie warstwy: heptan na górze i utrwalacz na dole.</li>
	<li>W szklanej fiolce wypłukać embriony, inkubując je w roztworze soli fizjologicznej przez 5 minut. Nadmiar soli usunąć za pomocą pipety Pasteura.</li>
	<li>Przepłukać embriony wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Odchorionować embriony, inkubując je w 50% roztworze wybielacza przez 3 minuty.</li>
	<li>Dokładnie wypłukać embriony wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Utrwalić embriony, inkubując je przez 30 minut w roztworze Heptane-Fix przy delikatnym wytrząsaniu.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura zastąpić utrwalacz (dolna warstwa) metanolem, pozostawiając heptan w probówce. Energicznie wstrząsnąć, aby usunąć błonę witelinową. Odwitelinizowane embriony opadną na dno probówki.</li>
	<li>Zebrać embriony do nowej szklanej fiolki za pomocą pipety Pasteura. Przepłukać embriony pięciokrotnie metanolem, za każdym razem inkubując je przez 5 minut.</li>
</ol>
4. Barwienie przeciwciałami, montowanie i wizualizacja
<ol>
	<li>Rehydratyzuj zarodki w mieszaninie 50% roztworu PBT i 50% metanolu przez 5 minut. Następnie rehydratyzuj w 100% roztworze PBT przez 5 minut.</li>
	<li>Zablokuj zarodki, inkubując je w 5% BSA z 0.01% roztworem NaAcide przez 1 godzinę w 4°C.</li>
	<li>Zarodki są teraz gotowe do barwienia przeciwciałami. Przygotuj przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczając je do odpowiedniego stężenia w 5% BSA z 0.01% roztworem NaAcide. Stosujemy przeciwciało przeciwko białku łańcucha cysteinowego (CSP), pęcherzykowemu białku synaptycznemu, oraz przeciwciało anty-HRP (peroksydaza chrzanowa), które rozpoznaje specyficzną dla neuronów część węglowodanową obecną w glikoproteinach powierzchniowych i znakuje wszystkie neurony.</li>
	<li>Inkubuj zarodki przez noc w 4°C w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego.</li>
	<li>Następnego dnia przemyj zarodki 10 razy roztworem PBT w ciągu godziny.</li>
	<li>Przygotuj roztwór przeciwciała wtórnego, rozcieńczając je do odpowiedniego stężenia. Stosujemy przeciwciała wtórne Alexa w stężeniu 1:200.</li>
	<li>Inkubuj zarodki przez dwie godziny w 4°C w roztworze przeciwciała wtórnego.</li>
	<li>Przemyj zarodki 10 razy roztworem PBT w ciągu godziny.</li>
	<li>Inkubuj zarodki przez noc w medium montażowym Vectashield.</li>
	<li>Zamocuj zarodki na szkiełku przedmiotowym i zaklej szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci. Obserwuj zarodki przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1a.jpg" alt="Obraz z mikroskopu konfokalnego przedstawiający fluorescencyjne komórki, paski skali wskazujące powiększenie do analizy komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1b.jpg" alt="Obraz z mikroskopii konfokalnej; struktura rdzenia kręgowego; barwienie fluorescencyjne; wizualizacja komórkowa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> HRP-FITC <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1c.jpg" alt="Obraz z mikroskopii konfokalnej, wizualizacja struktury komórkowej; białka fluorescencyjne podkreślają morfologię komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Nałożone (Merged) Rycina 1: A. Reprezentatywne obrazy przedstawiające embrionalny OUN w stadium 16-17, z użyciem przeciwciał przeciwko CSP (czerwony) i HRP (zielony). Zwróć uwagę na wyraźne barwienie spoiwa.
<img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2a.jpg" alt="Obraz mikroskopii konfokalnej; włókna nerwowe; znakowanie fluorescencyjne; wizualizacja struktury komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2b.jpg" alt="Obraz mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający włókna nerwowe w biologicznej próbce tkanki, skala 20 μm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> HRP-FITC <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2c.jpg" alt="Obraz mikroskopii konfokalnej; wizualizacja struktury neuronów; znakowanie fluorescencyjne, skala powiększenia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Nałożone Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy przedstawiające embrionalny obwodowy układ nerwowy (PNS) w stadium 16-17 z użyciem przeciwciał przeciwko CSP (czerwony) i HRP (zielony). Zwróć uwagę na powtarzalne wzory neuronów obwodowych.

<ol><li>Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+sensory+organs+by+mutations+of+the+cut+locus+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster.</a> Cell. 51, 293-307 (1987).</li>
<li>Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+of+the+peripheral+nervous+system+in+Drosophila+embryos%3A+DNA+replication+patterns+and+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages.</a> Neuron. 3, 21-32 (1989).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer-Verlag. New York. (1985).</li>
<li>Carroll, S. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+fushi+tarazu+protein+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis.</a> Cell. 43, 47-57 (1985).</li>
<li>Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+connections+between+imaginal+discs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle connections between imaginal discs in Drosophila.</a> Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Zarodek Drosophila stanowi potężny układ do badania zmian komórkowych i molekularnych podczas rozwoju neuronów. W niniejszym protokole zaprezentowaliśmy sposób przygotowania całych zarodków do immunohistochemii. Protokół ten został opracowany na podstawie metody opisanej przez Carrolla i Scotta w 1985 roku. Można go również dostosować do testowania innych przeciwciał przeciwko białkom neuronalnym, jednak wymagana jest optymalizacja tych przeciwciał. Ponadto defekty rozwojowe embrionalnego PNS i CNS można łatwo z...

<table><tbody><tr><td>37% formaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-25</td><td></td></tr><tr><td>CSP</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRP-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>323-095-021</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 przeciwciała kozie anty-mysie IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach drosophila

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Zarodek Drosophila stanowi atrakcyjny model badawczy do analizy komórkowych i molekularnych podstaw rozwoju neuronalnego. W niniejszej pracy opisujemy procedurę wizualizacji embrionalnego układu nerwowego Drosophila z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko białkom neuronalnym. Ponieważ cały obwodowy i ośrodkowy układ nerwowy zarodka są dobrze scharakteryzowane na poziomie pojedynczych komórek (Dambly-Chaudière et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), wszelkie aberracje w tych układach mogą być łatwo zidentyfikowane przy użyciu przeciwciał przeciwko różnym białkom neuronalnym. Rozwijające się zarodki są zbierane w określonych odstępach czasu, aby zapewnić, że znajdują się one we właściwych stadiach rozwoju do wizualizacji. Po zebraniu, przed utrwaleniem, usuwane są zewnętrzne warstwy zarodka: błona chorionowa oraz otoczka witelinowa otaczająca zarodek. Następnie zarodki są inkubowane z przeciwciałami neuronalnymi i wizualizowane przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał wtórnych. W celu uzyskania dostępu do embrionalnego układu nerwowego wizualizowane są zarodki w stadiach 12-17. W stadium 12 pas zarodkowy OUN zaczyna się skracać, a do stadium 15 zostaje osiągnięty ostateczny wzorzec komisury. W stadium 17 OUN ulega skurczeniu, a OUN jest w pełni rozwinięty (Campos-Ortega et al. 1985). Dzięki temu zmiany w strukturze OUN i OUN mogą być łatwo obserwowane podczas tych stadiów rozwoju.

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

Zarodek Drosophila stanowi atrakcyjny system modelowy do badania komórkowych i molekularnych podstaw rozwoju neuronalnego. W niniejszym materiale opisujemy...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie embrionów oph i melanogaster do wizualizacji całego układu nerwowego. Jest to realizowane poprzez najpierw pobranie embrionów z interesującego nas szczepu muchy. Drugim krokiem procedury jest usunięcie chorionu za pomocą wybielacza.Trzecim krokiem procedury jest zastosowanie heptanu i metanolu w celu usunięcia błony vilin. Ostatnim etapem procedury jest naniesienie przeciwciał na embriony. W rezultacie można uzyskać obrazy ukazujące strukturę układu nerwowego embrionu drosophila za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak rola, jaką mutacje mogą odgrywać w rozwijającym się układzie nerwowowym. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ mogą przypadkowo wypłukać embriony z probówki. Protokół należy rozpocząć od przygotowania niezbędnych odczynników, w tym P-E-M-F-A, buforu PBC 5% BSA z 0,01% roztworem soli azku sodu oraz utrwalacza z formaldehydem.Przygotuj klatkę dla wybranej linii muszek Drosophila, ogłuszając muchy dwutlenkiem węgla, a następnie przenosząc co najmniej 100 osobników do plastikowej b

visualization-embryonic-nervous-system-whole-mount-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wizualizacja układu nerwowego zarodkowego w całym zarodku Drosophila

Drosophila melanogaster larwy stanowią idealny model badawczy do analizy mechanizmów transportu aksonalnego w nerwach segmentowych larw. Stosując tę procedurę, 3Badania i rozwój larwy w stadium poczwarki niosące różne mutacje można porównać z larwami typu dzikiego.

Wizualizacja nerwów segmentowych larw w preparatach larw Drosophila w 3rd stadium zasiedlenia

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół montowania barwionych zarodków Drosophila w pozycji pionowej, co umożliwia obrazowanie przekrojów poprzecznych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie w układzie pionowym embrionów Drosophila

Źródło: Jeong, S. Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wizualizację projekcji aksonalnych w zarodkach Drosophila. Znakowanie immunologiczne neuronów ruchowych, precyzyjna sekcja w celu odsłonięcia struktur neuronalnych oraz mikroskopia kontrastowa z różnicową interferencją łącznie ujawniają szczegółową architekturę neuronów, podkreślając wzorce projekcji aksonalnej.

Wizualizacja wzorców projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Opisujemy protokół preparacji, utrwalania i barwienia immunologicznego organów steroidogennych u larw Drosophila i dorosłych samic w celu zbadania biosyntezy hormonów steroidowych i ich mechanizmu regulacyjnego. Oprócz narządów steroidogennych wizualizujemy unerwienie narządów steroidogennych, a także steroidogennych komórek docelowych, takich jak komórki macierzyste linii rozrodczej.

Protokoły wizualizacji narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów z barwieniem immunologicznym u muszki owocowej Drosophila melanogaster

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Ten protokół opisuje trzy kroki przygotowania płatów wzrokowych larw i dorosłych Drosophila do obrazowania: 1) preparacje mózgu, 2) immunohistochemia i 3) montaż. Nacisk położono na krok 3, ponieważ do wizualizacji określonych struktur płatów optycznych wymagane są różne orientacje montażowe.

Rozwarstwienie, immunohistochemia i montaż mózgów larw i dorosłych osobników Drosophila w celu wizualizacji płata wzrokowego

Tutaj udostępniamy protokół sekcji wymagany do zobrazowania na żywo późnej embrionalnej męskiej gonady Drosophila. Protokół ten pozwoli na obserwację dynamicznych procesów komórkowych w normalnych warunkach lub po manipulacji transgenicznej lub farmakologicznej.

Sekcja i obrazowanie na żywo późnej embrionalnej gonady Drosophila

Poznaj metodę wizualizacji układu nerwowego w zarodkach Drosophila za pomocą immunofluorescencji. Technika ta umożliwia badanie struktur neuronalnych podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

Przeglądaj więcej filmów