Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila
11 grudnia 2010
Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie embrionów much *D. oph* i *D. melanogaster* do wizualizacji całego układu nerwowego. Osiąga się to najpierw poprzez zebranie embrionów z wybranej linii much. Drugim krokiem procedury jest usunięcie chorionu za pomocą wybielacza.
Trzecim krokiem procedury jest zastosowanie heptanu i metanolu w celu usunięcia błony vilin. Ostatnim krokiem procedury jest naniesienie przeciwciał na embriony. W rezultacie można uzyskać obrazy przedstawiające strukturę układu nerwowego zarodka drosophila za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.
Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki, takie jak rola, jaką mutacje mogą odgrywać w rozwijającym się układzie nerwowym. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ mogą przypadkowo wypłukać zarodki z probówki. Rozpocznij ten protokół od przygotowania niezbędnych odczynników, w tym P-E-M-F-A, buforu PBC 5%BSA z 0,01% roztworem soli azotku sodu oraz utrwalacza z formaldehydem.
Przygotuj klatkę dla wybranej linii muszek *Drosophila*, ogłuszając muchy dwutlenkiem węgla, a następnie przenosząc co najmniej 100 osobników do plastikowej butelki wyposażonej w adapter z pożywką agarową z sokiem jabłkowym. Umieść klatkę z muchami w ciemności w temperaturze pokojowej na 72 godziny. Wymieniaj płytki z pożywką agarową z sokiem jabłkowym co 8 do 12 godzin, aby muchy mogły zaaklimatyzować się w klatce i nie zatrzymywały jaj przed rozpoczęciem eksperymentu.
Po 72-godzinnym okresie aklimatyzacji należy zebrać embriony 12 godzin po ostatniej wymianie płytki z agarem z sokiem jabłkowym. Wyjąć płytkę z agarem z sokiem jabłkowym z klatki lęgowej i zastąpić ją roztworem soli fizjologicznej. Płukać płytkę z agarem z sokiem jabłkowym.
Zebrać zarodki na gęstym sitku. Za pomocą czystego pędzla odkleić wszelkie zarodki, które pozostały przytwierdzone do płytki. Przepłukać zarodki na sitku solą fizjologiczną, aby usunąć nadmiar drożdży; następnie za pomocą szpatułki delikatnie zebrać zarodki i umieścić je w małej szklanej fiolce.
Dodaj około 1 ml roztworu soli fizjologicznej. Następnie zakręć fiolkę i inkubuj przez pięć minut w celu przemycia embrionów. Po zakończeniu zbioru embrionów.
Przygotuj roztwór utrwalający z heptanem, łącząc 50% heptanu i 50% utrwalacza. Roztwór utworzy dwie warstwy z heptanem na górze i utrwalaczem na dole. Po upływie pięciu minut użyj pipety Pasteura, aby usunąć nadmiar soli fizjologicznej ze szklanej fiolki z zarodkami.
Opłucz zarodki wodą dejonizowaną, dodając około 1 mL wody dejonizowanej do szklanej fiolki zawierającej zarodki. Pozostaw zarodki na jedną minutę, a następnie usuń wodę i dodaj 50% roztwór wybielacza. Kilkukrotnie potrząśnij fiolką ręcznie, a następnie inkubuj przez trzy minuty, aby pokryć zarodki roztworem.
Zestalone embriony opadną na dno fiolki. Embrionalne COR-y będą pływać. Po trzech minutach inkubacji należy usunąć wybielacz oraz COR-y.
Po dekoracji dokładnie wypłucz zarodki wodą dejonizowaną, aplikując około 1 ml wody dejonizowanej do szklanej fiolki zawierającej zarodki. Pozostaw zarodki na jedną minutę, a następnie usuń wodę; pozostałe COR-y będą wypływać na powierzchnię i należy je usunąć. Dodaj do zarodków roztwór utrwalający na bazie heptanu i inkubuj je przez 30 minut przy delikatnym wstrząsaniu w celu ich utrwalenia.
Użyj pipety Pastra, aby usunąć utrwalacz, który stanowi dolną warstwę, pozostawiając heptan w probówce. Następnie dodaj metanol z powrotem na dno probówki w miejsce utrwalacza, zamknij probówkę i energicznie wstrząśnij nią ręcznie, aby usunąć błonę żółtkową. Po tym kroku zdezintegrowane embriony opadną na dno probówki.
Za pomocą pipety Pasteura usuń metanol i pozostałości z fiolki, pozostawiając zdejonizowane embriony. Następnie przemyj embriony pięciokrotnie metanolem, usuwając metanol pipetą Pasteura po każdym płukaniu. Podczas każdego płukania inkubuj embriony przez pięć minut.
Umieść zarodki w mieszaninie 50% roztworu PBT i 50% metanolu na pięć minut w celu ich rehydratacji. Następnie kontynuuj proces rehydratacji, przenosząc je do 100% roztworu PBT na pięć minut. Następnie przeprowadź blokowanie zarodków, inkubując je w 5% roztworze BSA z 0,01% azotkiem sodu przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsius.
Następnie należy przygotować przeciwciało pierwszorzędowe do barwienia zarodków, rozcieńczając je do odpowiedniego stężenia w 5%BSA z dodatkiem 0,01% azotku sodu. Przeciwciała zastosowane w tej procedurze są skierowane przeciwko pęcherzykowemu białku cysteinowemu oraz są to przeciwciała anty-HRP. Przeciwciała anty-HRP rozpoznają specyficzną dla neuronów grupę węglowodanową obecną w glikoproteinach powierzchniowych, co pozwala na znakowanie wszystkich neuronów.
Inkubować zarodki przez noc w temperaturze 4 °C w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego. Przemyć zarodki 10 razy buforem PBT w ciągu godziny. Nakładając około 1 mL PBT do szklanej fiolki z zarodkami, pozostawić je na sześć minut przed usunięciem PBT.
Powtórz proces nakładania PBT, inkubacji i usuwania PBT 10 razy. Przeciwciała wtórne rozcieńcz do odpowiedniego stężenia, przygotowując roztwór w ciemności ze względu na jego światłoczułość. Stosujemy przeciwciała wtórne Alexa w stężeniu 1:200.
Inkubować zarodki przez dwie godziny w temperaturze 4 °C w roztworze przeciwciała wtórnego. Szklaną fiolkę z zarodkami i roztworem przeciwciała wtórnego owinąć folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło. Przemyć zarodki 10 razy buforem PBT w ciągu jednej godziny.
Do embrionów dodać medium montażowe Vector Shield i inkubować je przez noc w temperaturze 4 °C w celu zamocowania. Za pomocą pipety Pasteura pobrać embriony wraz z niewielką ilością medium montażowego. Nanieść embriony i medium na szkiełko przedmiotowe.
Nałóż szkiełko nakrywkę na embriony i zabezpiecz krawędzie szkiełka lakierem do paznokci. Następnie zwizualizuj embriony za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. OUN embrionów przedstawiono w stadium 16 do 17.
Białko cystynowe (cystine string protein) zaznaczono kolorem czerwonym. Neurony HRP zaznaczono kolorem zielonym. Na tym reprezentatywnym obrazie widoczne jest wyraźne barwienie społecznika.
Zarodekowy PNS pokazano w stadium 16 do 17. Ponownie, białko cystine string zaznaczono na czerwono, a neurony na zielono. Zwróć uwagę na powtarzające się wzory neuronów obwodowych.
Podczas wykonywania tej procedury należy zachować ostrożność w obchodzeniu się z embrionami, aby nie usunąć ich przypadkowo z fiolki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat przygotowania embrionów oph fla do wizualizacji całego układu nerwowego metodą whole mount.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółową procedurę przygotowania embrionów Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy. Metoda obejmuje kilka etapów, w tym zbieranie embrionów, fiksację oraz barwienie przeciwciałami, co w końcowym etapie umożliwia obserwację struktur neuronalnych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Embriologia
Wprowadzenie
- Zrozumienie embrionalnego układu nerwowego jest kluczowe dla poznania procesów rozwojowych.
- Wizualizacja struktur neuronalnych może pomóc w wyjaśnieniu efektów mutacji genetycznych.
- Mikroskopia immunofluorescencyjna to potężna technika badania komponentów komórkowych.
- Prawidłowe przygotowanie embrionów jest niezbędne dla uzyskania pomyślnych wyników obrazowania.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu wizualizacji układu nerwowego w embrionach Drosophila.
- Ułatwienie badań nad rolą mutacji w rozwoju układu nerwowego.
- Pogłębienie wiedzy na temat struktury neuronów embrionalnych dzięki zastosowaniu zaawansowanych technik obrazowania.
Zastosowane metody
- Pozyskiwanie embrionów z określonych szczepów Drosophila.
- Zastosowanie wybielacza i heptanu do usuwania błon i fixacji.
- Użycie przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych do specyficznego barwienia.
- Wizualizacja embrionów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w stadium 16.
- Demonstracja efektywności protokołu barwienia przeciwciałami.
- Wgląd w organizację strukturalną neuronów w rozwijających się embrionach.
- Identyfikacja potencjalnych trudności dla nowych badaczy stosujących ten protokół.
Wnioski
- Opisany protokół przedstawia kompleksową metodę badania układów nerwowych embrionów Drosophila.
- Mikroskopia immunofluorescencyjna została zwalidowana jako skuteczne narzędzie w tych badaniach.
- Dalsze prace mogą wykorzystać tę metodę do badania wpływów genetycznych na rozwój układu nerwowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila umożliwia wysokorozdzielczą analizę rozwoju neuronów oraz perturbacji genetycznych. Niniejszy schemat postępowania wspiera wczesny etap walidacji celów oraz minimalizację ryzyka mechanistycznego poprzez bezpośrednią wizualizację architektury neuronalnej i fenotypowych skutków mutacji. Podejście to jest strategicznie ukierunkowane na selekcję projektów w ramach portfela badań oraz zwiększenie pewności predykcyjnej w procesach badawczych nad neurorozwojem.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią ocenę fenotypów neuronalnych w odpowiedzi na modyfikacje genetyczne.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów neurorozwojowych poprzez wizualizację z użyciem przeciwciał.
- Ułatwia minimalizację ryzyka mechanistycznego poprzez ujawnianie aberracyjnych wzorców układu nerwowego z rozdzielczością pojedynczych komórek.
- Zapewnia solidną platformę do weryfikacji hipotez dotyczących szlaków rozwojowych.
Przesiew i opracowanie testu
- Ustanawia powtarzalny system ilościowej wizualizacji struktur neuronalnych.
- Standaryzuje detekcję z użyciem przeciwciał w celu późniejszego przesiewania perturbacji genetycznych lub chemicznych.
- Umożliwia skalowalne przygotowanie embrionów do procesów obrazowania o wysokiej zawartości informacji (high-content imaging).
- Dostarcza ilościowe wyniki odpowiednie do analizy porównawczej między różnymi warunkami eksperymentalnymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami istotnymi dla chorób, umożliwiając wizualizację wad neurorozwojowych.
- Zapewnia ciągłość od odkryć genetycznych do walidacji przedklinicznej w neurobiologii.
- Dostarcza punktów końcowych fenotypowych dla dostosowanego do ryzyka wdrażania związków neuroaktywnych.
- Zwiększa wartość prognostyczną dla identyfikacji translacyjnych biomarkerów w neuronauce rozwojowej.
Integracja potoków przetwarzania i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy, obejmujący etapy od wczesnego testowania hipotez genetycznych, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację modeli przedklinicznych w badaniach nad rozwojem neurologicznym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych poprzez umożliwienie wizualizacji zmian w wzorcach neuronalnych po manipulacjach genetycznych.
- Przesiewanie: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne wyniki obrazowania do porównawczego przesiewania efektów fenotypowych.
- Analityka: Dostarcza ilościowe odczyty oparte na przeciwciałach do rzetelnej analizy statystycznej rozwoju neuronów.
- Badania translacyjne: Łączy etapy odkrywcze i przedkliniczne poprzez dopasowanie wyników fenotypowych do punktów końcowych istotnych dla przebiegu choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku dla różnorodnych badań nad rozwojem neurologicznym w wielu liniach genetycznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów neurorozwojowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne przepływy pracy dla wizualizacji neuronów z wykorzystaniem przeciwciał.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez zapewnienie wczesnej przejrzystości fenotypowej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów neurorozwojowych i związków z uwzględnieniem korekty ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z Drosophila oraz w mikroskopii immunofluorescencyjnej.
- Wymaga dostępu do infrastruktury obrazowania fluorescencyjnego i zwalidowanych odczynników przeciwciał.
- Niezbędna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów określania stadium rozwoju zarodków oraz barwienia w ramach całego zespołu.
- Możlizna jest konieczność adaptacji metody dla różnych tła genetycznych lub etapów rozwoju.
- Staranne obchodzenie się z zarodkami jest kluczowe, aby uniknąć utraty próbek i zapewnić powtarzalność.
