Generowanie hybryd RNA/DNA w genomowym DNA poprzez transformację z wykorzystaniem oligonukleotydów zawierających RNA

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest generowanie hybryd RNA-DNA na poziomie chromosomalnym w żywych komórkach drożdży poprzez transformację komórek drożdży oligosami zawierającymi RNA. Osiąga się to poprzez wprowadzenie pojedynczej nici RNA w postaci oligo do dzielących się komórek drożdży. Oligo połączy się następnie z komplementarnym regionem zmutowanego genu markerowego znajdującego się na chromosomie drożdżowym, tworząc hybrydę RNA-DNA; w drugim kroku komórki przekształcone za pomocą oligo zawierającego RNA są wysiewane na podłoża selekcyjne.

Umożliwia to wzrost komórek, w których frakcja RNA oligonukleotydu służy jako matryca do korekcji zmutowanego genu markera. Następnie przeliczono kolonie drożdży rosnące na podłożu selektywnym w celu ustalenia częstotliwości korekcji genu za pomocą oligonukleotydu zawierającego RNA; uzyskane wyniki wykazują transfer informacji genetycznej z fragmentu RNA oligonukleotydu do zmutowanego genu markera w genomie drożdży. Jest to ewidentne na podstawie analizy trawienia restrykcyjnego, analizy sekwencji oraz testu podatności na zasady.

Witajcie, jestem założycielem HIN, laboratorium dr Francescki na wydziale biologii Georgia Institute of Technology. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę generowania hybryd RNA-DNA na poziomie chromosomowym w żywych komórkach drożdży. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać, w jaki sposób komórki tolerują obecność RNA wbudowanego w genomiczne DNA oraz aby określić, jakie czynniki wpływają na stabilność hybryd RNA-DNA in vivo.

Zacznijmy zatem. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przetrzeć wszystkie materiały, które będą wykorzystywane w eksperymencie, w tym probówki do oligonukleotydów, pipety, statywy do vortexera, obszar roboczy oraz rękawice używane przez badacza, roztworem do dekontaminacji RNA. Aby wyeliminować potencjalne zanieczyszczenia RNA, przez cały czas trwania procedury należy stosować wodę wolną od RNA, odczynniki chemiczne, probówki i końcówki do pipet wolne od RNA.

Przygotuj oligonukleotyd zawierający RNA w celu przeniesienia informacji genetycznej do genomowego DNA komórek drożdży. Szczep drożdży użyty w tej procedurze zawiera zmutowany gen TRP5 z delecją dwóch zasad oraz jedną mutacją nonsensowną. Taki szczep drożdży jest mutantem atroficznym w stosunku do tryptofanu i nie tworzy kolonii na pożywkach bez tryptofanu.

Oligonukleotyd zawierający RNA jest 65-merem z dwunukleotydową wstawką DNA, zaprojektowaną w celu korekcji mutacji delecyjnej. Dodatkowo oligonukleotyd posiada jeden rybonukleotyd do korekcji mutacji nonsensownej allelu trip five; po otrzymaniu przygotuj roztwór zapasowy oligonukletydu zawierającego RNA o stężeniu 250 micromolar, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Na 16 godzin przed transformacją oligonukleotydem zawierającym RNA wykonaj szczepienie.

Pięć mililitrów bogatego podłoża płynnego YPD (yeast peptide dextrose) z mutantem drożdży trip five i hoduj komórki w temperaturze 30°C przez noc. Po inkubacji nocnej przenieś 1,5 ml kultury nocnej do 50 ml płynnego podłoża YPD. Inkubuj komórki w wytrząsarce w temperaturze 30°C przy 225 obrotach na minutę przez cztery godziny bezpośrednio przed rozmrożeniem do transformacji.

Oligonukleotydy zawierające RNA oraz odpowiadające im oligonukleotydy zawierające wyłącznie DNA należy przechowywać w lodzie. Oligonukleotydy zawierające wyłącznie DNA służą jako kontrola pozytywna. Rozcieńczyć oligonukleotydy do stężenia 50 µM w wodzie wolnej od RNaz, używając probówek wolnych od RNaz.

Przygotować 70 µL każdego oligonukleotydu, aby zapewnić wystarczającą ilość próbki do trzech transformacji jednego mola z niewielką nadwyżką; poddać denaturacji oligonukleotydy zawierające RNA oraz wyłącznie DNA na bloku grzewczym o temperaturze 100 °C przez dwie minuty, aby wyeliminować struktury drugorzędowe oligonukleotydów. Natychmiast po denaturacji umieścić probówki w lodzie i przechowywać je tam do momentu transformacji. Przygotować roztwór jeden i roztwór dwa bezpośrednio przed transformacją w probówkach wolnych od RNA. Przenieść hodowlę komórkową do probówki o pojemności 50 mL wolnej od RNA i wirować przy 3000 obr/min, co odpowiada 1,562 ×g, przez dwie minuty.

Odwirować nadsącz i przemyć komórki 50 mililitrami wody wolnej od RNase. Ponownie odwirować komórki przy 3000 obrotach na minutę przez dwie minuty. Powtórzyć ten proces pięciokrotnie, aby usunąć pożywkę hodowlaną oraz wszelkie RNazy, które mogłyby wystąpić po ostatnim wirowaniu.

Odrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w pięciu mililitrach roztworu jeden. Odwiruj próbkę z prędkością 3000 obr./min przez dwie minuty, odlej supernatant i dodaj do komórek 250 µL roztworu jeden. Taka liczba komórek jest wystarczająca do przeprowadzenia od siedmiu do ośmiu transformacji.

Odmiarkuj 50 µL zawiesiny komórkowej do każdej z siedmiu mikroprobówek do wirówki wolnych od RNA. Następnie do trzech probówek dodaj 20 µL 50 µM oligonu zawierającego RNA, do trzech probówek 20 µL 50 µM oligonu zawierającego wyłącznie DNA, a do jednej probówki, służącej jako kontrola negatywna, 20 µL sterylnej wody bez oligonu.

Następnie dodaj 300 µL roztworu dwa do każdej z siedmiu reakcji transformacyjnych. Energicznie wymieszaj próbki za pomocą vortexa. Inkubuj reakcje transformacyjne w temperaturze 30 °C przez 30 minut w shakerze.

Przenieś próbki w szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 15 minut. Następnie odwirowuj komórki z prędkością 5 000 obr./min, co odpowiada 2 236 ×g, przez cztery minuty. Usuń nadsącz i resuspenduj komórki w 100 µL sterylnej wody dla każdej z trzech probówek.

Pobrać alikwot tej zawiesiny komórkowej i rozcieńczyć każdy alikwot w wodzie sterylnej 100 000 razy. Do każdej płytki dodać około 15 sterylnych szklanych kulek i wysiać 100 µL komórek rozcieńczonych 100 000 razy na trzy płytki YPD. Wysiać 100 µL resuspenderowanych komórek z każdej reakcji transformacji na jedną płytkę Petriego z syntetyczną pożywką stałą kompletną bez tryptofanu, a następnie równomiernie wstrząsnąć płytkami.

Następnie należy usunąć kuleczki. Komórki inkubuje się na płytkach YPD w temperaturze 30 °C przez dwa dni, a komórki wysiane na syntetycznej pożywce stałej typu complete bez tryptofanu inkubuje się w temperaturze 30 °C przez cztery do pięciu dni. Należy policzyć i porównać liczbę kolonii wyrosłych na pożywce selektywnej oraz na pożywce YPD, aby obliczyć częstotliwość korekcji genu dla oligonukleotydu zawierającego RNA, dla oligonukleotydu zawierającego tylko DNA oraz dla kontroli bez oligonukleotydu.

W przypadku braku dodatku oligonukleotydów do komórek na pożywce selektywnej nie powinno pojawić się żadnych kolonii. Kilka losowo wybranych kolonii transformowanych należy wysiać na pożywkę YPD w celu uzyskania izolatów pojedynczych kolonii. Komórki inkubuje się przez dwa dni w temperaturze 30 °C do momentu wzrostu kolonii. Po inkubacji należy pobrać kilka pojedynczych kolonii i wykonać pasy na pożywce YPD oraz na pożywce selektywnej.

Po jednodniowej inkubacji na syntetycznej pełnej pożywce stałej bez tryptofanu obserwuje się wzrost komórek transformowanych oligosami, natomiast nie stwierdza się wzrostu szczepu kontrolnego bez oligosów na selektywnej syntetycznej pełnej pożywce stałej bez tryptofanu. Następnie należy zaprojektować parę starterów do amplifikacji regionu docelowego dla oligo zawierającego RNA, aby rozpocząć procedurę colony PCR. Komórki pobrane z poszczególnych plamek należy resuspender w 50 µl wody zawierającej jedną jednostkę lizazy, a następnie inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut, po czym inkubować w bloku grzewczym w temperaturze 100 °C przez pięć minut w celu rozbicia komórek i uwolnienia genomowego DNA do roztworu.

Przygotuj reakcje PCR w probówkach do PCR, dodając 10 µL zawiesiny komórkowej do każdego zestawu probówek, a następnie przeprowadź reakcję amplifikacji zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Przeanalizuj uzyskane próbki na żelu agarozowym o stężeniu 1%, aby zaobserwować produkt PCR. Ponieważ informacja genetyczna przeniesiona w tym doświadczeniu przez oligonukleotyd zawierający RNA generuje nową miejsce restrykcyjne VAN 91 1 w docelowym regionie genomu drożdży, możliwe jest zweryfikowanie prawidłowego przeniesienia informacji poprzez trawienie produktu PCR enzymem restrykcyjnym van 91 1.

Przygotować reakcję trawienia, zawierającą 6 µL buforu do PCR, 0,5 µL BSA, odpowiednią ilość enzymu restrykcyjnego oraz wodę sterylną do osiągnięcia objętości 15 µL. Próbki inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Próbkę nietrawioną oraz próbki trawione poddać elektroforezie w 2% żelu agarozy w jednym rzędzie, aby zaobserwować modyfikację genetyczną przeniesioną przez trakt RNA oligonukleotydu zawierającego RNA.

Oczyść produkty PCR, korzystając z zestawu do oczyszczania PCR, i przygotuj je do sekwencjonowania DNA. Przekaż próbki do sekwencjonowania z użyciem tych samych starterów, które posłużyły do amplifikacji produktu. Na koniec przeanalizuj wyniki sekwencjonowania DNA za pomocą oprogramowania umożliwiającego dopasowanie wielu sekwencji do wybranej sekwencji referencyjnej, aby przeprowadzić traktowanie alkaliczne oligonukleotydu zawierającego RNA dla każdej reakcji przy użyciu 1 mol oligonukleotydu zawierającego RNA lub oligonukleotydu zawierającego wyłącznie DNA w probówce o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie dodać 4 µL 1 M wodorotlenku sodu w celu przeprowadzenia hydrolizy lub 4 µL wody jako kontroli negatywnej. Próbki inkubować w kąpieli wodnej w temperaturze 65 °C przez jedną godzinę. Po inkubacji przenieść reakcję na lód.

Zneutralizuj reakcję hydrolizy za pomocą 2 µL 1,2 M kwasu solnego, 4 µL 1 M chlorku trisu oraz 4 µL wody w przypadku kontroli negatywnej. Dodaj 6 µL wody i 4 µL 1 M chlorku trisu. Przechowuj próbki w lodzie do momentu przeprowadzenia transformacji.

Jak przed chwilą opisano, komórki drożdży transformowane bez użyciem oligonukleotydów nie tworzą kolonii na syntetycznej pożywce stałej typu complete bez tryptofanu. Z kolei komórki hodowane na syntetycznej pożywce stałej typu complete bez tryptofanu, po transformacji jedną dawką oligonukleotydu zawierającego RNA, wykazują obecność kolonii.

Kolonie drożdży rosną również na syntetycznym, pełnym podłożu stałym bez tryptofanu po transformacji komórek za pomocą jednego nanomola oligonukleotydu kontrolnego, będącego odpowiednim DNA; wykrycie transferu informacji genetycznej z oligonukleotydu zawierającego RNA do chromosomalnego DNA drożdży jest ewidentne po trawieniu restrykcyjnym produktu PCR amplifikującego docelowy region genomowy za pomocą VAN 91 1, jak pokazano; widoczny jest produkt PCR loci trip. Five amplifikowany z DNA genomowego szczepu mutant trip. Five.

Przedstawiono również produkt PCR amplifikowany z DNA genomicznego pochodzącego z kolonii trip plus, poddanej działaniu oligonukleotydu zawierającego wyłącznie DNA. Na żelu przeprowadzono również analizę produktów PCR amplifikowanych z DNA genomicznego pochodzącego z kolonii trip plus, poddanych działaniu oligonukleotydu zawierającego RNA. Wyniki trawienia restrykcyjnego tych samych produktów PCR enzymem van 91 1 wykazują amplifikowaną prążek PCR o długości 278 par zasad oraz prążki produktów trawienia przez van 91 1 o długości 177 par zasad i 101 par zasad.

Sekwencjonowanie DNA wykazuje korekcję genu za pomocą zastosowanego oligonu zawierającego RNA. Przedstawiono elektroferogram DNA regionu genomowego będącego celem oligonu zawierającego RNA. Litera g w sekwencji DNA pochodzi z RG w obrębie oligonu zawierającego RNA go.

W ramce przedstawiono również insercję sekwencji bazowych CG w regionie trip five transformantów trip plus, które były celem oligosów zawierających tylko DNA oraz oligosów zawierających RNA; sekwencje te są zgodne z sekwencją konsensusową i zostały porównane z sekwencjami komórek mutantów trip five przed zastosowaniem oligosów. Naprawiający oligo zawierający RNA na dole posiada dwubazową insercję DNA oraz jednobazową substytucję RNA.

Obszary obramowane na niebiesko z żółtym cieniowaniem pokazują, że zarówno oligo zawierające RNA, jak i oligo składające się z samego DNA, precyzyjnie skorygowały mutację delecyjna oraz mutację nonsensowną we wszystkich badanych próbkach; linie przerywane zaznaczają pozycję sekwencji oligo zawierającego RNA. Obróbka alkaliczna zapobiega korekcie genu przez oligo zawierające RNA; przedstawiono częstotliwość transformacji dla oligo zawierającego RNA oraz oligo składającego się z samego DNA. Słupki błędów reprezentują standardowy błąd średniej dla trzech niezależnych transformacji dla każdego oligo.

Oligo składające się wyłącznie z DNA wykazuje podobną częstotliwość transformacji bez i z zastosowaniem obróbki wodorotlenkiem sodu. Odwrotnie, częstotliwość transformacji w przypadku oligo zawierającego RNA spada do zera po obróbce wodorotlenkiem sodu. Zatem preparat z oligo zawierającym RNA nie jest zanieczyszczony oligo składającym się wyłącznie z DNA.

Zatem obserwowana częstotliwość transformacji jest specyficzna dla oligonukleotydów zawierających RNA. Właśnie pokazaliśmy, jak utworzyć hybrydę RNA-DNA na poziomie chromosomalnym oraz przeanalizowaliśmy transfer informacji genetycznej z RNA do genomowego DNA w komórkach drożdży. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zapewnić doskonałą jakość oligonukleotydów zawierających RNA oraz pracować w warunkach wolnych od RNA.

To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.