Name: Generowanie hybryd RNA/DNA w genomowym DNA przez transformację przy użyciu oligonukleotydów zawierających RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 42 s
Description: Poznaj metodę generowania hybryd RNA/DNA w genomowym DNA drożdży poprzez transformację oligonukleotydami zawierającymi RNA. Technika ta umożliwia badanie transferu informacji genetycznej z RNA do DNA oraz korekcji mutacji w komórkach Saccharomyces cerevisiae.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana z grantu Georgia Cancer Coalition nr R9028.

Uzasadnienie
Wykorzystując oligonukleotydy Thermo Scientific Dharmacon o długości od 50 do 80 merów, przedstawiamy tutaj procedurę opartą na teście korekcji genów, dzięki której oligonukleotydy mogą przenosić informacje genetyczne do genomowego DNA komórek drożdży po przyłączeniu do docelowego DNA chromosomowego. Pomyślne celowanie za pomocą oligonukleotydów ocenia się poprzez pojawienie się kolonii drożdży wykazujących oczekiwany fenotyp. Jeśli pożądana modyfikacja genetyczna jest zawarta w jednym lub więcej rybonukleotydach wbudowanych w sekwencję oligonukleotydu, informacja genetyczna przepływa bezpośrednio z fragmentu RNA do docelowego DNA chromosomowego, w związku z czym podczas procesu celowania na poziomie chromosomowym powstaje hybryda RNA/DNA. Rybonukleotydy zawarte w oligonukleotydzie Thermo Scientific Dharmacon mogą służyć jako matryca do celowania genetycznego poprzez syntezę naprawczą DNA lub mogą zostać wbudowane w DNA i służyć jako matryca podczas replikacji DNA. W tych eksperymentach wykorzystujemy eukariotyczny model komórkowy drożdży /Saccharomyces cerevisiae/; jednak podobne podejście można zastosować również w innych organizmach lub typach komórek. W tym filmie używamy oligonukleotydu Thermo Scientific Dharmacon zaprojektowanego z homologią do docelowego locus genomowego drożdży i zawierającego jeden rybonukleotyd w środku, aby skorygować mutację w genie docelowym. Po transformacji oligonukleotydem zawierającym RNA obserwujemy korekcję docelowego miejsca z określoną częstotliwością, co wskazuje, że fragment RNA oligonukleotydu mógł zostać wbudowany w DNA chromosomowe i służyć jako matryca dla syntezy DNA podczas replikacji DNA. Informacja genetyczna przeniesiona w obrębie fragmentu RNA jest stabilnie przekazywana kolejnym pokoleniom komórek. Opisujemy tutaj etapy transformacji komórek drożdży za pomocą oligonukleotydu Thermo Scientific Dharmacon zawierającego RNA oraz metodę wykrywania przenoszenia informacji RNA do DNA chromosomowego.
A. Projekt oligonukleotydu zawierającego RNA użytego w tym eksperymencie
Zaprojektowaliśmy zawierający RNA oligonukleotyd w celu korekcji defektu genetycznego w chromosomalnym DNA drożdży S. cerevisiae w locus trp5. Szczep drożdży użyty w protokole zawiera zmutowany gen trp5 z delecją dwóch zasad i jedną mutacją nonsensowną (Ryc. 1A). Taki szczep drożdży jest mutantem aukstroficznym w stosunku do tryptofanu i nie tworzy kolonii na pożywkach pozbawionych tryptofanu. Sekwencja DNA genu TRP5 jest dostępna w bazie Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). Zawierający RNA oligonukleotyd firmy Thermo Scientific Dharmacon użyty w tym protokole to 65-mer z insercją 2 zasad DNA, zaprojektowany w celu korekcji mutacji delekcyjnej, oraz jeden rybonukleotyd zaprojektowany w celu korekcji mutacji nonsensownej allelu trp5 (Ryc. 1A). Sekwencja oligonukleotydu została zaprojektowana w następujący sposób: 
 5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-rG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Oligonukleotyd ten został zsyntezowany przez firmę Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) w skali 200 nM, odsolony, odchroniony i użyty bez oczyszczania metodą PAGE.
B. Przygotowanie oligonukleotydu zawierającego RNA do transformacji drożdży (zmodyfikowane według Storici et al., 2007 1)
<ol>
 <li>Przed rozpoczęciem prac należy przetrzeć materiały wykorzystywane w eksperymencie, w tym probówki do oligonukleotydów, pipety, vortex, statywy, obszar roboczy oraz rękawice operatora, roztworem do dekontaminacji RNaz, aby usunąć potencjalne zanieczyszczenia RNazami. Na każdym etapie należy stosować wodę wolną od RNaz, odczynniki chemiczne, probówki i końcówki do pipet wolne od RNaz. Każdy etap tego eksperymentu musi być wolny od RNaz.</li>
 <li>Otrzymany od firmy Thermo Scientific Dharmacon oligonukleotyd zawierający RNA należy resuspender w wodzie wolnej od RNaz do uzyskania roztworu zapasowego o stężeniu 250 pmoles/μl, a następnie energicznie wymieszać na vortexie, aby rozpuścić osad. Przechowywać w temperaturze -80°C.</li>
 <li>Bezpośrednio przed transformacją należy rozmrozić oligonukleotyd zawierający RNA na lodzie i rozcieńczyć go wodą wolną od RNaz do stężenia 50 pmoles/μl w probówkach wolnych od RNaz. Każda transformacja wymaga 1 nmole oligonukleotydów zawierających RNA.</li>
 <li>Wybraną ilość oligonukleotydów zawierających RNA należy denaturować na bloku grzewczym w temperaturze 100 °C przez 2 min, aby wyeliminować struktury drugorzędowe oligonukleotydów.</li>
 <li>Niezwłocznie po denaturacji należy umieścić probówkę na lodzie. Przechowywać na lodzie do momentu transformacji.</li>
 <li>Jako kontrolę w eksperymencie stosuje się odpowiadający mu oligonukleotyd zawierający wyłącznie DNA. Oligonukleotyd ten jest rozmrażany z temperatury -20 °C i przygotowywany do transformacji w taki sam sposób jak oligonukleotyd zawierający RNA, zgodnie z powyższym opisem.</li>
</ol>
C. Transformacja komórek drożdży z użyciem oligonukleotydu zawierającego RNA
<ol>
 <li>Zaszczepić 5 ml bogatego płynnego medium YPD komórkami mutantów drożdży trp5 i hodować przez noc w temperaturze 30 °C (patrz Materiały).</li>
 <li>Przenieść 1,5 ml nocnej kultury do 50 ml płynnego medium YPD.</li>
 <li>Inkubować komórki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C (225 rpm) przez 4 h.</li>
 <li>Przygotować Roztwór 1 i Roztwór 2 bezpośrednio przed transformacją w probówkach wolnych od RNaz (patrz Materiały).</li>
 <li>Przenieść kulturę komórkową do probówki 50 ml wolnej od RNaz i wirować przy 3000 rpm, co odpowiada 1562 g, przez 2 min. Osad z precypitacji komórek ma objętość ok. 0,3 cm3.</li>
 <li>Usunąć nadsącz i przemyć komórki 50 ml wody wolnej od RNaz, a następnie wirować przy 3000 rpm przez 2 min.</li>
 <li>Powtórzyć krok 6 pięciokrotnie, aby w maksymalnym stopniu usunąć medium hodowlane oraz ewentualnie obecne w nim RNazy.</li>
 <li>Usunąć nadsącz i resuspendować komórki w 5 ml Roztworu 1, a następnie wirować przy 3000 rpm przez 2 min.</li>
 <li>Usunąć nadsącz i resuspendować komórki w 250 μl Roztworu 1. Taka ilość komórek jest wystarczająca do 7-8 transformacji.</li>
 <li>Odnieść 50 μl zawiesiny komórkowej do probówek mikrocentryfugowych wolnych od RNaz, dodać 20 μl roboczego roztworu oligo zawierającego RNA (1 nmole), lub 20 μl roboczego roztworu oligo zawierającego tylko DNA (1 nmole), lub 20 μl sterylnej wody bez oligo w celu uzyskania kontroli negatywnej. Następnie do każdej reakcji transformacji dodać 300 μl Roztworu 2. W procesie transformacji nie ma potrzeby dodawania DNA z nasienia łososia, ponieważ same oligosy pełnią funkcję nośnika.</li>
 <li>Wymieszać intensywnie na vortexie w celu homogenizacji składników.</li>
 <li>Inkubować reakcje transformacji w temperaturze 30 °C przez 30 min w inkubatorze z wytrząsaniem.</li>
 <li>Przeprowadzić szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 15 min.</li>
 <li>Zwirirmek komórki przy 5000 rpm, co odpowiada 2236 g, przez 4 min.</li>
 <li>Usunąć nadsącz i resuspendować komórki w 100 μl sterylnej wody.</li>
 <li>Pobrać alikvot tej zawiesiny komórkowej i rozcieńczyć go sterylną wodą 100 000-krotnie, a następnie wysiać komórki na jedną płytkę YPD, używając ok. 15 sterylnych szklanych kulek, i inkubować w temperaturze 30 °C przez 2 dni.</li>
 <li>Wysiać wszystkie resuspendowane komórki z każdej reakcji transformacji na jedną płytkę Petri z syntetycznym pełnym medium stałym bez tryptofanu (SC-Trp), używając ok. 15 sterylnych szklanych kulek, i inkubować w temperaturze 30 °C przez 4-5 dni (Rysunek 2).</li>
</ol>
D. Analiza korekcji genu za pomocą oligo zawierającego RNA
<ol>
 <li>Policz liczbę kolonii wyrosłych na pożywce selektywnej (Rysunek 2) oraz na pożywce YPD, aby obliczyć częstotliwość korekcji genu dla oligo zawierającego RNA, oligo zawierającego tylko DNA oraz dla kontroli bez oligo. Porównaj otrzymane wartości. Częstość spontanicznej rewersji alleli trp5 z delecjami dwóch zasad i mutacją nonsensowną wynosi mniej niż 10-9 w używanym szczepie drożdży, zatem w przypadku nie dodania oligo do komórek nie spodziewamy się powstania kolonii na pożywce selektywnej.</li>
 <li>Wysew pasmowo kilka losowo wybranych kolonii transformantów na pożywkę YPD w celu uzyskania izolatów pojedynczych kolonii. Odczekaj dwa dni do wzrostu kolonii, a następnie pobierz kilka (co najmniej 5) pojedynczych kolonii i wykonaj plamki na pożywce YPD oraz na pożywce selektywnej.</li>
 <li>Zaprojektuj parę starterów do amplifikacji regionu (250-1,000 bp) ukierunkowanego przez oligo zawierające RNA za pomocą kolonialnej PCR (Rysunek 1B). Procedura kolonialnej PCR przebiega następująco (zmodyfikowana według Storici and Resnick, 2006 2).
 <ol>
 <li>Resuspenduj komórki (ok. 1 mm3) pobrane z poszczególnych plamek w 50 μl wody i dodaj 1 jednostkę litykazy. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 min, a następnie inkubuj w bloku grzejnym w temperaturze 100 °C przez 5 min, aby rozbić komórki i uwolnić genomowe DNA do roztworu.</li>
 <li>Warunki PCR: Reakcja PCR obejmuje 10 μl roztworu resuspensji komórek, po 50 pmoles starterów forward i reverse, 1 μl 10 mM dNTPs, 1 jednostkę polimerazy Taq, 5 μl buforu 10x i jest uzupełniana sterylną wodą do końcowej objętości 50 μl. Program PCR: 3 min w 95 °C; 30 cykli: 30 s w 95 °C, 30 s w 55 °C i 1 min w 72 °C; końcowy czas elongacji 7 min w 72 °C; następnie próbki są przechowywane w 4 °C. Dla tej reakcji przyjęto czas elongacji 1 min/kb.</li>
 <li>Po PCR próbki są rozdzielane na żelu agarozowym 1% lub 2% (w zależności od oczekiwanej wielkości produktu PCR) w celu obserwacji produktu PCR (Rysunek 3).</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Jeśli informacja genetyczna przeniesiona przez oligo zawierające RNA generuje nową sekwencję rozpoznawaną przez enzym restrykcyjny w docelowym regionie genomu drożdży (Rysunek 1B), można zweryfikować prawidłowy transfer informacji poprzez trawienie produktu PCR odpowiednim enzymem restrykcyjnym. Jeśli oligo zawierające RNA nie generuje miejsca restrykcyjnego, przejdź do kroku 6. Traw produkty PCR za pomocą specyficznego enzymu restrykcyjnego. Reakcja trawienia obejmuje 6 μl produktu PCR, bufor, BSA (może nie być wymagane dla niektórych enzymów, patrz instrukcja do użytego enzymu), 0,5 μl enzymu restrykcyjnego i sterylną wodę do 15 μl. Próbki są inkubowane przez 1 h w temperaturze specyficznej dla użytego enzymu.</li>
 <li>Rozdziel próbkę nietrawioną wraz z próbkami trawionymi w jednym rzędzie żelu agarozowego 2%, aby zaobserwować modyfikację genetyczną przeniesioną przez fragment RNA oligo zawierającego RNA (Rysunek 3).</li>
 <li>Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR i przygotuj je do sekwencjonowania DNA. Przekaż próbki do sekwencjonowania z użyciem tych samych starterów, które posłużyły do amplifikacji produktu.</li>
 <li>Przeanalizuj wyniki sekwencjonowania DNA przy użyciu oprogramowania umożliwiającego dopasowanie wielu sekwencji do wybranej sekwencji referencyjnej (Rysunek 4).</li>
</ol>
E. Traktowanie zasadą oligonukleotydu zawierającego RNA (Rysunek 5)
<ol>
 <li>Do każdej reakcji, do probówki o pojemności 1,5 ml, dodaj 1 nmole (4 μl roztworu stokowego o stężeniu 250 pmoles/μl) oligonukleotydu zawierającego RNA lub oligonukleotydu DNA.</li>
 <li>W celu przeprowadzenia hydrolizy dodaj 4 μl 1 M NaOH lub, alternatywnie, jako kontrolę negatywną dodaj 4 μl H2O, a następnie inkubuj w kąpieli wodnej w temperaturze 65° C przez 1 h. Po tym czasie przenieś próbkę z kąpieli wodnej na lód.</li>
 <li>Zneutralizuj próbkę, dodając 2 μl 1,2 M HCl, 4 μl 1 M Tris-HCl oraz 4 μl H2O lub, w przypadku kontroli negatywnej, 6 μl H2O i 4 μl 1 M Tris-HCl. Przechowuj na lodzie do momentu transformacji.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig1.jpg" alt="Schemat edycji genów; zmutowane DNA poprawione za pomocą oligo RNA; zawiera miejsce Van91I." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Schematyczna ilustracja wadliwego genu trp5 oraz allelu TRP5 poprawionego za pomocą oligo zawierającego RNA. A) Zmutowany gen trp5 zawiera delecję 2 zasad (czarne trójkąty) oraz nonsensowną mutację 1 zasady (gwiazdka). Jednoniciowe oligo zawierające RNA z insercją 2 zasad (niebieska pętla) i substytucją 1 zasady RNA (czerwony prostokąt), tworzącą miejsce restrykcyjne dla enzymu Van91I (oznaczone nawiasem), jest transformowane do komórek drożdży w celu naprawy defektów genetycznych genu trp5. B) Po naprawie genu TRP5 za pomocą oligo zawierającego RNA (poprawione zasady zaznaczono niebieskimi prostokątami), w genie TRP5 powstaje miejsce Van91I. Fragment o długości 278 bp, zawierający tylko jedno miejsce restrykcyjne Van91I w genie TRP5, jest amplifikowany metodą PCR za pomocą pary starterów (P1 i P2). Przedstawiono również fragmenty o długości 177 bp i 101 bp, powstałe po trawieniu produktu PCR P1 i P2 enzymem Van91I.
<img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig2.jpg" alt="Porównawcza analiza wzrostu kolonii bakteryjnych; seria szalek Petriego, wyniki eksperymentu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Wynik transformacji z użyciem oligo zawierającego RNA. A) Komórki drożdży przekształcone bez użycia oligo nie tworzą żadnych kolonii na podłożu SC-Trp, patrz płytki a-b. B) Płytki c-g przedstawiają kolonie drożdży rosnące na SC-Trp po transformacji komórek 1 nmole oligo zawierającego RNA. C) Płytki h-l przedstawiają kolonie drożdży rosnące na SC-Trp po transformacji komórek 1 nmole odpowiadającego kontrolnego oligo składającego się wyłącznie z DNA.
<img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig3.jpg" alt="Żel elektroforetyczny do rozdziału DNA, pokazujący prążki wskazujące wielkość fragmentów w parach zasad (bp)." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Wykrywanie transferu informacji genetycznej z oligonukleotydu zawierającego RNA do chromosomalnego DNA drożdży poprzez trawienie restrykcyjne produktu PCR amplifikującego docelowy region genomowy. Elektroforeza w 2% żelu agarozowym próbek PCR amplifikowanych za pomocą P1 i P2 i trawionych enzymem restrykcyjnym Van91I. Ścieżki 1, 8 i 15: drabinka DNA z zaznaczonymi po lewej stronie wielkościami 100, 200, 300, 400 i 500 bp; ścieżka 2: produkt PCR locus trp5 amplifikowany z DNA genomowego szczepu mutanta trp5; ścieżka 3: produkt PCR amplifikowany z DNA genomowego pochodzącego z kolonii Trp+ celowanego przez oligonukleotyd zawierający samo DNA; ścieżki 4-7: produkty PCR amplifikowane z DNA genomowego pochodzącego z kolonii Trp+ celowanych przez oligonukleotyd zawierający RNA; ścieżki 9 do 14: trawienie restrykcyjne enzymem Van91I produktów PCR ze ścieżek 2 do 7. Obecność nienaruszonych prążków produktu PCR w ścieżkach 10 do 14 można wyjaśnić częściowym trawieniem przez Van91I w locus TRP5 (CCACATTCTGG). Biorąc pod uwagę, że miejsce cięcia dla Van91I (CCANNNN NTGG) może mieć wiele sekwencji, miejsce wygenerowane w TRP5 może nie być najbardziej optymalnym celem dla enzymu. W rzeczywistości, po sekwencjonowaniu DNA wszystkich powyższych produktów PCR, nie wykryto żadnych dodatkowych zmian poza tymi wprowadzonymi przez oligonukleotydy (patrz Rysunek 4). Prążek PCR o wielkości 278 bp amplifikowany starterami P1 i P2 oraz prążki produktów trawienia przez Van91I o wielkości 177 bp i 101 bp są wskazane strzałkami po prawej stronie.
<img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig4tmb.jpg" border="0" alt="Analiza sekwencjonowania DNA, wyniki elektroforezy żelowej z dopasowaniem oligo-RNA, porównanie kodu genetycznego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4Thumb"> Rycina 4. Wyniki sekwencjonowania DNA wykazujące korekcję genu za pomocą oligo zawierającego RNA. A) Elektroferogram DNA regionu genomicznego będącego celem oligo zawierającego RNA. G w sekwencji DNA (obramowane niebieską ramką) pochodzi z rG w oligo zawierającym RNA. Obramkowana jest również insercja zasad CG. Wyniki sekwencjonowania ze wszystkich pozostałych produktów PCR są równie wyraźne, a sygnały fluorescencyjne znajdują się znacznie powyżej tła. B) Sekwencje regionu TRP5 transformantów Trp+ będących celem oligo składającego się wyłącznie z DNA (T1) oraz oligo zawierającego RNA (T2-T5) są zgodne w sekwencji konsensus na górze i zostały porównane z sekwencją mutantów trp5 przed wprowadzeniem oligo (DNA genomiczne, zaznaczone na czerwono). Naprawiające oligo zawierające RNA na dole posiada dwuzasadową insercję DNA oraz jednozasadową (G) substytucję RNA zaznaczoną na czerwono. Regiony obramowane niebieską ramką z żółtym cieniowaniem pokazują, że oligo zawierające RNA, tak jak oligo składające się wyłącznie z DNA, precyzyjnie skorygowało mutację delecyjną i mutację nonsensowną we wszystkich badanych próbkach. Linie przerywane wyznaczają pozycję sekwencji oligo zawierającego RNA. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2152/2152fig4.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 4.
<img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig5.jpg" alt="Wykres słupkowy przedstawiający Log transformantów Trp⁺ na 10⁷ komórek z NaOH i bez NaOH; uwzględniono słupki błędów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
 Rycina 5. Obróbka alkaliczna zapobiega korekcji genu przez oligo zawierający RNA. Częstotliwość transformacji za pomocą oligo zawierającego RNA (R) przedstawiono na czerwonym słupku, a częstotliwość transformacji za pomocą oligo składającego się z samego DNA (D) na niebieskich słupkach. Słupki błędów reprezentują standardowy błąd średniej dla 3 niezależnych transformacji dla każdego oligo. Oligo składające się z samego DNA wykazuje podobną częstotliwość transformacji bez i z zastosowaniem obróbki NaOH. W przeciwieństwie do tego, częstotliwość transformacji za pomocą oligo zawierającego RNA spada do 0 po obróbce NaOH. Zatem preparat z oligo zawierającym RNA nie jest zanieczyszczony oligo składającym się z samego DNA, co oznacza, że obserwowana częstotliwość transformacji jest specyficzna dla oligo zawierającego RNA.

<ol><li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-templated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li>
<li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li>
<li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li>
<li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+H%3A+the+enzymes+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li>
</ol>

Produkcja wideo do tego artykułu została sponsorowana przez firmę Thermo Fisher Scientific, która produkuje odczynniki i instrumenty wykorzystane w niniejszej publikacji.

Fakt, że RNA może przekazywać informacje genetyczne bezpośrednio do genomowego DNA w komórkach, odkryto dzięki zastosowaniu syntetycznych oligosów zawierających RNA (oligosy zsyntezowane przez Dharmacon) 1. Stanowiło to dowód koncepcji, że komórki mogą wykorzystywać cząsteczki zawierające RNA lub sekwencje złożone wyłącznie z RNA jako matryce do syntezy DNA. Zastosowanie oligosów zawierających RNA doprowadziło nie tylko do wykazania, że informacje genetyczne mogą być przekazywane bezpośrednio z RNA do genomowego DNA bez konieczności tworzenia pośredniej kopii DNA odwrotnej transkrypcji, ale także do udowodnienia, że RNA może służyć jako matryca homologiczna w naprawie uszkodzeń DNA 1,3. Oligosy mogą składać się wyłącznie z RNA lub zawierać tylko jeden rybonukleotyd wbudowany w sekwencję DNA, jak w przedstawionym tutaj przykładzie. Oligo zawierający RNA posiada jeden wbudowany rybonukleotyd zaprojektowany w celu korekcji mutacji nonsensownej w wadliwym allelu genomowym trp5. Przeniesienie informacji genetycznej z rybonukleotydu do genomowego DNA objawia się zmianą fenotypu (wzrost komórek na pożywce pozbawionej tryptofanu) w komórkach docelowych. Częstość korekcji genu uzyskaną za pomocą oligo zawierającego RNA jest mierzona i porównywana z częstością dla kontrolnego oligo złożonego wyłącznie z DNA. Przeprowadzając ten test korekcji genów w różnych tłach komórkowych, w których mutujemy różne geny drożdży, możemy wykryć, który czynnik lub czynniki specyficznie wpływają na celowanie oligosów zawierających RNA. W ten sposób możemy odkryć mechanizmy, za pomocą których komórki regulują stabilność hybryd RNA/DNA. Poprzez projektowanie różnych wariantów oligosów zawierających RNA możemy określić prawdopodobieństwo, że dany odcinek RNA posłuży jako matryca w modyfikacji DNA, a także określić stabilność specyficznych sekwencji RNA wbudowanych w DNA. Co więcej, możemy zidentyfikować, jakie są preferowane substraty in vivo dla czynników oddziałujących z hybrydami RNA/DNA.
Choć przeprowadzono kilka badań in vitro, wykorzystujących głównie krótkie oligonukleotydy zawierające RNA, w celu scharakteryzowania funkcji czynników zdolnych do rozpoznawania RNA w hybrydzie z DNA, takich jak enzymy RNaza H 4, funkcje in vivo RNaz H, a także tożsamość innych białek, które mogłyby wpływać na stabilność hybrydy RNA/DNA, pozostają w większości nieznane. Możliwość wykorzystania oligonukleotydów zawierających RNA o znacznej długości (50 do 80-merów) i optymalnej jakości (takich jak oligonukleotydy zawierające RNA firmy Thermo Scientific Dharmacon) otworzyła drogę do badania szerokiego zakresu procesów molekularnych bezpośrednio in vivo w wybranych komórkach. Jak pokazano w tym filmie, transformacja z użyciem oligonukleotydów zawierających RNA wymaga w zasadzie tylko kilku dodatkowych kroków w porównaniu z transformacją za pomocą cząsteczek DNA, aby zapobiec degradacji przez RNazy. Zatem transformacja z użyciem oligonukleotydów zawierających RNA nie ogranicza się do systemu drożdżowego, lecz może być zastosowana w każdym organizmie lub typie komórek, w których transformacja za pomocą oligonukleotydów DNA jest efektywna.
Podsumowując, celowanie w komórki za pomocą oligosów zawierających RNA daje możliwość generowania hybryd RNA/DNA oraz rybonukleotydów wbudowanych w DNA in vivo w komórkach. Stabilność, funkcję i konsekwencje tych wygenerowanych in vivo hybryd RNA/DNA można analizować i charakteryzować, co potencjalnie pozwala na odkrycie nieznanych mechanizmów naprawy DNA oraz ujawnienie nowych strategii celowania w geny.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title">A. Odczynniki i pożywki do transformacji (zmodyfikowane na podstawie Storici i Resnick, 2006 &lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;YPD (Yeast Peptone Dextrose): Na 1 L: 10 g ekstraktu drożdżowego, 20 g peptonu sojowego, 20 g dekstrozy. Do sporządzenia stałej pożywki YPD dodać 15 g agaru. Autoklawować przed użyciem. Przechowywać w temperaturze pokojowej.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Roztwór 1: 0,1 M octanu litu. Przygotować bezpośrednio przed transformacją. Roztwór 1 jest roztworem roboczym, dlatego przygotowuje się go bezpośrednio z proszku. Nie sporządza się roztworu zapasowego. Przechowywać w temperaturze pokojowej. LiAc zwiększa przepuszczalność ściany komórkowej drożdży dla DNA. &lt;/li&gt; &lt;li&gt;Roztwór 2: 0,1 M octanu litu i 50% glikolu polietylenowego 4000. Roztwór 2 jest również roztworem roboczym i przygotowuje się go bezpośrednio z proszku. Nie sporządza się roztworu zapasowego. Przechowywać w temperaturze pokojowej. PEG wspomaga osadzanie się oligonukleotydów na komórkach drożdży.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Oligonukleotydy zawierające RNA (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80-mery, odsolone, odchronione i nieoczyszczone. Resuspendować do stężenia 250 pmoles/&amp;mu;l. Przechowywać w temperaturze -80 &amp;deg;C.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Oligonukleotydy zawierające tylko DNA, 50-80-mery, odsolone i nieoczyszczone. Resuspendować do stężenia 50 pmoles/&amp;mu;l. Przechowywać w temperaturze -20 &amp;deg;C.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Stała pożywka SC-Trp (syntetyczna pożywka kompletna pozbawiona tryptofanu).&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Szklane koraliki o średnicy 0,5 cm, wysterylizowane w autoklawie. &lt;/li&gt; &lt;li&gt;RNase-off: roztwór do dekontaminacji z RNaz.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Sterylne probówki do wirowania, wolne od DNaz i RNaz.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Sterylne probówki stożkowe, wolne od DNaz i RNaz.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Sterylne końcówki do pipet z filtrem ZAP, wolne od DNaz i RNaz: 1-200 µL, 100-1000 µL.&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title">B. Materiały do colony PCR.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;Startery DNA, odsolone i nieoczyszczone. Rozpuścić w sterylnej wodzie do stężenia 50 pmoles/&amp;mu;l. Przechowywać w temperaturze -20 &amp;deg;C.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Polimeraza DNA Taq, bufor, dNTPs.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Probówki do PCR.&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title">C. Oczyszczanie produktów PCR.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;Zestaw do oczyszczania PCR.&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title">D. Elektroforeza w żelu.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;Agaroza.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1 x bufor do elektroforezy TBE (45 mM Tris-boranu i 1 mM etylenodiaminotetraoctanu) rozcieńczony z 10x TBE. &lt;/li&gt; &lt;li&gt;Prefabrykowany marker masy cząsteczkowej.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Barwnik do nakładania DNA.&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title">E. Trawienie restrykcyjne.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;Enzymy restrykcyjne, bufory 10x, BSA.&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title">F. Obróbka alkaliczna oligonukleotydu zawierającego RNA.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;1 M roztwór NaOH.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1,2 M roztwór HCl.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1 M roztwór Tris-HCl, pH 7,4.&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

generowanie hybryd rna/dna w genomowym dna poprzez transformację z wykorzystaniem oligonukleotydów zawierających rna

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Syntetyczne krótkie polimery kwasów nukleinowych, oligonukleotydy (oligos), są najbardziej funkcjonalnymi i rozpowszechnionymi narzędziami biologii molekularnej. Oligonukleotydy mogą być produkowane w celu uzyskania dowolnej pożądanej sekwencji DNA lub RNA i mogą być przygotowywane z uwzględnieniem szerokiej gamy modyfikacji zasad i cukrów. Ponadto oligonukleotydy mogą być projektowane tak, aby naśladować specyficzne zmiany w kwasach nukleinowych, a tym samym mogą służyć jako istotne narzędzia do badania efektów uszkodzeń DNA i mechanizmów naprawy. Stwierdziliśmy, że zawierające RNA oligonukleotydy firmy Thermo Scientific Dharmacon o długości od 50 do 80 nukleotydów mogą być szczególnie odpowiednie do badania in vivo funkcji i konsekwencji hybryd RNA/DNA w chromosomach oraz rybonukleotydów wbudowanych w DNA. Hybrydy RNA/DNA mogą łatwo powstawać podczas replikacji, naprawy i transkrypcji DNA, jednak niewiele wiadomo o stabilności hybryd RNA/DNA w komórkach oraz o tym, w jakim stopniu hybrydy te mogą wpływać na integralność genetyczną komórek. Z tego względu oligonukleotydy zawierające RNA stanowią idealny wektor do wprowadzania rybonukleotydów do chromosomalnego DNA i generowania hybryd RNA/DNA o wybranej długości i składzie zasad. Przedstawiamy tutaj protokół inkorporacji rybonukleotydów do genomu eukariotycznego systemu modelowego drożdży /Saccharomyces cerevisiae/. Nasze laboratorium wykorzystało jednak oligonukleotydy zawierające RNA firmy Thermo Scientific Dharmacon do generowania hybryd RNA/DNA na poziomie chromosomalnym w różnych systemach komórkowych, od bakterii po komórki ludzkie.

Niniejsza praca pokazuje, jak tworzyć hybrydy RNA/DNA na poziomie chromosomowym oraz wykazać transfer informacji genetycznej z RNA do genomowego DNA w komórkach drożdży.

Generowanie hybryd RNA/DNA w genomowym DNA poprzez transformację z wykorzystaniem oligonukleotydów zawierających RNA

Syntetyczne krótkie polimery kwasów nukleinowych, oligonukleotydy (oligo), są najbardziej funkcjonalnymi i rozpowszechnionymi narzędziami biologii molekularnej. Oligonukleotydy mogą być...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest generowanie hybryd RNA-DNA na poziomie chromosomalnym w żywych komórkach drożdży poprzez transformację komórek drożdży oligosami zawierającymi RNA. Osiąga się to poprzez wprowadzenie pojedynczej nici RNA w postaci oligo do dzielących się komórek drożdży. Oligo połączy się następnie z komplementarnym regionem zmutowanego genu markerowego znajdującego się na chromosomie drożdżowym, tworząc hybrydę RNA-DNA; w drugim kroku komórki przekształcone za pomocą oligo zawierającego RNA są wysiewane na podłoża selekcyjne.Umożliwia to wzrost komórek, w których frakcja RNA oligonukleotydu służy jako matryca do korekcji zmutowanego genu markera. Następnie przeliczono kolonie drożdży rosnące na podłożu selektywnym w celu ustalenia częstotliwości korekcji genu za pomocą oligonukleotydu zawierającego RNA; uzyskane wyniki wykazują transfer informacji genetycznej z fragmentu RNA oligonukleotydu do zmutowanego genu markera w genomie drożdży. Jest to ewidentne na podstawie analizy trawienia restrykcyjnego, analizy sekwencji oraz testu podatności na zasady.Witajcie, jestem założycielem HIN, laboratorium dr Francescki na wydziale biologii Georgia Institute of Technology. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę generowania hybryd RNA-DNA na poziomie chromosomowym w żywych komórkach drożdży. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać, w jaki sposób komórki tolerują obecność RNA wbudowanego w genomiczne DNA oraz aby określić, jakie czynniki wpływają na stabilność hybryd RNA-DNA in vivo.Zacznijmy zatem. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przetrzeć wszystkie materiały, które będą wykorzystywane w eksperymencie, w tym probówki do oligonukleotydów, pipety, statywy do vortexera, obszar roboczy oraz rękawice używane przez badacza, roztworem do dekontaminacji RNA. Aby wyeliminować potencjalne zanieczyszczenia RNA, przez cały czas trwania procedury należy stosować wodę wolną od RNA, odczynniki chemiczne, probówki i końcówki do pipet wolne od RNA.Przygotuj oligonukleotyd zawierający RNA w celu przeniesienia informacji genetycznej do genomowego DNA komórek drożdży. Szczep drożdży użyty w tej procedurze zawiera zmutowany gen TRP5 z delecją dwóch zasad oraz jedną mutacją nonsensowną. Taki szczep drożdży jest mutantem atroficznym w stosunku do tryptofanu i nie tworzy kolonii na pożywkach bez tryptofanu.Oligonukleotyd zawierający RNA jest 65-merem z dwunukleotydową wstawką DNA, zaprojektowaną w celu korekcji mutacji delecyjnej. Dodatkowo oligonukleotyd posiada jeden rybonukleotyd do korekcji mutacji nonsensownej allelu trip five; po otrzymaniu przygotuj roztwór zapasowy oligonukletydu zawierającego RNA o stężeniu 250 micromolar, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Na 16 godzin przed transformacją oligonukleotydem zawierającym RNA wykonaj szczepienie.Pięć mililitrów bogatego podłoża płynnego YPD (yeast peptide dextrose) z mutantem drożdży trip five i hoduj komórki w temperaturze 30°C przez noc. Po inkubacji nocnej przenieś 1,5 ml kultury nocnej do 50 ml płynnego podłoża YPD. Inkubuj komórki w wytrząsarce w temperaturze 30°C przy 225 obrotach na minutę przez cztery godziny bezpośrednio przed rozmrożeniem do transformacji.Oligonukleotydy zawierające RNA oraz odpowiadające im oligonukleotydy zawierające wyłącznie DNA należy przechowywać w lodzie. Oligonukleotydy zawierające wyłącznie DNA służą jako kontrola pozytywna. Rozcieńczyć oligonukleotydy do stężenia 50 µM w wodzie wolnej od RNaz, używając probówek wolnych od RNaz.Przygotować 70 µL każdego oligonukleotydu, aby zapewnić wystarczającą ilość próbki do trzech transformacji jednego mola z niewielką nadwyżką; poddać denaturacji oligonukleotydy zawierające RNA oraz wyłącznie DNA na bloku grzewczym o temperaturze 100 °C przez dwie minuty, aby wyeliminować struktury drugorzędowe oligonukleotydów. Natychmiast po denaturacji umieścić probówki w lodzie i przechowywać je tam do momentu transformacji. Przygotować roztwór jeden i roztwór dwa bezpośrednio przed transformacją w probówkach wolnych od RNA. Przenieść hodowlę komórkową do probówki o pojemności 50 mL wolnej od RNA i wirować przy 3000 obr/min, co odpowiada 1,562 ×g, przez dwie minuty.Odwirować nadsącz i przemyć komórki 50 mililitrami wody wolnej od RNase. Ponownie odwirować komórki przy 3000 obrotach na minutę przez dwie minuty. Powtórzyć ten proces pięciokrotnie, aby usunąć pożywkę hodowlaną oraz wszelkie RNazy, które mogłyby wystąpić po ostatnim wirowaniu.Odrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w pięciu mililitrach roztworu jeden. Odwiruj próbkę z prędkością 3000 obr./min przez dwie minuty, odlej supernatant i dodaj do komórek 250 µL roztworu jeden. Taka liczba komórek jest wystarczająca do przeprowadzenia od siedmiu do ośmiu transformacji.Odmiarkuj 50 µL zawiesiny komórkowej do każdej z siedmiu mikroprobówek do wirówki wolnych od RNA. Następnie do trzech probówek dodaj 20 µL 50 µM oligonu zawierającego RNA, do trzech probówek 20 µL 50 µM oligonu zawierającego wyłącznie DNA, a do jednej probówki, służącej jako kontrola negatywna, 20 µL sterylnej wody bez oligonu.Następnie dodaj 300 µL roztworu dwa do każdej z siedmiu reakcji transformacyjnych. Energicznie wymieszaj próbki za pomocą vortexa. Inkubuj reakcje transformacyjne w temperaturze 30 °C przez 30 minut w shakerze.Przenieś próbki w szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 15 minut. Następnie odwirowuj komórki z prędkością 5 000 obr./min, co odpowiada 2 236 ×g, przez cztery minuty. Usuń nadsącz i resuspenduj komórki w 100 µL sterylnej wody dla każdej z trzech probówek.Pobrać alikwot tej zawiesiny komórkowej i rozcieńczyć każdy alikwot w wodzie sterylnej 100 000 razy. Do każdej płytki dodać około 15 sterylnych szklanych kulek i wysiać 100 µL komórek rozcieńczonych 100 000 razy na trzy płytki YPD. Wysiać 100 µL resuspenderowanych komórek z każdej reakcji transformacji na jedną płytkę Petriego z syntetyczną pożywką stałą kompletną bez tryptofanu, a następnie równomiernie wstrząsnąć płytkami.Następnie należy usunąć kuleczki. Komórki inkubuje się na płytkach YPD w temperaturze 30 °C przez dwa dni, a komórki wysiane na syntetycznej pożywce stałej typu complete bez tryptofanu inkubuje się w temperaturze 30 °C przez cztery do pięciu dni. Należy policzyć i porównać liczbę kolonii wyrosłych na pożywce selektywnej oraz na pożywce YPD, aby obliczyć częstotliwość korekcji genu dla oligonukleotydu zawierającego RNA, dla oligonukleotydu zawierającego tylko DNA oraz dla kontroli bez oligonukleotydu.W przypadku braku dodatku oligonukleotydów do komórek na pożywce selektywnej nie powinno pojawić się żadnych kolonii. Kilka losowo wybranych kolonii transformowanych należy wysiać na pożywkę YPD w celu uzyskania izolatów pojedynczych kolonii. Komórki inkubuje się przez dwa dni w temperaturze 30 °C do momentu wzrostu kolonii. Po inkubacji należy pobrać kilka pojedynczych kolonii i wykonać pasy na pożywce YPD oraz na pożywce selektywnej.Po jednodniowej inkubacji na syntetycznej pełnej pożywce stałej bez tryptofanu obserwuje się wzrost komórek transformowanych oligosami, natomiast nie stwierdza się wzrostu szczepu kontrolnego bez oligosów na selektywnej syntetycznej pełnej pożywce stałej bez tryptofanu. Następnie należy zaprojektować parę starterów do amplifikacji regionu docelowego dla oligo zawierającego RNA, aby rozpocząć procedurę colony PCR. Komórki pobrane z poszczególnych plamek należy resuspender w 50 µl wody zawierającej jedną jednostkę lizazy, a następnie inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut, po czym inkubować w bloku grzewczym w temperaturze 100 °C przez pięć minut w celu rozbicia komórek i uwolnienia genomowego DNA do roztworu.Przygotuj reakcje PCR w probówkach do PCR, dodając 10 µL zawiesiny komórkowej do każdego zestawu probówek, a następnie przeprowadź reakcję amplifikacji zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Przeanalizuj uzyskane próbki na żelu agarozowym o stężeniu 1%, aby zaobserwować produkt PCR. Ponieważ informacja genetyczna przeniesiona w tym doświadczeniu przez oligonukleotyd zawierający RNA generuje nową miejsce restrykcyjne VAN 91 1 w docelowym regionie genomu drożdży, możliwe jest zweryfikowanie prawidłowego przeniesienia informacji poprzez trawienie produktu PCR enzymem restrykcyjnym van 91 1.Przygotować reakcję trawienia, zawierającą 6 µL buforu do PCR, 0,5 µL BSA, odpowiednią ilość enzymu restrykcyjnego oraz wodę sterylną do osiągnięcia objętości 15 µL. Próbki inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Próbkę nietrawioną oraz próbki trawione poddać elektroforezie w 2% żelu agarozy w jednym rzędzie, aby zaobserwować modyfikację genetyczną przeniesioną przez trakt RNA oligonukleotydu zawierającego RNA.Oczyść produkty PCR, korzystając z zestawu do oczyszczania PCR, i przygotuj je do sekwencjonowania DNA. Przekaż próbki do sekwencjonowania z użyciem tych samych starterów, które posłużyły do amplifikacji produktu. Na koniec przeanalizuj wyniki sekwencjonowania DNA za pomocą oprogramowania umożliwiającego dopasowanie wielu sekwencji do wybranej sekwencji referencyjnej, aby przeprowadzić traktowanie alkaliczne oligonukleotydu zawierającego RNA dla każdej reakcji przy użyciu 1 mol oligonukleotydu zawierającego RNA lub oligonukleotydu zawierającego wyłącznie DNA w probówce o pojemności 1,5 mililitra.Następnie dodać 4 µL 1 M wodorotlenku sodu w celu przeprowadzenia hydrolizy lub 4 µL wody jako kontroli negatywnej. Próbki inkubować w kąpieli wodnej w temperaturze 65 °C przez jedną godzinę. Po inkubacji przenieść reakcję na lód.Zneutralizuj reakcję hydrolizy za pomocą 2 µL 1,2 M kwasu solnego, 4 µL 1 M chlorku trisu oraz 4 µL wody w przypadku kontroli negatywnej. Dodaj 6 µL wody i 4 µL 1 M chlorku trisu. Przechowuj próbki w lodzie do momentu przeprowadzenia transformacji.Jak przed chwilą opisano, komórki drożdży transformowane bez użyciem oligonukleotydów nie tworzą kolonii na syntetycznej pożywce stałej typu complete bez tryptofanu. Z kolei komórki hodowane na syntetycznej pożywce stałej typu complete bez tryptofanu, po transformacji jedną dawką oligonukleotydu zawierającego RNA, wykazują obecność kolonii.Kolonie drożdży rosną również na syntetycznym, pełnym podłożu stałym bez tryptofanu po transformacji komórek za pomocą jednego nanomola oligonukleotydu kontrolnego, będącego odpowiednim DNA; wykrycie transferu informacji genetycznej z oligonukleotydu zawierającego RNA do chromosomalnego DNA drożdży jest ewidentne po trawieniu restrykcyjnym produktu PCR amplifikującego docelowy region genomowy za pomocą VAN 91 1, jak pokazano; widoczny jest produkt PCR loci trip. Five amplifikowany z DNA genomowego szczepu mutant trip. Five.Przedstawiono również produkt PCR amplifikowany z DNA genomicznego pochodzącego z kolonii trip plus, poddanej działaniu oligonukleotydu zawierającego wyłącznie DNA. Na żelu przeprowadzono również analizę produktów PCR amplifikowanych z DNA genomicznego pochodzącego z kolonii trip plus, poddanych działaniu oligonukleotydu zawierającego RNA. Wyniki trawienia restrykcyjnego tych samych produktów PCR enzymem van 91 1 wykazują amplifikowaną prążek PCR o długości 278 par zasad oraz prążki produktów trawienia przez van 91 1 o długości 177 par zasad i 101 par zasad.Sekwencjonowanie DNA wykazuje korekcję genu za pomocą zastosowanego oligonu zawierającego RNA. Przedstawiono elektroferogram DNA regionu genomowego będącego celem oligonu zawierającego RNA. Litera g w sekwencji DNA pochodzi z RG w obrębie oligonu zawierającego RNA go.W ramce przedstawiono również insercję sekwencji bazowych CG w regionie trip five transformantów trip plus, które były celem oligosów zawierających tylko DNA oraz oligosów zawierających RNA; sekwencje te są zgodne z sekwencją konsensusową i zostały porównane z sekwencjami komórek mutantów trip five przed zastosowaniem oligosów. Naprawiający oligo zawierający RNA na dole posiada dwubazową insercję DNA oraz jednobazową substytucję RNA.Obszary obramowane na niebiesko z żółtym cieniowaniem pokazują, że zarówno oligo zawierające RNA, jak i oligo składające się z samego DNA, precyzyjnie skorygowały mutację delecyjna oraz mutację nonsensowną we wszystkich badanych próbkach; linie przerywane zaznaczają pozycję sekwencji oligo zawierającego RNA. Obróbka alkaliczna zapobiega korekcie genu przez oligo zawierające RNA; przedstawiono częstotliwość transformacji dla oligo zawierającego RNA oraz oligo składającego się z samego DNA. Słupki błędów reprezentują standardowy błąd średniej dla trzech niezależnych transformacji dla każdego oligo.Oligo składające się wyłącznie z DNA wykazuje podobną częstotliwość transformacji bez i z zastosowaniem obróbki wodorotlenkiem sodu. Odwrotnie, częstotliwość transformacji w przypadku oligo zawierającego RNA spada do zera po obróbce wodorotlenkiem sodu. Zatem preparat z oligo zawierającym RNA nie jest zanieczyszczony oligo składającym się wyłącznie z DNA.Zatem obserwowana częstotliwość transformacji jest specyficzna dla oligonukleotydów zawierających RNA. Właśnie pokazaliśmy, jak utworzyć hybrydę RNA-DNA na poziomie chromosomalnym oraz przeanalizowaliśmy transfer informacji genetycznej z RNA do genomowego DNA w komórkach drożdży. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zapewnić doskonałą jakość oligonukleotydów zawierających RNA oraz pracować w warunkach wolnych od RNA.To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

generation-rnadna-hybrids-genomic-dna-transformation-using-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Generowanie hybryd RNA/DNA w DNA genomowym poprzez transformację za pomocą oligonukleotydów zawierających RNA

Interferencja RNA (RNAi) posiada wiele zalet w porównaniu z nokautem genów i jest szeroko stosowana jako narzędzie w badaniach nad funkcjami genów. Wynalezienie technologii RNAi opartej na wektorach DNA umożliwiło długotrwałe i indukowalne wyciszanie genów, a także zwiększyło wykonalność wyciszania genów in vivo.

Interferencja RNA oparta na wektorach DNA w badaniu funkcji genów w nowotworach

Opisujemy metodę opartą na sekwencjonowaniu RNA, która obejmuje przygotowanie indeksowanych bibliotek cDNA, hybrydyzację i przechwytywanie za pomocą niestandardowych sond oraz analizę danych w celu zbadania wybranych transkryptów pod kątem ekspresji genów, mutacji i fuzji genów. Ukierunkowany RNAseq pozwala na ekonomiczną, szybką ocenę wybranych transkryptów na sekwencerze stacjonarnym.

Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych

Ten artykuł zawiera szczegółową procedurę syntezy, oczyszczania i charakterystyki dodekamerów RNA modyfikowanych w pozycji C2'-O. Analizy fotometryczne UV-vis i dichroizmu kołowego służą do ilościowego określania i charakteryzowania aspektów strukturalnych, tj. jednoniciowych lub dwuniciowych.

Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2'-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego

Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.

Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

W tym artykule prezentujemy i omawiamy nowe osiągnięcia w syntezie i zastosowaniach mikromacierzy kwasów nukleinowych wytwarzanych in situ. W szczególności pokazujemy, w jaki sposób protokoły syntezy DNA można rozszerzyć na RNA i jak można wykorzystać mikromacierze do tworzenia pobieralnych bibliotek kwasów nukleinowych.

Mikromacierze DNA i RNA o dużej gęstości - synteza fotolitograficzna, hybrydyzacja i przygotowanie dużych bibliotek kwasów nukleinowych

Interferencja RNA jest szeroko stosowaną, potężną techniką manipulowania ekspresją genów na określonych etapach rozwoju. Tutaj opisujemy niezbędne kroki do wdrożenia tej techniki u wodnego chrząszcza nurkującego Thermonectus marmoratus, od nabycia sekwencji genów po knockdown genów wpływających na strukturę lub zachowanie.

Interferencja RNA u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych

Opisujemy inżynierię nowatorskiej polimerazy T7 RNA na uwięzi DNA do regulacji reakcji transkrypcji in vitro. Omawiamy etapy syntezy i charakterystyki białek, walidujemy regulację transkrypcji typu proof-of-concept i omawiamy jej zastosowania w obliczeniach molekularnych, diagnostyce i przetwarzaniu informacji molekularnych.

Polimeraza RNA na uwięzi DNA do programowalnej transkrypcji in vitro i obliczeń molekularnych

Protokół opisuje metodę wprowadzania kontrolowanej różnorodności genetycznej w genomie wirusa zapalenia wątroby typu C poprzez połączenie pełnej długości syntezy zmutowanego RNA za pomocą podatnego na błędy PCR i genetyki odwrotnej. Metoda ta stanowi model selekcji fenotypu i może być stosowana do 10 kb długich genomów wirusa RNA o dodatnim sensie.

Genetyka odwrotna w celu inżynierii wariantów wirusa RNA o pozytywnym wyczuwaniu

Izolacja genomowego DNA z ogonów myszy

Poznaj metodę generowania hybryd RNA/DNA w genomowym DNA drożdży poprzez transformację oligonukleotydami zawierającymi RNA. Technika ta umożliwia badanie transferu informacji genetycznej z RNA do DNA oraz korekcji mutacji w komórkach Saccharomyces cerevisiae.

Generowanie hybryd RNA/DNA w genomowym DNA poprzez transformację z wykorzystaniem oligonukleotydów zawierających RNA

Przeglądaj więcej filmów