Name: System hodowli zarodków kurzych ex-ovo odpowiedni do zastosowań w obrazowaniu i mikrochirurgii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Poznaj metodę hodowli zarodków kurzych ex-ovo umożliwiającą pełną dostępność optyczną i mikrochirurgię. Technika ta wspiera długoterminowe badania embriogenezy w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Protokół hodowli ex-ovo:
<ol>
	<li>Inkubacja zapłodnionych jaj kurzych
	<ol class="lroman">
		<li>Zapłodnione jaja kurze mogą być przechowywane w temperaturze 13°C do 5 dni przed inkubacją bez inicjowania rozwoju. Temperaturę tę można utrzymać za pomocą chłodziarki do czerwonego wina.</li>
		<li>Inkubować jaja tępą stroną do góry w inkubatorze przy stałej wilgotności 60% z ciągłym kołysaniem w temperaturze 37.5°C przez 72 godziny.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przygotowanie hamaków (Rycina 1a)
	<ol class="lroman">
		<li>Napełnić do ¾ wysokości plastikowe kubki o pojemności 9 oz ciepłą sterylną wodą. Standardowy kubek 9 oz ma średnicę górną 8 cm. Ustalono, że rozmiar ten jest najbardziej odpowiedni dla zastosowań w długotrwałej kulturze przedstawionych w niniejszej pracy.</li>
		<li>Odciąć około 20 cm folii spożywczej. Przymocować ją okrężnie na górze kubka, zakładając gumkę recepturkę. Folia powinna być rozciągnięta nad wodą. Odciąć nadmiar folii wokół gumki. Stwierdzono, że folia spożywcza jest najbardziej odpowiednia do tego zastosowania, ponieważ zapobiega przyleganiu żółtka, co mogłoby prowadzić do jego pęknięcia podczas transportu.</li>
		<li>Przetrzeć folię chusteczkami kimwipes (Kimberly-Clark, Inc.) zwilżonymi 70% etanolem.</li>
	</ol>
 </li>
	<li>Wyjąć jaja z inkubatora po 72 godzinach inkubacji.</li>
	<li>Zsterylizować jaja, przecierając powierzchnię chusteczkami kimwipes zwilżonymi 70% etanolem.</li>
	<li>Położyć jaja poziomo na 1-2 minuty w celu prawidłowego ustawienia zarodka (Rycina 1b). Do poziomego ułożenia jaj można użyć wytłoczki do jaj. Zarodki obrócą się do góry po 1-2 minutach.</li>
	<li>Przenieść zarodki na hamaki aseptycznie w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
	<ol class="lroman">
 	<li>Używając ostrej krawędzi (np. krawędzi metalowego wiadra lub szklanego zlewki), delikatnie uderzyć w jajo, aż na jego dolnej stronie powstanie niewielkie wgniecenie (Rycina 1c). Należy pamiętać, że zarodek znajduje się w górnej części.</li>
		<li>Umieścić kciuki po przeciwnych stronach wgniecenia i rozdzielić skorupki poziomo (Rycina 1d).</li>
		<li>Umieścić żółtko wraz z zarodkiem oraz albuminę na hamaku (rycina 1e). Albumina zapewni amortyzujące środowisko wokół żółtka, aby absorbować wstrząsy wywołane przemieszczaniem układu, a także dostarczy składników odżywczych zarodkowi podczas długotrwałej hodowli. Woda pod hamakiem zapewni, że zarodek pozostanie równolegle do podłoża podczas transportu i będzie służyć jako przewodnik ciepła podczas obrazowania, jeśli stosowany jest grzejnik z cyrkulacją wody.</li>
		<li>Jeśli transfer został wykonany prawidłowo, zarodek powinien znajdować się już u góry. W przeciwnym razie należy użyć tępego, sterylnego przedmiotu (np. tępego końca zamkniętych nożyczek zakrzywionych) i kierunkowo pogłaskać żółtko tak, aby zarodek obrócił się do góry.</li>
		<li>Na wierzchu kubka położyć szalkę Petriego o średnicy 10 cm, aby zabezpieczyć zarodek.</li>
	</ol>
 </li>
	<li>Umieścić kulturę w kubku w inkubatorze ustawionym na 37.5°C. W przypadku użycia inkubatora przenośnego, umieszczenie 1-2 kubków 9 oz wypełnionych wodą destylowaną pozwala utrzymać wilgotność na poziomie ~60% (Rycina 1f).</li>
	<li>W przypadku hodowli zarodków poza 7. dniem embrionalnym, wokół obwodu zarodka należy rozsypać pokruszone fragmenty skorupki jaja jako źródło wapnia dla rozwoju i dojrzewania kości.</li>
</ol>
Wyposażenie dodatkowe do obrazowania i manipulacji poza inkubatorem:
W celu utrzymania temperatury inkubacji podczas obrazowania lub manipulacji zbudowano w laboratorium cyrkulacyjną kąpiel wodną (Rysunek 3). Kąpiel wodna, w której mieści się naczynie, jest połączona za pomocą odpowiednio dobranych rurek ze zbiornikiem wody. Grzałka rezystancyjna podgrzewa wodę w zbiorniku, a temperatura jest regulowana ręcznie na podstawie pomiarów. Woda jest tłoczona przez pompę wodną. Przedstawienie graficzne obrazuje łatwość obrazowania za pomocą ultrasonografii/mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 3).
<img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig1.jpg" alt="Eksperyment z osmozą jaj, kroki A-F; zestaw obejmuje wodę, jaja, zlewkę, wynikające efekty osmotyczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Przygotowanie hamaka i przeniesienie embrionów kurzych do hamaków.
<img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig2.jpg" alt="Rozwój embrionalny, zarodki kurczęcia w stadiach 20-38, porównawcza analiza wzrostu, ustawienie eksperymentalne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki – zarodki kurczęcia na różnych stadiach rozwoju hodowane za pomocą techniki kultury ex ovo. Zarodki od stadium HH 17 mogą być hodowane za pomocą tej techniki.
<img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig3.jpg" alt="Schemat zestawu do obrazowania optycznego do analizy rozwoju embrionalnego w temperaturze fizjologicznej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Schemat i reprezentatywne zdjęcia systemu cyrkulacji wody stosowanego wraz z systemem hodowli ex-ovo w celu utrzymania zarodków w optymalnej temperaturze rozwoju.
2. Wybrane zastosowania:
 I. Mikroiniekcja
Ta hodowla embrionów jest odpowiednia do zastosowań w mikroiniekcjach, w których roztwory muszą zostać wstrzyknięte do naczyń krwionośnych w celu obrazowania opartego na kontraście (np. mikroskopia fluorescencyjna, mikrotomografia komputerowa itp.) (Rysunek 4). Poniżej znajduje się protokół mikroiniekcji:
<ol>
	<li>Przygotowanie aparatury do iniekcji
	<ol class="lroman">
		<li>Wytworzono mikroiły o ściętych końcówkach poprzez wyciąganie szklanych kapilar o średnicy wewnętrznej (ID) 0,75 mm przy użyciu mikrokuźni. Wymiar końcówki zależy od średnicy docelnej żyły lub pożądanej prędkości przepływu.</li>
		<li>Podłączyć strzykawkę do rurki silikonowej o wewnętrznej średnicy 0,03 cala.</li>
		<li>Napełnij rurkę roztworem do wstrzyknięcia i podłącz mikroigłę do rurki.</li>
		<li>Umieść mikroiigłę w mikromanipulatorze, a strzykawkę w uchwycie do strzykawek lub pompie strzykawkowej.</li>
	</ol>
 </li>
	<li>Do kubka należy dodać sterylną wodę, aby unieść embrion. Doświadczalnie ustalono, że w celu prawidłowego wprowadzenia igły do naczynia krwionośnego (tj. naczynia pępkowego), konieczna jest penetracja pozioma. Wymaga to, aby embrion znajdował się w tej samej płaszczyźnie co krawędzie kubka.
 <ol class="lroman">
		<li>Zdejmij gumkę recepturkę podtrzymującą plastik pod zarodkiem.</li>
		<li>Delikatnie unieś jedną stronę folii i dodaj do naczynia trochę sterylnej wody.</li>
		<li>Ponownie zamocuj gumkę na plastiku.</li>
	</ol>
 </li>
	<li>Wstrzyknij roztwór do naczynia embrionalnego. Z naszego doświadczenia wynika, że w przypadku wstrzykiwania roztworu do naczynia żółtkowego mikroiły powinny mieć rozmiar około 1/10th średnicy naczynia, aby utrzymać efektywną perfuzję bez wywoływania krwawienia.
<ol class="lroman">
	<li>wpompuj roztwór do mikroiły, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Ustaw końcówkę mikroiły na wybranym naczyniu. W przypadku naczyń witelinowych wybór obszaru rozwidlenia zapewni maksymalną powierzchnię do penetracji naczynia.</li>
	<li>Przesunąć igłę w kierunku naczynia. Naczynie początkowo się cofnie. Po przebiciu naczynia przez igłę należy rozpocząć perfuzję. Kolor płynącej krwi powinien ulec zmianie w miarę postępu perfuzji. Jeśli zmiana koloru nie wystąpi, igła mogła przebić naczynie na wylot. W takim przypadku należy powoli wycofać mikroigłę, jednocześnie pompując roztwór, aż do momentu zaobserwowania zmiany koloru w naczyniu. Po zakończeniu perfuzji należy wycofać mikroigłę z naczynia.</li>
</ol>
</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig4.jpg" alt="Układ mikroskopowy i obraz fluorescencyjny; analiza optyczna; obserwacja struktury komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4: Mikrosekcja barwnika fluorescencyjnego do naczyń krwionośnych zarodka kurczaka hodowanego w systemie ex-ovo.
II. Procedura mikrosurgicalna - podwiązanie lewego przedsionka
Ten układ hodowli ex-ovo jest idealny do przeprowadzania zabiegów chirurgicznych na embrionach kurczaka, ponieważ zapewnia pełny dostęp do zarodka. Poniżej znajduje się protokół dla przykładowej techniki – podwiązania lewego przedsionka (LAL) (Rycina 5). Procedurę wykonuje się w około 24. godzinie okresu hodowli (HH24):
<ol>
	<li>Przygotować węzły nadgarstkowe o średnicy ~0.5 mm, używając nylonowej nici chirurgicznej 10-0.</li>
	<li>Za pomocą precyzyjnej pęsety lokalnie usunąć błony chorionowe i alantoidowe znad zarodka, a następnie unieść zarodek od strony grzbietowej i obrócić go pionowo tak, aby widoczna była jego lewa strona.</li>
	<li>Używając precyzyjnej pęsety, usunąć osierdzie nad lewym przedsionkiem.</li>
	<li>Ustawić węzeł nad lewym przedsionkiem i go zaciągnąć. Węzeł należy zawiązać tak, aby ograniczyć pierwotny przepływ krwi na lewą stronę o ~75%. Odciąć końce nici mikronożyczkami, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić nadmiar nici.</li>
	<li>Obrócić zarodek z powrotem do pierwotnej orientacji (strona prawa na górze).</li>
	<li>W grupie kontrolnej (sham) zastosuje się tę samą procedurę, jednak nić zostanie jedynie przeprowadzona przez tkankę, a nie zawiązana. Skuteczność zabiegu LAL (zwężenie o 75%) zostanie potwierdzona 24 godziny po operacji, a zarodki niezakwalifikowane zostaną wykluczone.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2154/2154fig5.jpg" alt="Porównanie rozwoju zarodka, kontrola vs. traktowanie LAL, mikroskopia, dowody na różnicowanie komórkowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> Rysunek 5: Zarodek kurczaka z grupy kontrolnej oraz zarodek z podwiązanym lewym przedsionkiem. Strzałka wskazuje lewy przedsionek, który jest o około 75% mniejszy w zarodku z podwiązaniem.

<ol><li>Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodermal+cell+displacements+during+avian+gastrulation+are+due+to+both+individual+cell-autonomous+and+convective+tissue+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).</li>
<li>Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regulation+in+the+heart+forming+region+of+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos.</a> Dev Biol. 207, 163-175 (1999).</li>
<li>Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+conotruncal+constriction+on+aortic-mitral+valve+continuity+in+the+stage+18%2C+21+and+24+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo.</a> Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).</li>
<li>deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ventricular+preload+is+compensated+by+myocyte+proliferation+in+normal+and+hypoplastic+fetal+chick+left+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle.</a> Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li>
<li>Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+in+early+embryonic+atrioventricular+valvular+function+correspond+with+changes+in+cushion+biomechanics+that+are+predictable+by+tissue+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition.</a> Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).</li>
<li>McQuinn, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+ultrasonographic+imaging+of+avian+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development.</a> Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev Biol. 41, 391-394 (1974).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Dostęp optyczny i przeprowadzanie eksperymentów na embrionach ptaków jest utrudnione ze względu na ograniczenia wynikające z budowy skorupy jaja. Wycinanie okna znacząco ogranicza liczbę mikronaczyń dostępnych do iniekcji oraz podejść mikrochirurgicznych8. W rezultacie manipulacje są możliwe jedynie w przypadku wczesnych embrionów, a ciągła obserwacja nie jest wykonalna. Wczesne hodowle ex-ovo z wykorzystaniem szalek Petriego miały ograniczone zastosowanie, ponieważ niewystarczająca kontrola napięcia ...

<table><tbody><tr><td>Zapłodnione jaja białej kury rasy Leghorn</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Folia spożywcza Saran Wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gumki recepturki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciepła sterylna woda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy kubek 9 oz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petri o średnicy 100 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termiczny inkubator powietrzny 1602N</td><td>GQF Manufacturing</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dekstran koniugowany z fluoresceiną (2 MDa, 1% w/v w roztworze soli fosforanowej PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrokuźnia (Microforge)</td><td>Glassworx, Inc, St Louis MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklane kapilary (średnica wewnętrzna 0.75 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Model M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Z20</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna pęseta nr 55</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szycie chirurgiczne nylonowe 10-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przewody</td><td>VWR international</td><td></td><td>średnica zewnętrzna 1mm</td></tr><tr><td>Strzykawka 3 mL</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetka 200 &amp;mu;L i końcówki do pipety</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

system hodowli embrionów kurzych ex-ovo odpowiedni do obrazowania i zastosowań mikrochirurgicznych

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Zrozumienie zależności między czynnikami genetycznymi a mikrośrodowiskowymi, które napędzają prawidłowy oraz wadliwy rozwój embrionalny, jest kluczowe dla odkrywania nowych strategii terapeutycznych. Postępy w technologiach obrazowania umożliwiły ilościowe badanie organizacji i dojrzewania planu budowy ciała, jednak morfogeneza embrionalna w późniejszych stadiach jest mniej poznana. Zarodki kurczęce stanowią atrakcyjny kręgowy model zwierzęcy do tych zastosowań ze względu na łatwość hodowli i manipulacji chirurgicznych. Wczesne embriony można hodować przez krótki czas na pierścieniach z papieru filtracyjnego, co zapewnia pełny dostęp optyczny do badań nad wzorcowaniem i losem komórek1,2. Badania zaawansowanych procesów rozwojowych, takich jak morfogeneza serca, tradycyjnie prowadzi się przez okno w skorupie jaja3-5, jednak technika ta ogranicza dostęp optyczny ze względu na rozmiar okna. Opracowaliśmy wcześniej prostą metodę hodowli całych embrionów ex-ovo w heksagonalnych łódkach ważnych do 10 dni, co umożliwiło obrazowanie o wysokiej rozdzielczości za pomocą ultrasonografii6,7. Hodowle te były trudne w transporcie, co ograniczało rodzaje narzędzi obrazujących dostępnych do eksperymentów na żywo. Przedstawiamy tutaj udoskonalony system hodowli bezskorupowej z ekonomiczną, przenośną komorą środowiskową. Jaja rozbijano na „hamak” utworzony z membrany poliuretanowej (folii spożywczej) przymocowanej obwodowo do plastikowego kubka częściowo wypełnionego sterylną wodą. Zarówno wymiary obwodu, jak i głębokość hamaka były krytyczne dla utrzymania napięcia powierzchniowego, natomiast mechanika hamaka i wody znajdującej się pod nim pomagały tłumić wibracje wywołane transportem. Opracowano również kompaktową łaźnię wodną z cyrkulacją, aby umożliwić ciągłą kontrolę temperatury podczas eksperymentów. Wykazujemy możliwość hodowli embrionów w ten sposób przez co najmniej 14 dni bez wad morfogenetycznych lub opóźnień i wykorzystujemy ten system w kilku zastosowaniach mikrochirurgicznych i obrazowych.

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodologię umożliwiającą długotrwałą hodowlę embrionów ptaków ex-ovo. Technika ta jest idealna do eksperymentów podłużnych, które wymagają pełnej dostępności optycznej i/lub sterylnego transportu embrionów ptaków.

System hodowli embrionów kurzych ex-ovo odpowiedni do obrazowania i zastosowań mikrochirurgicznych

Zrozumienie zależności między czynnikami genetycznymi a mikrośrodowiskowymi, które determinują prawidłowy oraz wadliwy rozwój embrionalny, ma fundamentalne znaczenie dla ...

W systemie hodowli zarodków kurzych in ovo, przygotowanie kultur zarodków w skorupkach umożliwia badanie embriogenezy. Procedura rozpoczyna się od pozyskania i inkubacji zapłodnionych jaj kurzych w temperaturze 37.5 °C przez 72 godziny. Następnie przygotowuje się hamaki do podtrzymywania żółtek jaj z rozwijającymi się zarodkami.Następnie żółtka jaj mogą zostać przeniesione na specjalne podpory (tzw. hammocks), a embriogeneza kontynuowana jest poza skorupą. Technikę tę można zastosować do mikroiniekcji do układu naczyniowego, ultrasonografii oraz mikrochirurgii, a uzyskane wyniki mogą ukazać, jak zarodki rozwijają się w warunkach normalnych oraz zaburzonych. Cześć, nazywam się Akshay Shaker i jestem studentem studiów magisterskich w laboratorium inżynierii biomedycznej rozwoju sercowo-naczyniowego kierowanym przez Jonathana Butchera na Wydziale Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie Cornell.Główną zaletą naszej techniki w porównaniu z poprzednimi metodami, takimi jak hodowla jaj in ovo, jest zapewnienie pełnego dostępu optycznego do zarodka oraz łatwość transportu bez ryzyka uszkodzeń. Witam, nazywam się Char Hin. Jestem pracownikiem naukowym na etapie postdoc w Laboratorium Bioinżynierii Rozwoju Układu Sercowo-Naczyniowego, w laboratorium Jonathana Chu w Katedrze Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu Cornell.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak mechanizm powstawania wad serca podczas embriogenezy. Przed rozpoczęciem procedury należy wysterylizować wszystkie materiały, przecierając je 70% ethanol. Aby rozpocząć procedurę, należy napełnić trzy czwarte plastikowego kubka o pojemności dziewięciu uncji ciepłą sterylną wodą.Powtórz czynność dla tylu kubków, ile jest konieczne. Zwykły kubek o pojemności dziewięciu uncji ma średnicę górną wynoszącą osiem centymetrów, co jest rozmiarem najodpowiedniejszym dla przedstawionej tutaj metody długotrwałej hodowli. Następnie odetnij kawałek folii spożywczej o długości 20 centymetrów.Przykryj wierzch plastikowego kubka o pojemności dziewięciu uncji wypełnionego ciepłą sterylną wodą kawałkiem folii spożywczej i użyj gumki recepturki, aby utrzymać folię na miejscu. Folia spożywcza jest najbardziej odpowiednia do tego zastosowania, ponieważ zapobiega przywieraniu żółtka, co mogłoby doprowadzić do jego pęknięcia. Podczas transportu folia powinna być rozciągnięta tak, aby dotykała powierzchni wody.Odetnij nadmiar plastiku wokół opaski i przetrzyj plastik. Po przetarciu chusteczkami Kim wipes nasączonymi 70% ethanol, hamaki są gotowe do podtrzymania embrionów. Zapłodnione jaja kurze mogą być przechowywane w temperaturze 13 °C do pięciu dni przed inkubacją.Bez aktywacji rozwoju, chłodniczka do czerwonego wina może utrzymać tę temperaturę, aby jaja były gotowe do hodowli. Aktywuj rozwój zarodka, inkubując jaja w pozycji skierowanej jedną stroną do góry w inkubatorze z ciągłą wilgotnością 60% przy jednoczesnym ciągłym kołysaniu w temperaturze 37.5 °C przez 72 godziny. Gdy jaja będą gotowe, wyjmij je z inkubatora.Zesterylizuj jaja, przecierając je chusteczkami Kim nasączonymi 70% etanolem. Połóż jaja poziomo na boku w wytłoczce do jaj na jedną do dwóch minut, aby zapewnić odpowiednie ułożenie zarodka. Pracuj maksymalnie z sześcioma jajami jednocześnie, ponieważ próba rozbicia większej liczby jaj w jednym czasie może być utrudniona.Może to spowodować zbyt długie utrzymywanie temperatury pokojowej w pomieszczeniu wyjścia, co może wpłynąć na żywotność. Po upływie jednej do dwóch minut zarodek przesunie się do górnej części jaja. Aby przenieść każdy zarodek do hamaka, należy pracować aseptycznie w komorze z laminarnym przepływem powietrza.W pierwszej kolejności należy delikatnie rozbić dolną część jaja, używając ostrej krawędzi, np. krawędzi metalowego wiaderka lub zlewki szklanej. Należy pamiętać, że zarodek znajduje się w górnej części. Następnie należy ostrożnie rozdzielić dwie połówki skorupki jaja, rozsuwając je kciukami na boki.Następnie umieść zarodek, żółtko i albuminę na hamaku. Albumina zapewnia wilgotne środowisko wokół żółtka, amortyzując wstrząsy spowodowane przemieszczaniem układu. Albumina dostarcza również składników odżywczych zarodkowi podczas długiego okresu hodowli.Jeśli transfer zarodka został przeprowadzony prawidłowo, zarodek powinien znajdować się już u góry. Jeśli zarodek znajduje się na dnie, należy użyć zakrzywionej pęsety, małych nożyczek lub innego podobnego tępego narzędzia, aby delikatnie poruszyć żółtkiem w taki sposób, by obróciło się ono wokół własnej osi, a zarodek przemieścił się na górę. W przypadku hodowli zarodków po siódmym dniu embrionalnym należy rozsypać wokół obwodu zarodka pokruszone fragmenty skorupki jaja, które będą służyć jako źródło wapnia niezbędnego do rozwoju i dojrzewania kości.Po zakończeniu transferu zarodka, nałóż na kubek szalkę Petriego o średnicy 10 centymetrów, aby go uszczelnić. Umieść hamak w inkubatorze ustawionym na 37,5 °C. W przypadku korzystania z inkubatora przenośnego, należy umieścić w nim również jeden lub dwa kubki o pojemności dziewięciu uncji wypełnione wodą.Aby utrzymać wilgotność na poziomie około 60%, zarodki są nadal rozwijane, co umożliwia ich wykorzystanie do mikroiniekcji w zastosowaniach mikrochirurgicznych. Taka hodowla zarodków jest odpowiednia do procedur mikroiniekcyjnych, w których wymagane jest wstrzyknięcie roztworów do naczyń krwionośnych. W pierwszej kolejności należy przygotować aparat do iniekcji, zaczynając od igieł, które wykonuje się za pomocą mikropalnika, wyciągając szklane kapilary do postaci mikroigieł o ściętych końcówkach.Rozmiar końcówki zależy od pożądanego szybkości przepływu. Należy połączyć strzykawkę z mikroiżłą z silikonową rurką o średnicy wewnętrznej 0,03 cala. Wypełnić rurkę strzykawki roztworem do wstrzyknięcia, a następnie połączyć mikroiżłę strzykawki z rurką.Umieść mikroigłę w mikromanipulatorze, a strzykawkę w uchwycie do strzykawek lub pompie strzykawkowej. Po przygotowaniu zestawu do iniekcji wyjmij embriony. Do prawidłowego wprowadzenia igły do naczynia krwionośnego, takiego jak naczynie główne, wymagane jest poziome przebicie.Zarodek musi zatem znajdować się na tym samym poziomie co krawędzie naczynia, w którym się znajduje. Aby podnieść zarodek, należy zdjąć gumkę stabilizującą folię plastikową, na której spoczywa zarodek. Należy delikatnie unieść jeden koniec folii i dolać do naczynia nieco wody, uważając, aby nie przemieścić nadmiernie zarodka.Następnie ponownie nałóż gumkę na plastik. Teraz, gdy embrion jest uniesiony, do naczynia embrionalnego można wstrzyknąć roztwór. Należy pamiętać, że podczas wstrzykiwania do żywego naczynia rozmiar mikroiły powinien wynosić w przybliżeniu 1/10 średnicy tego naczynia.Aby utrzymać wydajną perfuzję bez wywoływania krwawienia, najpierw należy wpompować roztwór do mikroiły, tak aby wewnątrz nie pozostało uwięzione powietrze. Następnie należy wyrównać końcówkę mikroiły z wybranym naczyniem w przypadku naczyń żywotnych. Wybór obszaru zapewnia maksymalną powierzchnię do celowania w naczynie.Po wyznaczeniu obszaru wstrzyknięcia, pchnij igłę w stronę naczynia. Naczynie początkowo się cofnie. Po przebiciu naczynia przez igłę rozpocznij perfuzję; kolor płynącej krwi zmieni się w miarę postępu perfuzji.Jeśli nie zaobserwowano zmiany koloru, igła mogła zostać przepchnięta przez naczynie. W takim przypadku należy powoli wycofać mikroiżłę, jednocześnie pompując roztwór, aż w naczyniu pojawi się widoczna zmiana koloru. Po zakończeniu perfuzji należy delikatnie wyciągnąć mikroigłę z naczynia. Ta hodowla zarodków nadaje się również do zastosowań mikrochirurgicznych, takich jak podwiązanie lewego przedsionka, które wykonuje się w czwartym dniu inkubacji.W pierwszej kolejności przygotować węzły o średnicy 0,5 mm z nici chirurgicznej nylonowej 10-0. Za pomocą precyzyjnej pęsety usunąć błony błonowe i pozarodkowe z embrionu. Unieść embrion z tyłu i obrócić go pionowo tak, aby lewa strona embrionu znajdowała się na górze i była dostępna.Następnie usuń osierdzie nad lewym przedsionkiem. Ustaw węzeł nad lewym przedsionkiem i zaciśnij go, trzymając i pociągając go z boków pęsetą; węzeł powinien zostać zawiązany tak, aby ograniczyć około 75% pierwotnego przepływu krwi po lewej stronie. Odetnij końce węzła mikro-nożyczkami, a następnie ostrożnie usuń i odrzuć nadmiar nici chirurgicznej.Na koniec obróć embrion z powrotem do pierwotnej orientacji, tak aby prawa strona znajdowała się na górze. Przedstawione tutaj embriony na różnych etapach rozwoju hodowane x ovo w opisany sposób pokazują, że podgrzewacz z cyrkulacją wody może utrzymywać warunki środowiskowe przez dłuższy czas, co może być wymagane podczas obrazowania i zabiegów mikrochirurgicznych.Zarosaki kurze hodowane ex ovo nadają się do mikroiniekcji. W tym doświadczeniu do układu naczyniowego zarodka kurczego hodowanego ex ovo wstrzyknięto barwnik fluorescencyjny. Zaroski kurze hodowane ex ovo nadają się do mikrochirurgii.W tym eksperymencie przeprowadzono procedurę podwiązania lewego przedsionka w zarodku kurczaka hodowanym metodą ex ovo. Po opanowaniu techniki, hodowla zarodków kurcząt ex ovo może zająć około pięciu minut na jeden zarodek. Po obejrzeniu tego filmu, widz powinien dobrze zrozumieć, jak tworzyć hodowle zarodków kurcząt ex ovo odpowiednie do obrazowania i mikrochirurgii oraz w sytuacjach, gdy konieczny jest transport hodowli.

an-ex-ovo-chicken-embryo-culture-system-suitable-for-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ex-ovo system hodowania zarodków kurczaka nadający się do zastosowań w obrazowaniu i mikrochirurgii

W tym filmie zaprezentowano New culture – metodę, dzięki której zarodki kurcząt są hodowane poza jajem przez maksymalnie 24 hr. Metoda ta umożliwia badanie wczesnego rozwoju (od pręgi pierwotnej do 14 som.), co odpowiada okresowi E7-9 u myszy. Zastosowania tej techniki obejmują elektroporację, hybrydyzację in situ oraz immunohistochemię.

Metoda hodowli wczesnych zarodków kurczaka ex vivo (nowa hodowla)

Błona chorioallantoiczna (CAM) zarodka kurczaka stanowi unikalne, naturalnie immunodeficyjne środowisko hodowlane do badania angiogenezy i tumorigenzy. Niniejszy artykuł wideo prezentuje poszczególne etapy hodowli kurczaka ex ovo, aplikację substancji potencjalnie angiogennych oraz skuteczną inokulację komórek i tkanek nowotworowych na powierzchni CAM.

Hodowla kurcząt ex ovo oraz test CAM ex ovo: jak to naprawdę działa

Ten film demonstruje hodowlę ex vivo i obrazowanie wycinków okoruchowych z transgenicznych embrionów myszy. Zarodki są izolowane i osadzane w agarozie. Za pomocą wibratomu uzyskuje się plastry zawierające jądra okoruchowe i oczy. Plastry są utrzymywane w kulturze i obrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Hodowla ex vivo i obrazowanie wycinków okoruchowych z transgenicznych zarodków myszy

Kultury Slice ułatwiają manipulowanie rozwojem zarodka za pomocą zaburzeń genowych i farmakologicznych. Jednakże warunki hodowli muszą zapewniać, że normalny rozwój może przebiegać w ograniczonym środowisku wycinka. Ilustrujemy protokół, który ułatwia prawidłowy rozwój rdzenia kręgowego, aby przebiegał przez co najmniej 24 godziny.

Protokół hodowli plastrów rdzenia kręgowego zarodków kurczaka

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Oglądanie i dostęp do zarodka kurczaka podczas rozwoju może być wyzwaniem. Opracowaliśmy metodę ex ovo, która jest prosta, opłacalna i może być łatwo stosowana w klasie lub w środowisku badawczym. Metoda ta zapewnia dostęp do zarodka w późnych stadiach rozwoju zarodkowego (HH 40).

Zoptymalizowana hodowla ex-ovo zarodków piskląt do zaawansowanych etapów rozwoju

Tutaj prezentujemy nową technikę hodowli zarodków piskląt ex ovo do obrazowania poklatkowego przy użyciu światła przechodzącego i mikroskopii fluorescencyjnej. Kanapka z zanurzoną bibułą filtracyjną jest wariantem dobrze znanej techniki nośnika bibuły filtracyjnej1, która pozwala na hodowlę zarodków piskląt całkowicie zanurzonych w płynnej pożywce hodowlanej.

Zanurzona kanapka z bibuły filtracyjnej do długoterminowego obrazowania poklatkowego ex ovo wczesnych zarodków piskląt

Ten protokół opisuje trzy metody pozyskiwania i wykorzystywania zarodków kurczaków w wieku od 5 do 8 dni oraz ich błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) jako modelu in vivo do badania obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem i dostarczania leków za pośrednictwem mikropęcherzyków.

Przygotowanie zarodków ex ovo kurczaków i naczyń błony moczowo-omoczniowej jako modelu in vivo do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym i badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków

Ogólnym celem tego artykułu jest opisanie, jak przeprowadzić wewnątrzkomórkową iniekcję in ovo materiałów egzogennych do zarodków kurcząt. Takie podejście jest bardzo przydatne do badania biologii rozwoju zarodków kurczaków.

In Ovo Iniekcja donaczyniowa w zarodkach kurczaka

Ten protokół został opracowany do podłużnego monitorowania właściwości mechanicznych tkanki płytki nerwowej podczas neurulacji zarodka pisklęcia. Opiera się on na integracji mikroskopu Brillouin i systemu inkubacji na etapie, umożliwiającego mechaniczne obrazowanie na żywo tkanki płytki nerwowej w zarodkach piskląt hodowanych ex ovo.

Monitorowanie mechanicznej ewolucji tkanki podczas zamykania cewy nerwowej zarodka pisklęcia

Poznaj metodę hodowli zarodków kurzych ex-ovo umożliwiającą pełną dostępność optyczną i mikrochirurgię. Technika ta wspiera długoterminowe badania embriogenezy w biologii rozwoju.

System hodowli embrionów kurzych ex-ovo odpowiedni do obrazowania i zastosowań mikrochirurgicznych

Przeglądaj więcej filmów