Name: Genetyczne usuwanie cząsteczek sygnałowych za pośrednictwem adenowirusa w hodowanych pierwotnych fibroblastach embrionalnych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Poznaj metodę usuwania genu Rac1 w pierwotnych fibroblastach embrionalnych myszy przy użyciu adenowirusa dostarczającego rekombinazę Cre. Technika ta umożliwia badanie dynamiki aktyny z niemal 100% wydajnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr. Rizaldy'emu Scottowi ze szpitala Mount Sinai w Toronto w prowincji Ontario za przekazanie pierwotnych embrionalnych fibroblastów mysich Rac1flox/flox. Praca ta była wspierana przez granty operacyjne przyznane NJ przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR, MOP 2009-93526) oraz Kanadyjską Radę Badań nad Naukami Przyrodniczymi i Inżynierią (NSERC, RG 327372-06). SH i MW otrzymali wsparcie w ramach stypendiów CGSMA i CGS-M odpowiednio z CIHR i NSERC.
Steve Hawley i Melanie Wills wnieśli równy wkład w powstanie niniejszej pracy.

Rozmrażanie komórek
<ol>
 <li> Wyjąć zamrożone embrionalne fibroblasty mysie (MEFs) (wygenerowane wcześniej z pierwotnych kultur pojedynczych embrionów) z ciekłego azotu. </li>
 <li> Rozmrozić komórki, zanurzając fiolkę w wodzie o temperaturze 37°C i delikatnie nią obracając, aż zawartość zostanie całkowicie rozmrożona.</li>
 <li> Do płytki hodowli komórkowej o średnicy 10 cm dodać 9 mL DMEM uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny i streptomycyny.</li>
 <li> Rozmrożoną zawiesinę komórkową dodawać kroplami do płytki, delikatnie nią kołysząc w celu rozproszenia komórek, a następnie umieścić płytkę na noc w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO2. Należy pamiętać, że jeśli komórki są wrażliwe na DMSO (stosowany w procesie mrożenia), początkową pożywkę można zastąpić świeżą po tym, jak komórki przywrą do płytki (około czterech godzin po wysiewaniu). Należy również zwrócić uwagę, że stopień zrastania się komórek po rozmrożeniu zależy od liczby zamrożonych komórek, szybkości ich regeneracji po zamrażaniu oraz tempa ich wzrostu.</li>
</ol>
Pasażowanie komórek
<ol start="5">
 <li>Gdy komórki osiągną niemal 10% konfluencji (tj. następnego dnia), odessać pożywkę i przemyć komórki 5mL sterylnego PBS.</li>
 <li>Usunąć PBS i dodać 1mL trypsyny zawierającej 10mM EDTA, a następnie umieścić płytkę w inkubatorze na około 5 minut, aby umożliwić odłączenie się komórek od płytki.</li>
 <li>Po odłączeniu się komórek, dodać 9mL pożywki do komórek poddanych trypsynizacji, pipetować 2-3 razy w celu rozbicia skupisk, a następnie dodać 1mL tej zawiesiny kroplami na nową płytkę zawierającą 9mL pożywki i inkubować w 37°C przez noc. Obecność FBS w pożywce zneutralizuje trypsynę – alternatywnie komórki można najpierw przemyć, aby rozcieńczyć trypsynę.</li>
</ol>
Liczenie i wysiewanie komórek na szkiełka nakrywki
<ol start="8">
 <li> Wyjąć komórki z inkubatora, przemyć i poddać trypsynizacji zgodnie z wcześniejszą procedurą, z wyjątkiem tego, że tym razem do komórek po trypsynizacji należy dodać 5–6 ml pożywki zamiast 9 ml. </li>
 <li> Dokładnie pipetować komórki, aby zapewnić całkowitą dysocjację do zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie usunąć 15μL połączyć z 15μL trypan blue w oddzielnej probówce do mikrowirówki. </li>
 <li> Wymieszać tę zawiesinę komórek w błękicie trypanu, pipetując ją kilkakrotnie w górę i w dół, a następnie dodać 15μL do hemocytometru. </li>
 <li> Pod mikroskopem martwe komórki będą widoczne jako niebieskie. Należy policzyć liczbę przejrzystych/bezzbarwnych (żywych) komórek w jednym z czterech pól 4x4 komory licznikowej (hemocytometru). Powtórzyć to liczenie w trzech pozostałych polach 4x4 (oznaczonych jako A, B, C i D), a następnie zastosować poniższe równanie, aby obliczyć liczbę komórek na μL zawiesiny: 
 <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="Równanie wzoru na liczbę komórek, obliczanie liczby komórek na µL przy użyciu średniej z A, B, C, D; mnożnik." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1"></li>
 <li> Dzięki optymalizacji protokołu ustalono, że wysianie 30 0 komórek pozwala na uzyskanie odpowiedniej gęstości komórek do wizualizacji po zakończeniu eksperymentu.</li>
 <li> Aby obliczyć objętość zawiesiny komórkowej potrzebną do uzyskania 30 00 komórek, należy zastosować następujące równanie: 
 <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="Wzór na stężenie komórek, obliczanie objętości dla hodowli komórkowych; równanie: objętość (µL) = 30 00 / liczba komórek na µL." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 2"></li>
 <li> Następnie do każdego dołka płytki sześcio-dołkowej należy włożyć sterylną szklaną lamellkę i dodać 2 ml pożywki do każdego dołka, a następnie kroplowo dodać z zawiesiny komórkowej objętość odpowiadającą 30 0 komórek na każdy dołek. Należy pamiętać, że w tym doświadczeniu zastosowano szklane lamellki, ponieważ w późniejszym czasie będziemy wizualizować komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; nie wszystkie zastosowania wymagają mikroskopii, zatem lamellki mogą nie być konieczne.</li>
</ol>
Transdukcja wirusowa
<ol start="15">
 <li> Po kilku godzinach lub przez noc (przez czas wystarczający do zapewnienia adhezji komórek do szkiełek podstawkowych) należy usunąć pożywkę i przemyć komórki 1 ml bezsurowiczego DMEM. </li>
 <li> Do każdej studzienki należy dodać 1 ml pożywki bezsurowiczej w celu wprowadzenia wirusa. W tym doświadczeniu wirus adeno-Cre został zakupiony komercyjnie w firmie Vector Biolabs.</li>
 <li> Poprzednia optymalizacja protokołu wykazała, że wielokrotność infekcji (MOI) wynosząca 50 zapewnia bardzo wydajną transdukcję genów do pierwotnych MEF, wywierając niewielki lub żaden wpływ na żywotność komórek. MOI można obliczyć w następujący sposób: 
 <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="Równanie służące do obliczania ilości wirusa, Pożądane MOI × liczba komórek = potrzebna liczba wirusów, wzór." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 3"> 
 
 <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="Wzór na obliczanie objętości zapasu wirusa; równanie do eksperymentów laboratoryjnych i badań wirusologicznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 4"> </li>
 <li> Dodaj obliczoną objętość wirusa bezpośrednio do każdej studni przeznaczonej do infekcji, delikatnie kołysz płytką, aby rozprowadzić wirusa, a następnie umieść komórki w 37°C inkubator przez noc. </li>
 <li> Następnego dnia rano usunąć pożywkę zawierającą wirusa z komórek, przemyć komórki 1 ml sterylnego PBS, a następnie dodać 2 ml zwykłej pożywki do każdej studni.</li>
 <li> W przypadku komórek Rac1 przedstawionych w tym eksperymencie, zmiany morfologiczne wystąpiły w komórkach około 72 godzin po transdukcji.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
Komórki zwizualizowano poprzez barwienie faloidyną na aktynę (wyłącznie w celach obrazowania), a następnie wykonano zdjęcia przy użyciu wielofotonowego konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego Leica TCS-SP5 w Advanced Analysis Centre na Uniwersytecie w Guelph. Rycina 1 przedstawia skurczoną i wydłużoną morfologię komórek Rac1flox/flox poddanych działaniu wirusa adeno-Cre w porównaniu do tych samych komórek nieeksponowanych na wirusa.
<img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopowy systemu Rac1^flox/flox; Cre w czerwonej fluorescencji, przedstawiający wyniki porównania komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Porównanie Rac1flox/flox komórki zainfekowane wirusem adeno-Cre (po lewej) w porównaniu z niezinfekowanymi komórkami z tego samego źródła (po prawej).

<ol><li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li>
<li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. owney, Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li>
<li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li>
<li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li>
<li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li>
<li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi przez Canadian Council on Animal Care.

Towarzyszące wideo demonstruje, w jaki sposób wirus rekombinowany może zostać wykorzystany do wycięcia specyficznego genu in vitro przy użyciu rekombinazy Cre. Opracowanie tego protokołu ujawniło jednak kilka szczególnych kwestii, które warto omówić.
<ul>
<li>Podczas pracy z adenowirusami należy zawsze stosować odpowiednie procedury bezpieczeństwa. Podczas pracy z wirusem należy przez cały czas nosić fartuch laboratoryjny i rękawiczki. Pożywki oraz sprzęt plastikowy należy poddać działaniu 10% roztworu wybielacza przez co najmniej 30 minut, a następnie sprzęt plastikowy należy autoklawować.</li>
<li>Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania zapasów wirusa, ponieważ może to wpłynąć na miano wirusa, a tym samym obniżyć wydajność transdukcji. Małe objętości zapasów wirusa należy początkowo podzielić na osobne alikwoty w oddzielnych probówkach.</li>
<li>Podczas opracowywania metody testowano wartości MOI w zakresie od 50 do 500; w większości przypadków zaobserwowano wysoką wydajność transdukcji bez negatywnego wpływu na żywotność komórek.</li>
<li>Podczas opracowywania metody wykorzystano również Adeno-GFP w celu szybkiego przesiewu wydajności transdukcji. Kontrolę tę (lub pusty wektor) należy przeprowadzić podczas eksperymentu, aby upewnić się, że sama infekcja wirusowa nie powoduje zmian komórkowych. Podobnie, jeśli wycięcie genu z locus floxed w badanych komórkach nie powoduje żadnych zmian komórkowych (np. zmian w morfologii lub żywotności), zainfekowanie tego samego typu komórek za pomocą adeno-GFP jest ważną kontrolą służącą do wykazania, że transdukcja wirusowa zachodzi.</li>
</ul>
Poza badaniem kaskad sygnalizacyjnych w hodowlach komórkowych, podejście adeno-Cre stosowano również in vivo do warunkowego usuwania genów z organizmów zwierząt doświadczalnych3,4 oraz do znakowania specyficznych populacji komórek wewnątrz organizmu6. System adenowirusowy można również zaadaptować do wprowadzania do komórek gospodarza genów innych niż rekombinaza Cre. Dwie główne zalety stosowania tego wektora dostarczającego to wysoka wydajność transdukcji i dostarczania genów oraz brak integracji z DNA gospodarza. Jednak generowanie nowych rekombinowanych adenowirusów może być pracochłonne. Opisany tutaj protokół wykorzystuje zatem możliwości systemu adenowirusowego poprzez zastosowanie wcześniej opracowanego wirusa adeno-Cre i powiązanie go z naszym floksowanym allelem docelowym, Rac1. W ramach tego eksperymentu z warunkowym wyłączeniem genu potwierdziliśmy, że transdukcja wirusem adeno-Cre komórek MEF posiadających floksowany allel Rac1 rzeczywiście powoduje wycięcie Rac1, co prowadzi do zmian w morfologii komórkowej charakterystycznych dla komórek z niedoborem Rac12,5.

<table><tbody><tr><td>Wirus Ad-CMV-Cre</td><td>Vector Biolabs</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka DME z wysoką zawartością glukozy 500mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td></td></tr><tr><td>FBS pochodzenia kanadyjskiego 500mL</td><td>VWR international</td><td>CAA15-701</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór PEN-STREP 1X 100mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Faloidyna Texas Red-X</td><td>Invitrogen</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td></td></tr></tbody></table>

genetyczne usuwanie cząsteczek sygnałowych w hodowanych pierwotnych fibroblastach embrionalnych myszy za pomocą adenowirusów

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Zdolność do genetycznego usuwania konkretnych komponentów różnych kaskad sygnałowych komórek stała się nieodzownym narzędziem w nowoczesnej analizie transdukcji sygnałów. Jedną z konkretnych metod umożliwiających taką warunkową delecję jest zastosowanie systemu Cre-loxP. Metoda ta polega na flankowaniu interesującego genu miejscami loxP, które stanowią specyficzne sekwencje rozpoznawane przez białko rekombinazę Cre. Poddanie tak zwanego DNA floxed (flankowanego miejscami loxP) działaniu tego enzymu prowadzi do procesu rekombinacji zależnej od Cre w miejscach loxP, a w konsekwencji do wycięcia znajdującego się pomiędzy nimi genu3. Istnieje kilka różnych metod dostarczania rekombinazy Cre do interesowanego miejsca. W tym filmie prezentujemy zastosowanie adenowirusa zawierającego gen rekombinazy Cre do infekcji pierwotnych zarodkowych fibroblastów mysich (MEFs) uzyskanych z embrionów posiadających allel Rac1 w wersji floxed1. Podstawą wyboru MEFs z genem Rac1 do naszych eksperymentów jest fakt, że po delecji Rac1 można zaobserwować wyraźne zmiany morfologiczne wynikające z modyfikacji cytoszkieletu aktynowego2,5. 72 godziny po transdukcji wirusowej i ekspresji Cre komórki wybarwiono przy użyciu barwnika do aktyny – falooidyny – i obrazowano za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej. Zaobserwowano, że MEFs poddane działaniu wirusa adeno-Cre wykazywały morfologię kurczliwą i wydłużoną w porównaniu z komórkami nieinfekowanymi, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami2,5. Metoda dostarczania rekombinazy Cre za pomocą adenowirusa jest korzystna, ponieważ wirus adeno-Cre jest łatwo dostępny, a zoptymalizowana infekcja adenowirusowa pozwala na osiągnięcie delecji genu za pomocą Cre w niemal 100% komórek.

W tym filmie wykorzystujemy adenowirus niosący gen rekombinazy Cre do zakażenia pierwotnych embrionalnych fibroblastów myszy posiadających floxowany allel Rac1.

Genetyczne usuwanie cząsteczek sygnałowych w hodowanych pierwotnych fibroblastach embrionalnych myszy za pomocą adenowirusów

Zdolność do genetycznego usuwania konkretnych komponentów różnych kaskad sygnalizacji komórkowej stała się nieodzownym narzędziem w nowoczesnych badaniach nad transdukcją sygnału...

Współczesna analiza genetyczna w dużym stopniu opiera się na technikach ułatwiających ukierunkowane usuwanie konkretnych genów z komórek, narządów lub całych organizmów. Takie eksperymenty z nokautem pomagają w wyjaśnieniu funkcji genu w jego kontekście komórkowym. Fenotypy molekularne, morfologiczne i fizjologiczne nokautu dostarczają wskazówek dotyczących roli produktów genów kodowanych przez usuniętą sekwencję.W organizmach modelowych, takich jak myszy, powszechną metodą uzyskania warunkowej delecji genu jest flankowanie interesującego genu lub eksonu sekwencjami loxP, które służą jako sekwencje rozpoznawane przez enzym rekombinazę Cre. Nieodwracalna ekscyzja tak zflankowanego allelu jest następnie katalizowana przez Cre, co prowadzi do usunięcia sekwencji z genomu. Istnieje kilka różnych metod wprowadzania rekombinazy Cre do układu, w tym metody wykonywane in vivo oraz takie, które są stosowane bezpośrednio w ugruntowanych liniach komórkowych.W tym konkretnym zastosowaniu użyjemy adenowirusa do dostarczenia Cree do komórek fibroblastów, które zostały wyizolowane i hodowane z myszy transgenicznej niosącej allel flock. Metoda ta pozwala na osiągnięcie niemal 100% wydajności dostarczania transgenu. Po podaniu wirusa do komórek zostaje on zinternalizowany w pęcherzyku endocytycznym i przetransportowany do otoczki jądrowej, gdzie jego DNA, w tym interesujący nas transgen, może przeniknąć do jądra poprzez kompleks porowy.Maszyneria komórkowa może następnie przeprowadzić transkrypcję wstrzykniętego genu, umożliwiając jego produktom białkowym oddziaływanie na komórkę. W tym przypadku wirusowo kodowany enzym rekombinaza Cre wycina allel „flocked” z genomu komórki gospodarza. Reprezentujemy laboratorium Jonesa na Uniwersytecie w Guelph w Guelph, Ontario, w Kanadzie.W naszym laboratorium interesujemy się koncepcją transdukcji sygnału oraz tym, co dzieje się po usunięciu specyficznych komponentów z różnych kaskad transdukcji sygnału. Dzisiaj przyjrzymy się kaskadzie związanej z organizacją aktyny. Transdukcja sygnału jest realizowana przez szereg komponentów biochemicznych, które przekazują informacje i wywołują zmiany fenotypowe, takie jak reorganizacja aktyny.Naszym białkiem docelowym jest RAC1, mała GTPaza, która odgrywa istotną rolę w regulacji dynamiki aktyny, w tym w adhezji, migracji i morfologii komórek. W niniejszym badaniu wykorzystamy system Cre-LoxP do usunięcia tego genu i potwierdzenia jego roli w komórce. Wcześniej, 12 dni po zapłodnieniu, wyizolowano komórki fibroblastów z embrionów myszy z floksowanym allelem RAC1.Komórki te umieszczono następnie w ciekłym azocie do długotrwałego przechowywania; procedurę rozpoczniemy od rozmrożenia jednej fiolki tych komórek, reprezentującej jeden embrion. Podczas przeprowadzania eksperymentów z hodowlami komórkowymi kluczowe jest zachowanie sterylnych warunków. Wymaga to przetarcia odsłoniętych powierzchni zatwierdzonego dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, a także spryskania 70% etanolem wszystkich butelek z odczynnikami i sprzętu laboratoryjnego wprowadzanego do dygestorium.Po przygotowaniu komory z laminarnym przepływem powietrza, rozmroź komórki, zanurzając fiolkę w zlewce z wodą o temperaturze 37 °C do momentu upłynnienia zawartości. Następnie zdezynfekuj fiolkę 70% etanolem, a potem dodaj zawiesinę komórkową. Przenieś ją kroplami na płytkę 10 cm zawierającą 9 mL pożywki DMEM (wysoka zawartość glukozy) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny.Po dodaniu streptomycyny delikatnie poruszaj płytką, aby rozproszyć komórki, a następnie umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2, pamiętając o odpowiednim oznakowaniu płytki. Komórki zazwyczaj osiągają 100% konfluencji w ciągu 24 godzin. W tym momencie można przeprowadzić pasaż komórek na nową płytkę.Aby to zrobić, należy rozpocząć od odessania starego medium. Dodaj 5 ml sterylnego PBS w celu wypłukania komórek, a następnie go usuń. Teraz dodaj 1 ml trypsyny zawierającej 10 mM EDTA.Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37°C na około pięć minut, aby komórki mogły oddzielić się od podłoża. Przenieś płytkę z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza i dodaj dziewięć ml pożywki do płytki z trypsynizowanymi komórkami, rozcieńczając je w stosunku 1:10. Pipetuj ciecz kilkakrotnie w górę i w dół, aby rozbić skupiska komórek, a następnie pobierz jeden ml zawiesiny i dodaj go kroplami do dziewięciu ml świeżej pożywki w nowej płytce 10 cm. Ponownie delikatnie zakolebś płytką, aby rozproszyć komórki, i umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37°C.Gdy komórki osiągną konfluencję, kolejnym krokiem jest ich wysianie na szklane szkiełka nakrywkowe, aby umożliwić ich obserwację pod mikroskopem. Przygotuj komórki, stosując tę samą technikę, która była używana do pasażowania, aż do momentu dodania trypsyny do komórek i umieszczenia ich w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Podczas gdy komórki odrywają się od płytki, przygotuj płytkę sześciodołkową ze szklanymi szkiełkami nakrywowymi, umieszczając jedno autoklawowane szkiełko w każdym dołku.Po odłączeniu komórek od płytki, do komórek poddanych trypsynizacji należy dodać od pięciu do sześciu ml pożywki. W kolejnym etapie eksperymentu zostanie przeprowadzone zliczenie komórek, aby wysiać odpowiednią ich liczbę w celu zapewnienia efektywnej infekcji wirusowej. Aby policzyć komórki, należy połączyć 15 µL próbki z równą ilością błękitu trypanu, wymieszać roztwór poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie nanieść 15 µL tak przygotowanego roztworu do hemocytometru.Martwe komórki będą miały kolor niebieski. W tym preparacie należy policzyć tylko żywe lub bezbarwne komórki w siatce o wymiarach cztery na cztery, aby obliczyć liczbę komórek na mikrolitr. Rozpocznij od policzenia komórek w czterech oddzielnych polach, od A do D, a następnie wylicz średnią. Następnie pomnóż tę wartość przez dwa, aby uwzględnić rozcieńczenie w błękicie trypanowym.Ponieważ siatka mieści 1/10 mikrolitra, pomnóż wynik przez 10, aby wyrazić wartość jako liczbę komórek na mikrolitr. Następnie wyznacz wymaganą objętość, dzieląc pożądaną liczbę komórek przez wcześniej obliczone stężenie komórek. Dodaj obliczoną objętość zawiesiny komórkowej kroplami do każdego dołka płytki sześciodołkowej.Pozostawić te komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia do komórek zostanie dodany wirus. Wirus Den Creek otrzymany z Vector B labs został podzielony na alikwoty i przechowywany w temperaturze -80 °C.Pobrać ten wirus i przenieść go do komory z laminarnym przepływem powietrza. Wyjąć płytkę sześciodołkową z inkubatora i przenieść ją do komory. Odessać pożywkę i przemyć komórki 1 ml DMEM bez surowicy.Teraz do każdej studni dodaj 1 mL medium bezsurowiczego w celu aplikacji wirusa. Do zakażenia stosujemy wielokrotność infekcji (MOI) wynoszącą 500. Optymalizacja protokołu została wcześniej przeprowadzona z użyciem różnych wartości MOI; ustalono, że MOI równe 500 zapewnia wysoką wydajność zakażenia przy niewielkim lub żadnym wpływie na żywotność komórek.Aby obliczyć MOI, należy zastosować następujące równanie. W pierwszej kolejności oblicza się liczbę wymaganych wirusów, co można osiągnąć poprzez pomnożenie docelowego MOI (w tym przypadku 500) przez liczbę komórek w dołku (30 000). Aby określić objętość zapasu wirusa, którą należy zastosować, należy pomnożyć liczbę wirusów przez 1000, a następnie podzielić wynik przez początkowe stężenie wirusa. W tym przypadku do każdego dołka przeznaczonego do infekcji dodamy 1,5 µL zapasu wirusa.Delikatnie zakołysz płytkę, aby rozprowadzić wirusa, a następnie umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C na noc. Następnego dnia rano usuń pożywkę z wirusem z komórek, przemyj je PBS i dodaj do komórek 2 mL zwykłej pożywki. W tym eksperymencie stwierdzono, że zmiany fenotypowe w komórkach wystąpiły po około 72 godzinach.Komórki barwione Aktinidyną obrazowano przy użyciu wielofotonowego konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego Leica T-C-S-S-P w Advanced Analysis Center na University of Guelph. Wykazało to zmiany w morfologii pomiędzy komórkami zakażonymi a niezakażonymi. Te, w których brakuje RAC1, wydają się wydłużone i cienkie w porównaniu do szerokich, spłaszczonych komórek, które nie zostały zakażone.W niniejszej pracy wykazaliśmy, że system kreacji ADOC jest niezawodną metodą wydajnej dostawy genów do komórek, wykraczającą poza badanie transdukcji sygnału. Metodę tę można również wykorzystać do wyciszania genów u zwierząt doświadczalnych lub do znakowania określonych populacji komórek w organizmie. System adenowirusowy może być również stosowany do wprowadzania genów innych niż Cre w zależności od celu.Zalety zastosowania tej metody dostarczania obejmują jej wysoką skuteczność, wydajność oraz brak integracji z DNA komórki gospodarza. Jednak generowanie powszechnych adenowirusów może być pracochłonne. Protokół opisany w niniejszej pracy wykorzystuje zatem potencjał systemu adenowirusowego, stosując wcześniej opracowany wirus ocre z naszym systemem RAC one mes; dzięki temu warunkowemu nokautowi wykazaliśmy, że.Zatem morfologia jest rzeczywiście częściowo zależna od małych białek GTP, takich jak RAC. Podsumowując, my z laboratorium Jonesa chcielibyśmy podziękować za obejrzenie naszego filmu i życzyć powodzenia w dalszych badaniach.

adenovirus-mediated-genetic-removal-signaling-molecules-cultured

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Usunięcie genetyczne cząstek sygnałowych za pośrednictwem adenowirusa w hodowli pierwotnych mysich zarodkowych fibroblastów

Przedstawiamy technikę lentiwirusową służącą do manipulacji genetycznej i wizualizacji pojedynczego aksonu neuronu sensorycznego węchu oraz jego arboryzacji terminalnej in vivo.

Lentiwirusowa manipulacja genetyczna i wizualizacja neuronów sensorycznych węchu in vivo

Opisujemy protokół służący do identyfikacji kluczowych ról cząsteczek sygnałowych gospodarza w litycznej replikacji modelowego herpeswirusa, gamma herpeswirusa 68 (γHV68). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy oraz fibroblasty zarodkowe do litycznej replikacji γHV68, protokół ten umożliwia zarówno charakterystykę fenotypową, jak i analizę molekularną oddziaływań wirus-gospodarz podczas litycznej replikacji wirusa.

Analiza oddziaływań gospodarz-wirus podczas litycznej replikacji modelowego herpeswirusa

Pomimo funkcjonalnego i medycznego znaczenia podwzgórza, rzadko próbowano genetycznej manipulacji jego rozwojem in utero. Przedstawiamy szczegółową procedurę elektroporacji in utero do podwzgórza myszy i pokazujemy reprezentatywne wyniki całkowitej i częściowej (regionalnej) transfekcji podwzgórza.

Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero

Opisujemy protokół pomiaru produkcji cytokin przeciwwirusowych u myszy zakażonych modelowym herpeswirusem, mysim gamma herpesvirus 68 (γHV68), który jest blisko spokrewniony z ludzkim wirusem opryszczki Kaposiego (KSHV) i wirusem Epsteina-Barr (EBV). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy i mysie fibroblasty embrionalne (MEF), oceniliśmy produkcję cytokin przeciwwirusowych zarówno in vivo, jak i ex vivo. "Odtwarzając" ekspresję wrodzonych składników odpornościowych w...

Analiza wrodzonej sygnalizacji immunologicznej w unikaniu produkcji cytokin przez wirusa

Tutaj prezentujemy solidną metodę przeprogramowania pierwotnych fibroblastów embrionalnych w funkcjonalne kardiomiocyty poprzez nadekspresję GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 i miR-133 (GHMT2m) wraz z hamowaniem sygnalizacji TGF-β. Nasz protokół generuje bicie kardiomiocytów już po 7 dniach od transdukcji z wydajnością do 60%.

Tłumienie sygnalizacji pro-fibrotycznej nasila przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy w indukowane kardiomiocyty za pośrednictwem czynników

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania aktywności sygnalizacyjnej TGF-β/Smad3 na żywo komórek za pomocą systemu reporterskiego adenowirusa. System ten śledzi aktywność transkrypcyjną w czasie rzeczywistym i może być stosowany zarówno do pojedynczych komórek in vitro, jak i do żywychmodeli zwierzęcych.

Obrazowanie żywych komórek szlaku sygnałowego TGF-β/Smad3 in vitro i in vivo przy użyciu systemu reporterowego adenowirusa

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju dominująco-ujemnego systemu indukcyjnego, w którym każde białko może być warunkowo dezaktywowane przez odwracalną nadekspresję jego dominująco-ujemnej wersji zmutowanej.

Indukowalne i odwracalne hamowanie białka dominująco-ujemnego (DN)

Tutaj prezentujemy protokół przeprowadzania nokautów genów, które są embrionalne śmiertelne in vivo w genetycznie modyfikowanych mysich modelach nowotworów, a następnie oceniamy wpływ nokautu na wzrost, proliferację, przeżycie, migrację, inwazję i transkryptom in vitro i in vivo.

Definiowanie funkcji genów w nowotworzeniu poprzez ablację ex vivo floksowanych alleli w złośliwych komórkach nowotworowych osłonki nerwów obwodowych

Ten protokół opisuje proces generowania i charakterystyki mysich organoidów urotelialnych zawierających delecje w interesujących genach. Metody obejmują pobieranie mysich komórek urotelialnych, transdukcję ex vivo z adenowirusem napędzającym ekspresję Cre za pomocą promotora CMV oraz charakterystykę in vitro i in vivo.

Ex vivo Organoidalny model delecji genów za pośrednictwem adenowirusa-cre w mysich komórkach urotelialnych

Ten protokół opisuje, w jaki sposób dośledzionowa iniekcja małego RNA spinki do włosów dostarczanego przez AAV8 osiąga taką samą skuteczność knockdownu genu w wątrobie jak iniekcja do żyły wrotnej, co stanowi prostszą procedurę ze znacznie niższą śmiertelnością i powikłaniami okołooperacyjnymi i pooperacyjnymi.

Skuteczny knockdown genu w wątrobie poprzez wstrzyknięcie do śledziony małego RNA dostarczonego przez serotyp 8 (AAV8) wirusa związanego z adenowirusem

Poznaj metodę usuwania genu Rac1 w pierwotnych fibroblastach embrionalnych myszy przy użyciu adenowirusa dostarczającego rekombinazę Cre. Technika ta umożliwia badanie dynamiki aktyny z niemal 100% wydajnością.

Genetyczne usuwanie cząsteczek sygnałowych za pośrednictwem adenowirusa w hodowanych pierwotnych fibroblastach embrionalnych myszy (Wideo) | JoVE Journal

Genetyczne usuwanie cząsteczek sygnałowych w hodowanych pierwotnych fibroblastach embrionalnych myszy za pomocą adenowirusów

Przeglądaj więcej filmów