Metoda hodowli całych embrionów gryzoni z wykorzystaniem systemu hodowli w butelkach typu rotacyjnego
28 sierpnia 2010
Technika hodowli całego zarodka pozwala na hodowlę zarodków myszy i szczura w warunkach ex vivo przez ograniczony czas, odpowiadający etapom środkowej okresu ciężywności. W niniejszym protokole wideo prezentujemy standardowe procedury hodowli całego zarodka szczura po E12.5 przy użyciu systemu hodowli w butelkach typu rotacyjnego.
W biologii rozwoju do eksperymentów wykorzystuje się różne zwierzęta. Technika hodowli zarodków została opracowana w latach 50. XX wieku i rozwinięta przed wprowadzeniem nowoczesnych manipulacji genetycznych w hodowli hawajskiej. Precyzyjnie celowane obszary można modyfikować poprzez wprowadzanie genów lub transfekcję, ponieważ zarodki można manipulować i obserwować pod mikroskopem, w związku z czym hodowla całych embrionów jest bardzo użytecznym narzędziem.
Kiedy chcemy badać dynamiczny proces rozwoju embrionów szczurzych po implantacji. Wzrost embrionów szczurzych jest krytycznie zależny od funkcjonalnego łożyska, co ogranicza czas trwania hodowli. Generalnie embriony można hodować w okresie od 8,5 do 14,5 dnia embrionalnego u szczura oraz od E 6,5 do 12,5 u myszy.
W laboratorium hodujemy zarodki szczura i myszy, wykorzystując rotacyjny system hodowli. System ten jest najpopularniejszy i najlepiej dostosowany do hodowli zarodków szczura i myszy w późniejszym okresie ciąży. Chodzi o etap po E 11,5 u szczurów i E 9,5 u myszy.
W tym filmie chcielibyśmy przedstawić nasz standardowy protokół hodowli typu „hungry culture” z wykorzystaniem embrionów RU w stadium E 12.5. W tych warunkach embrion może być hodowany przez dwa dni, co jest wystarczającym czasem do zbadania różnych skutecznych manipulacji w hodowli. Istnieją dwa krytyczne kroki niezbędne dla osiągnięcia sukcesu.
Po pierwsze, procedura sekcji musi być precyzyjna, aby nie uszkodzić zarodka, w szczególności naczyń prętoidowych. Po drugie, procedura powinna być przeprowadzona tak szybko, jak to możliwe. Ma to szczególne znaczenie w przypadku starszych zarodków.
Na przykład w przypadku zarodków myszy w stadium E 10.5 należy je przenieść w ciągu 30 minut. Zastosowaliśmy technikę hodowli całych zarodków dla zarodków mutantów pack six. Na przykład analizujemy wzorzec migracji komórek neurore w mutancie poprzez znakowanie niewielkiej liczby komórek barwnikiem lub poprzez transplantację komórek w zarodki o genotypie dzikim oraz mutantów.
Ponadto opracowaliśmy metodę transferu genów do hodowlanych embrionów myszy i szczurów za pomocą elektroporacji wykorzystującej wstrząsy elektryczne. Możemy w prosty sposób wprowadzać konstrukty genów egzogennych, formy dominująco-negatywne oraz siRNA do obszaru rozwijających się mózgów. Dzięki temu możemy łatwo analizować funkcje genów poprzez eksperymenty typu loss-of-function oraz gain-of-function.
Badamy również zachowanie komórek znakowanych GFP lub RFP, wykorzystując hodowlę organów lub hodowlę plastrów po wykonaniu zabiegu lub w trakcie hodowli. Dzięki temu można przeprowadzać różnorodne eksperymenty, wykorzystując hodowlę ex vivo w połączeniu z innymi technikami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół wideo demonstruje technikę hodowli całych embrionów szczura po etapie E12.5 z wykorzystaniem systemu hodowli w butelkach typu rotacyjnego. Metoda ta umożliwia hodowlę ex vivo podczas krytycznych etapów średniego okresu ciążowości.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwoju
- Embriologia
- Techniki hodowli ex vivo
Wstęp
- Technika hodowli całego zarodka jest stosowana od lat 50. XX wieku.
- Umożliwia ona manipulacje z zarodkami na potrzeby badań genetycznych.
- Zarodki mogą być hodowane podczas określonych okresów rozwoju.
- Wzrost jest zależny od funkcjonalnej obecności zarodka.
Cel badania
- Badanie dynamicznych procesów rozwoju embrionów po implantacji.
- Zapewnienie zestandaryzowanej procedury hodowli całych embrionów.
- Usprawnienie badań w dziedzinie biologii rozwoju.
Zastosowane metody
- Technika hodowli całych zarodków
- System hodowli w butelkach typu rotacyjnego
- Warunki ex vivo dla zarodków szczura
- Okresy hodowli od 8,5 do 14,5 dnia embrionalnego
Główne wyniki
- Skuteczna hodowla zarodków szczura po etapie E12.5.
- Prezentacja standardowych procedur manipulacji zarodkami.
- Wgląd w krytyczne okresy wzrostu zarodków.
- Ustanowienie niezawodnej metody do przyszłych badań.
Wnioski
- Technika hodowli całego zarodka jest cennym narzędziem w biologii rozwoju.
- Umożliwia ona badanie rozwoju embrionalnego w kontrolowanych warunkach.
- Ustandaryzowane metody zwiększają powtarzalność badań.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
System rotacyjnej hodowli całych embrionów (WEC) umożliwia bezpośrednią manipulację i obserwację embrionów gryzoni podczas krytycznych etapów środkowej fazy gestacji, wspierając ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć. Ta platforma ex vivo pozwala na precyzyjne interwencje genetyczne i komórkowe, ułatwiając funkcjonalną walidację celów oraz analizę szlaków sygnalizacyjnych przed badaniami in vivo. Jej powtarzalność i adaptacyjność sprawiają, że jest ona cennym narzędziem w badaniach translacyjnych i selekcji projektów w modelowaniu rozwoju oraz chorób.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią manipulację genetyczną lub komórkową w celu funkcjonalnej walidacji celu w embrionach ssaków.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie badań nad utratą i wzmocnieniem funkcji w kontrolowanym systemie ex vivo.
- Ułatwia wyjaśnianie szlaków sygnałowych i testowanie hipotez w kluczowych punktach zwrotnych rozwoju.
- Zapewnia platformę do oceny wpływu potencjalnych interwencji na rozwój embrionalny.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych, podatnych na manipulacje systemów embrionalnych do późniejszego screeningu fenotypowego lub analiz mechanistycznych.
- Umożliwia powtarzalną, ilościową ocenę wyników rozwojowych po perturbacjach genetycznych lub chemicznych.
- Wspiera standaryzację i skalowalność testów w badaniach porównawczych między genotypami lub interwencjami.
- Pozwala na wiarygodną ocenę funkcji związku lub genu w fizjologicznie istotnym kontekście.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z istotnymi dla choroby etapami rozwoju, co pozwala na modelowanie wad wrodzonych lub funkcji genów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając badania mechanistyczne w nienaruszonych embrionach.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, dzięki wczesnemu wyjaśnianiu wad rozwojowych w procesie badawczym.
- Ułatwia odkrywanie i walidację biomarkerów w kontrolowanym, modyfikowalnym systemie.
Integracja potoku i przepływu pracy
System WEC typu rotacyjnego stanowi pomost między wczesną fazą odkryć a badaniami przedklinicznymi, umożliwiając manipulacje oparte na hipotezach oraz ilościową analizę rozwoju embrionalnego. Pozycjonowany pomiędzy testami in vitro a modelami in vivo, oferuje unikalną platformę do badań mechanistycznych i ograniczania ryzyka w procesie doboru celów terapeutycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez bezpośrednią interwencję genetyczną lub komórkową.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne systemy embrionalne do ilościowych odczytów fenotypowych.
- Analityka: Umożliwia pomiar efektów rozwojowych, migracyjnych lub molekularnych w celu przeprowadzenia analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne odkrycia mechanistyczne z przedklinicznym modelowaniem chorób i walidacją biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zestandaryzowaną, adaptowalną platformę do wielokrotnego zastosowania w wielu programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy ex vivo dla badań rozwojowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie ryzyka biologicznego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów na etapie odkrywania.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie embriologii, mikrodyssekcji oraz technik manipulacji ex vivo.
- Konieczne jest zastosowanie specjalistycznej aparatury do hodowli w butelkach rotacyjnych oraz infrastruktury mikroskopowej.
- Wymagana jest rygorystyczna standaryzacja między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Możliwa jest konieczność adaptacji protokołu dla różnych szczepów gryzoni lub etapów rozwoju.
- Okres hodowli jest ograniczony przez zależność embrionu od funkcji łożyska, co zawęża okno analizy.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
The Method of Rodent Whole Embryo Culture Using the Rotator-type Culture System
2:06
Setting up Whole Embryo Culture System
3:53
Removal of Embryos from the Uterus
2:52
Preparation of Culture Medium
4:52
Dissection of Rat Embryos
7:27
Results and Discussion
0:07
Introduction
