Przygotowanie mysiego immunogenu przysadki do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki mózgowej

Autoimmunologiczne zapalenie przysadki mózgowej charakteryzuje się powiększeniem przysadki mózgowej i niedoborem jednego lub więcej hormonów przysadki mózgowej. Autoantygeny sprawcze pozostają nieznane. W tym miejscu przedstawiono protokół przygotowania białek przysadki mózgowej myszy do wykorzystania w badaniu tej choroby.

Pierwsze przysadki mózgowe są izolowane od myszy poddanych eutanazji. Przysadki mózgowe są następnie homogenizowane w celu mechanicznego rozbicia komórek i uwolnienia białek cytozolowych. Jednorodność jest klarowana przez wirowanie z niską prędkością i oceniana pod względem ilości za pomocą testu kolorometrycznego, BCA i jakości za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.

Na koniec wodny homogenat białka miesza się z oleistym adiuwantem. Mieszanina ta jest następnie wstrzykiwana myszom w celu stworzenia mysiego modelu przypominającego autoimmunologiczne zapalenie przysadki. Jak pokazano w filmie towarzyszącym, opisano cztery techniki wywoływania zapalenia przysadki mózgowej u zwierząt doświadczalnych.

Technika przedstawiona w tym artykule, czyli wstrzyknięcie adiuwantu do białek przysadki mózgowej, jest najstarsza z nich, pochodząca z lat 60. Inne podejścia to wstrzyknięcie rozpuszczalnych glikoprotein z wirusa różyczki w 1992 r., stereotaktyczne wstrzyknięcie adenowirusa bezpośrednio do przysadki mózgowej w 2002 r. oraz przeszczepienie przysadki mózgowej z jednego szczepu szczura pod torebkę nerkową innego szczepu szczura w 2010 r. Główną zaletą podejścia adiuwantowego Florencji jest to, że jest ono obecnie mniej inwazyjne, bardziej konsekwentne, a przede wszystkim dokładniejsze w wywoływaniu choroby, która bardzo przypomina ludzki odpowiednik.

Chociaż zgłaszano o tym od 1960 roku, zagraniczna technika adiuwantowa słabo sprawdzała się w indukcji zapalenia przysadki. Kiedy rozpocząłem pracę doktorską, udało mi się uzyskać tylko niewielki przypadek i nasilenie zapalenia przysadki przy użyciu opublikowanego zagranicznego protokołu adiuwantowego. Sytuacja znacznie się poprawia, gdy wpadam na pomysł dziesięciokrotnego zwiększenia ilości białek pitu zawartych w emocjach EM.

Chociaż metody te mogą dostarczyć informacji na temat patogenezy autoimmunologicznego zapalenia przysadki mózgowej, mogą być również wykorzystywane do badania innych chorób autoimmunologicznych, dla których autoantygeny pozostają do zidentyfikowania. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, będą miały problemy głównie z ostatnim krokiem, przygotowaniem marginesu, ponieważ wymaga to umiejętności manualnych, czasu i poświęcenia. Demonstracja wizualna ma zatem kluczowe znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób należy przygotować odpowiednią emulsję.

Implikacje tej techniki wykraczają poza dziedzinę autoimmunologii. Wiedza o tym, jak przygotować antygen do immunizacji, może być również wykorzystana do produkcji przeciwciał monoklonalnych lub do testowania nowych szczepionek. Tę technikę zademonstrują bohaterski Ura z S Zoo i Mayland al gato z mojego laboratorium.

Przysadka myszy to gruczoł w kształcie cylindra, który znajduje się u podstawy czaszki w zagłębieniu kości klinowej zwanym terica. Gruczoł jest otoczony bocznie nerwami trójdzielnymi, a z przodu skrzyżowaniem nerwu wzrokowego. Składa się z większego płata przedniego oraz mniejszych, pośrednich i tylnych płatów.

Aby wyizolować przysadkę mózgową, użyj nożyczek, aby odciąć głowę uśpionej myszy, a następnie wykonaj równoległe nacięcia od tyłu do przodu czaszki. Podnieś mózg i odwróć go do tyłu, aby odsłonić przysadkę mózgową, która pojawia się jako cylinder w kontekście trójkąta równoramiennego. Mając przysadkę mózgową jako podstawę, nerwy trójdzielne jako boki, a skrzyżowanie wzrokowe jako wierzchołek.

Okrąż gruczoł końcami zamkniętych kleszczy, aby złamać otaczającą oponę mózgową. Następnie za pomocą cienkich kleszczy chwyć przysadkę mózgową z komórki Turca i umieść ją w plastikowej tubie na suchym lodzie. Na jeden preparat zbierz 300 przysadek mózgowych myszy.

Zbieranie tych danych zajmuje około dziewięciu roboczogodzin. Po zakończeniu zbierania przechowuj przysadkę mózgową w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne. Umieść 15-mililitrową rurkę Falcon w łaźni lodowej.

Dodać do probówki 250 mikrolitrów buforu homogenizacyjnego. Na każde 100 przysadek pobranych tuż przed homogenizacją dodaj mysie przysadki mózgowe do buforu. Następnie umieść końcówkę homogenizatora poly tron, generatora o średnicy pięciu milimetrów, na dnie rurki Falcon zawierającej przysadki myszy i bufor, homogenizuj z maksymalną prędkością przez 30 sekund.

Delikatnie przesuwaj rurkę w górę iw dół, trzymając ją na lodzie. Następnie odłóż homogenat na lodzie na jedną minutę. Powtórz etapy homogenizacji i chłodzenia jeszcze dwa razy.

Ta delikatna homogenizacja powinna rozbić komórki i uwolnić białka bez rozbijania jąder Wirówka. Homogenat z małą prędkością, około 1000 G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza do osadu, jąder, nieuszkodzonej tkanki i materiałów nierozpuszczalnych, takich jak tkanka łączna i zdenaturowane kompleksy białkowe. Uważając, aby nie naruszyć pelletu.

Przenieś SNA teraz nazywany sate postnuklearnym lub PNS do nowego magazynu lamp Falcon. PNS na lodzie cofają osad przy użyciu tej samej objętości buforu homogenizacyjnego co poprzednio, homogenizują i odwirowują jak poprzednio. Po połączeniu dwóch próbek PNS należy umieścić roztwór w licznych mikroprobówkach wirówkowych.

Przechowuj probówki do mikrowirówek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne. Ten preparat białkowy jest stabilny w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, ale stopniowo traci swoją moc. Dlatego zaleca się zstosowanie go w ciągu sześciu miesięcy od przygotowania.

Zachować jedną małą podwielokrotność PNS w celu określenia wydajności i stężenia białka za pomocą testu kwasu biy. Następnie określ jakość białka za pomocą elektroforezy żelowej z 300 przysadek mózgowych myszy, które średnio ważą około 570 miligramów. Spodziewaj się wydajności 60 miligramów białek przysadki mózgowej lub jednego miligrama białka na każde 10 miligramów tkanki.

Stężenie białka wynosi zwykle około 40 miligramów na mililitr. Podany tutaj przykład dotyczy uodpornienia 10 myszy. Zaplanuj wstrzyknięcie każdej myszy 100 mikrolitrów emulsji zawierającej jeden miligram białka przysadki mózgowej, pozwalając dwóm dodatkowym myszom na straty materialne podczas przygotowania Tutaj przygotowuje się 12 miligramów emulsji białkowej.

Zacznij od szybkiego rozmrożenia zamrożonych porcji białka, podgrzewając je w dłoniach. Dostosuj stężenie białka do 20 miligramów na mililitr za pomocą PBS. Następnie narysuj 600 mikrolitrów ekstraktu białkowego przysadki odpowiadającego 12 miligramom do 2,5-mililitrowej strzykawki Gas Tite Hamilton, pełnego adiuwanta FRONS lub CFA zawierającego pięć miligramów na mililitr ciepła, które zabiło prątki gruźlicy, ręcznie wstrząsając nimi.

Następnie wlej 600 mikrolitrów CFA do kolejnej 2,5-mililitrowej strzykawki Hamiltona. Przymocować i przymocować igłę do mikroemulgowania o rozmiarze 22 do strzykawki wypełnionej CFA. Powoli wciskać tłok w taki sposób, aby igła została wypełniona CFA.

Następnie przymocuj i przymocuj drugi koniec igły do drugiej strzykawki wypełnionej ekstraktem białkowym z przysadki mózgowej. Należy unikać uwięzienia pęcherzyków powietrza wewnątrz strzykawek. Powoli przesuwać tłok strzykawki CFA, aby wepchnąć składnik olejowy do wodnego ekstraktu z przysadki mózgowej w taki sposób, aby wymieszać tylko niewielką ilość.

Następnie wepchnij tłok strzykawki z ekstraktem przysadki mózgowej do strzykawki CFA. Powtórz tę czynność, aby stopniowo zwiększać ilość mieszanego materiału, aż cała zawartość zostanie wymieszana. Ten białawy i równomiernie rozłożony materiał reprezentuje emulsję wodno-olejową.

Po utworzeniu emulsji powtórz pełny cykl tam iz powrotem co najmniej 500 razy po ostatnim cyklu, strzykawki będą zawierały emulsję wody i oleju jeden do jednego, w której stężenie białka przysadki wynosi teraz 10 miligramów na mililitr. Emulsja jest gotowa do użycia w celu sprawdzenia jakości emulsji po jej upuszczeniu do zlewki z wodą. Jeśli emulsja zostanie przygotowana prawidłowo, kropla pozostanie zwarta i szczelna na powierzchni.

Jeśli emulsja jest złej jakości, rozproszy się i rozpadnie na mniejsze krople. Emulsję wstrzykuje się tego samego dnia po przygotowaniu myszom SJL w celu wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki mózgowej. Protokół ten jest szczegółowo opisany w dołączonym jo pionu.

Po pobraniu gruczołu pitu i opanowaniu technik, można wykonać instrukcję białka w ciągu godziny, pamiętając o pracy na szybko i na lodzie. Na tym etapie, podczas przygotowania zanurzenia, które trwa około godziny. Pamiętaj, aby pracować powoli i cierpliwie w początkowej fazie mieszania, po jego rozwinięciu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się autoimmunizacją do zbadania mechanizmów, za pomocą których autoreaktywne limfocyty rozpoznają i infiltrują narząd docelowy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre zrozumienie wszystkiego, jak przygotować ekstrakt białkowy z przysadki mózgowej myszy i jak wymieszać go z tymi z aju Leśniowskiego-Crohna, aby przygotować emulsję, która jest gotowa do użycia jako immunogen. Nie zapominaj, że praca ze strzykawkami i kompletnymi strzykawkami przeciw grypie, które zawierają inaktywowaną i suchą gruźlicę mikrobakteryjną, może być niebezpieczna, jeśli przypadkowo nakłujesz się.

Dlatego zawsze używaj żarzeń G i odpowiednio utylizuj igły podczas wykonywania tej procedury.