Name: Przygotowanie mysiego immunogenu przysadki do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki mózgowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Poznaj metodę przygotowania białek przysadki mysiej do badań nad autoimmunologicznym zapaleniem przysadki mózgowej. Protokół obejmuje izolację, homogenizację i ocenę jakości ekstraktów białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez grant NIH DK080351 przyznany PC.

Protokół eksperymentalny
Pierwszym krokiem w tym protokole eksperymentalnym jest pobranie dużej liczby przysadki mózgowe myszy. Drugim krokiem jest homogenizacja gruczołów w celu przygotowania ekstraktu białkowego. Trzecim krokiem jest emulgacja tych białek z mieszaniną olejową.
Krok 1: Pobieranie i przechowywanie przysadki mózgowej myszy
Przysadka mózgowa myszy znajduje się u podstawy czaszki, w zagłębieniu kości klinowej zwanym siodłem tureckim, otoczona bocznie przez nerwy trójdzielne, a z przodu przez skrzyżowanie wzrokowe. Gruczoł składa się z większego płata przedniego oraz mniejszych płatów tylnego i pośredniego i waży średnio 1.9 mg. Przysadki mózgowe pobierane są od myszy różnych szczepów, płci i w różnym wieku, przeznaczonych do eutanazji w placówce opieki nad zwierzętami.
Aby wyizolować przysadkę mózgową, mysz poddawana jest eutanazji, nacięta zostaje skóra nad czaszką, a kości czaszki są przecinane nożyczkami. Mózg jest unoszony w celu odsłonięcia przysadki, która następnie zostaje oddzielona od otaczającej ją opony twardej, wyjęta z kości klinowej i umieszczona w plastikowej probówce na suchym lodzie.
Zazwyczaj do przygotowania jednej porcji białka wykorzystujemy 300 przysadek mysich, co jest liczbą, którą jedna osoba może zebrać w ciągu 9 godzin.
Po zakończeniu pobierania probówka zawierająca przysadki jest przechowywana w temperaturze -80 °C do momentu przejścia do następnego etapu.
Krok 2. Ekstrakcja białek z przysadki mysiej
<ol>
<li>Do probówki Falcon 15 ml (nr katalogowy 352059) umieszczonej w kąpieli lodowej dodać bufor do homogenizacji, stosując 250 μL buforu na każde 100 zebranych przysadki mózgowe. Należy użyć buforu o sile jonowej zbliżonej do tej, która występuje fizjologicznie w cytoplazmie komórki (0.2 M) i o fizjologicznym pH (7.4). Stosujemy roztwór fosforanowo-solny (0.161 M, pH 7.4), uzupełniony koktajlem inhibitorów proteaz (Sigma-Aldrich, nr katalogowy P8340-1ML).</li>
<li>Tuż przed homogenizacją dodać przysadki mózgowe do buforu, a następnie umieścić generator (o średnicy 5 mm) homogenizatora Polytron na dnie probówki Falcon. Homogenizować przy maksymalnej liczbie obrotów przez 30 sekund, delikatnie poruszając probówką Falcon w górę i w dół, utrzymując ją w kąpieli lodowej. Następnie pozostawić homogenizat na lodzie przez 1 min. Powtórzyć etapy homogenizacji i chłodzenia jeszcze dwa razy. Ta delikatna homogenizacja powinna doprowadzić do rozbicia komórek i uwolnienia białek cytozolowych bez uszkodzenia jąder komórkowych.</li>
<li>Aby usunąć jądra, nierozbite tkanki i materiały nierozpuszczalne (takie jak tkanka łączna i zdenaturowane kompleksy białkowe), homogenizat wirować z niską prędkością (1000g) przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
<li>Przenieść nadsącz (zwany teraz nadsącz ponuklearnym, PNS) do nowej probówki Falcon, uważając, aby nie naruszyć osadu, i przechowywać PNS na lodzie.</li>
<li>Resuspender osad w pierwotnej objętości buforu do homogenizacji (250 μL buforu na każde 100 zebranych przysadki mózgowe), homogenizować i wirować w sposób opisany powyżej, a następnie połączyć drugi PNS z pierwszym.</li>
<li>Rozdzielić dwie połączone próbki PNS do probówek do mikrocentryfugi i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu wykonania kolejnego kroku. Taki preparat białkowy można przechowywać w -80 °C, jednak stopniowo traci on swoją aktywność, dlatego zaleca się jego wykorzystanie w ciągu 6 miesięcy od przygotowania. Małą alikwot wykorzystać do oznaczenia wydajności i stężenia białka za pomocą testu BCA (Pierce nr katalogowy 23225) oraz jakości białka za pomocą elektroforezy żelowej. Zazwyczaj z 300 mysich przysadek w 1.5 mL buforu do homogenizacji otrzymuje się około 60 mg białka, przy stężeniu około 40 mg/ mL.</li>
</ol>
Krok 3. Przygotowanie emulsji do immunizacji
<ol>
<li>Szybko rozmrozić mrożone alikwoty białka potrzebne do eksperymentu i dostosować stężenie białka do 20 mg/ mL. Ten ekstrakt białkowy zostanie zemulgowany w stosunku 1:1 z pełnym adiuwantem Freunda (CFA, Sigma F-5881) zawierającym 5 mg/ mL zabitych termicznie Mycobacterium tuberculosis (Becton Dickinson, 231141). Każda mysz otrzyma 1 mg ekstraktu z przysadki w 100 μL emulsji.</li>
<li>Przedstawiony tutaj przykład dotyczy immunizacji 10 myszy, z których każda otrzyma wstrzyknięcie 100 μL emulsji zawierającej 1 mg białek przysadki. Należy uwzględnić dwie dodatkowe myszy ze względu na straty materiału podczas przygotowania, zatem należy użyć 12 mg białek przysadki. Za pomocą szczelnej strzykawki Hamiltona o pojemności 2,5 mL pobrać 600 μL opisanego powyżej ekstraktu białek przysadki o stężeniu 20 mg/ mL. Resuspendować CFA poprzez wstrząsanie i pobrać 600 μL CFA do drugiej strzykawki Hamiltona o pojemności 2,5 mL. Do strzykawki wypełnionej CFA przymocować i zabezpieczyć igłę mikroemulgacyjną o rozmiarze 22G. Powoli nacisnąć tłok strzykawki z CFA tak, aby igła wypełniła się CFA, a następnie przymocować i zabezpieczyć drugi koniec igły do strzykawki wypełnionej ekstraktem z przysadki.</li>
<li>Powoli przesuwać tłok strzykawki z CFA, aby wtłoczyć komponent olejowy do wodnego ekstraktu z przysadki, tak aby zmieszała się tylko niewielka ilość materiału. Następnie cofnąć tłok strzykawki z ekstraktem z przysadki w stronę strzykawki z CFA. Powtarzać tę czynność, stopniowo zwiększając ilość mieszanego materiału. Kontynuować do momentu zmieszania całej zawartości obu strzykawek. Otrzymany zostanie białawy i jednorodny roztwór stanowiący emulsję woda w oleju.</li>
<li>Po utworzeniu emulsji powtórzyć ruchy posuwisto-zwrotne co najmniej 500 razy, aby zapewnić dokładne wymieszanie emulsji. Po ostatnim cyklu mieszania emulsja woda w oleju w stosunku 1:1 jest gotowa do użycia i zawiera białka przysadki w stężeniu 10 mg/mL. Emulsję należy wstrzyknąć tego samego dnia podskórnie znieczulonym myszom SJL, zgodnie ze szczegółami opisanymi w towarzyszącym artykule JoVE.</li>
</ol>

<ol><li>Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).</li>
<li>Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-lymphocyte-associated+antigen-4+blockage+can+induce+autoimmune+hypophysitis+in+patients+with+metastatic+melanoma+and+renal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer.</a> J Immunother. 28, 593-598 (2005).</li>
<li>Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+Hypophysitis+of+SJL+mice%3A+Clinical+Insights+from+a+New+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model.</a> Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).</li>
<li>Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+hypophysitis+and+Hashimoto%27s+disease+in+a+woman%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman.</a> J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).</li>
<li>Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hypophysitis%3A+an+underestimated+disease+in+search+of+its+autoantigen%28s%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s).</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Pomimo że pierwszy przypadek pacjenta z autoimmunologicznym zapaleniem przysadki opisano w 1962 roku4, patogenne autoantygeny przysadki wciąż nie zostały zidentyfikowane5. Modele zwierzęce mogą być bardzo użyteczne w identyfikacji tych autoantygenów, pomagając w odkryciu biomarkerów, które można przełożyć na opiekę nad pacjentem. Niniejszy artykuł zaprezentował prostą procedurę przygotowania białek przysadki w formie odpowiedniej do indukowania autoimmunologicznego zapalenia przysadki u zwierząt doś...

<table><tbody><tr><td>probówki Falcon 15 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bufor do homogenizacji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bufor fosforanowo-solny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>koktajl inhibitorów proteaz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>homogenizator Polytron</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>metoda BCA</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>pełne adjuwant Freunda&amp;rsquo;adiuwant (CFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-5881</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>BD Biosciences</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka Hamilton gastight o pojemności 2,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>igła mikroemulgująca G22</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie immunogenu z przysadki mysiej do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmunologiczne zapalenie przysadki jest przewlekłym stanem zapalnym przysadki mózgowej wywołanym lub towarzyszącym autoimmunizacji1. Tradycyjnie uważano je za rzadką chorobę, jednak w ostatnich latach liczba zgłoszeń znacząco wzrosła. Zapalenie przysadki rozwija się w rzeczywistości dość często jako „skutek uboczny” u pacjentów onkologicznych leczonych przeciwciałami blokującymi receptory hamujące ekspresjonowane na limfocytach T, takimi jak CTLA-42 i receptory PD-1. Autoimmunologiczne zapalenie przysadki można wywołać eksperymentalnie poprzez wstrzykiwanie myszom białek przysadki zmieszanych z adiuwantem3. W niniejszym artykule wideo demonstrujemy sposób ekstrakcji białek z przysadek mózgowych myszy oraz sposób ich przygotowania w formie odpowiedniej do wywoływania autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL.

Autoimmunologiczne zapalenie przysadki można wywołać u myszy poprzez wstrzyknięcie ekstraktu z białek przysadki mysiej.

Przygotowanie immunogenu z przysadki mysiej do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki

Autoimmunologiczne zapalenie przysadki jest przewlekłym stanem zapalnym przysadki mózgowej wywołanym przez autoimmunizację lub jej towarzyszącym1. Tradycyjnie uważano je za...

Autoimmunologiczne zapalenie przysadki charakteryzuje się powiększeniem przysadki mózgowej oraz niedoborem jednego lub więcej hormonów przysadki. Przyczynowe autoantygeny pozostają nieznane. W niniejszym materiale przedstawiono protokół przygotowania białek z przysadki mózgowej myszy do badań nad tą chorobą.W pierwszej kolejności izoluje się przysadki mózgowe z uśpionych myszy. Następnie przysadki poddaje się homogenizacji w celu mechanicznego rozbicia komórek i uwolnienia białek cytozolowych. Homogenat oczyszcza się poprzez wirowanie z niską prędkością, a następnie określa jego ilość za pomocą kolorymetrycznego testu BCA oraz jakość poprzez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym.Na koniec wodny homogenat białkowy miesza się z adiuwantem olejowym. Mieszaninę tę wstrzykuje się następnie myszom w celu stworzenia modelu mysiego przypominającego autoimmunologiczne zapalenie przysadki. Jak pokazano w towarzyszącym filmie, opisano cztery techniki indukowania zapalenia przysadki u zwierząt doświadczalnych.Technika przedstawiona w niniejszym artykule, polegająca na wstrzykiwaniu mieszanki białek przysadki jako adiuwanta grypy, jest najstarszą metodą, sięgającą lat 60. XX wieku. Inne podejś

preparation-mouse-pituitary-immunogen-for-induction-experimental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przygotowanie immunogenu przysadki mysiej do wywołania doświadczalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki

W niniejszym filmie przedstawiono sposób indukowania autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL oraz metodę oceny stopnia jego nasilenia za pomocą badania histopatologicznego.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL

Ten film demonstruje skuteczną technikę homogenizacji w celu wygenerowania emulsji antygenowo-adiuwantowej do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) w modelu mysim. Emulsja zawiera autoantygen — glikoproteinę mielinową oligodendrocytów (MOG) — w fazie wodnej, otoczoną ciągłą fazą olejową zawierającą inaktywowane bakterie chorobotwórcze. Emulsja zapewnia przedłużone uwalnianie antygenów w celu przedłużenia odpowiedzi immunologicznej.

Przygotowanie emulsji z adiuwantem antygenowym w celu wywołania autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Film demonstruje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy poprzez wstrzyknięcie kombinacji glikoprotein oligodendrocytów mielinowych i inaktywowanych Mycobacterium tuberculosis. Model umożliwia naukowcom badanie mechanizmów chorobowych i testowanie interwencji terapeutycznych.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

W tym filmie mysi model stwardnienia rozsianego jest tworzony za pomocą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Myszowi wstrzykuje się emulsję zawierającą peptyd neuronalny i adiuwant, wywołując odpowiedź immunologiczną, która aktywuje autoreaktywne limfocyty T. Następnie podaje się wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (PTX) w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając autoreaktywnym limfocytom T infiltrację mózgu. Ten naciek inicjuje kaskadę...

Przeszczep komórek macierzystych/progenitorowych (NPC) jest bardzo obiecujący w neurologii regeneracyjnej. Systemowe dostarczanie NPC przekształciło się w skuteczny, mało inwazyjny i bardzo skuteczny terapeutycznie protokół dostarczania komórek macierzystych do mózgu i rdzenia kręgowego gryzoni i naczelnych dotkniętych eksperymentalnym przewlekłym uszkodzeniem zapalnym ośrodkowego układu nerwowego.

Systemowe wstrzykiwanie nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych u myszy z przewlekłym EAE

W tym raporcie prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi na wygenerowanie mysiego modelu wewnątrzgałkowego zapalenia błony naczyniowej oka. Ten uznany model, częściej określany jako eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka (EAU), obejmuje wiele aspektów chorób u ludzi. W tym miejscu opiszemy, jak indukować i monitorować postęp choroby za pomocą kilku odczytów.

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka: wewnątrzgałkowy model zapalny myszy

Niniejszy protokół opisuje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia w modelu mysim przy użyciu glikoproteiny oligodendrocytów mieliny i monitorowanie procesu chorobowego za pomocą systemu punktacji klinicznej. Eksperymentalne objawy związane z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego są analizowane za pomocą analizy mikrotomografii komputerowej kości udowej myszy i testu terenowego w celu kompleksowej oceny procesu chorobowego.

Indukcja i zróżnicowane wskaźniki oceny eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Ustalono kilka typów zwierzęcych modeli zapalenia tarczycy Hashimoto, podobnie jak spontaniczne autoimmunologiczne zapalenie tarczycy u myszy NOD. Myszy H-2h4 to prosty i niezawodny model do indukcji HT. W tym artykule opisano to podejście i oceniono proces patologiczny w celu lepszego zrozumienia mysiego modelu SAT.

Generacja modelu spontanicznego autoimmunologicznego zapalenia tarczycy u myszy

Aby wywołać eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia, zwierzęcy model stwardnienia rozsianego, myszy są immunizowane emulsją typu woda w oleju zawierającą autoantygen i kompletny adiuwant Freunda. Chociaż istnieje kilka protokołów przygotowania tych emulsji, tutaj przedstawiono szybki, prosty i ustandaryzowany protokół homogenizacji do przygotowania emulsji.

Szybka, prosta i standaryzowana metoda homogenizacji do przygotowania emulsji antygenowych/adiuwantowych do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia jest jednym z najczęściej stosowanych mysich modeli stwardnienia rozsianego. W obecnym protokole myszy C57BL/6J obu płci są immunizowane peptydem glikoproteinowym oligodendrocytów mielinowych, co skutkuje głównie wznoszącym się niedowładem ogona i kończyn. W tym miejscu omówiono protokół indukcji i oceny EAE.

Modelowanie stwardnienia rozsianego u obu płci: eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia wywołane MOG35-55

Poznaj metodę przygotowania białek przysadki mysiej do badań nad autoimmunologicznym zapaleniem przysadki mózgowej. Protokół obejmuje izolację, homogenizację i ocenę jakości ekstraktów białkowych.

Przygotowanie immunogenu z przysadki mysiej do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki

Przeglądaj więcej filmów