Badanie aktywności protozoobójczej peptydów litycznych ligandów przeciwko pierwotniakiom jelita termitów in vitro (hodowla pierwotniaków) i in vivo (mikroiniekcja do jelita tylnego termitów)

Ogólnym celem tej procedury jest wykazanie, że zsyntetyzowany ligand specyficznie wiąże się z protozoami trawiącymi celulozę w jelitach termitów podziemnych z gatunku formosa, oraz że ligand sprzężony z peptydem litycznym zabija te protozoa in vitro w beztlenowej hodowli protozoów oraz in vivo poprzez wstrzyknięcie do jelita tylnego termita. Osiąga się to najpierw poprzez wyizolowanie protozoów z jelit robotnic termitów w warunkach beztlenowych. Drugim krokiem procedury jest potwierdzenie wiązania liganda sprzężonego z fluoresceiną z protozoami z jelit termitów in vitro.

Trzecim krokiem procedury jest wykazanie, że peptyd lityczny sprzężony z ligandem zabija pierwotniaki z jelit termitów in vitro. Ostatnim krokiem procedury jest wstrzyknięcie ligandu sprzężonego z fluoresceincją oraz peptydu litycznego sprzężonego z ligandem do jelita tylnego termita w celu potwierdzenia wiązania oraz niszczenia pierwotniaków jelitowych in vivo. Wykorzystując iniekcje kultur pierwotniaków do jelita tylnego termita oraz mikroskopię fluorescencyjną, wykazujemy, że ligand sprzężony z peptydem litycznym wiąże się i skutecznie zabija pierwotniaki z jelit termitów in vitro oraz in vivo.

Przyłączenie liganda do peptydu litycznego zwiększyło toksyczność wobec pierwotniaków w porównaniu do samego peptydu litycznego. Choć zmniejszyło to toksyczność wobec organizmów niebędących celem, takich jak e coli, najprawdopodobniej dlatego, że ligand nie wiązał się z błoną komórkową bakterii, utrata pierwotniaków prowadzi do śmierci termitów w czasie krótszym niż dwa tygodnie. Przedstawiona technika wykorzystania litycznych peptydów z ligandem do zabijania symbiotycznych pierwotniaków w jelitach termitów podziemnych jest częścią wysiłków mających na celu opracowanie alternatywnych metod zwalczania termitów.

Termity giną, gdy są mniej zależne od chemikaliów bez symbiontów w ich jelitach. Wyodrębniamy pierwotniaki z jelita termita, aby wykazać, że ligand wiąże się z pierwotniakami oraz że lityczny peptyd liganda zabija pierwotniaki. Cząsteczki drewna wewnątrz pierwotniaków wykazują autofluorescencję. Dlatego ważne jest porównanie wyników pierwotniaków traktowanych fluorescencyjnym ligandem z pierwotniakami nietraktowanymi.

Aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich, wstrzykujemy peptydy bezpośrednio do jelita tylnego, ponieważ w przypadku podania peptydów termitesom drogą pokarmową, proteaza obecna w jelicie środkowym oraz jelito przednie doprowadziłyby do ich strawienia. Wykorzystując biblioteki phage display firmy New England Bio Labs, zidentyfikowaliśmy 19 sekwencji peptydów hep, które wiążą się z pierwotniakami. Wybraliśmy jeden z ligandów o sekwencji peptydowej wykazującej podobieństwo do domniemanych glikoprotein znanych z błony Trypanosoma brucei.

Po syntezie peptydów, sprzęgliśmy syntetyzowany peptyd z fluorescencyjną sondą C-terminalną za pomocą syntezy peptydów w fazie stałej przy użyciu żywicy E-D-A-N-S novatech, aby ocenić właściwości lityczne koniugatów peptydowych. W tej procedurze wykorzystujemy koniugat syntetyzowanego ligandu i peptydu litycznego, który został wcześniej zsyntetyzowany w placówce białkowej LSU na jeden dzień przed eksperymentem. Należy zastosować sigma coat w celu zblokowania wszystkich używanych materiałów, aby zapobiec adsorpcji pierwotniaków lub peptydów do powierzchni.

Nanieś równomierną warstwę i pozostaw do wyschnięcia na całą noc przed użyciem następnego dnia. Przygotuj wentylator w schranku (glove box), aby stale wymuszać obieg powietrza w temperaturze pokojowej przez osuszacz oraz zestawy wkładów z katalizatorem typu D, w celu obniżenia poziomu wilgotności i tlenu przez ponad jedną godzinę. Wypełnij schranek ciągłym strumieniem azotu przez 20 do 30 minut i w razie potrzeby stosuj dodatkowy azot, aby utrzymać warunki beztlenowe.

Następnie należy przygotować pożywkę Traeger U i dostosować jej pH do wartości 7. Sterylną pożywkę w filtrze należy przelać w komorze rękawicowej za pomocą końcówki 200 µL podłączonej do rurki z mieszaniną 2,5% wodoru, 5% dwutlenku węgla i 92,5% azotu przez jedną godzinę, aby usunąć pozostałości tlenu z komory rękawicowej. Po przygotowaniu materiałów, za pomocą pęsety należy pobrać robotnicę termita z szalki Petriego i zanurzyć całe ciało w zlewce wypełnionej 70% etanolem, delikatnie potrząsając i trzymając termita pęsetą przez około 10 sekund. Aby usunąć zanieczyszczenia powierzchniowe, należy wyjąć robotnicę z etanolu i pozostawić do wyschnięcia na czystej chusteczce Kimwipe przez około 20 sekund.

W komorze rękawicowej przygotuj zasilikonizowany szkiełko przedmiotowe z 100 µL pożywki Trager U do pobierania jelita termitów oraz probówkę z 900 µL pożywki Trager U do pobierania pierwotniaków. Następnie, używając mikroskopu sekcyjnego i sterylnej pęsety z cienkimi końcówkami, przytrzymaj odwłok robotnicy i chwyć koniec odwłoka drugą pęsetą, aby delikatnie wyciągnąć jelito w górę lub w dół pod kątem 45 stopni; spróbuj pobrać cztery fragmenty jelita środkowego i jelita tylnego w jednym kawałku. Umieść pobrane jelita w kropli 100 µL pożywki Traeger U na szkiełku przedmiotowym.

W następnym kroku przebij jelita tylne za pomocą pary sterylnych, cienkich sond do sekcji, aby uwolnić pierwotniaki, a następnie delikatnie przenieś zawartość jelit pipetą 200 µL do probówki do mikrowirówki o pojemności 1 mL zawierającej 900 µL medium Traegera. Odczekaj pięć sekund do osadzenia się fragmentów ścian jelit i przenieś 900 µL nadsączu do nowej probówki. Przenieś 10 µL hodowli pierwotniaków na szkiełko mikroskopowe powlekane sigmą.

Przygotuj preparat i sprawdź stan pierwotniaków pod mikroskopem przy 200-krotnym powiększeniu. Przygotuj kultury kontrolne pierwotniaków tlenowych: tetra piriformis, ameby, ug, gleaner oraz paraguli, a także nocną kulturę E. coli w pożywce zalecanej przez dostawcę. Bezpośrednio po otrzymaniu pierwotniaków, utrwal pierwotniaki z jelit termitów, wszelkie inne kontrole pierwotniakowe oraz E. coli w 10% formaldehydzie w temperaturze 4°C przez 12 godzin. Następnie odwiruj roztwór pierwotniaków przy 30 ×g przez 10 minut.

Odlej supernatant i dwukrotnie przemyj pellet zawierający utrwalone pierwotniaki jednym mililitrem pożywki Trager U. Resuspenduj pellet w jednym mililitrze pożywki Trager. Inkubuj utrwalone mikroorganizmy od jednej do dwóch godzin z 100 µL roztworu syntetycznego ligandu sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym E-D-A-N-S, stosując końcowe stężenie ligandu 50 µM rozpuszczonego w wodzie. Obserwuj mikroorganizmy traktowane ligandami oraz niepoddane działaniu ligandów kontrole pod mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 400x, z maksimum absorbancji przy 341 nm i emisją w obszarze niebieskim przy 471 nm.

Aby ocenić właściwości lityczne peptydu litycznego sprzężonego z ligandem, pipetuj sześć aliquotów po 198 µL kultury pierwotniaków, przygotowanej zgodnie z opisem w sekcji trzeciej, do probówek typu Eppendorf o pojemności 0,5 mL. Do połowy aliquotów kultury pierwotniaków z jelita termitów dodaj 2 µL 100 µM roztworu peptydu litycznego z ligandem. W celu uzyskania końcowego stężenia 1 µM, do pozostałej połowy aliquotów dodaj 2 µL sterylnej wody jako kontrolę.

Po jednej godzinie przenieś 10 µL każdej hodowli pierwotniaków na szkiełko. Porównaj przeżywalność pierwotniaków traktowanych peptydem litycznym sprzężonym z ligandem z grupą kontrolną pod mikroskopem przy powiększeniu 200x. Wyciągnij igły, korzystając z wyciągacza mikropipet NGI PC 10 z dwustopniowym poziomem ogrzewania. Aby uzyskać rozmiar końcówki od 20 do 30 µm, potwierdź jej rozmiar, mierząc go pod mikroskopem.

Za pomocą mikrometrów napełnij jedną igłę około 30 µL 50 µM fluorescencyjnie znakowanego ligandu zawieszonego w wodzie. Za pomocą dołączonej strzykawki napełnij drugą igłę wodą do kontroli. Przymocuj mikropipetę do uchwytu i mikromanipulatora. Przymocuj igłę do uchwytu systemu wtryskowego w drugim mikromanipulatorze.

Ustaw początkowe parametry wtrysku na długość impulsu wynoszącą około jednej sekundy oraz ciśnienie wtrysku od 10 do 12 PSI. Następnie powoli wprowadź igłę do mikropipety i wtryśnij roztwór, używając pedału sterującego po uruchomieniu wtrysku. Wyjmij mikropipetę i zmierz długość wstrzykniętego roztworu.

Używając suwmiarki, oblicz objętość wstrzykiwaną na podstawie znanych parametrów mikropipety, a następnie dostosuj ciśnienie i długość impulsu tak, aby wydalić 0,3 µL roztworu. Następnie przygotuj 20 termitów do iniekcji dla każdej grupy badawczej, najpierw ściskając koniec odwłoka miękką pęsetą w celu usunięcia wszelkich wydzielin znajdujących się w odbycie.

Następnie unieruchom robotnice termitów, chłodząc je na lodzie przez pięć minut do czasu ich unieruchomienia. Przygotuj pojemniki do utrzymania robotnic termitów, odcinając końcówki pipet o pojemności 100 µL. Za pomocą ostrza skalpela dotnij końcówkę do długości od 10 do 12 mm, dostosowując ją do wielkości termitów, a następnie umieść je w fiolce.

Za pomocą nakrętki przymocuj odbiornik do mikromanipulatora. Umieść robotnicę na szalce Petriego na grzbiecie i wciągnij ją głową do odbiornika, używając pompy ssącej z azotem, tak aby odwłok robotnicy wystawał z odbiornika. Trzymając termita w odbiorniku, ostrożnie posuń wypełnioną igłę za pomocą mikromanipulatora, aby wprowadzić ją do odbytka robotnicy. Wstrzyknij 0,3 µL liganda znakowanego fluorescencyjnie lub wody kontrolnej.

Robotnice po wstrzyknięciu liganda lub wody umieść w oddzielnych szalkach Petriego z wilgotnym papierem filtracyjnym i pozostaw je na noc w temperaturze 26 °C przy wilgotności względnej 78%. Po 24 godzinach wyizoluj jelita z wstrzykniętych termitów i pobierz pierwotniaki zgodnie z wcześniej opisananą procedurą. Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej zaobserwuj wiązanie liganda w pierwotniakach z wstrzykniętych termitów, aby ocenić właściwości lityczne peptydów litycznych sprzężonych z ligandem w żywych termitach.

Przygotować materiały do iniekcji, sprzęt oraz termity w sposób opisany wcześniej dla iniekcji, a następnie wstrzyknąć 0,3 µL 500 µM roztworu litycznego peptydu ligandu lub wodę jako kontrolę do jelita tylnego 20 robotnic termitów. Po 24 godzinach wypreparować jelita z kilku robotnic i obserwować zawartość jelit pod mikroskopem przy 200-krotnym powiększeniu, aż do potwierdzenia śmierci wszystkich pierwotniaków w jelicie potraktowanego termita. Pozostałe potraktowane termity oraz grupę kontrolną przechowywać w szalkach Petriego z wilgotnym papierem filtracyjnym i codziennie monitorować śmiertelność. Potwierdzamy, że ligand sprzężony z sondą fluorescencyjną wiąże się ze wszystkimi trzema gatunkami pierwotniaków: p grassi, h heart mani oraz sla.

W jelicie tylnym czterech podziemnych termitów z gatunku mosson, przy wykrywalnych gęstościach, wiązanie liganda zachodzi na całej powierzchni komórki i jest skoncentrowane w przedniej części pierwotniaka na osi, wciąż przy warstwie mikrotubul i jądrze MP grass eye. Wykryliśmy również fluorescencję u wszystkich badanych wolnożyjących tlenowych gatunków pierwotniaków, co sugeruje, że ligand wiąże się ze strukturami typowymi dla pierwotniaków. Chociaż nie zaobserwowano wiązania liganda w przypadku e coli, stężenie 1 µM litycznego peptydu liganda zabiło wszystkie trzy gatunki pierwotniaków z jelita robotnic termitów omo i podziemnych, a także wolnożyjące tea piriformis in vitro w czasie krótszym niż 10 minut, podczas gdy grupa kontrolna przeżyła.

Na tym obrazie przedstawiono postępującą utratę integralności błon protozoów z jelit termitów poddanych działaniu litycznego peptydu z ligandem. Nie zaobserwowano różnic w liczbie kolonii e coli pomiędzy zastosowaniem litycznego peptydu z ligandem a wodą; natomiast lityczny peptyd bez ligandu znacznie zredukował liczbę kolonii e coli. Sugeruje to, że przyłączenie ligandu do peptydu litycznego w pewnym stopniu chroni mikroorganizmy niebędące celem przed lizą. Iniekcja 0,3 µL 500 µM litycznego peptydu z ligandem zabiła wszystkie trzy gatunki protozoów w jelitach termitów z rodzaju foremost oraz podziemnych w ciągu 24 godzin, a termity padły po 10 dniach od iniekcji litycznego peptydu sprzężonego z ligandem.

Pierwotniaki i termity obumarły trzykrotnie szybciej niż w przypadku wstrzyknięcia peptydów litycznych nieskonjugowanych z ligandem, jak pokazano w pracy husen i Colia 2009, co sugeruje, że ligand zwiększa efektywność cydalną peptydów litycznych wobec pierwotniaków w optymalnych warunkach hodowli. Wszystkie trzy gatunki pierwotniaków wyizolowane z jelit termitów podziemnych Omo powinny pozostać żywe i zdrowe przez co najmniej trzy dni.

Jeśli jednak w medium pozostaną resztki tlenu, ruch pierwotniaków natychmiast ustaje. W przypadku użycia niewłaściwego medium i zbyt wysokiego ciśnienia osmotycznego w komórkach, błony pierwotniaków wybrzuszają się, a same pierwotniaki pękają. Jeśli ciśnienie osmotyczne w komórkach stanie się zbyt niskie lub błony zostaną uszkodzone, pierwotniaki marszczą się i kurczą. Fixacja pierwotniaków ułatwia wykrycie wiązania fluorescencyjnego ligandu sprzęgającego z pierwotniakami.

Trudno jest wykryć fluorescencję i odróżnić ją od autofluorescencji cząsteczek drewna, gdy pierwotniaki swobodnie się poruszają. Po opanowaniu tej techniki, przy pomocy asystenta, można wstrzyknąć preparat do około 30 termitów na godzinę. Chociaż ligand peptyd kolityczny został opracowany w celu zabicia symbiotycznych pierwotniaków w jelitach termitów podziemnych i tym samym do zwalczania termitów, może on być również przydatny w opracowywaniu leków przeciwko pierwotniakom pasożytniczym, takim jak slash mania, ponoma, te i odium, które wywołują wiele chorób u ludzi.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak pozyskiwać i utrzymywać w kulturze pierwotniaki wyizolowane z jelit termitów, jak wykazywać specyficzne wiązanie liganda z pierwotniakami za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz jak demonstrować działanie pro-samobójcze liganda w formie peptydów kolitycznych in vitro. I wreszcie, jak wstrzykiwać peptydy do jelit termitów w celu potwierdzenia wyników in vivo.