Badanie aktywności protozoobójczej peptydów litycznych ligandów przeciwko pierwotniakiom jelita termitów in vitro (hodowla pierwotniaków) i in vivo (mikroiniekcja do jelita tylnego termitów)

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykazanie, że syntetyzowany ligand wiąże się specyficznie z protozoami trawiącymi celulozę w jelicie termitów podziemnych z formy mosen, oraz że ligand sprzężony z peptydem litycznym zabija te protozoa in vitro w beztlenowej hodowli protozoów oraz in vivo poprzez wstrzyknięcie do jelita tylnego termita. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez wstępną ekstrakcję protozoów z jelita robotnic termitów w warunkach beztlenowych. Drugim krokiem procedury jest potwierdzenie wiązania liganda sprzężonego z fluoresceiną z protozoami z jelita termitów in vitro.

Trzecim krokiem procedury jest wykazanie, że ligand sprzężony z peptydem litycznym zabija pierwotniaki z jelit termitów in vitro. Ostatnim krokiem procedury jest wstrzyknięcie ligandu sprzężonego z fluorescencją oraz ligandu sprzężonego z peptydem litycznym do jelita tylnego termita, aby potwierdzić wiązanie oraz niszczenie pierwotniaków jelitowych in vivo. Wykorzystując iniekcje kultur pierwotniaków do jelita tylnego termita oraz mikroskopię fluorescencyjną, wykazujemy, że ligand sprzężony z peptydem litycznym wiąże się i efektywnie zabija pierwotniaki z jelit termitów in vitro oraz in vivo.

Przyłączenie ligandu do peptydu litycznego zwiększyło toksyczność wobec pierwotniaków w porównaniu do samego peptydu litycznego. Choć zmniejszyło to toksyczność wobec organizmów niecelowych, takich jak e coli, najprawdopodobniej dlatego, że ligand nie wiązał się z błoną komórkową bakterii, utrata pierwotniaków prowadzi do śmierci termitów w czasie krótszym niż dwa tygodnie. Przedstawiona technika wykorzystania litycznych peptydów z ligandem do zwalczania symbiotycznych pierwotniaków w jelitach termitów podziemnych jest częścią wysiłków mających na celu opracowanie alternatywnych metod kontroli populacji termitów.

W wyniku zmniejszenia zależności od chemikaliów, termity bez symbiontów w jelitach giną. Wyizolowaliśmy pierwotniaki z jelita termita, aby wykazać, że ligand wiąże się z pierwotniakami oraz że lityczny peptyd liganda zabija pierwotniaki. Cząsteczki drewna wewnątrz pierwotniaków wykazują autofluorescencję. Dlatego istotne jest porównanie wyników pierwotniaków traktowanych fluorescencyjnym ligandem z pierwotniakami nietraktowanymi.

Aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich, wstrzykujemy peptydy bezpośrednio do jelita tylnego, ponieważ w przypadku podania peptydów termitom drogą pokarmową, proteaza znajdująca się w jelicie środkowym oraz jelito przednie uległyby ich strawieniu. Wykorzystując biblioteki phage display od New England Bio Labs, zidentyfikowaliśmy 19 sekwencji peptydów HEP, które wiążą się z pierwotniakami. Wybraliśmy jeden z ligandów o sekwencji peptydowej wykazującej podobieństwo do domniemanych glikoprotein znanych z błony komórkowej Trypanosoma brucei.

Po syntezie peptydów, sprzęgaliśmy zsyntetyzowany peptyd z fluorescencyjną sondą C-końcową za pomocą syntezy peptydów w fazie stałej, wykorzystując żywicę E-D-A-N-S novatech, aby ocenić właściwości lityczne koniugatów peptydowych. W tej procedurze wykorzystujemy koniugat zsyntetyzowanego ligandu i litycznego peptydu ate, który został zsyntetyzowany w jednostce białkowej LSU na jeden dzień przed eksperymentem. Należy użyć sigma coat do przygotowania wszystkich wykorzystywanych materiałów, aby zapobiec absorpcji pierwotniaków lub peptydów do powierzchni.

Nanieś równomierną warstwę i pozostaw do wyschnięcia przez noc przed użyciem następnego dnia. Przygotuj skrzynkę z wentylatorem w komorze rękawicowej, aby stale cyrkulować powietrze w temperaturze pokojowej przez osuszacz i zestawy wkładów z katalizatorem typu D w celu obniżenia poziomu wilgotności i tlenu przez ponad jedną godzinę. Wypełnij komorę rękawicową ciągłym strumieniem azotu przez 20 do 30 minut i w razie potrzeby stosuj dodatkowy azot w celu utrzymania warunków beztlenowych.

Następnie przygotuj pożywkę Traeger U i dostosuj pH do wartości 7. Przesącz sterylną pożywkę w komorze rękawicowej za pomocą końcówki 200 µL przymocowanej do rurki z mieszanką 2,5% wodoru, 5% dwutlenku węgla i 92,5% azotu przez jedną godzinę, aby usunąć pozostałości tlenu z komory rękawicowej. Po przygotowaniu materiałów, za pomocą pincety wyjmij robotnicę termita z szalki Petriego i zanurz całe ciało w zlewce wypełnionej 70% etanolem, delikatnie potrząsając termitem trzymanym pincetą przez około 10 sekund. Aby usunąć zanieczyszczenia powierzchniowe, wyjmij robotnicę z etanolu i pozostaw do wyschnięcia na czystej chusteczce Kim wipe przez około 20 sekund.

W komorze rękawicowej przygotuj zsilikonizowane szkiełko przedmiotowe z 100 µL medium Trager U do pobrania jelita termita oraz probówkę z 900 µL medium Trager U do pobrania pierwotniaków. Następnie, używając mikroskopu stereoskopowego i pary sterylnych pęset precyzyjnych, przytrzymaj odwłok robotnicy i chwyć koniec odwłoka drugą pęsetą, aby delikatnie wyciągnąć jelito w górę lub w dół pod kątem 45 stopni; postaraj się pobrać środkowe i tylne jelito w jednym kawałku. Umieść pobrane jelita w kropli 100 µL medium Trager U na szkiełku przedmiotowym.

Następnie, przebij jelita tylne za pomocą pary sterylnych, cienkich sond sekcyjnych, aby uwolnić pierwotniaki, a następnie delikatnie przenieś zawartość jelit pipetą 200 µL do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1 mL zawierającej 900 µL medium Traegera. Odczekaj pięć sekund, aż fragmenty ścian jelita opadną na dno, a następnie przenieś 900 µL supernatantu do nowej probówki. Przenieś odpowiednią ilość mikrolitrów kultury pierwotniaków na szkiełko mikroskopowe pokryte sigmą.

Przygotuj preparat i sprawdź stan pierwotniaków pod mikroskopem przy powiększeniu 200x. Przygotuj kultury kontrolne pierwotniaków tlenowych: tetra piriformis, ameby, ug, gleaner oraz pantofelka, a także nocną kulturę e coli w pożywce zalecanej przez dostawcę. Niezwłocznie po otrzymaniu pierwotniaków, utrwal pierwotniaki z jelit termitów, wszelkie inne kontrole pierwotniakowe oraz e coli w 10% formaldehydzie w temperaturze 4°C przez 12 godzin. Następnie odwiruj roztwór pierwotniaków przy 30×g przez 10 minut.

Odlej nadlew i dwukrotnie przemyj osad zawierający utrwalone pierwotniaki jednym mililitrem pożywki Trager U. Resuspender osad w jednym mililitrze pożywki Traeger Edia i inkubować utrwalone mikroorganizmy przez jedną do dwóch godzin z 100 µL roztworu syntetycznego ligandu sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym E-D-A-N-S, stosując końcowe stężenie 50 µM ligandu rozpuszczonego w wodzie. Obserwować mikroorganizmy traktowane ligandami oraz nie traktowane kontrole pod mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 400x, przy maksimum absorbancji 341 nm i emisji w obszarze niebieskim przy 471 nm.

Aby ocenić właściwości lityczne peptydów litycznych sprzężonych z ligandem, pipetuj sześć alikwotów po 198 µL hodowli pierwotniaków, przygotowanej zgodnie z instrukcją w sekcji trzeciej, do probówek typu Eppendorf o pojemności 0,5 ml. Do połowy alikwotów hodowli pierwotniaków z jelit termitów dodaj 2 µL 100 µM roztworu litycznego peptydy z ligandem. Aby uzyskać końcowe stężenie 1 µM, do pozostałej połowy alikwotów dodaj 2 µL sterylnej wody w celu zastosowania kontroli.

Po jednej godzinie przenieś 10 µL każdej kultury pierwotniaków na szkiełko. Porównaj przeżywalność pierwotniaków traktowanych litycznym peptydem sprzężonym z ligandem z przeżywalnością grup kontrolnych pod mikroskopem przy powiększeniu 200x. Wyciągnij igły, używając wyciągarki do mikropipet NGI PC 10 z dwustopniowym poziomem grzania. Aby uzyskać rozmiar końcówki od 20 do 30 µm, potwierdź jej wielkość, mierząc ją pod mikroskopem.

Używając mikrometru, napełnij jedną igłę około 30 µL 50 µM fluorescencyjnie znakowanego ligandu zawieszonego w wodzie. Używając dołączonej strzykawki, napełnij drugą igłę wodą do celów kontrolnych. Przymocuj mikropipetę do uchwytu i mikromanipulatora. Przymocuj igłę do uchwytu systemu wtryskowego w drugim mikromanipulatorze.

Ustaw początkowe parametry wtrysku na długość impulsu wynoszącą około jednej sekundy oraz ciśnienie wtrysku od 10 do 12 PSI. Następnie powoli wprowadź igłę do mikropipety i wtryśnij roztwór, korzystając z pedału sterującego po uruchomieniu wtrysku. Wyjmij mikropipetę i zmierz długość wstrzykniętego roztworu.

Używając suwmiarki, oblicz objętość wtrysku na podstawie znanych parametrów mikropipety, a następnie dostosuj ciśnienie i długość impulsu, aby wydalić 0.3 µL roztworu. Następnie przygotuj po 20 termitów do iniekcji dla każdej grupy badawczej, najpierw ściskając koniec odwłoka miękką pęsetą, aby usunąć wszelkie wydzieliny znajdujące się w odbytnicy.

Następnie unieruchom robotnice termitów, chłodząc je na lodzie przez pięć minut do momentu ich unieruchomienia. Przygotuj naczynia do trzymania robotnic termitów, odcinając końcówki pipet o objętości 100 µL. Za pomocą ostrza skalpela utnij końcówkę na długość od 10 do 12 mm, dostosowując ją do rozmiaru termitów, a następnie umieść je w fiolce.

Za pomocą nakrętki przytwierdź odbiornik do mikromanipulatora. Umieść robotnicę na szalce Petri na grzbiecie i wciągnij ją głową do odbiornika, używając pompy ssącej z azotem, tak aby koniec odwłoka robotnicy wystawał z odbiornika. Trzymając termita w odbiorniku, ostrożnie przesuń wypełnioną igłę za pomocą mikromanipulatora, aby wprowadzić ją do odbytu robotnicy. Wstrzyknij 0.3 µL znakowanego fluorescencyjnie ligandu lub wody kontrolnej.

Umieść robotnice po wstrzyknięciu ligandu lub wody w oddzielnych szalkach Petriego z wilgotnym papierem filtracyjnym i przechowuj je przez noc w temperaturze 26 °C przy wilgotności względnej 78%. Po 24 godzinach wyizoluj jelita z wstrzykniętych termitów i pobierz pierwotniaki zgodnie z wcześniej opisaną procedurą. Obserwuj wiązanie ligandu w pierwotniakach z wstrzykniętych termitów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej, aby ocenić właściwości lityczne peptydów litycznych sprzężonych z ligandem w żywych termitach.

Przygotować materiały do iniekcji, sprzęt oraz termity w sposób opisany wcześniej dla procedury iniekcji, a następnie wstrzyknąć 0,3 µL 500 µM roztworu litycznego peptydu ligandu lub wodę jako kontrolę do jelita tylnego 20 robotnic termitów. Po 24 godzinach wypreparować jelita z kilku robotnic i obserwować ich zawartość pod mikroskopem przy 200-krotnym powiększeniu, aż do potwierdzenia śmierci wszystkich pierwotniaków w jelicie termitów poddanych działaniu preparatu. Pozostałe termity potraktowane oraz grupę kontrolną przetrzymywać w szalkach Petriego na wilgotnym papierze filtracyjnym i codziennie obserwować śmiertelność. Potwierdzamy, że ligand sprzężony z sondą fluorescencyjną wiąże się ze wszystkimi trzema gatunkami pierwotniaków: p grassi, h heart mani oraz sla.

W jelicie tylnym termitów podziemnych z gatunku Mosson, przy niewykrywalnych gęstościach, wiązanie ligandu zachodzi na całej powierzchni komórki i koncentruje się w przedniej części pierwotniaków na osi, w obrębie warstwy mikrotubul oraz jądra MP grass eye. Wykryto również fluorescencję we wszystkich badanych wolnożyjących gatunkach pierwotniaków tlenowych, co sugeruje, że ligand wiąże się ze strukturami typowymi dla pierwotniaków. Choć nie zaobserwowano wiązania ligandu w przypadku e coli, stężenie 1 µM litycznego peptydu ligandowego zabiło wszystkie trzy gatunki pierwotniaków z jelit robotnic termitów omo i podziemnych, a także wolnożyjące tea piriformis in vitro w czasie krótszym niż 10 minut, podczas gdy grupa kontrolna przeżyła.

Obraz ten przedstawia postępującą utratę integralności błony pierwotniaków z jelit termitów traktowanych peptydem litycznym z ligandem. Nie zaobserwowano różnic w liczbie kolonii e coli pomiędzy traktowaniem peptydem litycznym z ligandem a wodą; jednak peptyd lityczny bez ligandu znacznie zredukował liczbę kolonii e coli. Sugeruje to, że przyłączenie ligandu do peptydu litycznego w pewnym stopniu chroni mikroorganizmy niebędące celem przed lizą. Iniekcja 0,3 µL 500 µM peptydu litycznego z ligandem zabiła wszystkie trzy gatunki pierwotniaków w jelitach termitów z rodzaju foremost oraz termitów podziemnych w ciągu 24 godzin, a termity padły po 10 dniach od iniekcji peptydu litycznego sprzężonego z ligandem.

Pierwotniaki i termity obumarły trzykrotnie szybciej niż w przypadku wstrzyknięcia litycznych peptydów nieukonjugowanych z ligandem, co wykazali Husen i Colia w 2009 roku, sugerując tym samym, że ligand zwiększa efektywność cydalną litycznych peptydów wobec pierwotniaków w optymalnych warunkach hodowli. Wszystkie trzy gatunki pierwotniaków wyizolowane z jelit termitów podziemnych Omo powinny pozostać żywe i zdrowe przez co najmniej trzy dni.

Jeśli jednak w medium pozostaną resztki tlenu, ruch pierwotniaków natychmiast ustaje. W przypadku zastosowania niewłaściwego medium i zbyt wysokiego ciśnienia osmotycznego w komórkach, błony pierwotniaków wybrzuszają się i dochodzi do ich rozerwania. Jeśli ciśnienie osmotyczne w komórkach stanie się zbyt niskie lub błony zostaną uszkodzone, pierwotniaki wysychają i kurczą się. Fixacja pierwotniaków ułatwia wykrycie wiązania fluorescencyjnego ligandu sprzężonego z pierwotniakami.

Trudno jest wykryć fluorescencję i odróżnić ją od autofluorescencji cząsteczek drewna, gdy pierwotniaki swobodnie się poruszają. Po opanowaniu tej techniki, przy pomocy asystenta, można wstrzykiwać preparat około 30 termitom na godzinę. Chociaż ligand peptyd kolityczny został opracowany w celu zabijania symbiotycznych pierwotniaków w jelitach termitów podziemnych i służy zatem do zwalczania termitów, mógłby być on również przydatny w opracowywaniu leków przeciwko pierwotniakom pasożytniczym, takim jak slash mania, ponoma, te i odium, które wywołują wiele chorób u ludzi.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak pozyskiwać i utrzymywać w kulturze pierwotniaki wyizolowane z jelita termitów, jak wykazać specyficzne wiązanie liganda z pierwotniakami za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz jak zademonstrować in vitro działanie indukujące „samobójstwo” pierwotniaków przez peptyd kolityczny jako ligand. I na koniec, jak wstrzykiwać peptydy do jelita termitów w celu potwierdzenia efektu in vivo.