Strategie badania neuroprotekcji przed zimnem

Uraz neurologiczny jest częstą przyczyną zachorowalności i śmiertelności z powodu znieczulenia ogólnego. Celem pracy przedstawionej w tym filmie jest zbadanie wpływu kondycjonowania wstępnego na nerwową sygnalizację immunologiczną szczurów jako sposób na identyfikację nowych celów terapeutycznych chroniących mózg przed wystąpieniem urazu. Osiąga się to poprzez produkcję zdrowych i długowiecznych dorosłych kultur plastrów hipokampa szczura.

Kultury są poddawane kondycjonowaniu wstępnemu w zimnie w celu wywołania neuroprotekcji o podłożu immunologicznym. Następnie dodaje się anty i obrazuje się kultury w plastrach. Analiza obrazu sugeruje, że kondycjonowanie wstępne na zimno prowadzi do dramatycznego zmniejszenia poziomu selektywnej utraty neuronów.

Nazywam się Richard Craig, a to jest Heidi Mitchell. Jesteśmy z University of Chicago na Wydziale Neurologii, a dzisiaj opiszemy dla Was, w jaki sposób preparat kultur plastrowych może być wykorzystany do odpowiedzi na pytania dotyczące neuroprotekcji, w tym niskiego poziomu prozapalnej sygnalizacji immunologicznej jako środka do wzmocnienia mózgu przeciwko chorobom mózgu. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej procedurze zmagają się z potrzebą zapewnienia długoterminowej żywotności i zdrowych kultur, które są w stanie wykazywać niski poziom sygnalizacji prozapalnej.

Heidi pokaże teraz szereg procedur, które stosujemy w laboratorium, aby pokonać te przeszkody, tak aby można było zmierzyć niski poziom sygnalizacji prozapalnej jako sposób na wytworzenie neuroprotektantów dla mózgu. Poniższe eksperymenty należy wykonywać w czystym fartuchu laboratoryjnym i sterylnych rękawiczkach rozciągniętych na laboratorium. Płaszcz. Rękawy Zacznij od umieszczenia wszystkich przedmiotów potrzebnych do zabiegu w kapturze BSL z jednym blaszkowym przepływem, w tym wkładek teflonowych związanych z rozdrabniaczem tkanek mcil wane, żyletki, narzędzi chirurgicznych i szalek Petriego.

Kaptur powinien znajdować się w pomieszczeniu do hodowli nadciśnieniowej z filtrem HIPAA, w którym powietrze jest oczyszczane przez niezależne wentylatory oczyszczające powietrze światłem ultrafioletowym co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentów. Umieść zimną płytkę do preparowania w okapie i podłącz ją do pobliskiej łaźni wodnej w kapturze do hodowli komórkowych. Umieść wkładkę milikomórkową w każdym dołku na płytce z sześcioma dołkami, dodaj do każdej 1,1 mililitra pożywki hodowlanej.

Dobrze umieść tacę w inkubatorze w temperaturze 36 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 95% wilgotności na co najmniej 20 minut. Utrzymuj szczenięta szczurów w cieple, dopóki nie będą potrzebne, umieszczając je pod lampą grzewczą, znieczulej szczeniaka, umieszczając go w 100% dwutlenku węgla. Po znieczuleniu zanurz szczenię w 100% etanolu, a następnie odetnij mu głowę i umieść ciało na jednej 100-milimetrowej szalce Petriego, a głowę na drugiej.

Następnie użyj nożyczek z zakrzywioną tęczówką, aby otworzyć czaszkę z nacięciem w linii środkowej, a następnie dwoma bocznymi cięciami po lewej i prawej stronie za oczami. Użyj kleszczy pod kątem, aby oderwać leżącą na niej czaszkę i szpatułki, aby zacząć wyjmować mózg. Usuń mózg, przecinając nerwy trójdzielne szpatułką i umieść mózg w dolnej połowie 60-milimetrowej szalki Petriego zawierającej 10 mililitrów sterylnego roztworu soli o zrównoważonym spojrzeniu na zimno uzupełnionego glukozą.

Następnie użyj kleszczyków IOx numer pięć pod szpatułką do tęczówki numer dwa, aby wyciąć campi hipopotama z każdej półkuli i umieścić je na teflonowym krążku dla helikoptera McIlwain. Za pomocą szpatułki rozprowadź pożywkę z dala od tkanki mózgowej za pomocą rozdrabniacza o grubości przekroju ustalonej na 350 do 400 mikrometrów. Przekrój hipopotama campi prostopadle do ich długiej osi z jednym mililitrem energicznie.

Zmyj świeżo pokrojone plastry z wkładek teflonowych i umieść je w górnej połowie 60-milimetrowej szalki Petriego zawierającej BSS o zimnym spojrzeniu. Umieść plastry pod mikroskopem stereoskopowym i zbadaj je. Zidentyfikuj wszystkie plasterki, które mają nienaruszony zakręt zębaty i warstwę komórek parametalicznych.

Następnie delikatnie ułóż trzy największe plasterki na wkładce, przygotowując w sumie 12 plasterków na pop. Umieść wkładki na tacy z sześcioma światami i inkubuj w temperaturze 36 stopni Celsjusza co trzy do czterech dni. Odśwież podłoże, zastępując stare podłoże świeżym, ciepłym podłożem.

Po siedmiu dniach włóż komórki z powrotem do inkubatora pod kątem 36 stopni. Zastąp pożywkę 1,1 mililitra wolnego od surowicy uzupełnionego podłoża neuro Basal. W dniu 18 zbadaj żywotność kultur plasterków.

Zacznij od umieszczenia 1,1 mililitra wołu w sześciu dobrze naczyniach hodowlanych. Umieść naczynie w inkubatorze, aby podgrzać je do 36 stopni Celsjusza. W międzyczasie włącz fluorescencyjne źródło światła z filtrem fitzy do mikroskopu i pozwól mu się rozgrzać przez co najmniej 20 minut.

Zapewni to równomierne natężenie światła. Następnie za pomocą kleszczy umieść kulturę plastrów, włóż pożywkę inox na 10 minut. Następnie przenieś je z powrotem na nośnik bez karty SIM.

Umieść wkładkę hodowlaną na stoliku mikroskopu i zaznacz orientację do ekranu jako nieodwracalną. CA jedna warstwa parametalu uszkodzenie. Umieścić kultury na aseptycznej powierzchni odwróconego mikroskopu pod pięciokrotnym powiększeniem z wycinkami utrzymywanymi w orientacji podobnej do używanej do wstępnego badania przesiewowego.

Przełącz się na kostkę emisji cytowań FIT CX. Wybierz kultury, które mają mniej niż 30 komórek cytx dodatnich w obszarze ca jeden do kondycjonowania wstępnego na zimno. Umieścić 1,1 mililitra pożywki wolnej od surowicy w sześciodołkowym naczyniu hodowlanym i umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 30 stopni z 5% dwutlenkiem węgla i wilgotnością 95% na co najmniej 20 minut, aby zrównoważyć pożywkę po upływie 20 minut.

Usunąć pożywkę wyrównującą z inkubatora. Przenieś wkładki hodowlane z plastrami z normalnej pożywki wolnej od surowicy na pożywkę o temperaturze 30 stopni. Następnie umieść je w inkubatorze pod kątem 30 stopni na 90 minut po inkubacji.

Przywróć kultury plastrów z powrotem do normalnego podłoża wolnego od surowicy i inkubuj w temperaturze 36 stopni przez 24 godziny. Rozpocznij wstępne badanie przesiewowe do eksperymentalnego użytku z kulturą plastrową, przenosząc wkładki hodowlane do pożywki cyt na 20 minut. Podczas inkubacji krajalnic włącz lampę ultrafioletową i kamerę CCD i pozwól im się rozgrzać przez 20 minut.

W razie potrzeby użyj oprogramowania, aby wyczyścić matrycę CCD, wystawiając ją na działanie światła przez 50 cykli. Następnie roztwór pepeta zawierający 10 mikrolitrów fluoresceiny w 90 mikrolitrach PBS na cytometr hemocytometryczny o głębokości 100 mikrometrów i umieścić go na stoliku mikroskopu. Za pomocą oprogramowania dostosuj czas ekspozycji tak, aby zakres dynamiczny wynosił 1000 z 4 096.

Następnie umieść naczynie z zimnymi kulturami wstępnymi na plastry pod mikroskopem i uzyskaj obrazy. Zostaną one wykorzystane do określenia poziomu fluorescencji tła, który zostanie odjęty od fluorescencji emitowanej z uszkodzonych plastrów. Jeśli samo zimne kondycjonowanie spowodowało uraz, komórki o zwiększonej fluorescencji będą widoczne w następnej kolejności.

Aby zbadać wpływ uszkodzenia ExoToxic, przenieś wkładki do pożywki wolnej od surowicy zawierającej od 20 do 50 mikromolowców i MDA, które zostały zrównane z 36 stopniami Celsjusza przez co najmniej 20 minut. Inkubuj przez 60 minut w temperaturze 36 stopni Celsjusza, NMDA naśladuje działanie neuroprzekaźnika glutaminianu po inkubacji. Spłucz NMDA z wkładek, zanurzając każdą wkładkę trzy razy w trzech oddzielnych naczyniach o średnicy 60 milimetrów.

Każdy zawiera 10 mililitrów neuro podłoża podstawowego ogrzanego do 36 stopni Celsjusza. Nie używaj więcej niż trzech wkładek na każdy zestaw naczyń o średnicy 360 milimetrów. Po umyciu umieść wkładki w tacce ze świeżymi pożywkami i włóż je z powrotem do inkubatora o temperaturze 36 stopni.

Po 24 godzinach skalibruj aparat za pomocą wzorca fluoresceiny, tak jak poprzednio. Następnie umieść kultury w pożywkach OX na 20 minut przed. Jeśli poziom obrażeń jest niski jeden dzień po urazie, przedłuż eksperyment do dwóch do trzech dni w razie potrzeby, aby określić ilościowo uraz za pomocą oprogramowania metamorficznego.

Zdefiniuj obszar zainteresowania wokół jednego regionu CA, aby zmierzyć intensywność wybranego obszaru urazu. Skopiuj i wklej obszar zainteresowania od urazu do obrazu tła. Następnie wprowadź wartości z kontuzji i tła do programu Excel za pomocą oprogramowania statystycznego.

Określ ilościowo licznik minus tło dla hodowli kontrolnych i wstępnie kondycjonowanych na zimno, przeprowadź odpowiedni test statystyczny, aby porównać obrażenia w grupie eksperymentalnej z grupą kontrolną, która zawsze powinna być uwzględniana w każdym przebiegu eksperymentalnym. To zdjęcie przedstawia typową dojrzałą plamę kultury w warstwie hipokampa po 21 dniach hodowli in vitro. Nowe oznakowanie końców pokazane na zielono służy do zilustrowania architektury cyto głównych neuronów.

Neurony parametaliczne są pokazane w obszarach ca jeden i ca trzy hipokampa i zakrętu zębatego lub neurony DG są widoczne po lewej stronie. Jeden obszar CA pokazany przy wyższej mocy ilustruje rozgałęzioną jakość spoczynkowego mikrogleju. W dojrzałych kulturach warstwowych komórki znakowano markerem powierzchniowym mikrogleju CD 11 B. Ten rysunek pokazuje efekty zimnego kondycjonowania wstępnego, neuroprotekcji i kultur warstw hipokampa inkubowanych z zielonym markerem cytx dla martwych komórek.

Zdjęcia sprzed ekranu po lewej stronie nie pokazują tutaj ani jednej kontuzji. Fikcyjne kultury kontrolne są pokazane na górze, a zimne kultury wstępnie kondycjonowane są pokazane na dole. Zdjęcia w środkowym rzędzie pokazują względne uszkodzenie kultury plastra 24 godziny po ekspozycji na 20 mikromolowe NMDA.

Zauważ, że pozorowane obrażenia kontrolne są większe niż w przypadku kultur narażonych na zimne kondycjonowanie wstępne oznaczone cp. Skala kalibracji kolorów względnego urazu jest pokazana na lewym górnym obrazie. Tradycyjnie, hodowle są następnie wystawiane na maksymalny poziom urazu, taki jak 20 mikromolowców i MDA przez noc, aby zmaksymalizować poziom uszkodzenia neuronów CA one i względne uszkodzenie zimnego kondycjonowania wstępnego w porównaniu z pozorowanym odnotowanym jako stosunek urazu do maksymalnego urazu.

Jednak ekspozycja na maksymalne bodźce urazowe może nie być wystarczająca do pokonania neuroprotekcji wynikającej ze wstępnego kondycjonowania. W związku z tym stosowanie proporcji obrażeń do maksymalnych urazów może nie odzwierciedlać dokładnie neuroprotekcji wynikającej z kondycjonowania wstępnego. Jest to widoczne na zdjęciach po prawej stronie, które pokazują, że maksymalne poziomy kondycjonowania wstępnego w zimnie są mniejsze niż w przypadku pozorowanych kontroli.

W tym badaniu stwierdzono, że zastosowanie stosunku urazów do maksymalnych urazów może przesłaniać neuroprotekcję przed zimnem. Można to zobaczyć na schemacie, na którym pozorowany uraz jest pokazany na czerwono i że po wstępnym kondycjonowaniu na zimno na niebiesko jeden dzień po ekspozycji na NMDA, zimne kondycjonowanie wstępne, poziom urazu określono na trzy w porównaniu z poziomem piątym, który zaobserwowano w pozorowanej kontroli. Jest to zgodne z 40% neuroprotekcją.

Jeśli jednak stosuje się tradycyjny format wykorzystujący proporcje takie jak uraz do maksymalnego urazu, nie jest widoczna żadna ochrona. Innymi słowy, 50% w przypadku pozorowania kontra 50% w przypadku wstępnego kondycjonowania na zimno. Ilościowy PCR przeprowadzono przy użyciu próbek mRNA, jak pokazano tutaj.

Poziomy TNF alfa po kondycjonowaniu wstępnym na zimno reprezentowane przez niebieską linię były wyższe niż w kontrolach, które są reprezentowane przez zieloną, żółtą i fioletową linię. Sugeruje to, że wstępne kondycjonowanie na zimno wyzwala zwiększoną produkcję TNF alfa w mózgu, aby potwierdzić ilościowe wyniki PCR i ilościowe barwienie matrycy PCR. Ta kultura plasterków została przetworzona pod kątem interleukiny 11 pokazanej na czerwono, nowy koniec, aby pokazać neurony pokazane na zielono.

Zauważ, że niektóre neurony parametaliczne, które są oznaczone strzałkami, wykazują interleukinę 11 i nowe zabarwienie końca i są pokazane na żółto. Strzałki wskazują na kilka mniejszych komórek, które przypuszczalnie są astrocytami i wykazują jedynie zwiększone barwienie interleukiną 11. Określając system sygnalizacji cytokin biorący udział w zimnym warunkowaniu neuroprotekcji, ważne jest, aby zwrócić uwagę na kilka fundamentalnie ważnych pojęć.

Chociaż cytokiny są w bardzo niskich stężeniach w normalnym mózgu, niewielkie zmiany w stężeniach cytokin zmieniają ekspresję genów. Tak więc, nawet przy niskich stężeniach, cytokiny mają ogromny potencjał do zmiany struktury i funkcji mózgu, a tym samym fenotypu organizmu. Pojęcie to jest tutaj reprezentowane przez odwrotność odległości, zaczynając od kociego wąsa jako punktu odniesienia oraz sodu, potasu, pH i wapnia w porównaniu z TNF alfa.

Ważne jest również, aby pamiętać, że cytokiny są wysoce redundantne, a wielokrotne cytokiny plyo tropic mogą mieć podobne działanie, a pojedyncza cytokina może mieć zmienne działanie. W związku z tym, aby dokładnie ustalić wrodzoną podstawę cytokin dla neuroprotekcji przed zimnem, należy określić złożoną analizę powiązanych zmiennych sygnałowych. Osiąga się to za pomocą strategii testów multipleksowych, które ustalą sygnaturę cytokin neuroprotekcji warunkującej zimno Po opanowaniu kultury te można przygotować w ciągu około trzech godzin i manipulować nimi do badania.

Reakcja kondycjonowania wstępnego na zimno może być wykonywana przez około trzy dni podczas wykonywania tych procedur, należy pamiętać, że sterylne techniki i minimalne obchodzenie się z nimi są konieczne, aby zachować zdolność do wykrywania niskiego poziomu sygnalizacji prozapalnej po tych procedurach. Inne metody, takie jak proteomiczne i molekularne analizy biologiczne, można zastosować do kultur w celu rozszyfrowania środków, za pomocą których wstępne kondycjonowanie zimnem ma odżywczy i ochronny wpływ na mózg.