Name: Strategie badania neuroprotekcji przed zimnem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: Poznaj strategie neuroprotekcji przed zimnem w kulturach plasterków hipokampu szczura. Metoda wykorzystuje sygnalizację cytokinową TNF-α i interleukiny 11 do identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta została sfinansowana z grantów National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS-19108), Migraine Research Foundation oraz White Foundation przyznanych Richardowi P. Kraigowi. Pani Marcia P. Kraig pomogła w przygotowaniu pożywek oraz utrzymaniu kultur plastrów. Dziękujemy Yelenie Grinberg za uwagi i poprawki do ostatecznej wersji tego artykułu.

<ol><li>Aptowicz, C. O., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+plasticity+in+hippocampal+slice+cultures+involves+changes+in+voltage-gated+Na%2B+channel+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Homeostatic plasticity in hippocampal slice cultures involves changes in voltage-gated Na+ channel expression.</a> Brain Res. 998, 155-163 (2004).</li>
<li>Beattie, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synaptic+strength+by+glial+TNFalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synaptic strength by glial TNFalpha.</a> Science. 295, 2282-2285 (2002).</li>
<li>Breder, C. D., Dewitt, D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+inducible+cyclooxygenase+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characterization of inducible cyclooxygenase in rat brain.</a> J Comp Neurol. 355, 296-315 (1995).</li>
<li>Caggiano, A. O., Breder, C. D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+elevation+of+cyclooxygenase-2%2C+but+not+lipoxygenase%2C+in+regions+synaptically+distant+from+spreading+depression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Long-term elevation of cyclooxygenase-2, but not lipoxygenase, in regions synaptically distant from spreading depression.</a> J Comp Neurol. 376, 447-462 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoids+and+nitric+oxide+influence+induction+of+reactive+gliosis+from+spreading+depression+in+microglia+but+not+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes.</a> J Comp Neurol. 369, 93-108 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+and+4-aminopyridine+prevent+the+lipopolysaccharide-induced+outwardly+rectifying+potassium+current+and+interleukin-1beta+production+in+cultured+rat+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 and 4-aminopyridine prevent the lipopolysaccharide-induced outwardly rectifying potassium current and interleukin-1beta production in cultured rat microglia.</a> J Neurochem. 70, 2357-2368 (1998).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E+receptor+subtypes+in+cultured+rat+microglia+and+their+role+in+reducing+lipopolysaccharide-induced+interleukin-1beta+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E receptor subtypes in cultured rat microglia and their role in reducing lipopolysaccharide-induced interleukin-1beta production.</a> J Neurochem. 72, 565-575 (1999).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+therapies+for+stroke+and+traumatic+brain+injury+often+display+U-shaped+dose+responses%3A+occurrence%2C+mechanisms%2C+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Drug therapies for stroke and traumatic brain injury often display U-shaped dose responses: occurrence, mechanisms, and clinical implications.</a> Crit Rev Toxicol. 38, 557-577 (2008).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+stress+response+terminology%3A+Integrating+the+concepts+of+adaptive+response+and+preconditioning+stress+within+a+hormetic+dose-response+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Biological stress response terminology: Integrating the concepts of adaptive response and preconditioning stress within a hormetic dose-response framework.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 222, 122-128 (2007).</li>
<li>Calabrese, E. J., Baldwin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormesis%3A+the+dose-response+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hormesis: the dose-response revolution.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 175-197 (2003).</li>
<li>Hansel, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CD4%2B+T-cell+gene+expression+in+allergic+subjects+using+two+different+microarray+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Analysis of CD4+ T-cell gene expression in allergic subjects using two different microarray platforms.</a> Allergy. 63, 366-369 (2008).</li>
<li>Hulse, R. E., Kunkler, P. E., Fedynyshyn, J. P., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+multiplexed+bead-based+cytokine+immunoassays+for+rat+serum+and+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of multiplexed bead-based cytokine immunoassays for rat serum and brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 136, 87-98 (2004).</li>
<li>Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+IgG+is+neuroprotective+via+enhancing+microglial+recycling+endocytosis+and+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-alpha.</a> J Neurosci. 28, 12199-12211 (2008).</li>
<li>Hulse, R. E., Winterfield, J., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+clasmatodendrosis+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytic clasmatodendrosis in hippocampal organ culture.</a> Glia. 33, 169-179 (2001).</li>
<li>Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+and+Microglial+Hormetic+Involvement+in+Neurological+Health+and+Migraine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Dose-Respose+Society%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha and Microglial Hormetic Involvement in Neurological Health and Migraine.</a> International Dose-Respose Society. , (2010).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+cytokine+protein+expression+profiles+from+spreading+depression+in+hippocampal+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Multiplexed cytokine protein expression profiles from spreading depression in hippocampal organotypic cultures.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 24, 829-839 (2004).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+current+source+density+analysis+in+hippocampal+organotypic+culture+shows+that+spreading+depression+occurs+with+uniquely+reversing+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents.</a> J Neurosci. 25, 3952-3961 (2005).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytosis+from+excitotoxic+injury+in+hippocampal+organ+culture+parallels+that+seen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 17, 26-43 (1997).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+precede+electrophysiological+changes+of+spreading+depression+in+hippocampal+organ+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures.</a> J Neurosci. 18, 3416-3425 (1998).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%2FQ+Ca2%2B+channel+blockade+stops+spreading+depression+and+related+pyramidal+neuronal+Ca2%2B+rise+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">P/Q Ca2+ channel blockade stops spreading depression and related pyramidal neuronal Ca2+ rise in hippocampal organ culture.</a> Hippocampus. 14, 356-367 (2004).</li>
<li>Lambertsen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+protect+neurons+against+ischemia+by+synthesis+of+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia protect neurons against ischemia by synthesis of tumor necrosis factor.</a> J Neurosci. 29, 1319-1330 (2009).</li>
<li>Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormesis+and+disease+resistance%3A+activation+of+cellular+stress+response+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Exp+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hormesis and disease resistance: activation of cellular stress response pathways.</a> Hum Exp Toxicol. 27, 155-162 (2008).</li>
<li>Ning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+simultaneous+gene+profiling+of+84+drug-metabolizing+genes+in+primary+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Systematic and simultaneous gene profiling of 84 drug-metabolizing genes in primary human hepatocytes.</a> J Biomol Screen. 13, 194-201 (2008).</li>
<li>Oppenheim, J., Feldman, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOppenheim%2C+J+%22in+Cytokine+Reference%22">in Cytokine Reference</a>. Oppenheim, J. J., Feldman, M. 1, Academic. New York. (2001).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, e45-e45 (2001).</li>
<li>Stellwagen, D., Beattie, E. C., Seo, J. Y., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+AMPA+receptor+and+GABA+receptor+trafficking+by+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of AMPA receptor and GABA receptor trafficking by tumor necrosis factor-alpha.</a> J Neurosci. 25, 3219-3228 (2005).</li>
<li>Stellwagen, D., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaling+mediated+by+glial+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaling mediated by glial TNF-alpha.</a> Nature. 440, 1054-1059 (2006).</li>
<li>Streit, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+neuroprotective%2C+immunocompetent+cells+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS.</a> Glia. 40, 133-139 (2002).</li>
<li>Wilde, G. J., Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Mann, D. A., Iannotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+and+augmentation+of+ischaemia-related+neuronal+death+by+tumour+necrosis+factor-alpha+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attenuation and augmentation of ischaemia-related neuronal death by tumour necrosis factor-alpha in vitro.</a> Eur J Neurosci. 12, 3863-3870 (2000).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Dwie fundamentalnie ważne koncepcje istotne dla określenia systemu sygnalizacji cytokin zaangażowanego w neuroprotekcję indukowaną prekondycjonowaniem zimnem zostały zilustrowane na rysunkach 6 i 7. Po pierwsze, cytokiny są cząsteczkami sygnałowymi występującymi w normalnym mózgu w skrajnie niskich stężeniach. Niemniej jednak, fizjologiczne zmiany stężenia cytokin mają ogromny potencjał do zmiany struktury i funkcji mózgu (tj. fenotypu) ze względu na ich zdolność do modyfikowania ekspresji genów (rysunek 6). Ponadto cytokiny charakteryzują się wysoką redundancją i plejotropią, co oznacza, że wiele cytokin może wywoływać podobne efekty, a pojedyncza cytokina może wywoływać zróżnicowane efekty (rysunek 7). Zatem, aby dokładnie ustalić wrodzone podstawy cytokinowe neuroprotekcji wynikającej z prekondycjonowania zimnem (lub innych fizjologicznych bodźców prekondycjonujących), należy przeprowadzić analizę kompozytową powiązanych zmiennych sygnalizacyjnych. Jest to realizowane za pomocą strategii analizy multipleksowej. Pozwoli to na ustalenie „sygnatury” cytokinowej neuroprotekcji indukowanej prekondycjonowaniem zimnem.
<img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig6.jpg" alt="Diagram porównawczy wielkości z oznaczeniami kota, owoców, krajobrazu miasta, linii brzegowej, Ziemi i Księżyca w zależności od skali." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> Rycina 6. Moc sygnalizacji cytokin w mózgu. Ilustracje przekazują ogromną moc sygnalizacji fizjologicznych stężeń cytokin w mózgu w porównaniu do stężeń innych, dobrze znanych odpowiedników. Stężenie przedstawiono jako odwrotność odległości, przyjmując za punkt odniesienia pojedynczy wąs kota. Sód (10-1M zilustrowany ziarnkiem pieprzu) i potas (10-3M zilustrowany pomidorem) występują w przestrzeni śródmiąższowej mózgu na poziomach około 150 i 3 mM odpowiednio i pełnią uznane role w funkcji elektrofizjologicznej komórek nerwowych. Podobnie przedstawiono pH (tj. poziomy jonów wodoru ~10-7M zilustrowane jako 780 metrów wzdłuż nabrzeża jeziora w Chicago) oraz wapń (tj. poziomy ~10-8M pokazane jako 7,8 km na zdjęciu satelitarnym Google wzdłuż nabrzeża jeziora w Chicago, od McCormick Place do Promontory Point w Hyde Park w pobliżu University of Chicago). Ponadto neuroprzekaźniki uwalniane do przestrzeni śródmiąższowej w stężeniach powyżej tych wartości wpływają na aktywność lokalnych obszarów mózgu. W przeciwieństwie do nich, cytokiny (pokazane jako odległość z Ziemi na Marsa) mogą zmieniać funkcje mózgu przy stężeniach ponad dziesięć milionów razy niższych.
<img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig7.jpg" alt="Schemat szlaków sygnalizacji komórkowej; przedstawia oddziaływania cytokin w odpowiedzi immunologicznej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> Rycina 7. Interaktywna sygnalizacja wrodzonych szlaków cytokinowych. Cytokiny wykazują wysoką redundancję i plejotropię, co oznacza, że wiele cytokin może wywoływać podobne efekty, a pojedyncza cytokina może mieć zróżnicowane działanie. Taka różnorodność wynika ze złożonej interaktywnej sygnalizacji zachodzącej na poziomie ligandów, receptorów i fosfoprotein. Dalsza złożoność wynika z faktu, że mózg składa się z różnych typów komórek, z których każda jest zdolna do specyficznych dla danego typu komórki zmian w zakresie wrodzonych cytokin, receptorów i powiązanych fosfoprotein. W celach ilustracyjnych przedstawiono tutaj wyłącznie wrodzone szlaki sygnalizacji cytokinowej (pochodzące z badań nad komórkami odpornościowymi). Dla uproszczenia mózg narysowano jako pojedynczą komórkę (biała linia), pokazując potencjalne interakcje dla wrodzonych cytokin (IL-1α i IL-1β (tutaj określanych jako IL-1α/β), TNF-α, IL-6, IFN-γ i IL-10), receptorów (IL-1R1, TNFR1, IL-6/gp130, IFNγR i IL-10R), fosfoprotein (tj. kinaz ERK1/2, P38 (P38-MAPK) i JNK) oraz czynników transkrypcyjnych (ATF-2, NFκB i STAT3). Na przykład TNF-α sygnalizuje poprzez TNFR1 do JNK, p38-MAPK i ERK1/2, co wyzwala ekspresję genów poprzez ATF-2. TNF-α zmienia również ekspresję genów bezpośrednio poprzez aktywację NFκB. Wspólnie aktywacja tych czynników transkrypcyjnych wywołuje zwiększoną (strzałka) i zmniejszoną (tępy koniec) ekspresję cytokin i ich receptorów, jak wskazano. Co ważne, szlaki te pokazują, że zmiany w jednej cytokinie (np. TNF-α) wpływają na produkcję innych cytokin (np. IL-1β). Zatem, aby dokładnie ustalić podstawy cytokinowe neuroprotekcji wynikającej z prekondycjonowania zimnem, należy określić złożoną analizę powiązanych zmiennych sygnalizacyjnych. Pozwoli to na ustalenie wrodzonego „podpisu” cytokinowego prekondycjonowania zimnem. (Obraz opracowano na podstawie danych z pozycji bibliograficznej #25.)

<table><tbody><tr><td colspan="4">Przygotowanie kultur skrawków</td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli tkankowych Millicell-CM (30 mm)</td><td></td><td>PICM0-3050</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże podstawowe Eagle (Basal Medium Eagle)</td><td></td><td>21010</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Earle'a (Earle's Balanced Salt Solution)</td><td></td><td>E2888</td><td></td></tr><tr><td>Surowica konia</td><td></td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td></td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td></td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td></td><td>15295</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td></td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Dygestorium BSL-1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krojarka do tkanek McIlwaina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dyski teflonowe</td><td></td><td>023-49-310-1</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka</td><td></td><td>14-373-25A</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki irydowe</td><td></td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>Długie nożyczki proste</td><td></td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Długie pęseta</td><td></td><td>13-812-40</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta kątowa</td><td></td><td>11808-02</td><td></td></tr><tr><td>Krótka pęseta</td><td></td><td>13-812-38</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Inox #5</td><td></td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>2 szpatułki irydowe</td><td></td><td>10094-13</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego 150 x 15 mm</td><td></td><td>08-757-148</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego 60 x 15 mm</td><td></td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop Wild M8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Geya (Gey's balance salt solution)</td><td></td><td>G9779</td><td></td></tr><tr><td>Miernik promieniowania ultrafioletowego krótkofalowego Blak-Ray</td><td></td><td>J-225</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe naczynia hodowlane Falcon</td><td></td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td></td><td>21103</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td></td><td>17504</td><td></td></tr><tr><td>Gem21 Neuroplex</td><td></td><td>400-160-010</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td></td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Analizator CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>#2820</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Wstępna ocena żywotności kultur skrawków</td></tr><tr><td>Sytox Green</td><td></td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony DMIBRE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Wstępne schłodzenie</td></tr><tr><td>Dygestorium BSL-2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Uszkodzenie ekscytotoksyczne</td></tr><tr><td>Kamera CCD CoolSnap &lt;em&gt;fx&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina</td><td></td><td>F36915</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie MetaMorph</td><td></td><td>v. 7.5.04</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr o głębokości 100 &amp;mu;m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-metylo-D-asparginian</td><td></td><td>454575</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie SigmaStat</td><td></td><td>v. 3.5</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Współleczenie stosowane podczas wstępnego schłodzenia</td></tr><tr><td>sTNFR1</td><td></td><td>425-R1-050</td><td></td></tr><tr><td>Sery Albuminy Bydłowej (BSA)</td><td></td><td>A-4503</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Izolacja RNA</td></tr><tr><td>RNAl&lt;em&gt;ater&lt;/em&gt;</td><td></td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Micro RNEasy</td><td></td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td></td><td>03446-100</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy tłuczek 1,5 wolny od RNazy</td><td></td><td>749521-1590</td><td></td></tr><tr><td>RNasin</td><td></td><td>N261A</td><td></td></tr><tr><td>Tris[hydroksymetylo]aminometan</td><td></td><td>T3069</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (dwusodowa sól hydratu kwasu etylenodiaminotetraoctowego)</td><td></td><td>#E7889</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Ilościowe oznaczanie RNA</td></tr><tr><td>Test RiboGreen</td><td></td><td>R11491</td><td></td></tr><tr><td>tRNA drożdży</td><td></td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 1,5 mL</td><td></td><td>16155500</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa fluorescencyjna płytka testowa</td><td></td><td>DK-4000</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy fluorescencyjny czytnik płytek</td><td></td><td>Safire II</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Ilościowy PCR (qPCR)</td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji iScript</td><td></td><td>170-8891</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td></td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza Platinum Taq</td><td></td><td>RNA Ultrasense 11732-927</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler iCycler</td><td></td><td>Moduł Optyczny iCycler</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie systemowe iCycler</td><td></td><td>v. 3.1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Ilościowy PCR dla mikromacierzy</td></tr><tr><td>RNase &lt;em&gt;Away&lt;/em&gt;</td><td></td><td>#7000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do pierwszej nici RT&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td></td><td>C-03</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina PCR oparta na SYBR Green</td><td>Specyficzna dla iCycler</td><td>PA-011</td><td></td></tr><tr><td>Macierz PCR RT&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Profiler</td><td></td><td>PARN-011A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Analiza proteomiczna</td></tr><tr><td>Zestaw do lizy komórek</td><td></td><td>171-304011</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td>Micro 7</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór zapasowy białka BSA</td><td></td><td>500-0007</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td></td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Płytki Immuno 96 MicroWell</td><td></td><td>449824</td><td></td></tr><tr><td>Taśma uszczelniająca</td><td></td><td>2239444</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek 96-dołkowych</td><td></td><td>licznika wieloetykietowego 1420</td><td></td></tr><tr><td>Test cytokin Bioplex Rat TNF-&amp;#945;</td><td></td><td>X0000001T</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Immunobarwienie</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td></td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td>Lizyna</td><td></td><td>L-6001</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td></td><td>S374-1</td><td></td></tr><tr><td>Jodynian sodu</td><td></td><td>S-1878</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td></td><td>S-2002</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru (30%)</td><td></td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozy</td><td></td><td>CS 0920</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety do barwienia</td><td></td><td>14511</td><td></td></tr><tr><td>Wstrząsarka do płytek</td><td></td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny #1 (185 mm)</td><td></td><td>1001-185</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-diaminobenzydyna</td><td></td><td>D8001</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfoksyd</td><td></td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td></td><td>X3S-4</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe Permount</td><td></td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td></td><td>cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;050 S</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek</td><td></td><td>27050</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel z cienkim końcem</td><td></td><td>11806</td><td></td></tr><tr><td>Pisak blokujący PAP</td><td></td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz sygnału SFX</td><td></td><td>A31631</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Antifade</td><td></td><td>P7481</td><td></td></tr></tbody></table>

strategie badania neuroprotekcji indukowanej prekondycjonowaniem zimnem

Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

Uszkodzenia neurologiczne są częstą przyczyną zachorowalności i śmiertelności związanych z narkozą ogólną i powiązanymi z nią procedurami chirurgicznymi, co mogłoby zostać ograniczone poprzez opracowanie skutecznych, łatwych w podaniu i bezpiecznych metod prekondycjonowania. Dążymy do zdefiniowania szlaków sygnalizacji immunologicznej w układzie nerwowym odpowiedzialnych za prekondycjonowanie zimnem, aby zidentyfikować nowe cele terapeutyczne służące ochronie mózgu przed wystąpieniem urazu. Zmiany w niskopoziomowej sygnalizacji mediatorów prozapalnych w czasie są niezbędne dla neuroprotekcji indukowanej prekondycjonowaniem zimnem. Sygnalizacja ta jest zgodna z podstawowymi zasadami fizjologicznej hormezy kondycjonowania, która wymaga, aby bodźce drażniące osiągnęły określoną wartość progową, przy jednoczesnym zapewnieniu wystarczającego czasu na adaptację do tych bodźców, aby efekt ochronny stał się widoczny.
W związku z tym, opisanie szlaków sygnalizacji immunologicznej zaangażowanej w neuroprotekcję indukowaną prekondycjonowaniem zimnem wymaga, aby systemy biologiczne, manipulacje eksperymentalne oraz możliwości techniczne były wysoce powtarzalne i czułe. Nasze podejście polega na wykorzystaniu hodowli skrawków hipokampa jako modelu in vitro, który ściśle odzwierciedla ich odpowiedniki in vivo z wielosynaptycznymi sieciami neuronalnymi pod wpływem dojrzałej i spoczynkowej makroglei / mikroglei. Ten stan gleju jest szczególnie istotny w przypadku mikroglei, ponieważ stanowi ona główne źródło cytokin, które działają w zakresie femtomolarnym. Ponadto hodowle skrawków mogą być utrzymywane in vitro przez kilka tygodni, co jest wystarczającym czasem na wywołanie bodźców aktywujących i ocenę odpowiedzi adaptacyjnych. Wreszcie, warunki środowiskowe mogą być precyzyjnie kontrolowane przy użyciu hodowli skrawków, tak aby sygnalizację cytokinową prekondycjonowania zimnem można było zmierzyć, naśladować i modulować w celu przeanalizowania krytycznych węzłów sygnalizacyjnych. Analizy systemu sygnalizacji cytokinowej wymagają zastosowania czułych i powtarzalnych technik multipleksowych. Wykorzystujemy ilościową PCR dla TNF-α w celu przesiewowej oceny aktywacji mikroglei, a następnie screening za pomocą macierzy ilościowej qPCR w czasie rzeczywistym, aby ocenić zmiany cytokinowe w całej tkance. Ta druga metoda jest najczulszym i najbardziej powtarzalnym sposobem jednoczesnego pomiaru zmian w sygnalizacji wielu systemów cytokinowych. Istotne zmiany są potwierdzane za pomocą ukierunkowanej qPCR, a następnie detekcji białek. Badamy zmiany białek cytokinowych w tkankach, stosując multipleksowe analizy cytometryczne z użyciem mikrosfer w technologii Luminex. Komórkową produkcję cytokin określa się za pomocą podwójnej immunohistochemii. Podsumowując, ta metoda przygotowania tkanki mózgowej i sposób jej wykorzystania, w połączeniu z sugerowanymi strategiami badawczymi, mogą stanowić optymalne podejście do identyfikacji potencjalnych celów dla opracowania nowych terapii, które mogłyby naśladować korzyści płynące z prekondycjonowania zimnem.

Dążymy do zdefiniowania immunologicznego sygnalizowania neuronalnego odpowiedzialnego za prekondycjonowanie zimnem, aby zidentyfikować nowe cele dla rozwoju terapii chroniących mózg przed wystąpieniem urazu. Przedstawiamy strategie dla takich badań, które wymagają systemów biologicznych, manipulacji eksperymentalnych oraz możliwości technicznych o wysokiej czułości i powtarzalności.

Strategie badania neuroprotekcji indukowanej prekondycjonowaniem zimnem

Uraz neurologiczny jest częstą przyczyną zachorowalności i śmiertelności w przebiegu znieczulenia ogólnego oraz powiązanych procedur chirurgicznych, co można by złagodzić poprzez...

Urazy neurologiczne są częstą przyczyną zachorowalności i śmiertelności związaną z narkozą ogólną. Celem pracy przedstawionej w tym filmie jest zbadanie wpływu prekondycjonowania zimnem na sygnalizację odpornościową neuronów szczura, aby zidentyfikować nowe cele terapeutyczne służące ochronie mózgu przed wystąpieniem urazu. Cel ten osiągnięto poprzez wytworzenie zdrowych i długożyjących kultur plastrów hipokampa dorosłych szczurów.Kultury poddaje się prekondycjonowaniu zimnem w celu indukcji neuroprotekcji o podłożu immunologicznym. Następnie dodaje się toksynę anci, a kultury skrawków poddaje się obrazowaniu. Analiza obrazów sugeruje, że prekondycjonowanie zimnem prowadzi do gwałtownego zmniejszenia poziomu selektywnej utraty neuronów.Nazywam się Richard Craig, a to jest Heidi Mitchell. Reprezentujemy Katedrę Neurologii Uniwersytetu w Chicago i dzisiaj opiszemy Państwu, w jaki sposób preparaty kultur plastrów mogą być wykorzystane do odpowiedzi na pytania dotyczące neuroprotekcji z udziałem niskopoziomowej prozapalnej sygnalizacji immunologicznej jako sposobu na zwiększenie odporności mózgu na choroby mózgowia. Mówiąc ogólnie, osoby rozpoczynające pracę z tą procedurą napotykają trudności ze względu na konieczność zapewnienia długoterminowej żywotności i zdrowych kultur, które są w stanie wykazać niskopoziomową sygnalizację prozapalną.Heidi zaprezentuje teraz szereg procedur stosowanych w laboratorium w celu przezwyciężenia tych trudności, aby możliwe było pomiar niskopoziomowego sygnałowania prozapalnego, co służy opracowywaniu neuroprotektorów dla mózgu. Poniższe eksperymenty należy przeprowadzać w czystym fartuchu laboratoryjnym i sterylnych rękawiczkach naciągniętych na rękawy fartucha. W pierwszej kolejności należy umieścić wszystkie przedmioty niezbędne do procedury w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy BSL 1, w tym przecinak do tkanek Mcilwaine wraz z wkładkami teflonowymi, żyletkę, narzędzia chirurgiczne oraz szalki Petriego do sekcji.Dygestorium powinno znajdować się w pomieszczeniu do hodowli z nadciśnieniem i filtrami HEPA, w którym powietrze zostało oczyszczone za pomocą autonomicznych wentylatorów z lampami ultrafioletowymi co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentów. Wewnątrz dygestorium należy umieścić chłodzącą płytkę sekcyjną i podłączyć ją do pobliskiej łaźni wodnej w dygestorium do hodowli komórkowych. Do każdego dołka płytki 6-dołkowej należy włożyć wkładkę typu milli-cell i dodać do każdego z nich 1,1 milliliters pożywki hodowlanej.Tackę umieść w inkubatorze w temperaturze 36 °C, przy 5% carbon dioxide i 95% humidity przez co najmniej 20 minut. Utrzymuj młode szczury w cieple do momentu ich użycia, umieszczając je pod lampą grzewczą. Znieczul młode szczury, umieszczając je w 100% carbon dioxide. Po znieczuleniu zanurz młode zwierzę w 100% ethanol, a następnie dokonaj dekapitacji i umieść tułów w jednej szalce Petriego o średnicy 100 millimeter, a głowę w drugiej.Następnie, za pomocą zakrzywionych nożyczek irydowych, należy otworzyć czaszkę, wykonując nacięcie w linii pośrodkowej, a następnie dwa cięcia boczne, po lewej i prawej stronie za oczami. Używając pęsety kątowej, należy odchylić fragmenty czaszki, a następnie za pomocą szpatułki rozpocząć usuwanie mózgu. Mózg należy wyciąć, przecinając nerwy trójdzielne szpatułką, a następnie umieścić go w dolnej części 60 mm szalki Petriego zawierającej 10 mL sterylnego, zimnego zrównoważonego roztworu soli Hanksa uzupełnionego o glukozę.Następnie, używając pęsety IOx nr 5 oraz szpatułki do tęczówki nr 2, wypreparuj hipokampy z każdej półkuli i umieść je na dysku teflonowym do mikrotomu McIlwaina. Za pomocą szpatułki odsuń medium od tkanki mózgowej, ustawiając w mikrotomie grubość przekroju na 350 do 400 µm. Wykonaj szybkie cięcia hipokampów prostopadle do ich osi długiej, używając do tego 1 mL perpet.Zmyj świeżo wycięte plastry z wkładki teflonowej do górnej części szalki Petriego o średnicy 60 mm zawierającej zimny roztwór gaze BSS. Umieść plastry pod stereomikroskopem i obejrzyj je. Zidentyfikuj wszystkie plastry, które mają nienaruszony zakręt zębaty oraz warstwę komórek parametalnych.Następnie ostrożnie umieść trzy największe plasterki na wkładce, przygotowując łącznie 12 plasterków na jedną próbkę. Umieść wkładki w sześciostanowiskowej taczce i inkubuj w temperaturze 36 °C co trzy do czterech dni. Odnawiaj pożywkę wzrostową, zastępując starą pożywkę nową, ciepłą pożywką.Po siedmiu dniach przenieś komórki z powrotem do inkubatora w temperaturze 36°C. Wymień medium na 1,1 ml suplementowanego medium NeuroBasal bez surowicy. W 18. dniu ocenia żywotność kultur skrawków.Zacznij od nalania 1,1 ml ox poel do sześciostudniowych płytek hodowlanych. Umieść płytkę w inkubatorze, aby ogrzać ją do 36 °C. W tym czasie włącz źródło światła fluorescencyjnego z filtrem fitzy do mikroskopu i pozwól mu się rozgrzać przez co najmniej 20 minut.Zapewni to jednorodną intensywność światła. Następnie, używając pęsety, umieść wkłady z kulturami skrawków w pożywce inox na 10 minut. Po tym czasie przenieś je z powrotem do pożywki wolnej od SIM.Umieść wkład kultur na stoliku mikroskopu i zaznacz orientację, aby wykluczyć nieodwracalne uszkodzenie warstwy parametalicznej. Umieść hodowle na aseptycznej powierzchni mikroskopu odwróconego przy powiększeniu pięciokrotnym (5x), utrzymując orientację przekrojów zbliżoną do tej stosowanej podczas wstępnej oceny.Przełącz na kostkę emisyjną dla cytacji FIT CX. Wybierz hodowle, które mają mniej niż 30 komórek cytx dodatnich w obszarze ca one do prekondycjonowania zimnem. Wlej 1,1 ml medium bezzsółkowego do sześciodołkowej płytki hodowlanej i umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 30 °C, przy 5% dwutlenku węgla i 95% wilgotności na co najmniej 20 minut, aby wyrównać temperaturę medium; po upływie 20 minut przystąp do dalszych działań.Wyjąć medium równoważące z inkubatora. Przenieść wkłady hodowlane z plastrami z medium pozbawionego surowicy do medium o temperaturze 30°C. Następnie umieścić je w inkubatorze w temperaturze 30°C na 90 minut po inkubacji.Przenieś hodowle plastrów z powrotem do standardowego pożywki bezsurowiczej i inkubuj w temperaturze 36 stopni przez 24 godziny. Rozpocznij wstępną selekcję hodowli plastrów do celów eksperymentalnych, przenosząc wkłady z hodowlą do pożywki cyt na 20 minut. Podczas inkubacji plastrów włącz lampę ultrafioletową oraz kamerę CCD i pozostaw je do rozgrzania przez 20 minut.W razie potrzeby należy użyć oprogramowania, aby wyczyścić matrycę CCD, naświetlając ją przez 50 cykli. Następnie nanieść pipetą 10 µL roztworu fluoresceiny w 90 µL PBS na hemocytometr o głębokości 100 µm i umieścić go na stoliku mikroskopu. Za pomocą oprogramowania należy dostosować czas ekspozycji tak, aby zakres dynamiczny wynosił 1000 z 4096.Następnie należy umieścić naczynie z kulturami plastrów poddanych chłodnemu prekondycjonowaniu na mikroskopie i pobrać obrazy. Służą one do określenia poziomu fluorescencji tła, która zostanie odjęta od fluorescencji emitowanej przez uszkodzone plastry. Jeśli samo chłodne prekondycjonowanie spowodowało uszkodzenia, w dalszej kolejności widoczne będą komórki o zwiększonej fluorescencji.Aby zbadać efekt uszkodzenia wywołanego przez ExoToxic, przenieś wkłady do medium bezsurowiczego zawierającego od 20 do 50 µM NMDA, które było równoważone do temperatury 36 °C przez co najmniej 20 minut. Inkubuj przez 60 minut w temperaturze 36 °C; NMDA naśladuje działanie neuroprzekaźnika glutaminianu. Po inkubacji wypłucz NMDA z wkładów, zanurzając każdy wkład trzykrotnie w trzech osobnych płytkach 60 mm.Każda z nich powinna zawierać 10 mililitrów pożywki neurobasal podgrzanej do 36 stopni Celsjusza. Nie należy używać więcej niż trzech wkładów dla każdego zestawu naczyń do płukania o rozmiarze 360 milimetrów. Po płukaniu wkładki należy umieścić w tacy zawierającej świeżą pożywkę i przenieść je z powrotem do inkubatora ustawionego na 36 stopni.Po 24 godzinach skalibrować kamerę za pomocą standardu fluoresceiny, analogicznie jak poprzednio. Następnie umieścić hodowle w medium OX na 20 minut przed wykonaniem zdjęć. Jeśli poziom uszkodzeń jeden dzień po urazie jest niski, przedłużyć eksperyment do dwóch lub trzech dni, zależnie od potrzeb, aby określić stopień uszkodzenia przy użyciu oprogramowania Metamorph.Zdefiniuj obszar zainteresowania wokół regionu CA 1, aby zmierzyć intensywność wybranego obszaru w miejscu urazu. Skopiuj i wklej obszar zainteresowania z obrazu urazu do obrazu tła. Następnie, wpisz wartości z obrazu urazu i tła do programu Excel, korzystając z oprogramowania statystycznego.Oblicz wartość licznika pomniejszoną o tło dla kultur kontrolnych i kultur poddanych prekondycjonowaniu zimnem, a następnie przeprowadź odpowiedni test statystyczny, aby porównać stopień uszkodzenia w grupie badawczej względem grupy kontrolnej, która powinna być zawsze uwzględniona w każdym cyklu eksperymentalnym. Na tym obrazie przedstawiono typowe barwienie dojrzałej hodowli plastrów hipokampa po 21 dniach hodowli in vitro. Nowe etykietowanie zakończeń, zaznaczone na zielono, służy do zilustrowania cytoarchitektury głównych neuronów.Neurony piramidalne widoczne są w obszarach CA1 i CA3 hipokampa, natomiast neurony zakrętu zębatego (DG) znajdują się tutaj po lewej stronie. Obszar CA1 przedstawiony w większym powiększeniu ilustruje rozgałęzioną strukturę spoczynkowych mikroglejów. W dojrzałych kulturach skrawków komórki zostały oznakowane markerem powierzchniowym mikrogleju CD 11 B. Rysunek ten przedstawia efekty prekondycjonowania zimnem, neuroprotekcji oraz hodowle skrawków hipokampa inkubowane z markerem CytX Green dla martwych komórek.Obrazy z wstępnej oceny po lewej stronie nie wykazują uszkodzeń CA1. Na górze przedstawiono kultury kontrolne (sham), a na dole kultury poddane prekondycjonowaniu zimnem. Obrazy w środkowym rzędzie ukazują względny stopień uszkodzenia kultury skrawka 24 godziny po ekspozycji na 20 µM NMDA.Zauważmy, że uszkodzenie w grupie kontrolnej (sham) jest większe niż w kulturach poddanych prekondycjonowaniu zimnem, oznaczonych jako cp. Skala kalibracji kolorów względnego uszkodzenia jest pokazana na obrazie w górnym lewym rogu. Tradycyjnie kultury są następnie poddawane maksymalnemu poziomowi uszkodzenia, np. 20 µM MDA przez noc, aby zmaksymalizować poziom uszkodzeń neuronów CA1 oraz względne uszkodzenie w przypadku prekondycjonowania zimnem w porównaniu z grupą kontrolną, co odnotowuje się jako stosunek uszkodzenia do uszkodzenia maksymalnego.Jednakże narażenie na maksymalne bodźce uszkadzające może być niewystarczające, aby przełamać neuroprotekcję wynikającą z prekondycjonowania. W związku z tym stosowanie stosunku uszkodzenia do uszkodzenia maksymalnego może nie odzwierciedlać dokładnie neuroprotekcji zapewnianej przez prekondycjonowanie. Jest to widoczne na obrazach po prawej stronie, które pokazują, że maksymalne poziomy w grupie z prekondycjonowaniem zimnem są niższe niż w grupie kontrolnej (sham).W badaniu tym stwierdzono, że zastosowanie stosunku urazu do urazu maksymalnego może maskować neuroprotekcję wynikającą z prekondycjonowania zimnem. Można to zauważyć na schemacie, gdzie uraz pozorny (sham) przedstawiono kolorem czerwonym, a uraz po prekondycjonowaniu zimnem kolorem niebieskim; jeden dzień po ekspozycji na NMDA, w przypadku prekondycjonowania zimnem poziom urazu określono jako trzy, w porównaniu do poziomu pięciu zaobserwowanego w grupie kontrolnej sham. Jest to zgodne z 40% neuroprotekcją.Jednakże, jeśli zastosowany zostanie tradycyjny format z użyciem stosunków, takich jak uszkodzenie do maksymalnego uszkodzenia, żadna ochrona nie jest widoczna. Innymi słowy, 50% dla grupy pozorowanej (sham) w stosunku do 50% dla schładzającego uprzedniego kondycjonowania. Ilościową reakcję PCR przeprowadzono z wykorzystaniem próbek mRNA, jak pokazano tutaj.Poziomy TNF alpha po prekondycjonowaniu zimnem, reprezentowane przez niebieską linię, były wyższe niż w grupach kontrolnych, reprezentowanych przez linie zieloną, żółtą i purpurową. Sugeruje to, że prekondycjonowanie zimnem wywołuje zwiększoną produkcję TNF alpha w mózgu; aby potwierdzić wyniki ilościowej PCR oraz macierzy ilościowej PCR, przeprowadzono barwienie immunochemiczne. Próbka tej hodowli plastrów została opracowana pod kątem interleukiny 11, pokazanej na czerwono, oraz NeuN w celu wykazania neuronów, pokazanych na zielono.Zauważmy, że niektóre neurony parametaliczne, wskazane strzałkami, wykazują barwienie dla interleukiny 11 oraz NeuN i są przedstawione na żółto. Strzałki wskazują na kilka mniejszych komórek, które prawdopodobnie są astrocytami i wykazują jedynie zwiększone barwienie dla interleukiny 11. Przy opisywaniu systemu sygnalizacji cytokin zaangażowanego w neuroprotekcję indukowaną wstępnym schłodzeniem, ważne jest zwrócenie uwagi na kilka fundamentalnych koncepcji.Chociaż cytokiny występują w normalnym mózgu w niezwykle niskich stężeniach, niewielkie zmiany w ich poziomach modyfikują ekspresję genów. Zatem nawet przy niskich stężeniach cytokiny mają ogromny potencjał do zmiany struktury i funkcji mózgu, a tym samym fenotypu organizmu. Koncepcja ta jest tutaj przedstawiona jako odwrotność odległości, przyjmując wibrys kota jako punkt odniesienia, a stężenia sodu, potasu, pH oraz wapnia w porównaniu do TNF alpha.Należy również pamiętać, że cytokiny wykazują dużą redundancję oraz plejotropowość; wiele cytokin może wywierać podobne działanie, a pojedyncza cytokina może wywoływać zróżnicowane efekty. Aby zatem dokładnie określić wrodzoną podstawę cytokinową neuroprotekcji wynikającej z prekondycjonowania zimnem, konieczne jest przeprowadzenie analizy złożonej powiązanych zmiennych sygnałowych. Osiąga się to za pomocą strategii analizy multipleksowej, która pozwoli ustalić sygnaturę cytokinową neuroprotekcji indukowanej prekondycjonowaniem zimnem. Po opanowaniu metody, hodowle te można przygotować w ciągu około trzech godzin i przystąpić do manipulacji badawczych.Reakcja na prekondycjonowanie zimnem może być realizowana w ciągu około trzech dni; podczas wykonywania tych procedur niezbędne jest pamiętanie o tym, że zachowanie technik sterylnych i minimalizacja manipulacji są konieczne, aby zachować możliwość wykrycia niskopoziomowej sygnalizacji prozapalnej po tych zabiegach. W celu rozszyfrowania mechanizmów, dzięki którym prekondycjonowanie zimnem wywiera odżywczy i ochronny wpływ na mózg, do kultur można zastosować inne metody, takie jak analizy proteomiczne i biologii molekularnej.

strategies-for-study-of-neuroprotection-from-cold-preconditioning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Strategie badań nad neuroprotekcją wynikającą z zimnego prekondycjonowania

Przybywa dowodów na to, że przeciwwarunkowanie niedokrwienne (PC) – nieuszkadzający bodziec niedokrwienny dla mózgu – zapewnia przejściową ochronę przed następującym po nim uszkadzającym niedokrwieniem. Zastosowaliśmy obustronną okluzję wspólnej tętnicy szyjnej (BCCAO) jako bodziec przeciwwarunkujący w celu wywołania wczesnej tolerancji na niedokrwienie (IT) w odpowiedzi na przejściowe ogniskowe niedokrwienie mózgu (wywołane okluzją środkowej tętnicy mózgowej, MCAO) u myszy C57Bl6/J.

Dwustronne zamknięcie wspólnych tętnic szyjnych jako odpowiedni bodziec prekondycjonujący w celu indukcji wczesnej tolerancji niedokrwiennej na ogniskowe niedokrwienie mózgu

Źródło: Zheng, Y., et al. Modele eksperymentalne do badania neuroprotekcji kwaśnego kondycjonowania końcowego przed niedokrwieniem mózgu. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia zastosowanie kwaśnego kondycjonowania końcowego (APC) w celu oceny jego neuroprotekcyjnego działania przeciwko uszkodzeniu niedokrwiennemu w mysim modelu niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO). Przedstawiono w nim etapy związane z reperfuzją w modelu MCAO i zastosowaniem APC podczas reperfuzji w celu złagodzenia...

 Ocena neuroprotekcyjnego wpływu kwaśnego kondycjonowania końcowego w mysim modelu niedokrwienia mózgu

Źródło: Poinsatte, K., et al., K. Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Ocluzion in Mys. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje metodę powtarzalnego kondycjonowania wstępnego hipoksyjnego (RHP) poprzez wystawienie myszy na kontrolowane cykle hipoksji przed wywołaniem udaru niedokrwiennego. Eksperyment ocenia jego wpływ na stabilność bariery krew-mózg, adaptację neuronów i stan zapalny.

Adaptacja neuronalna do powtarzającego się kondycjonowania wstępnego hipoksyjnego u myszy

Źródło: Brandli, A. Zdalne warunkowanie niedokrwienne kończyn: technika neuroprotekcyjna u gryzoni. J. Vis. Exp. (2015)Ten film przedstawia nieinwazyjny protokół wstępnego kondycjonowania niedokrwiennego kończyn u szczurów w celu wywołania neuroprotekcji ogólnoustrojowej. Zabieg polega na kontrolowanym zamknięciu tętnic i reperfuzji, uruchamiając komórkowe szlaki stresu, które uwalniają czynniki ochronne. Czynniki te zwiększają odporność na urazy niedokrwienne i metaboliczne w odległych...

Nieinwazyjne przygotowanie niedokrwienne kończyn w modelu szczurzym do neuroprotekcji

Zdalne warunkowanie niedokrwienne (RIP) to metoda kondycjonowania tkanek przed szkodliwym stresem. Ustaliliśmy metodę zdalnego niedokrwienia kończyny tylnej, poprzez napompowanie mankietu ciśnieniomierza na 5-10 minut. Zdolności neuroprotekcyjne RIP wykazano w modelu zwyrodnienia siatkówki u gryzoni.

Warunkowanie niedokrwienne kończyn na odległość: technika neuroprotekcyjna u gryzoni

Ten protokół opisuje powtarzające się wstępne kondycjonowanie hipoksyjne, czyli krótkie ekspozycje na niedotlenienie ogólnoustrojowe, które zmniejszają objętość zawału i zaburzenie bariery krew-mózg po przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu u myszy. Szczegółowo opisano również podwójną kwantyfikację objętości zawału i przerwania bariery krew-mózg po udarze, aby ocenić skuteczność ochrony nerwowo-naczyniowej.

Kwantyfikacja ochrony nerwowo-naczyniowej po powtarzającym się kondycjonowaniu wstępnym hipoksyjnym i przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu u myszy

Chirurgiczne zamknięcie dystalnej gałęzi środkowej tętnicy mózgowej (MCAo) jest często używanym modelem w eksperymentalnych badaniach nad udarem. Manuskrypt ten opisuje podstawową technikę stałego MCAo, połączoną z wstawieniem bocznego okna czaszki, które daje możliwość podłużnej mikroskopii przyżyciowej u myszy.

Przygotowanie bocznego przewlekłego okna czaszki umożliwia obserwację in vivo po niedrożności dystalnej tętnicy środkowej mózgu u myszy

Kwaśne kondycjonowanie końcowe chroni przed niedokrwieniem mózgu. Poniżej przedstawiamy dwa modele do uruchamiania APC. Osiąga się je odpowiednio poprzez przeniesienie wycinków korowo-prążkowych do buforu kwaśnego po deprywacji tlenu i glukozy in vitro oraz przez wdychanie 20% CO2 po niedrożności tętnicy środkowej mózgu in vivo.

Modele eksperymentalne do badania neuroprotekcji kwaśnego kondycjonowania końcowego przeciwko niedokrwieniu mózgu

Złożona lokomocja w naturalnym środowisku, wymagająca starannej koordynacji kończyn, obejmuje obszary kory ciemieniowej. Poniższy protokół opisuje zastosowanie odwracalnej dezaktywacji wywołanej chłodzeniem w celu zademonstrowania roli obszaru ciemieniowego 5 w sterowanym pamięciowo unikaniu przeszkód u chodzącego kota.

Odwracalne dezaktywacje wywołane chłodzeniem w celu zbadania wkładu kory mózgowej w pamięć przeszkód u chodzącego kota

Różne efekty różnych stopni hipotermii na ochronę mięśnia sercowego nie zostały dokładnie ocenione. Celem niniejszego badania było ilościowe określenie poziomów śmierci komórek po różnych metodach leczenia hipotermii w modelu opartym na ludzkich kardiomiocytach, kładąc podwaliny pod przyszłe dogłębne badania molekularne.

Ocena in vitro ochrony mięśnia sercowego po wstępnym kondycjonowaniu hipotermicznym w modelu ludzkich miocytów serca

Ten artykuł opisuje dwie metody krótkotrwałej hipotermii całego ciała u szczurów. Pierwsza, szybka metoda indukcji, wykorzystuje aktywne chłodzenie za pomocą wentylatorów i rozpylonego etanolu w celu szybkiego spadku temperatury. Druga metoda to metoda stopniowego chłodzenia. Osiąga się to dzięki połączeniu znieczulenia izofluranem i redukcji ustawień temperatury na homeotermicznej macie grzewczej. Powoduje to stopniowy spadek temperatury głębokiej ciała bez użycia jakichkolwiek zewnętrznych...

Krótkotrwała indukcja hipotermii u szczurów przy użyciu modeli do badań oceniających znaczenie kliniczne i mechanizmy

Poznaj strategie neuroprotekcji przed zimnem w kulturach plasterków hipokampu szczura. Metoda wykorzystuje sygnalizację cytokinową TNF-α i interleukiny 11 do identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Strategie badania neuroprotekcji indukowanej prekondycjonowaniem zimnem

Przeglądaj więcej filmów