Name: Mikroskopia konfokalna rogówki: nowatorska nieinwazyjna technika ilościowego określania patologii małych włókien w neuropatiach obwodowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Poznaj mikroskopię konfokalną rogówki jako nieinwazyjną metodę ilościowej oceny uszkodzeń włókien nerwowych w neuropatiach obwodowych. Technika ta umożliwia szybką diagnostykę i stratyfikację pacjentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez Juvenile Diabetes Research Foundation International (grant 17-2008-1031) oraz National Institutes of Health (grant 1R01DK077903-01A1).

Wprowadzenie: 
Dokładne ilościowe określenie stopnia neuropatii obwodowej jest istotne dla zdefiniowania pacjentów z grup ryzyka, przewidywania pogorszenia stanu zdrowia oraz oceny nowych terapii. Metody konwencjonalne oceniają deficyty neurologiczne i elektrofizjologię, a ilościowe badania czucia pozwalają określić zmiany funkcjonalne w celu wykrycia neuropatii. Jednakże najwcześniejsze uszkodzenia dotyczą najprawdopodobniej małych włókien, podczas gdy testy te oceniają głównie dysfunkcję dużych włókien i mają ograniczoną zdolność do wykazania regeneracji oraz naprawy. Jedynymi technikami umożliwiającymi bezpośrednią ocenę uszkodzeń i naprawy nieumielinowanych włókien nerwowych są biopsja nerwu suralnego z badaniem w mikroskopii elektronowej oraz biopsja punch skóry. Obie te metody są jednak procedurami inwazyjnymi, wymagającymi czasochłonnych analiz laboratoryjnych i znacznego doświadczenia. Konfokalna mikroskopia rogówki jest nieinwazyjną techniką kliniczną, która umożliwia obrazowanie włókien nerwowych rogówki in-vivo.
HRT III- Rostock Corneal Module (RCM)
Instrukcja obsługi

1. Przygotowanie kamery

Pierwszym krokiem w badaniu z użyciem HRT jest przygotowanie końcówki obiektywu.
<ol>
<li>Najpierw w tubusie obiektywu kamery skanującej laserowo ustaw refrakcję na +12 dioptrii, a następnie przesuń kamerę do najniższej pozycji.</li>
<li>Nanieś na końcówkę soczewki dużą, jednorodną, pozbawioną pęcherzyków powietrza kroplę żelu Viscotears o wielkości ziarnka grochu.</li>
<li>Wyjmij TomoCap ze sterylnego opakowania i zamocuj go na końcówce soczewki w taki sposób, aby żel utworzył menisk między soczewką obiektywu a nakładką. Przesuń go tak daleko, jak to możliwe, w stronę uchwytu. Należy uważać, aby podczas montażu nie dotknąć przedniej powierzchni TomoCap. 
<img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig1.jpg" alt="Ustawienie wzbudzenia optycznego; zbliżenie na wyrównanie soczewki dla eksperymentu fotonicznego." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przygotowanie końcówki soczewki obiektywu (góra), nakładanie żelu viscotear (dół), nakładanie TomoCap.</li>
<li>Przesuń kamerę skanującą laserowo tak daleko w tył, jak to możliwe, na uchwycie kamery.</li>
<li>Zarówno wewnętrzna, jak i zewnętrzna powierzchnia TomoCap pojawiają się jako jasne odbicia laserowe. Koło regulacji płaszczyzny ogniskowej należy obracać do momentu zaobserwowania jasnego odbicia, co wskazuje, że soczewka jest ogniskowana w przedniej części nakładki. Wartość głębokości wyświetlana w wskaźniku pozycji ogniskowania powinna teraz wynosić od -150 μm do +150 μm.</li>
<li>Zresetuj ustawienie głębokości do zera. 
<img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig2.jpg" alt="Interfejs mikroskopowy pokazujący wzorce wzrostu; ustawienie analizy; kontrola powiększenia próbki." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Regulacja płaszczyzny ogniskowej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pacjenta
Oczy badanego zostają znieczulone za pomocą kropli 0,4% hydrochlorku benoksynatu, a w celu nawilżenia przedniej części oka stosuje się preparat Viscotears. 
Badany zostaje wygodnie posadzony z podbródką opartą na podstawce i proszony o mocne dociśnięcie czoła do poprzeczki stabilizującej.
<img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig3.jpg" alt="Układ pomiaru optycznego z mikroskopem, komputerem i analizą danych spektroskopowych." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Przygotowanie pacjenta
3. Ustawianie kamery
Badanie jest łatwiejsze, jeśli poprosimy pacjenta o utrwalenie wzroku na zewnętrznym świetle fiksacyjnym okiem, które nie jest w danej chwili badane. Kompaktowy rozmiar głowicy mikroskopu sprawia, że oko przeciwległe badanej osoby nie jest zasłonięte, co umożliwia wykorzystanie celów dystansowych.
<img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig4.jpg" alt="Schemat obiektywu mikroskopu ze strzałkami regulacji kierunkowej dla precyzyjnego ustawienia ostrości." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Obiektyw modułu rogówkowej.
<ol>
<li>Ustaw kamerę CCD w taki sposób, aby jej oś optyczna przebiegała prostopadle do osi optycznej kamery skanującej laserowo. Podczas obrazowania prawego oka kamera powinna znajdować się po prawej stronie pacjenta i odwrotnie. 
W tej pozycji przednia powierzchnia TomoCap powinna znajdować się w centrum obrazu na żywo z kamery CCD.</li>
<li>Przesuwaj kamerę skanującą laserowo w stronę pacjenta, aż rogówka pacjenta znajdzie się w odległości około 5 do 10 mm od TomoCap, następnie przesuwaj kamerę skanującą laserowo w górę/dół i w lewo/prawo, używając czarnych pokręteł na uchwycie kamery, aż TomoCap zostanie ustawiony w centrum rogówki pacjenta. Na tym etapie można sprawdzić, czy czerwone światło laserowe znajduje się w centrum rogówki, a w celu precyzyjnej regulacji należy obserwować odbicie wiązki lasera od rogówki, które jest widoczne na obrazie z kamery CCD. Odbicie to musi wystąpić dokładnie w biegunie przednim rogówki. 
<img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig5.jpg" alt="Proces laserowej operacji oka, celowanie optyczne, czerwona kropka lasera, schemat procedury medycznej, korekcja wzroku." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Ustawienie wiązki lasera na biegunie przednim rogówki w celu wykonania centralnych obrazów rogówki.</li>
<li>Poproś pacjenta, aby otworzył oko tak szeroko, jak to możliwe. Powoli przesuwaj kamerę skanującą laserowo do przodu w stronę pacjenta, aż TomoCap zetknie się z rogówką pacjenta. Jeśli konieczne jest skorygowanie pozycji kamery skanującej laserowo, należy najpierw odsunąć kamerę od pacjenta, dokonać korekty, a następnie ponownie przesunąć ją do przodu, aby zetknęła się z rogówką. 
<img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig6.jpg" alt="Schemat Tomocap z odbiciem lasera do analizy wyrównania rogówki; technika ustawiania optycznego." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Demonstracja cienkiego mostka żelowego między TomoCap a rogówką.</li>
<li>Wystarczający jest minimalny kontakt kamery z rogówką. Przy optymalnym ustawieniu na obrazie na żywo z kamery CCD widoczny jest cienki mostek żelowy między TomoCap a rogówką.</li>
</ol>
Jeśli naciśniesz TomoCap lub przesuniesz rogówkę zbyt blisko kamery, w obrazie na żywo z kamery CCD zauważysz ucisk rogówki, która będzie wyglądać na spłaszczoną. Podobnie na uzyskanych obrazach pojawi się linia wskazująca miejsce nacisku, dlatego nie należy wywierać zbyt silnego nacisku na rogówkę. Po nawiązaniu kontaktu nie zmieniaj położenia zagłówka, aby uniknąć przesuwania się rogówki po TomoCap.
<img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig7.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna włókien nerwowych; schemat podkreśla analizę wzorca nerwów, prawdopodobnie detekcję optyczną." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. (lewo) Wygląd strie z powodu zastosowania nadmiernego nacisku na rogówkę przez TomoCap; (prawo) Obraz o normalnym wyglądzie bez nadmiernego nacisku.
4. Badanie pacjenta
Po wybraniu pola widzenia należy włączyć kamerę laserową HRT III, wówczas na ekranie pojawi się okno akwizycji obrazu. Na podstawie obrazu CCD należy ustawić TomoCap oraz światło laserowe na rogówce pacjenta. Następnie można rozpocząć badanie w wybranym trybie.
<img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig8.jpg" alt="Układ laserowej mikroskopii skaningowej oka, obraz z kamery CCD, badane oko pacjenta, kontrola ostrości i czułości." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8. Tryb wyświetlania na monitorze podczas akwizycji obrazów.
Sposób akwizycji
W trybie przekroju (section mode) pojedynczy obraz jest rejestrowany i zapisywany przy każdym naciśnięciu przełącznika nożnego. Trybu tego używamy do przechwytywania obrazów całej warstwy rogówki, w tym warstwy Bowmana w centrum rogówki. Po zarejestrowaniu odpowiedniej liczby obrazów można wypróbować pozostałe tryby, w tym sekwencyjny (sequence) i wolumetryczny (volume).
<img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig9.jpg" alt="Interfejs wyboru typu skanowania, schemat; pola wprowadzania: Przekrój, Sekwencja, Objętość; przekroje=5." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9. Ekran z wyborem różnych trybów akwizycji obrazu.
Dzięki funkcji Sequence scan można zarejestrować sekwencję do 100 obrazów z regulowaną częstotliwością klatek. Można wybrać częstotliwość od 30 do 1 klatki na sekundę (fps), co w tym trybie pozwala na nagranie filmu o czasie trwania od 3 do 100 sekund.
W trybie skanowania objętościowego kamera automatycznie wykonuje serię 40 obrazów w kolejnych płaszczyznach ogniskowania. Przy zastosowaniu soczewki pola „FOV 400 μm” można zeskanować całkowitą głębokość 85 μm, a odległość ogniskowa między dwoma kolejnymi obrazami wyniesie około 2,1 μm.
Po wykonaniu kilku skanów można zmienić płaszczyznę ogniskowania obiektywu, aby zmierzyć głębokość warstwy komórek rogówki względem jej powierzchni, ustawiając ostrość na warstwie komórek nabłonka, a następnie klikając przycisk Reset w celu ustawienia wartości głębokości na 0.
Na potrzeby niniejszego badania uzyskujemy obrazy z centralnej części rogówki na różnych głębokościach. W związku z tym nie przesuwamy skaningowej kamery laserowej poziomo ani pionowo po rogówce, lecz jedynie przemieszczamy ją w przód i w tył, rejestrując obrazy ze wszystkich głębokości błony Bowmana w tym samym punkcie rogówki. Odległość między poszczególnymi obrazami wynosi około 1 μm; zatem jeśli głębokość błony Bowmana wynosi 10 μm, uzyskamy 10 obrazów. Jednak do końcowej analizy wybieramy obrazy z odstępem około 2-3 μm między nimi.
Po zakończeniu badania wyłącz kamerę, klikając przycisk zasilania kamery w oknie akwizycji. Poinformuj pacjenta, aby nie pocierał oczu do czasu ustąpienia działania znieczulenia miejscowego. W ramach środków ostrożności można przeprowadzić badanie rogówki pacjenta za pomocą lampy szczelinowej po zakończeniu procedury.
Zdejmij TomoCap z kamery i go wyrzuć, a następnie oczyść soczewkę mikroskopu za pomocą patyczka higienicznego zwilżonego wodą destylowaną.
5. Analiza badania

a. Wybór klatek

Aby przejrzeć i przeanalizować istniejące badania, w oknie bazy danych należy wybrać odpowiednią dokumentację pacjenta. Okno przeglądania obrazów zapewnia przegląd istniejących badań rogówki dla wybranego pacjenta. Badania wykonane w różne dni są przechowywane w oddzielnych kartach wizyt. Trzy różne typy skanowania są reprezentowane przez trzy różne ikony w karcie wizyt rogówki HRT III w oknie przeglądania obrazów programu Heidelberg Eye Explorer.
Aby przejrzeć obraz rogówki, należy dwukrotnie kliknąć odpowiednią ikonę obrazu, wówczas funkcja „Show” otworzy następujące okno:
<img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig10.jpg" alt="Analiza obrazów z mikroskopii konfokalnej; oprogramowanie wyświetla przekroje próbki do badania struktur komórkowych." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10. Wyświetlenie wszystkich zarejestrowanych obrazów po badaniu.
<img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig11.jpg" alt="Eksperyment neuronaukowy, obrazy z mikroskopu konfokalnego, mapowanie sieci neuronowej, detekcja fluorescencji." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 11"> 
Rycina 11. Wyświetlanie wybranego obrazu przed eksportem z widokiem oka z kamery CCD w celu wykazania prawidłowego ustawienia.
Aby wyeksportować odpowiednie obrazy do dalszej analizy, kliknij „Export” na pasku narzędzi, a następnie wybierz folder, w którym chcesz zapisać obrazy.

Dla każdego pacjenta pozyskujemy i rejestrujemy obrazy ze wszystkich warstw rogówki, jednak ponieważ głównym celem niniejszych badań jest warstwa Bowmana i nerwy rogówki, analizowane będą jedynie obrazy z tej warstwy. Dla każdego badanego wybieramy 5-6 klatek z warstwy Bowmana na różnych głębokościach rogówki.
<img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig12.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii konfokalnej na różnych głębokościach ukazujące struktury komórkowe, analiza obrazowa." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 12"> 
Rycina 12. Prezentacja wszystkich warstw rogówki u zdrowego osobnika.
Średnio 5-6 klatek z warstwy Bowmana w centrum rogówki na różnych głębokościach jest wybieranych losowo do pomiarów ilościowych i analizy.
b. Analiza obrazów
Do analizy obrazów warstwy Bowmana centralnej rogówki wykonanych za pomocą HRT III wykorzystujemy specjalistyczne oprogramowanie opracowane w naszej grupie o nazwie „CCM Image Analysis Tools v 0.6”.
Za pomocą tego oprogramowania mierzy się cztery główne parametry nerwów rogówki:
<ul>
<li>Gęstość włókien nerwowych (NFD), definiowana jako liczba głównych nerwów na kadr.</li>
<li>Gęstość odgałęzień nerwowych (NBD), liczba głównych odgałęzień na kadr.</li>
<li>Długość włókien nerwowych (NFL), która stanowi całkowitą długość wszystkich nerwów na kadr.</li>
<li>Krętość włókien nerwowych (NFT) głównych nerwów na kadr.</li>
</ul>

Aby otworzyć obraz CCM, przejdź do Plik &gt; Otwórz.
<ul>
<li>Po załadowaniu obrazu jego rozmiar i typ są wyświetlane w polu informacji o obrazie (Image Information Box) w lewym górnym rogu panelu sterowania.</li>
<li>Domyślna skala jest wyświetlana w linii edycji informacji o obrazie. Jeśli skala jest inna, należy zmienić wartość w linii edycji.</li>
<li>Aby rozpocząć analizę obrazu, należy wybrać z pola metryk (Metric Box) w prawym górnym rogu panelu sterowania parametr, który ma zostać zmierzony.</li>
<li>W polu wyników na dole strony liczba NFD i NBD jest przedstawiona jako wartość bezwzględna, NFL w mm, a krętość jako współczynnik krętości (TC).</li>
<li>Jednak po wyeksportowaniu wyników do arkusza Excel, wyniki dla NFD i NBD zostaną przedstawione w no/mm2, a dla NFL w mm/mm2.</li>
<li>W tym celu, po zakończeniu pomiarów, należy kliknąć Dodaj pomiary (Add measurements), przejść do Plik > Zapisz jako, a następnie otworzyć zapisane wyniki w programie Excel.</li>
</ul>
<img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig13.jpg" alt="Analiza mikroskopowa fluorescencyjna; schemat śledzenia dendrytów z oprogramowaniem do pomiarów ilościowych." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 13"> 
Rysunek 13. Prezentacja obrazu nerwu rogówki z obrysem w narzędziu analitycznym przy użyciu „CCM Image Analysis Tool”.
6. Reprezentatywne wyniki:
Wykazaliśmy postępujący wzrost degeneracji nerwów rogówki wraz ze zwiększającym się stopniem nasilenia neuropatii cukrzycowej 1 oraz wczesne uszkodzenia nerwów w cukrzycy, które wyprzedzają utratę wewnątrzepidermalnych włókien nerwowych w biopsjach skóry 2, wraz ze stratyfikacją nasilenia neuropatii i regeneracją po transplantacji trzustki 3 u pacjentów z cukrzycą. Wykazaliśmy również uszkodzenia nerwów w idiopatycznej neuropatii małych włókien 4 oraz w chorobie Fabry 5.
<img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig14.jpg" alt="Struktura włókien nerwowych w mikroskopii wysokiej rozdzielczości; obrazowanie szlaków neuronalnych; analiza komórkowa." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 14"> 
Rycina 14. Obrazy z konfokalnej mikroskopii rogówki wykonane za pomocą HRT III warstwy Bowmana rogówki: (a) osoba z grupy kontrolnej w porównaniu do (b) pacjenta z neuropatią i ciężkim uszkodzeniem nerwów.

<ol><li>Abbott, C. A., Kallinikos, P., Marshall, A., Finnigan, J., Morgan, P., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Confocal+Microscopy%3A+A+Novel+Non-invasive+Test+to+Diagnose+and+Assess+Progression+of+Human+Diabetic+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Test to Diagnose and Assess Progression of Human Diabetic Neuropathy.</a> Diabetes Care. 33, 1792-1797 (2010).</li>
<li>Quattrini, C., Tavakoli, M., Jeziorska, M., Kallinikos, P., Tesfaye, S., Marshall, A., Finnigan, J., Boulton, A. J. M., Efron, N., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surrogate+Markers+of+Small+Fiber+Damage+in+Human+Diabetic+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Surrogate Markers of Small Fiber Damage in Human Diabetic Neuropathy.</a> Diabetes. 56, 2148-2154 (2007).</li>
<li>Mehra, S., Tavakoli, M., Efron, N., Boulton, A. J. M., Augustine, T., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Confocal+Microscopy+Detects+Early+Nerve+Regeneration+After+Pancreas+Transplantation+in+Patients+with+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Corneal Confocal Microscopy Detects Early Nerve Regeneration After Pancreas Transplantation in Patients with Type 1 Diabetes.</a> Diabetes Care. 30, 2608-2612 (2007).</li>
<li>Tavakoli, M., Marshall, A., Pitceathly, R., Fadavi, H., Gow, D., Roberts, M. E., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+confocal+microscopy%3A+A+novel+means+to+detect+nerve+fibre+damage+in+patients+with+impaired+glucose+tolerance+and+idiopathic+small+fibre+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Corneal confocal microscopy: A novel means to detect nerve fibre damage in patients with impaired glucose tolerance and idiopathic small fibre neuropathy.</a> Experimental Neurology. 223, 245-250 (2010).</li>
<li>Tavakoli, M., Marshall, A., Thompson, L., Kenny, M., Waldek, S., Efron, N., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+confocal+microscopy%3A+A+novel+technique+to+detect+small-fibre+neuropathy+in+patients+with+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Corneal confocal microscopy: A novel technique to detect small-fibre neuropathy in patients with Fabry disease.</a> Muscle & Nerve. 40, 976-984 (2009).</li>
</ol>

Ryciny 4 - 6: Dzięki uprzejmości Heidelberg Engineering

Konfokalna mikroskopia rogówki (CCM) to nieinwazyjna technika kliniczna, która może być wykorzystywana do wykrywania wczesnych uszkodzeń nerwów oraz ilościowej oceny patologii małych włókien w neuropatiach obwodowych, w tym w cukrzycy, chorobie Fabry oraz idiopatycznych neuropatiach małych włókien (ISFN). Bezpośredni wpływ kliniczny tej techniki stanowi ogromny skok naprzód w zakresie naszych możliwości diagnostycznych, monitorowania progresji oraz oceny odpowiedzi na leczenie u pacjentów z neuropatią cukrzycową i innymi...

<table><tbody><tr><td>Urządzenie HRT III CCM - Moduł Rogówki z Rostocka</td><td></td><td></td><td> Heidelberg Engineering</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazów CCM v0.6 </td><td></td><td></td><td>University of Manchester</td></tr></tbody></table>

konfokalna mikroskopia rogówki: nowoczesna nieinwazyjna metoda ilościowej oceny patologii małych włókien w neuropatiach obwodowych

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

Dokładna kwantyfikacja neuropatii obwodowej jest istotna dla zdefiniowania pacjentów z grupy ryzyka, przewidywania pogorszenia stanu zdrowia oraz oceny nowych terapii. Metody konwencjonalne oceniają deficyty neurologiczne i elektrofizjologię, a ilościowe testy sensoryczne kwantyfikują zmiany funkcjonalne w celu wykrycia neuropatii. Jednakże najwcześniejsze uszkodzenia wydają się dotyczyć małych włókien, podczas gdy testy te oceniają przede wszystkim dysfunkcję dużych włókien i mają ograniczoną zdolność do wykazania regeneracji i naprawy. Jedynymi technikami umożliwiającymi bezpośrednie badanie uszkodzeń i naprawy nieumielinowanych włókien nerwowych są biopsja nerwu łydkowego z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej oraz biopsja punch skóry. Obie te metody są jednak procedurami inwazyjnymi, wymagają czasochłonnych procedur laboratoryjnych i znacznej wiedzy specjalistycznej. Konfokalna mikroskopia rogówki jest nieinwazyjną techniką kliniczną, która zapewnia obrazowanie włókien nerwowych rogówki in-vivo. Wykazaliśmy wczesne uszkodzenia nerwów, które wyprzedzają utratę wewnątrzepidermalnych włókien nerwowych w biopsjach skóry, wraz ze stratyfikacją stopnia nasilenia neuropatii i naprawy po przeszczepieniu trzustki u pacjentów z cukrzycą. Wykazaliśmy również uszkodzenia nerwów w idiopatycznej neuropatii małych włókien oraz w chorobie Fabry'ego.

Mikroskopia konfokalna rogówki jest nieinwazyjną techniką kliniczną, która może być wykorzystana do ilościowej oceny uszkodzeń włókien C w celu diagnozy i stratyfikacji pacjentów z rosnącym stopniem nasilenia neuropatii.

Konfokalna mikroskopia rogówki: Nowoczesna nieinwazyjna metoda ilościowej oceny patologii małych włókien w neuropatiach obwodowych

Dokładna kwantyfikacja neuropatii obwodowej jest istotna dla zdefiniowania pacjentów z grup ryzyka, przewidywania pogorszenia stanu zdrowia oraz oceny nowych terapii. ...

W niniejszym filmie zaprezentowano procedurę obrazowania włókien C rogówki z wykorzystaniem nieinwazyjnej techniki konfokalnej mikroskopii rogówki (CCM), która umożliwia ilościową ocenę uszkodzeń włókien nerwowych. W pierwszej kolejności regulowana jest płaszczyzna ogniskowania soczewki w urządzeniu CCM, a następnie na soczewkę nakłada się żel Visco Tears przed założeniem jednorazowej nakładki. Następnie do oka podaje się krople znieczulające oraz żel Visco Tears.Następnie reguluje się kamerę tak, aby żel znajdujący się z przodu soczewki stykał się z rogówką pacjenta. Na koniec dostosowuje się głębokość płaszczyzny ogniskowania i wykonuje obrazy nerwów rogówki z centralnej części błony Bowmana. Zmiany morfologiczne we włóknach nerwów rogówki mogą być obserwowane w celu ilościowego określenia neuropatii.Jest to bardzo nowatorska technika, która była wcześniej stosowana w optometrii i okulistyce, jednak w ciągu ostatnich ośmiu lat wykorzystujemy ją bardzo skutecznie do badania i oceny neuropatii cukrzycowej oraz innych neuropatii obwodowych. Główną zaletą tej metody jest to, że pozwala ona na ilościową ocenę uszkodzeń małych włókien na bardzo wczesnym etapie, a następnie całkowicie nieinwazyjne określenie stopnia nasilenia neuropatii u pacjentów. Możemy to zrobić bardzo szybko za pomocą dwuminutowego skanowania, które następnie pozwala określić stopień nasilenia neuropatii; mamy nadzieję, że dzięki temu metoda ta zastąpi niektóre z innych, znacznie bardziej inwazyjnych technik, takich jak biopsja skóry czy biopsja nerwu. Choć na pierwszy rzut oka wydaje się ona prostą techniką, w rzeczywistości wymaga ona zachowania określonych kroków, aby optymalnie zarejestrować obraz, a następnie poddać go analizie ilościowej.Naszym celem jest uczynienie całego tego procesu jasnym i przystępnym dla każdego, kto chciałby skorzystać z tej techniki. Pierwszym krokiem w badaniu z wykorzystaniem konfokalnego mikroskopu rogówki HRT jest przygotowanie końcówki obiektywu w tubusie obiektywu kamery skanującej laserowo. Należy ustawić refrakcję na +12 dioptrii, a następnie obniżyć kamerę do najniższej pozycji i zablokować soczewkę, obracając ją przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.Nanieś dużą, jednorodną, wolną od pęcherzyków powietrza kroplę ViscoTears o rozmiarze P na końcówkę soczewki. Wyjmij nakładkę tomo z jałowego opakowania i zamontuj ją na końcówce soczewki tak daleko, jak to możliwe w stronę uchwytu, aby żel utworzył menisk między soczewką obiektywu a nakładką. Należy uważać, aby podczas montażu nie dotknąć przedniej powierzchni nakładki tomo.Teraz przesuń kamerę skanującą laserem tak daleko w tył, jak to możliwe na uchwycie kamery, aby objąć wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnię nakrętki tomograficznej. Obie pojawią się na monitorze jako jasne odbicie lasera. Przekręć pokrętło regulacji płaszczyzny ogniskowania, aż pojawi się jasne odbicie, co wskaże, że obiektyw jest ustawiony na ostrość w obrębie przedniej części nakrętki.Wartość głębokości wyświetlana na ekranie pozycji ogniskowania powinna teraz wynosić od minus 150 micrometers do plus 150 micrometers. Zresetuj ustawienie głębokości do zera. Teraz zobaczmy, jak przygotować pacjenta.Po znieczuleniu oczu badanego kroplą 0,4% chlorowodorku tetrakainy, należy nawilżyć przednią część oka sztucznymi łzami o wysokiej lepkości. Osadź badanego wygodnie z brodą na podstawce, upewniając się, że czoło jest mocno dociśnięte do podpórki czołowej. Badanie ułatwia polecenie pacjentowi fiksacji wzroku na zewnętrznym świetle fiksacyjnym.Dzięki temu, że oko niepoddawane badaniu pozostaje wolne, niewielki rozmiar głowicy mikroskopu zapewnia, że przeciwległe oko badanego nie jest zasłonięte. Umożliwia to stosowanie celowników dystansowych. Ustaw kamerę CCD w taki sposób, aby jej oś optyczna biegła prostopadle do osi optycznej kamery skanującej laserowo.Podczas obrazowania prawego oka kamera powinna znajdować się po prawej stronie pacjenta i odwrotnie. W tej pozycji przednia powierzchnia nakładki tomo widoczna jest w centrum kamery CCD. Obraz na żywo.Przesuń kamerę skanującą laserowo w stronę pacjenta, aż rogówka pacjenta znajdzie się w odległości około 5 do 10 milimetrów od nakładki tomo. Następnie za pomocą pokręteł regulacji dostępu w pionie i poziomie na uchwycie kamery przesuń kamerę skanującą laserowo w górę, w dół, w lewo i w prawo, aż nakładka tomo zostanie ustawiona w centrum rogówki pacjenta. Teraz poproś pacjenta o otwarcie oczu tak szeroko, jak to możliwe.Powoli przesuwaj kamerę skanującą laserem w stronę pacjenta, aż nasadka tomograficzna zetknie się z rogówką pacjenta. Na tym etapie sprawdź, czy czerwone światło lasera znajduje się w centrum rogówki oraz czy odbicie wiązki lasera od rogówki następuje dokładnie w biegunie przednim rogówki. Przy optymalnej regulacji kontakt między soczewką a rogówką jest minimalny.Na obrazie z kamery CCD na żywo widoczny jest cienki mostek żelowy pomiędzy nakładką tomo a rogówką. Jeśli pomiędzy nakładką tomo a rogówką występuje zbyt duży nacisk, w obrazie z kamery CCD widoczne jest spłaszczenie rogówki. Obraz na żywo oraz rozproszone światło pojawiają się na obrazie z CCM.Po ustawieniu pacjenta włącz kamerę trzech laserów HR, wówczas na ekranie pojawi się okno akwizycji obrazu. Używając obrazu CCD, ustaw nakładkę tomograficzną i światło lasera na rogówce pacjenta. CCM oferuje trzy opcje przechwytywania obrazów.Skanowanie sekwencyjne umożliwia zarejestrowanie do 100 obrazów z regulowaną częstotliwością klatek. Wybierana jest częstotliwość od 1 do 30 klatek na sekundę. Na tej podstawie można zarejestrować film o czasie trwania od 3 do 100 sekund.W trybie skanowania objętościowego kamera automatycznie wykonuje serię 40 obrazów w kolejnych płaszczyznach ogniskowania. Przeskanowana może zostać całkowita głębokość 85 micrometers, a odległość ogniskowa między dwoma kolejnymi obrazami wynosi około 2.1 micrometers. Ostatnią opcją jest tryb sekcyjny, który zostanie wykorzystany w tym doświadczeniu.Tryb ten umożliwia optymalne obrazowanie z uzyskaniem i zapisaniem wyraźnych pojedynczych obrazów przy każdym naciśnięciu przełącznika nożnego. Tryb ten stosuje się do przechwytywania obrazów z całej warstwy rogówki, w tym z błony Bowmana w centrum rogówki. Po zarejestrowaniu odpowiedniej liczby obrazów można zastosować inne tryby, w tym sekwencyjny oraz wolumetryczny.Po wykonaniu kilku skanów można zmienić płaszczyznę ogniskową soczewki, aby zmierzyć głębokość warstwy komórek rogówki względem jej powierzchni, ustawiając ostrość na warstwie komórek nabłonka, a następnie klikając przycisk resetowania, aby ustawić wartość głębokości na zero. Po zakończeniu badania wyłącz kamerę, klikając przycisk zasilania kamery w oknie akwizycji. Poinformuj pacjenta, że nie powinien pocierać oczu do czasu ustąpienia działania znieczulenia miejscowego.Zdejmij nasadkę tomograficzną z kamery, wyrzuć ją, a następnie oczyść soczewkę mikroskopu za pomocą patyczka nasączonego wodą destylowaną. Teraz sprawdźmy, jak analizować obraz i kwantyfikować parametry włókien nerwowych w celu przeglądu i analizy istniejących badań. Najpierw wybierz odpowiednią kartę pacjenta w oknie bazy danych.Okno przeglądania obrazów zapewnia przegląd istniejących badań rogówki dla wybranego pacjenta. Badania wykonane w różne dni są przechowywane w oddzielnych kartach wizyt. Trzy różne typy skanów są reprezentowane przez trzy różne ikony. W karcie wizyty rogówki HRT w oknie przeglądania obrazów programu Heidelberg Eye Explorer.Aby przejrzeć obraz rogówki, należy dwukrotnie kliknąć odpowiednią ikonę obrazu, a następnie nacisnąć „show now”, aby wyeksportować odpowiednie obrazy do dalszej analizy; w tym celu kliknij „export” na pasku narzędzi, a następnie wybierz folder, w którym mają zostać zapisane obrazy. Ponieważ głównym celem tych badań jest błona Bowmana i nerwy rogówki, analizowane będą wyłącznie obrazy z tej warstwy. Dla każdego badanego wybieranych jest od pięciu do sześciu klatek z błony Bowmana na różnych głębokościach rogówki.Analiza obrazu jest przeprowadzana przy użyciu specjalistycznego oprogramowania opracowanego przez nasz zespół o nazwie CCM Image Analysis Tools, wersja 0.64. Za pomocą tego oprogramowania mierzone są główne parametry nerwów rogówki: gęstość włókien nerwowych, zdefiniowana jako liczba głównych nerwów na kadr, oraz gęstość rozgałęzień nerwowych, będąca całkowitą liczbą głównych odgałęzień na kadr.Długość włókien nerwowych to całkowita długość głównych nerwów i głównych odgałęzień na klatkę włókien nerwowych. Krętość to krętość głównych nerwów na klatkę. Aby otworzyć obraz CCM, przejdź do pliku, a następnie wybierz otwórz.Po załadowaniu obrazu jego rozmiar i typ są wyświetlane w polu informacji o obrazie w lewym górnym rogu panelu sterowania, a domyślna skala jest wyświetlana w linii edycji informacji o obrazie. Jeśli skala jest inna, należy zmodyfikować liczbę w linii edycji. Aby rozpocząć analizę obrazu, wybierz z pola metryk w prawym górnym rogu panelu sterowania parametr, który chcesz zmierzyć.W polu wyników na dole strony NFD i MBD są przedstawione jako wartości liczbowe. NFL jest podany w milimetrach, a krętość jako współczynnik krętości. Wyniki można wyeksportować do arkusza Excel.Po otwarciu arkusza Excel wyniki zostaną przedstawione jako liczba na milimetr kwadratowy dla NFD, milimetry na milimetr kwadratowy dla NFL oraz współczynnik krętości dla NFT. Aby wykonać te pomiary, należy najpierw zaznaczyć każdy główny nerw, a następnie każdą główną gałąź nerwu. Na koniec należy obrysować każdy nerw w kadrze.W celu uzyskania lepszej precyzji można użyć cyfrowego pióra. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje minutę. Ważne jest ścisłe przestrzeganie szczegółowych instrukcji.Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu zdobyli Państwo wiedzę na temat sposobu pracy i rejestrowania obrazów z warstwy ruchomej rogówki za pomocą konfokalnej mikroskopii rogówki oraz metod kwantyfikacji i analizy obrazów z tej warstwy u pacjentów z neuropatią obwodową, w szczególności z neuropatią cukrzycową. Prosimy pamiętać, że obsługa CCM wymaga specjalistycznej wiedzy i zaleca się, aby procedurę tę przeprowadzali specjaliści przeszkoleni w badaniu oka.

corneal-confocal-microscopy-novel-non-invasive-technique-to-quantify

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Mikroskopia konfokalna rogówki: nowatorska bezinwazyjna technika ilościowego oznaczania patologii małych włókien w neuropatiach obwodowych

W celu zbadania zmian nocyceptywnych wewnątrznaskórkowych włókien nerwowych (IENF) w bolesnych neuropatiach (PN), opracowaliśmy protokoły, które mogłyby bezpośrednio badać trójwymiarowe zmiany morfologiczne obserwowane w nocyceptywnych IENFach.  Trójwymiarowa analiza IENF ma potencjał do oceny zmian morfologicznych IENF w PN.

Trójwymiarowe obrazowanie nocyceptywnych śródnaskórkowych włókien nerwowych w biopsjach ludzkiej skóry

Przedstawiono protokół dynamicznego obrazowania podłużnego i selektywnego laserowego uszkadzania zakończeń nerwowych u reporterowych myszy transgenicznych.

In vivo (in vivo) Mikroskopia dwufotonowa pojedynczych zakończeń nerwowych w skórze

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest zmienione w różnych stanach, które czasami mogą prowadzić do niewydolności synaptycznej. W niniejszym raporcie opisano metody oparte na mikroskopie fluorescencyjnym do ilościowego określania takich zmian strukturalnych.

Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół wykorzystuje trójwymiarowe (3D) techniki obrazowania i analizy do wizualizacji i ilościowego określenia mitochondriów specyficznych dla nerwów. Techniki te mają zastosowanie w innych sytuacjach, w których jeden sygnał fluorescencyjny jest używany do odizolowania podzbioru danych od innego sygnału fluorescencyjnego.

Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka

Opisujemy użycie pełnej koherentnej mikroskopii optycznej jako metody wysokiej jakości oceny zrębu dawcy rogówki. Protokół ten może być stosowany do identyfikacji cech wskazujących na zdrowie lub chorobę i ma na celu poprawę badań przesiewowych i selekcji tkanek dawcy, a tym samym wyników keratoplastyki.

Pełnopolowa optyczna mikroskopia koherentna do histologicznej analizy cech zrębu w przeszczepach rogówki

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Ten protokół opisuje metodę analizy morfometrycznej połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i STED, która jest używana do ilościowego określania zmian patologicznych w mysich modelach SMA i CMS związanych z ColQ.

Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej

Badanie wrażliwości rogówki dostarcza informacji o zdrowiu nerwów rogówkowych i pomaga diagnozować choroby powierzchni oka. Przedstawiamy zwięzły protokół do jakościowej oceny wrażliwości rogówki, który może być z łatwością stosowany przez lekarzy okulistów w różnych warunkach klinicznych.

Procedura badania wrażliwości rogówki u pacjentów okulistycznych i optometrycznych

Kapilaroskopia jest dostępnym narzędziem do bezpośredniej, taniej i nieinwazyjnej wizualizacji mikrokrążenia. Celem tego protokołu jest umożliwienie naukowcom wykorzystania kapilaroskopii do wizualizacji obwodowej morfologii mikronaczyniowej w łożyskach paznokci myszy.

Nieinwazyjna wizualizacja morfologii mikrokrążenia łożyska paznokcia u myszy za pomocą kapilaroskopii

Niniejszy artykuł demonstruje działanie i wpływ mikroskopii konfokalnej in vivo w diagnozie i leczeniu suchego oka oraz bada zastosowanie i wyniki mikroskopii konfokalnej in vivo , aby stanowić podstawę przyszłych badań.

In Vivo Mikroskopia konfokalna w diagnostyce i leczeniu suchego oka: Skupienie się na protokołach obrazowania i interpretacji

Poznaj mikroskopię konfokalną rogówki jako nieinwazyjną metodę ilościowej oceny uszkodzeń włókien nerwowych w neuropatiach obwodowych. Technika ta umożliwia szybką diagnostykę i stratyfikację pacjentów.

Mikroskopia konfokalna rogówki: nowatorska nieinwazyjna technika ilościowego określania patologii małych włókien w neuropatiach obwodowych (Wideo) | JoVE Journal

Konfokalna mikroskopia rogówki: Nowoczesna nieinwazyjna metoda ilościowej oceny patologii małych włókien w neuropatiach obwodowych

Przeglądaj więcej filmów