Konfokalna mikroskopia rogówki: Nowoczesna nieinwazyjna metoda ilościowej oceny patologii małych włókien w neuropatiach obwodowych

W niniejszym filmie zaprezentowano procedurę obrazowania włókien C rogówki z wykorzystaniem nieinwazyjnej techniki konfokalnej mikroskopii rogówki (CCM), która umożliwia ilościową ocenę uszkodzeń włókien nerwowych. W pierwszej kolejności regulowana jest płaszczyzna ogniskowania soczewki w urządzeniu CCM, a następnie na soczewkę nakłada się żel Visco Tears przed założeniem jednorazowej nakładki. Następnie do oka podaje się krople znieczulające oraz żel Visco Tears.

Następnie reguluje się kamerę tak, aby żel znajdujący się z przodu soczewki stykał się z rogówką pacjenta. Na koniec dostosowuje się głębokość płaszczyzny ogniskowania i wykonuje obrazy nerwów rogówki z centralnej części błony Bowmana. Zmiany morfologiczne we włóknach nerwów rogówki mogą być obserwowane w celu ilościowego określenia neuropatii.

Jest to bardzo nowatorska technika, która była wcześniej stosowana w optometrii i okulistyce, jednak w ciągu ostatnich ośmiu lat wykorzystujemy ją bardzo skutecznie do badania i oceny neuropatii cukrzycowej oraz innych neuropatii obwodowych. Główną zaletą tej metody jest to, że pozwala ona na ilościową ocenę uszkodzeń małych włókien na bardzo wczesnym etapie, a następnie całkowicie nieinwazyjne określenie stopnia nasilenia neuropatii u pacjentów. Możemy to zrobić bardzo szybko za pomocą dwuminutowego skanowania, które następnie pozwala określić stopień nasilenia neuropatii; mamy nadzieję, że dzięki temu metoda ta zastąpi niektóre z innych, znacznie bardziej inwazyjnych technik, takich jak biopsja skóry czy biopsja nerwu. Choć na pierwszy rzut oka wydaje się ona prostą techniką, w rzeczywistości wymaga ona zachowania określonych kroków, aby optymalnie zarejestrować obraz, a następnie poddać go analizie ilościowej.

Naszym celem jest uczynienie całego tego procesu jasnym i przystępnym dla każdego, kto chciałby skorzystać z tej techniki. Pierwszym krokiem w badaniu z wykorzystaniem konfokalnego mikroskopu rogówki HRT jest przygotowanie końcówki obiektywu w tubusie obiektywu kamery skanującej laserowo. Należy ustawić refrakcję na +12 dioptrii, a następnie obniżyć kamerę do najniższej pozycji i zablokować soczewkę, obracając ją przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.

Nanieś dużą, jednorodną, wolną od pęcherzyków powietrza kroplę ViscoTears o rozmiarze P na końcówkę soczewki. Wyjmij nakładkę tomo z jałowego opakowania i zamontuj ją na końcówce soczewki tak daleko, jak to możliwe w stronę uchwytu, aby żel utworzył menisk między soczewką obiektywu a nakładką. Należy uważać, aby podczas montażu nie dotknąć przedniej powierzchni nakładki tomo.

Teraz przesuń kamerę skanującą laserem tak daleko w tył, jak to możliwe na uchwycie kamery, aby objąć wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnię nakrętki tomograficznej. Obie pojawią się na monitorze jako jasne odbicie lasera. Przekręć pokrętło regulacji płaszczyzny ogniskowania, aż pojawi się jasne odbicie, co wskaże, że obiektyw jest ustawiony na ostrość w obrębie przedniej części nakrętki.

Wartość głębokości wyświetlana na ekranie pozycji ogniskowania powinna teraz wynosić od minus 150 micrometers do plus 150 micrometers. Zresetuj ustawienie głębokości do zera. Teraz zobaczmy, jak przygotować pacjenta.

Po znieczuleniu oczu badanego kroplą 0,4% chlorowodorku tetrakainy, należy nawilżyć przednią część oka sztucznymi łzami o wysokiej lepkości. Osadź badanego wygodnie z brodą na podstawce, upewniając się, że czoło jest mocno dociśnięte do podpórki czołowej. Badanie ułatwia polecenie pacjentowi fiksacji wzroku na zewnętrznym świetle fiksacyjnym.

Dzięki temu, że oko niepoddawane badaniu pozostaje wolne, niewielki rozmiar głowicy mikroskopu zapewnia, że przeciwległe oko badanego nie jest zasłonięte. Umożliwia to stosowanie celowników dystansowych. Ustaw kamerę CCD w taki sposób, aby jej oś optyczna biegła prostopadle do osi optycznej kamery skanującej laserowo.

Podczas obrazowania prawego oka kamera powinna znajdować się po prawej stronie pacjenta i odwrotnie. W tej pozycji przednia powierzchnia nakładki tomo widoczna jest w centrum kamery CCD. Obraz na żywo.

Przesuń kamerę skanującą laserowo w stronę pacjenta, aż rogówka pacjenta znajdzie się w odległości około 5 do 10 milimetrów od nakładki tomo. Następnie za pomocą pokręteł regulacji dostępu w pionie i poziomie na uchwycie kamery przesuń kamerę skanującą laserowo w górę, w dół, w lewo i w prawo, aż nakładka tomo zostanie ustawiona w centrum rogówki pacjenta. Teraz poproś pacjenta o otwarcie oczu tak szeroko, jak to możliwe.

Powoli przesuwaj kamerę skanującą laserem w stronę pacjenta, aż nasadka tomograficzna zetknie się z rogówką pacjenta. Na tym etapie sprawdź, czy czerwone światło lasera znajduje się w centrum rogówki oraz czy odbicie wiązki lasera od rogówki następuje dokładnie w biegunie przednim rogówki. Przy optymalnej regulacji kontakt między soczewką a rogówką jest minimalny.

Na obrazie z kamery CCD na żywo widoczny jest cienki mostek żelowy pomiędzy nakładką tomo a rogówką. Jeśli pomiędzy nakładką tomo a rogówką występuje zbyt duży nacisk, w obrazie z kamery CCD widoczne jest spłaszczenie rogówki. Obraz na żywo oraz rozproszone światło pojawiają się na obrazie z CCM.

Po ustawieniu pacjenta włącz kamerę trzech laserów HR, wówczas na ekranie pojawi się okno akwizycji obrazu. Używając obrazu CCD, ustaw nakładkę tomograficzną i światło lasera na rogówce pacjenta. CCM oferuje trzy opcje przechwytywania obrazów.

Skanowanie sekwencyjne umożliwia zarejestrowanie do 100 obrazów z regulowaną częstotliwością klatek. Wybierana jest częstotliwość od 1 do 30 klatek na sekundę. Na tej podstawie można zarejestrować film o czasie trwania od 3 do 100 sekund.

W trybie skanowania objętościowego kamera automatycznie wykonuje serię 40 obrazów w kolejnych płaszczyznach ogniskowania. Przeskanowana może zostać całkowita głębokość 85 micrometers, a odległość ogniskowa między dwoma kolejnymi obrazami wynosi około 2.1 micrometers. Ostatnią opcją jest tryb sekcyjny, który zostanie wykorzystany w tym doświadczeniu.

Tryb ten umożliwia optymalne obrazowanie z uzyskaniem i zapisaniem wyraźnych pojedynczych obrazów przy każdym naciśnięciu przełącznika nożnego. Tryb ten stosuje się do przechwytywania obrazów z całej warstwy rogówki, w tym z błony Bowmana w centrum rogówki. Po zarejestrowaniu odpowiedniej liczby obrazów można zastosować inne tryby, w tym sekwencyjny oraz wolumetryczny.

Po wykonaniu kilku skanów można zmienić płaszczyznę ogniskową soczewki, aby zmierzyć głębokość warstwy komórek rogówki względem jej powierzchni, ustawiając ostrość na warstwie komórek nabłonka, a następnie klikając przycisk resetowania, aby ustawić wartość głębokości na zero. Po zakończeniu badania wyłącz kamerę, klikając przycisk zasilania kamery w oknie akwizycji. Poinformuj pacjenta, że nie powinien pocierać oczu do czasu ustąpienia działania znieczulenia miejscowego.

Zdejmij nasadkę tomograficzną z kamery, wyrzuć ją, a następnie oczyść soczewkę mikroskopu za pomocą patyczka nasączonego wodą destylowaną. Teraz sprawdźmy, jak analizować obraz i kwantyfikować parametry włókien nerwowych w celu przeglądu i analizy istniejących badań. Najpierw wybierz odpowiednią kartę pacjenta w oknie bazy danych.

Okno przeglądania obrazów zapewnia przegląd istniejących badań rogówki dla wybranego pacjenta. Badania wykonane w różne dni są przechowywane w oddzielnych kartach wizyt. Trzy różne typy skanów są reprezentowane przez trzy różne ikony. W karcie wizyty rogówki HRT w oknie przeglądania obrazów programu Heidelberg Eye Explorer.

Aby przejrzeć obraz rogówki, należy dwukrotnie kliknąć odpowiednią ikonę obrazu, a następnie nacisnąć „show now”, aby wyeksportować odpowiednie obrazy do dalszej analizy; w tym celu kliknij „export” na pasku narzędzi, a następnie wybierz folder, w którym mają zostać zapisane obrazy. Ponieważ głównym celem tych badań jest błona Bowmana i nerwy rogówki, analizowane będą wyłącznie obrazy z tej warstwy. Dla każdego badanego wybieranych jest od pięciu do sześciu klatek z błony Bowmana na różnych głębokościach rogówki.

Analiza obrazu jest przeprowadzana przy użyciu specjalistycznego oprogramowania opracowanego przez nasz zespół o nazwie CCM Image Analysis Tools, wersja 0.64. Za pomocą tego oprogramowania mierzone są główne parametry nerwów rogówki: gęstość włókien nerwowych, zdefiniowana jako liczba głównych nerwów na kadr, oraz gęstość rozgałęzień nerwowych, będąca całkowitą liczbą głównych odgałęzień na kadr.

Długość włókien nerwowych to całkowita długość głównych nerwów i głównych odgałęzień na klatkę włókien nerwowych. Krętość to krętość głównych nerwów na klatkę. Aby otworzyć obraz CCM, przejdź do pliku, a następnie wybierz otwórz.

Po załadowaniu obrazu jego rozmiar i typ są wyświetlane w polu informacji o obrazie w lewym górnym rogu panelu sterowania, a domyślna skala jest wyświetlana w linii edycji informacji o obrazie. Jeśli skala jest inna, należy zmodyfikować liczbę w linii edycji. Aby rozpocząć analizę obrazu, wybierz z pola metryk w prawym górnym rogu panelu sterowania parametr, który chcesz zmierzyć.

W polu wyników na dole strony NFD i MBD są przedstawione jako wartości liczbowe. NFL jest podany w milimetrach, a krętość jako współczynnik krętości. Wyniki można wyeksportować do arkusza Excel.

Po otwarciu arkusza Excel wyniki zostaną przedstawione jako liczba na milimetr kwadratowy dla NFD, milimetry na milimetr kwadratowy dla NFL oraz współczynnik krętości dla NFT. Aby wykonać te pomiary, należy najpierw zaznaczyć każdy główny nerw, a następnie każdą główną gałąź nerwu. Na koniec należy obrysować każdy nerw w kadrze.

W celu uzyskania lepszej precyzji można użyć cyfrowego pióra. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje minutę. Ważne jest ścisłe przestrzeganie szczegółowych instrukcji.

Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu zdobyli Państwo wiedzę na temat sposobu pracy i rejestrowania obrazów z warstwy ruchomej rogówki za pomocą konfokalnej mikroskopii rogówki oraz metod kwantyfikacji i analizy obrazów z tej warstwy u pacjentów z neuropatią obwodową, w szczególności z neuropatią cukrzycową. Prosimy pamiętać, że obsługa CCM wymaga specjalistycznej wiedzy i zaleca się, aby procedurę tę przeprowadzali specjaliści przeszkoleni w badaniu oka.