Name: Test komórek tworzących kolonię (CFC) dla ludzkich komórek krwiotwórczych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Poznaj test CFC dla ludzkich komórek krwiotwórczych CD34+ w hematopoiezie. Ta metoda ocenia proliferację i różnicowanie progenitorów w półstałym podłożu metylocelulozowym, umożliwiając badanie wpływu onkogenów na leukemogenezę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Alvin J. Siteman Cancer Center w Washington University School of Medicine oraz Barnes-Jewish Hospital w St Louis, MO, za możliwość korzystania z High Speed Cell Sorter Core, który zapewnił sprzęt do cytometrii przepływowej oraz usługi sortowania. Praca ta była finansowana z grantów National Institutes of Health R01 HL082549 oraz K02 HL084179 (NRY). Siteman Cancer Center jest częściowo wspierane przez grant NCI Cancer Center Support Grant P30 CA91842.

1. PRZYGOTOWANIE ODCZYN AgreementNIKI
<ol>
<li>Przygotować sterylne 1000x roztwory zapasowe liganda kinazy tyrozynowej 3 związanej z Fms (FLT-3), czynnika stymulującego kolonie granulocytów/makrofagów (GM-CSF), czynnika komórek macierzystych (SCF), trombopoetyny (TPO), interleukiny (IL)-3 oraz IL-6 zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotować również sterylny roztwór zapasowy Retronectin (1mg/ml) zgodnie z instrukcjami producenta. Podzielić te roztwory zapasowe na małe aliquoty i przechowywać w temperaturze -20 °C, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.</li>
<li>Przygotować 2% FBS w IMDM.</li>
<li>Przygotować pełną pożywkę IMDM z końcowymi stężeniami 20% FBS, 2 mM glutaminy oraz 100 units/ml penicyliny/streptomycyny (PS). Bezpośrednio przed użyciem dodać następujące cytokiny: 100 ng/ml liganda FLT-3, 20 ng/ml GM-CSF, 100 ng/ml SCF, 100 ng/ml TPO, 50 ng/ml IL-3 oraz 100 ng/ml IL-6.</li>
<li>Przygotować 1% BSA w HBSS (bez Ca i Mg, bez czerwieni fenolowej) oraz 2% BSA w D-PBS (bez Ca i Mg). Zsterylizować roztwory, przepuszczając je przez filtry strzykawkowe 0.22 μm, i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
<li>Przygotować 0.02% EDTA w HBSS i przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
<li>Przygotować pseudotypowanego wirusa retrowirusowego GaLV kodującego interesujący fragment DNA i przechowywać w aliquotach w temperaturze -80 °C. Procedura ta wykracza poza zakres niniejszego artykułu, lecz została opisana w innych źródłach (1-3).</li>
</ol>
Do barwienia metodą Giemsy
<ol start="7">
<li> Bezpośrednio przed użyciem przefiltrować dwa razy roztwór barwnika Wrighta/Giemsy przez filtry papierowe o oczkach 1 μm do czystej szklanej butelki.</li>
<li> Bezpośrednio przed użyciem przygotować bufor Wrighta/Giemsy o pH 6.4, mieszając 50 ml przefiltrowanego roztworu barwnika Wrighta/Giemsy z 200 ml roztworu buforu fosforanowego o pH 6.4 według formuły Giordano.</li>
<li> Przygotować roztwór buforu fosforanowego o pH 6.0, rozpuszczając 27.3 g KH2PO4 oraz 4.62 g Na2HPO4 w 3.5 L H2O.</li>
<li> Przygotować 50% metanol w H2O.</li>
</ol>

2. PROCEDURA
Rozmrażanie i preaktywacja komórek CD34+
<ol>
<li>Szybko rozmrozić fiolkę z zamrożonymi komórkami CD34+ w temperaturze 37 °C, delikatnie potrząsając do momentu, aż pozostanie ostatni mały kryształek lodu, a następnie przenieść zawiesinę komórkową (1 ml) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Pozostałe w fiolce komórki delikatnie wypłukać 1 ml roztworu 2% FBS/IMDM w temperaturze pokojowej i dodać go kroplami do probówki 50 ml, delikatnie mieszając zawirowaniem. Odczekać 3 minuty. Następnie, powoli dodać 2 ml 2% FBS/IMDM, delikatnie mieszając, i odczekać 3 minuty. Powtórzyć tę procedurę, dodając 2% FBS/IMDM w objętości równej objętości rozcieńczonej zawiesiny komórkowej w odstępach 3-minutowych, delikatnie mieszając pomiędzy kolejnymi dodaniami, aż objętość końcowa osiągnie 32 ml.</li>
<li>Wirować z prędkością 250 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i usunąć nadsącz, pozostawiając około 0,5 ml.</li>
<li>Przemyć osad, zawieszając go w 20 ml 2% FBS/IMDM i wirując z prędkością 200 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Usunąć nadsącz i zawiesić komórki w pełnej pożywce IMDM w stężeniu około 0,5 x 106 komórek/ml. Pobrać 10 μl zawiesiny komórkowej do mikroprobówki, wymieszać z taką samą objętością roztworu błękitu trypanu (0,4%) i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
<li>Rozcieńczyć komórki do stężenia 0,1-0,15 X 106 komórek/ml, dodając pełną pożywkę IMDM uzupełnioną o cytokiny (patrz 1.3).</li>
<li>Kulturować komórki w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 2 dni.</li>
</ol>
Transdukcja retrowirusowa poprzez wcześniejsze obciążenie wirusem
<ol start="7">
<li>W dniu transdukcji należy policzyć komórki przed rozpoczęciem wstępnego ładowania wirusa, aby określić liczbę studni do przygotowania.</li>
<li>Rozcieńczyć roztwór zapasu Retronectin do stężenia 25 μg/ml i dodać 400 μl do każdej studni nie처리owanej płytki hodowlanej z 24 studniami. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w laminarnym dygestorze bezpieczeństwa biologicznego w celu wstępnego pokrycia.</li>
<li>Usunąć roztwór Retronectin i dodać 400 μl 2% BSA w D-PBS do każdej studni. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Rozmrozić roztwory zapasowe wirusa i przechowywać na lodzie. Usunąć roztwór BSA, dodać 0,5 ml preparatu wirusowego do każdej studni i wirować przy 2200 x g w temperaturze 4°C przez 15 minut.</li>
<li>Usunąć roztwór wirusa ze studni i powtórzyć ładowanie wirusa opisane w punkcie 2.10 jeszcze trzy razy.</li>
<li>Przepłukać każdą studnię 0,5 ml zimnego HBSS (+ Ca &amp; Mg) lub IMDM.</li>
<li>Zebrać wstępnie aktywowane komórki CD34+, wirując przy 200 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Resuspenderć komórki w stężeniu 0,1-0,15 x 106 komórek na 1,5 ml w pełnym medium IMDM z cytokinami.</li>
<li>Dodać 1,5 ml zawiesiny komórkowej do każdej studni i inkubować w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37°C z 5% CO2 przez 2 dni.</li>
</ol>
Sortowanie komórek i zbieranie komórek przetransdukowanych
<ol start="16">
<li> Delikatnie, lecz dokładnie zresuspender komórki w powyższych płytkach z wirusem i przefiltrować je przez filtr komórkowy CellTrics 50 μm do probówki stożkowej. Przenieść 10 μl zawiesiny komórkowej do mikroprobówki, zmieszać z równą objętością roztworu błękitu trypanu i policzyć za pomocą hemocytometru. Przepłukać każdą studnienkę 0,8 ml zimnego 0,02% EDTA/HBSS (wolnego od Ca i Mg, bez czerwieni fenolowej) i dodać do tej samej probówki zbiorczej przez filtr komórkowy CellTrics 50 μm.</li>
<li> Wirować komórki przy 200 x g przez 8 minut w temperaturze 4°C, a następnie przemyć osad zimnym HBSS (wolnym od Ca i Mg, bez czerwieni fenolowej), wirowując przy 200 x g przez 8 minut w temperaturze 4°C.</li>
<li> Resuspender osad w 1% BSA/HBSS (wolnym od Ca i Mg, bez czerwieni fenolowej) do stężenia 15 X 106/ml lub do minimalnej objętości 0,250 ml w celu sortowania komórek. Przechowywać komórki na lodzie w ciemności. Przygotować probówkę zawierającą zimną pożywkę 20% FBS/IMDM/Glutamine/PS do zbierania posortowanych komórek. Sortowanie jest przeprowadzane w High Speed Cell Sorter Core w Alvin J. Siteman Cancer Center na Washington University School of Medicine przy użyciu szybkosortownika MoFlo (Dako, Glostrup, Dania).</li>
</ol>
Analiza CFC
<ol start="19">
<li>Rozmrozić wymaganą liczbę alikwotów po 3 ml pożywki do testu CFC. Wymieszać intensywnie za pomocą vorteXa i pozostawić probówki na co najmniej 5 min, aby pęcherzyki powietrza wypłynęły na powierzchnię przed dodaniem komórek.</li>
<li>Aby obliczyć stężenie komórek dla każdej posortowanej próbki, podzielić liczbę komórek podaną przez pracownię sortowania przez przybliżoną objętość zawiesiny komórkowej. Przenieść 3 000 posortowanych komórek transdukowanych wirusem do sterylnej mikroprobówki zawierającej zimny 2% FBS/IMDM. Wcześniej dostosować objętość 2% FBS/IMDM tak, aby końcowa objętość zawiesiny wynosiła około 0,3 ml.</li>
<li>Zawiesić komórki i przenieść całą zawiesinę komórkową o objętości 0,3 ml do alikwotu 3 ml Methocult GF+ H4435, który składa się z 1% metylocelulozy, 30% FBS, 1% BSA, 10-4 M 2-merkaptoetanolu, 2 mM L-glutaminy, 50 ng/ml SCF, 20 ng/ml GM-CSF, 20 ng/ml IL-3, 20 ng/ml IL-6, 20 ng/ml G-CSF i 3 jednostek/ml erytropoetyny w IMDM. Można również zastosować pożywkę Human Methylcellulose Enriched Media (R &amp; D Systems), która składa się z 1,3% metylocelulozy, 25% FBS, 1% BSA, 5 x 10-5 M 2-merkaptoetanolu, 2 mM L-glutaminy, 50 ng/ml SCF, 20 ng/ml GM-CSF, 20 ng/ml IL-3, 20 ng/ml IL-6, 20 ng/ml G-CSF i 3 jednostek/ml erytropoetyny w IMDM.</li>
<li>Wymieszać intensywnie za pomocą vorteXa, aby mieszanina całkowicie się uniosła i opadła 3-4 razy. Pozostawić probówkę w spoczynku przez 3 min.</li>
<li>Do strzykawki 3 ml dołączyć tępą igłę o rozmiarze 16 G i pobrać 2,2 ml. Nie pobierać dużych pęcherzyków powietrza; usunąć je na początku, kilkakrotnie wypychając zawartość. Wypchnąć po 1,1 ml do dwóch niepodłoża 30 mm (non-treated) i rozprowadzić mieszaninę równomiernie poprzez obracanie naczynia.</li>
<li>Umieścić dublety płytek w płytce 100 mm wraz z naczyniem z 3 ml sterylnej wody. Inkubować przez 14-17 dni.</li>
<li>Określić charakterystykę i ocenić kolonie na podstawie ich morfologii za pomocą mikroskopu odwróconego przy powiększeniu 40x w naczyniu hodowlanym z naniesioną siatką pomiarową. Na potrzeby niniejszego testu kolonie klasyfikuje się w 3 kategoriach: czysto erytroidalne, mielomonocytowe i mieszane. Dalszą podklasyfikację kolonii należy przeprowadzić zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
<li>Całą płytkę z testem CFC można zeskanować bez powiększenia za pomocą zwykłego skanera w rozdzielczości 600 dpi; mikrofotografie kolonii przy małym powiększeniu (40x) można wykonać za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w kolorową kamerę.</li>
<li>W celu dalszej analizy różnicowania i proliferacji komórki z całej płytki testu CFC odzyskuje się poprzez zawieszenie w kilku objętościach 2% FBS/IMDM w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu przy 300 x g przez 10 min w 4°C komórki resuspenderuje się w 2% FBS/IMDM, przelicza, a następnie barwi przeciwciałami do cytometrii przepływowej lub nanosi na szkiełka za pomocą wirówki Cytospin w celu barwienia metodą Giemsy.</li>
</ol>
Barwienie przeciwciałami i cytometria przepłyewowa
<ol start="28">
<li> Wirować komórki przy 200 x g przez 8 min w temperaturze 4°C i resuspendować w zimnym 50% normalnym surowicy mysiej w HBSS (bez Ca i Mg, bez czerwieni fenolowej).</li>
<li> Umieścić około 5 x 105 komórek w 80 μl na probówkę (probówki o dnie okrągłym 12 x 75 mm) i przechowywać w lodzie. Dodać mieszaninę przeciwciał (około 20 μl mieszaniny lub roztwór kontroli negatywnej dla kontroli bez przeciwciał) i wymieszać, lekko opukując probówki. Przygotować probówki do kontroli kalibracji bez przeciwciał lub z przeciwciałem anty-CD45 dla każdego fluorochromu. Umieścić probówki w lodzie w ciemności i inkubować przez 20 minut. Wymieszać, lekko opukując probówki po pierwszych 10 min. Po 20-minutowej inkubacji wypełnić probówki zimnym HBSS i wirować przy 200 x g przez 8 min w temperaturze 4°C. Resuspendować osad w zimnym 0,5% paraformaldehydzie/HBSS. 
Do analizy zazwyczaj stosuje się następujące mieszaniny przeciwciał. Dla różnicowania mieloidalnego: CD11b (klon ICRF44 sprzężony z fykoerytryną)/CD33 (klon WM53 sprzężony z allofikocyjaniną)/CD45 (klon HI30 sprzężony z fykoerytryną-Cy7). Dla różnicowania erytroidalnego: CD71 (klon M-A712 sprzężony z fykoerytryną)/CD235a (klon GA-R2 sprzężony z allofikocyjaniną)/CD45 (klon HI30 sprzężony z fykoerytryną-Cy7).</li>
<li> Cytometrię przepływową wykonuje się w High Speed Cell Sorter Core w Alvin J. Siteman Cancer Center w Washington University School of Medicine na cytometrze przepływowym FACScan zmodernizowanym do 5 kolorów i dwóch laserów (BD Biosciences), a analizy przeprowadza się przy użyciu oprogramowania CellQuest (BD Biosciences) lub FlowJO v7.2.4 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA).</li>
</ol>
Barwienie Giemsą
<ol start="31">
<li> Około 30 000 komórek odzyskanych z płytek do testu CFC opisanych powyżej zawiesza się w 0,3 ml 2% FBS/IMDM i przenosi na szkiełko za pomocą wirówki Cytospin przy 1 000 rpm przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li> Przygotowuje się dziewięć naczyń do barwienia zawierających roztwory w następującej kolejności.
<ol>
<li> Metanol bezwodny</li>
<li> Roztwór zasadniczy Wrighta/Giemsy</li>
<li> Bufor Wrighta/Giemsy, pH 6,4</li>
<li> 50% metanol w H2O</li>
<li> H2O</li>
<li> H2O</li>
<li> Bufor fosforanowy, pH 6,0</li>
<li> H2O</li>
<li> H2O</li>
</ol></li>
<li> Szkiełka umieszcza się w kasecie i zanurza w metanolu bezwodnym (#1) na 2 min, a następnie odsącza nadmiar metanolu.</li>
<li> Natychmiast zanurza się kasetę w roztworze zasadniczym Wrighta/Giemsy (#2) na 5 min.</li>
<li> Kasetę przenosi się do buforu Wrighta/Giemsy, pH 6,4 (#3) i inkubuje przez 10 min.</li>
<li> Kasetę zanurza się dwukrotnie w 50% metanolu (#4), 10 razy w H2O (#5), kolejne 10 razy w H2O (#6), a następnie 5 razy w buforze fosforanowym, pH 6,0 (#7).</li>
<li> Kasetę przenosi się do H2O (#8) i inkubuje przez 2 min. Płukanie w H2O (#9) powtarza się.</li>
<li> Pozostawia się szkiełka do całkowitego wyschnięcia na powietrzu w kasecie. Każde szkiełko wyjmuje się i przeciera jego stronę tylną chusteczkami Kimwipes nasączonymi metanolem, aby usunąć barwnik. Nakłada się kroplę Cytoseal 60 i nakłada szkiełko nakrywkowe w celu zabezpieczenia preparatu.</li>
<li> Dla każdego szkiełka zabarwionego metodą Giemsy wykonuje się różnicowe liczenie 500 komórek przy użyciu mikroskopu Olympus BX51. Komórki dzieli się na pięć kategorii: komórki prymitywne obejmują blasty i promielocyty; pośrednie komórki mieloidalne obejmują mielocyty i metamielocyty; dojrzałe komórki mieloidalne obejmują neutrofile pałeczkowate, neutrofile segmentowane, monocyty i makrofagi; pośrednie komórki erytroidalne obejmują komórki o pośrednim stopniu hemoglobinizacji; a dojrzałe komórki erytroidalne obejmują komórki z pełną hemoglobinizacją. Mikrofotografie wykonuje się za pomocą kamery Olympus DP71 z obiektywem olejowym 60x.</li>
</ol>

3.0) REPREZENTATYWNE WYNIKI:
<ol>
<li>Test CFC: Część początkowej populacji komórek będzie proliferować, różnicować się i tworzyć kolonie na podłożu półstałym podczas 14-17-dniowego okresu inkubacji. W tym eksperymencie ewidentne jest, że ekspresja onkogenu NUP98-HOXA9 spowodowała powstanie wyraźnych czerwonych kolonii (kolonie erytroidalne) (Rycina 1) (3).</li>
<li>Barwienie przeciwciałami i cytometria przepływowa: Immunofenotypowanie cytometryczne komórek zebranych z płytek testu CFC dostarcza informacji o stanie różnicowania populacji komórek. Dzięki połączonemu zastosowaniu przeciwciał przeciwko określonym markerom różnicowania można ocenić linię oraz stopień dojrzewania komórek. W tym przypadku do identyfikacji komórek erytroidalnych wykorzystano CD235a. Jak pokazano na Rycini 2A, NUP98-HOXA9 spowodował wzrost odsetka erytroidalnych komórek CD235a+, jednak intensywność ekspresji CD235a w tych komórkach była zmniejszona w porównaniu z kontrolą, co wskazuje na hamowanie dojrzewania erytroidalnego. Na Rycini 2B komórki mieloidalne zidentyfikowano na podstawie dodatniego wyniku dla CD33. NUP98-HOXA9 spowodował spadek liczby komórek CD33+ oraz spadek intensywności ekspresji CD11b, co jest zgodne z hamowaniem dojrzewania mieloidalnego (3). Zatem wyniki cytometrii przepływowej wykazują, że NUP98-HOXA9 spowodował hiperplazję erytroidalną z hamowaniem dojrzewania zarówno mieloidalnego, jak i erytroidalnego.</li>
<li>Barwienie Giemsą: Badanie morfologiczne komórek zebranych z płytek testu CFC dostarcza informacji o linii i stopniu dojrzewania populacji komórek. Wnioski uzyskane morfologicznie mogą różnić się od tych otrzymanych w badaniach cytometrycznych, dlatego metody te uzupełniają się wzajemnie (3). Eksperyment powtarza się co najmniej 3 razy, a za każdym razem wykonuje się różnicowe liczenie 500 komórek, aby wyróżnić 5 kategorii komórek opisanych powyżej. Przykłady tych komórek wskazano na Rycini 3. Wyniki są tabulowane i analizowane w celu ustalenia, czy istnieją statystycznie istotne różnice między próbką z transdukcją onkogenu a kontrolą. W tym przypadku wyniki wykazały, że NUP98-HOXA9 spowodował ogólny wzrost liczby komórek, z hiperplazją erytroidalną oraz hamowaniem dojrzewania erytroidalnego i mieloidalnego (3) (nie pokazano).</li>
</ol>
OPISY RYSUNKÓW
<img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig1.jpg" alt="Porównanie wzrostu kolonii komórkowych, kontrola vs. NUP98-HOXA9, eksperyment mikroskopowy, analiza hematopoetyczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Wpływ NUP98-HOXA9 na morfologię ludzkich CFC. 
Pierwotne ludzkie komórki CD34+ poddano transdukcji retrowirusowej za pomocą kontrolnego wektora MSCV-IRES-GFP lub wektora wykazującego ekspresję NUP98-HOXA9, a następnie wyizolowano komórki wykazujące pozytywność na GFP. Do każdej z dwóch powtórzonych płytek do testu CFC zasiano tysiąc komórek; eksperyment powtórzono 3-4 razy niezależnie. Przedstawiono reprezentatywne płytki bez powiększenia (lewa strona) oraz mikrofotografie reprezentatywnych kolonii erytroidalnych przy niskim powiększeniu (prawa strona) (3).

<img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig2.jpg" alt="Analiza cytometrii przepływowej; diagramy markerów CD45, CD235a, CD33, CD11b; porównanie populacji komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Cytometria przepływowa wykazuje zaburzenie różnicowania ludzkich pierwotnych komórek CD34+ przez NUP98-HOXA9. 
(A) Cytometria przepływowa dla różnicowania erytroidalnego: Komórki z płytek CFC (patrz Rysunek 1) zostały zebrane i znakowane przeciwciałami przeciwko CD45 oraz CD235a. Bramka CD235+ została przedstawiona na histogramie (panel prawy), aby wykazać ekspresję CD235a w stosunku do komórek kontrolnych (B) Cytometria przepływowa dla różnicowania mieloidalnego: Komórki z płytek CFC zostały zebrane i znakowane CD45 oraz CD33. Bramka CD33+ została przedstawiona na histogramie w celu wykazania ekspresji CD11b w porównaniu do kontroli (panel prawy). Przedstawiono procenty komórek znajdujących się w każdej bramce (3).
<img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig3.jpg" alt="Porównanie morfologii komórek, NUP98-HOXA9 vs. kontrola, obraz mikroskopowy, wskazujący ME, MM, IM, IE." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Morfologia komórek wykazuje zaburzenie różnicowania przez NUP98-HOXA9 w porównaniu z kontrolą wektorową. 
Preparaty z rozmazów cytospin przygotowano z płytek CFC i zabarwiono giemsą. Mikrofotografie wykonano z reprezentatywnych pól przy użyciu obiektywu olejowego 60x. B: blast; MM: dojrzałe mieloidalne, IM: pośrednie mieloidalne, ME: dojrzałe erytroidalne, IE: pośrednie erytroidalne (3).

<ol><li>Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98-HOXA9+induces+long-term+proliferation+and+blocks+differentiation+of+primary+human+CD34%2B+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells.</a> Cancer Res. , 66-6628 (2006).</li>
<li>Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+NUP98-DDX10+oncogene+on+primary+human+CD34%2B+cells%3A+role+of+a+conserved+helicase+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif.</a> Leukemia. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+transformation+of+primary+human+hematopoietic+cells+by+the+oncogene+NUP98-HOXA9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9.</a> PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).</li>
<li>Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hematopoietic+colonies+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Haematol%22%5BJournal%5D)">Human hematopoietic colonies in health and disease.</a> Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).</li>
<li>Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+colony-forming+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic colony-forming cell assays.</a> Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).</li>
<li>Coulombel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%3A+strength+and+drawbacks+of+functional+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays.</a> Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).</li>
<li>Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection%2C+maintenance%2C+and+differentiation+of+primitive+human+hematopoietic+cells+in+cultures+containing+murine+fibroblasts+engineered+to+produce+human+steel+factor%2C+interleukin-3%2C+and+granulocyte+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor.</a> Blood. 88, 3765-3773 (1996).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Analiza CFC była szeroko stosowana do określania wzorców proliferacji i różnicowania progenitorów krwiotwórczych oraz do badania wpływu onkogenów (4, 5). Posiada ona przewagę nad kulturami w cieczy dzięki temu, że jest analizą klonalną, co oznacza, że kolonie reprezentują potomstwo pojedynczego progenitora i mogą być indywidualnie usuwane do dalszych analiz. Ograniczeniem analizy CFC jest to, że nie nadaje się ona do wykrywania bardziej niedojrzałych progenitorów lub komórek macierzystych krwiotwórczych; takie komórki wy...

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>06150</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna (PS)</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Ligand FLT-3</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>IL3</td><td>PeproTech Inc</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>PeproTech Inc</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>Siarczyn albuminy wołowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Retronektyna</td><td>Takara Bio Inc</td><td>T100A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanu (0,4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Methocult GF+ H4435</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>04445</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie medium wzbogacone metylocelulozą</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>HSC005</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik Wrighta/Giemsy</td><td>Harleco</td><td>64571</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforu fosforanowego, pH 6,4 – formuła Giordano</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>1450</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>8310</td><td></td></tr><tr><td>Normalne surowica mysia</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>D208</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw ludzkie CD11b sprzężone z fiko&amp;#8211;erytryną</td><td>BD Biosciences</td><td>555388</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw ludzkie CD33 sprzężone z allofikocyjaniną</td><td>BD Biosciences</td><td>551378</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw ludzkie CD45 sprzężone z fiko&amp;#8211;erytryną-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw ludzkie CD71 sprzężone z fiko&amp;#8211;erytryną</td><td>BD Biosciences</td><td>555537</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw ludzkie CD235a sprzężone z allofikocyjaniną</td><td>BD Biosciences</td><td>551336</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw ludzkie CD45 sprzężone z fiko&amp;#8211;erytryną-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe nieprzetraktowane płytki do hodowli tkankowej</td><td>BD Biosciences</td><td>35-1147</td><td></td></tr><tr><td>Nieprzetraktowana szalka 30 mm</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27150</td><td></td></tr><tr><td>Szalka do hodowli tkankowej 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Siatkowane szalki do oceny</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27500</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>35-2097</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>35-2070</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 3 ml</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>Tępa igła 16G, dł. 1&amp;frac12; cala</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>28110</td><td></td></tr><tr><td>Filtr do komórek CellTrics 50 &amp;mu;m</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>Komory na próbki TPX</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>A78710018</td><td></td></tr><tr><td>Przedczyszczone szkiełka przedmiotowe Fisherbrand Superfrost/Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Karty filtracyjne Shandon</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>5991022</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do szkiełek cytospin Shandon</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>59920063</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny zestaw do barwienia Shandon 100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>100</td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny 1 &amp;mu;m</td><td>VWR international</td><td>28307-134</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon Instruments</td><td>Diaphot</td><td></td></tr><tr><td>Kamera do mikroskopu</td><td>Nikon Instruments</td><td>DS-F11</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Kamera do mikroskopu</td><td>Olympus Corporation</td><td>DP71</td><td></td></tr><tr><td>Skaner</td><td>Microtek</td><td>Scanmaker 4</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli tkankowej</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin</td><td>Shandon, Inc.</td><td>Cytospin 2</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka laboratoryjna</td><td>Eppendorf</td><td>5810-R</td><td></td></tr><tr><td>System oczyszczania wody</td><td>Barnstead</td><td>Nanopure-Diamond</td><td></td></tr></tbody></table>

test tworzenia kolonii (cfc) dla ludzkich komórek krwiotwórczych

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Ludzkie hematopoetyczne komórki macierzyste/progenitorowe są zazwyczaj pozyskiwane z szpiku kostnego, krwi pępowinowej lub krwi obwodowej i są wykorzystywane do badania hemopoezy oraz leukemogenezy. Posiadają one zdolność do różnicowania się w linie limfoidalne i mieloidalne. Test tworzenia kolonii (CFC) jest stosowany do badania wzorców proliferacji i różnicowania progenitorów hematopoetycznych na podstawie ich zdolności do tworzenia kolonii w medium półstałym. Liczba i morfologia kolonii utworzonych przez określoną liczbę komórek wejściowych dostarczają wstępnych informacji o zdolności progenitorów do różnicowania się i proliferacji. Komórki mogą być zbierane z pojedynczych kolonii lub z całej płytki w celu dalszej oceny ich liczebności i stanów różnicowania za pomocą cytometrii przepływowej oraz oceny morfologicznej preparatów barwionych metodą Giemsy. Test ten jest użyteczny do oceny różnicowania mieloidalnego, ale nie limfoidalnego. Termin mieloidalny w tym kontekście jest używany w szerszym znaczeniu, obejmując linie granulocytową, monocytową, erytroidalną i megakariocytową.

Wykorzystaliśmy ten test do oceny wpływu onkogenów na różnicowanie pierwotnych ludzkich komórek CD34+ pochodzących z krwi obwodowej. W tym celu komórki są transdukowane kontrolną konstrukcją retrowirusową lub konstrukcją wykazującą badany onkogen, w tym przypadku NUP98-HOXA9. Stosujemy powszechnie używany wektor retrowirusowy MSCV-IRES-GFP, który wykazuje bicistroniczny mRNA produkujący badany gen oraz marker GFP. Komórki są wstępnie aktywowane poprzez hodowlę w obecności cytokin przez dwa dni przed transdukcją retrowirusową. Po kolejnych dwóch dniach komórki GFP+ są izolowane za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS), mieszane z półpłynnym medium zawierającym metylocelulozę, uzupełnionym o cytokiny, i inkubowane do czasu pojawienia się kolonii na powierzchni, zazwyczaj przez 14 dni. Dokumentowana jest liczba i morfologia kolonii. Następnie komórki są usuwane z płytek, przemywane, liczone i poddawane cytometrii przepływowej oraz badaniu morfologicznemu. Cytometria przepływowa z użyciem przeciwciał specyficznych dla markerów powierzchni komórkowych ekspresowanych podczas hematopoezy dostarcza informacji o linii komórkowej i stopniu dojrzałości. Badania morfologiczne poszczególnych komórek pod mikroskopem po barwieniu metodą Wrighta-Giemsy dostarczają dodatkowych informacji w zakresie linii i dojrzewania. Porównanie komórek transdukowanych kontrolnym pustym wektorem z komórkami transdukowanymi onkogenem pozwala ujawnić wpływ onkogenu na różnicowanie hematopoetyczne.

Test tworzenia kolonii (CFC) to badanie in vitro, w którym komórki progenitorowe krwiotwórcze tworzą kolonie w podłożu półstałym. Do oceny zdolności progenitorów do proliferacji i różnicowania się wzdłuż różnych linii krwiotwórczych wykorzystuje się kombinację analizy morfologii kolonii, morfologii komórek oraz cytometrii przepływowej.

Test tworzenia kolonii (CFC) dla ludzkich komórek krwiotwórczych

Ludzkie hematopoetyczne komórki macierzyste/progenitorowe pozyskuje się zazwyczaj z szpiku kostnego, krwi pępowinowej lub krwi obwodowej i wykorzystuje do badania hematopoezy oraz ...

Procedura ta pozwala ocenić w podłożu półstałym zdolność progenitorów krwiotwórczych do proliferacji i różnicowania w kierunku różnych linii krwiotwórczych w celu rozpoczęcia hodowli. Świeżo rozmrożone komórki CD 34 dodatnie inkubuje się w obecności cytokin w celu promowania aktywacji przez dwa dni. Następnie przeprowadza się transdukcję retrowirusową konstruktu testowego wykazującego ekspresję GFP poprzez dodanie aktywowanych komórek CD 34 dodatnich do płytki uprzednio załadowanej wirusem.Po 48 godzinach należy wyizolować komórki GFP-dodatnie metodą FACS, a następnie wysiać je w półpłynnym medium metylocelulozowym uzupełnionym o czynniki wzrostu i inkubować przez około dwa tygodnie, aż na powierzchni pojawią się kolonie. Na koniec należy zebrać kolonie, unieruchomić komórki na szkiełkach za pomocą cytozyny i zabarwić metodą Wright-Giemsy w celu mikroskopowego określenia linii hematopoetycznej i stopnia dojrzałości. Metoda ta może dostarczyć wglądu w mechanizmy podczas badań nad leukemogenezą, a w szczególności w wpływ onkogenów na różnicowanie hematopoetyczne.Aby przygotować kulturę, należy szybko rozmrozić fiolkę z zamrożonymi komórkami CD 34 pozytywnymi w temperaturze 37 °C, del

colony-forming-cell-cfc-assay-for-human-hematopoietic-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Test komórki tworzącej kolonie (CFC) dla ludzkich komórek krwiotwórczych

Endotelialne komórki progenitorowe tworzące kolonie (ECFCs) stanowią obiecujące narzędzie do badania homeostazy i regeneracji naczyń krwionośnych.1,2 Niniejsza praca przedstawia nową metodę izolacji i ekspansji ECFC z heparynowanej krwi obwodowej dorosłego człowieka bez użycia surowicy zwierzęcej, z wykorzystaniem puli lizatu płytek krwi człowieka (pHPL), co zmniejsza ryzyko immunizacji przeciwko białkom bydlęcym.

Izolacja i wielkoskalowa ekspansja dorosłych ludzkich endotelialnych komórek progenitorowych zdolnych do tworzenia kolonii

Komórki endotelialne tworzące kolonie (ECFCs) to krążące komórki endotelialne o silnym potencjale proliferacyjnym klonalnym, które wykazują wrodzone in vivo zdolność do tworzenia naczyń. Fenotypowa i funkcjonalna charakterystyka komórek śródbłonka wyhodowanych z krwi pępowinowej jest istotna dla ich identyfikacji i izolacji bona fide ECFCy do potencjalnych zastosowań klinicznych w naprawie uszkodzonych tkanek.

Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna komórek endotelialnych tworzących kolonie pochodzących z krwi pępowinowej człowieka

Ten film opisuje protokół dla jednostki tworzenia kolonii na bazie metylocelulozy lub testu CFU, który pomaga zidentyfikować i policzyć liczbę kolonii utworzonych przez komórki białaczkowe w odpowiedzi na leczenie związkami przeciwnowotworowymi.

Test CFU na bazie metylocelulozy: metoda określania wpływu związków przeciwnowotworowych na tworzenie kolonii w komórkach białaczkowych

Ten protokół opisuje efektywną indukcję hemogennego śródbłonka i wielopotencjalnych hematopoetycznych komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Bezpośrednia indukcja hemogennego śródbłonka i krwi przez nadekspresję czynników transkrypcyjnych w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), używane do różnicowania hPSC na hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+. Metoda ta wykorzystuje specyficzną dla etapu manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT w celu określenia komórek wyłącznie do ostatecznego lub pierwotnego programu krwiotwórczego.

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy protokoły genetycznej i chemicznej walidacji c-Fos i Dusp1 jako celu terapeutycznego w białaczce, używając genetycznych i humanizowanych modeli mysich in vitro i in vivo. Metodę tę można zastosować do dowolnego celu walidacji genetycznej i rozwoju terapeutycznego.

Metody oceny roli c-fos i dusp1 w zależności onkogenu

Tutaj prezentujemy protokół precyzyjnego tworzenia hemogennego śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w stanie wolnym od karmów i kseno. Metoda ta będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

Tutaj opisujemy wiarygodną metodę pomiaru masy mitochondriów i potencjału błonowego w hodowanych ex vivo hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T.

Pomiar masy mitochondrialnej i potencjału błonowego w hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T metodą cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy nowatorską metodę cytometrii przepływowej do prospektywnej izolacji wczesnych prekursorów erytroidalnych (BFU-e) i erytroidalnych tworzących kolonie (CFU-e) bezpośrednio ze świeżego szpiku kostnego i śledziony myszy. Protokół ten, opracowany na podstawie danych transkryptomicznych pojedynczych komórek, jest pierwszym, który izoluje wszystkie erytroidalne komórki progenitorowe tkanki o wysokiej czystości.

Identyfikacja i izolacja progenitorów erytroidalnych jednostek tworzących pęknięcia i kolonii z tkanki myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Ten protokół opisuje procedurę indukowania różnicowania ludzkich komórek macierzystych i prądkotworzycznych krwiotwórczych pochodzących z szpiku kostnego pacjenta i komórek jednojądrzasty składnik krwi obwodowej. Test wykorzystuje półsztywne medium kulturowe wspierające zobowiązanie do linii erytrocytarnej i mieloidalnej oraz zawiera standaryzowane metryki umożliwiające reprodukowalną klasyfikację kolonii w celu charakteryzacji przedklinicznego leku.

Test jednostek formujących kolonie przystosowany dla pochodzących od pacjenta komórek rdzenia kostnego i obwodowej krwi jednojądrzastej

Poznaj test CFC dla ludzkich komórek krwiotwórczych CD34+ w hematopoiezie. Ta metoda ocenia proliferację i różnicowanie progenitorów w półstałym podłożu metylocelulozowym, umożliwiając badanie wpływu onkogenów na leukemogenezę.

Test tworzenia kolonii (CFC) dla ludzkich komórek krwiotwórczych

Przeglądaj więcej filmów