Test komórek tworzących kolonię (CFC) dla ludzkich komórek krwiotwórczych

Test komórek tworzących kolonie (CFC) to test in vitro, w którym hematopoetyczne komórki progenitorowe tworzą kolonie w półstałym podłożu. Połączenie morfologii kolonii, morfologii komórek i cytometrii przepływowej służy do oceny zdolności przodków do proliferacji i różnicowania wzdłuż różnych linii krwiotwórczych.

Procedura ta ocenia w pożywce półstałej zdolność komórek progenitorowych hematopoetycznych do namnażania się i różnicowania wzdłuż różnych linii krwiotwórczych w celu rozpoczęcia hodowli. Świeżo rozmrożone komórki CD 34-dodatnie w obecności cytokin w celu promowania aktywacji po dwóch dniach. Przeprowadzić transdukcję retrowirusową konstruktu testowego wykazującego ekspresję GFP, dodając aktywowane komórki dodatnie CD 34 do płytki wstępnie załadowanej wirusem.

48 godzin później wyizoluj komórki GFP dodatnie faksem, a następnie umieść te komórki w półstałym podłożu metylocelulozowym uzupełnionym czynnikami wzrostu, inkubuj przez około dwa tygodnie, aż kolonie pojawią się na powierzchni. Na koniec zbierz kolonie, unieruchamij komórki na szkiełkach za pomocą cytozyny i wybarwij odpowiednią gizą w celu mikroskopowego określenia linii krwiotwórczej i etapu dojrzewania. Metoda ta może dostarczyć mechanistycznego wglądu w badania białaczkowezy, a mianowicie wpływu onkogenów na różnicowanie układu krwiotwórczego.

Aby zobaczyć hodowlę, szybko rozmrozić fiolkę z zamrożonymi komórkami CD 34 dodatnimi w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie potrząsając, aż pozostanie ostatni mały kryształek lodu i przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Delikatnie spłucz pozostałe komórki z fiolki jednym mililitrem pożywki o temperaturze pokojowej, 2% F-B-S-I-M-D-M i dodaj kroplami do 50-mililitrowej probówki, delikatnie obracając. Teraz poczekaj trzy minuty.

Kontynuuj, powoli dodając dwa mililitry pożywki, delikatnie mieszając i ponownie równoważ przez trzy minuty. Powtórzyć tę procedurę dodawania pożywki o równej objętości do rozcieńczonej zawiesiny komórek w trzyminutowych odstępach, delikatnie wirując między dodaniami, aż ostateczna objętość osiągnie 32 mililitry, aby zebrać komórki, odwirować w temperaturze 250 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernat, pozostawiając około 0,5 mililitra pożywki nad osadem. Przystąp do jednokrotnego mycia komórek, zawieszając osad w 20 mililitrach pożywki i wirując w temperaturze 200 G przez osiem minut W temperaturze pokojowej usuń rozsądek i zawieś komórki w pełnym podłożu IMDM na około pół miliona komórek na mililitr.

Na koniec, aby określić stężenie komórek, weź 10 mikrolitrów zawiesiny do mikroprobówki zmieszanej z tą samą objętością 0,4% roztworu błękitu trianowego i policz. Za pomocą hemocytometru rozcieńczyć komórki do 10 do piątych komórek na mililitr, dodając kompletną pożywkę IMDM uzupełnioną mieszanką kultur cytokin aktywujących, komórki w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez dwa dni w dniu transdukcji liczą komórki przed rozpoczęciem wstępnego ładowania wirusa w celu określenia liczby studzienek, które należy przygotować w celu przygotowania 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej bez zabiegu. Dodaj 400 mikrolitrów po 25 mikrogramów na mililitr, retro roztwór aktyny do każdej studzienki i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w okapie bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym.

Usuń roztwór retro aktyny i zakoduj każdą studzienkę za pomocą 2% BSA, inkubując przez 30 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie rozmrozić roztwory podstawowe wirusa i przechowywać na lodzie. Następnie odessać wirusa w roztworze BSA, dodając 0,5 mililitra preparatu wirusowego do każdej studzienki i odwirować w temperaturze 2,200 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.

Usuń roztwór wirusa ze studzienek i powtórz ładowanie wirusa jeszcze trzy razy. Na koniec spłucz każdą studzienkę zimnym medium IMDM. Teraz zbierz wstępnie aktywowane komórki dodatnie CD 34 przez odwirowanie i ponownie zawieś komórki w świeżej, kompletnej pożywce IMDM uzupełnionej cytokinami o podwielokrotności 0,15 miliona komórek dodatnich CD 34 do każdej z zakodowanych przez wirusa studzienek, studzienek i inkubuj w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez dwa dni, aby delikatnie, ale dokładnie zebrać transdukowane komórki.

Zawiesić komórki na pływających płytkach wirusa i przefiltrować zawiesinę przez filtr komórkowy o średnicy 50 mikronów do stożkowej rurki. Weź 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do mikroprobówki. Wymieszać z równą objętością roztworu błękitu trianowego i policzyć komórki za pomocą cytometru hemologicznego.

Przepłukać każdą studzienkę 0,8 mililitra zimnego HBSS z 0,02% EDTA i dodać do tej samej probówki zbiorczej przez 50-mikronowy filtr komórkowy CEL Trix. Osadzać komórki przez odwirowanie i raz przemyć zimnym HBSS. Ponownie zawiesić końcową osadę komórkową w HBSS z 1% BA i utrzymać komórki na lodzie w ciemności w celu późniejszego sortowania komórek, które zwykle odbywa się w rdzeniu sortownika komórek o dużej prędkości w oparciu o projekt eksperymentalny.

Rozmrozić wymaganą liczbę podwielokrotności pożywki do oznaczania CFC energicznie wirować w celu wymieszania i odstawić probówkę na co najmniej pięć minut, aby pęcherzyki mogły wypłynąć na powierzchnię przed dodaniem komórek. Teraz weź 3000 posortowanych komórek transdukowanych wirusem do sterylnej mikroprobówki zawierającej zimne podłoże 2% F-B-S-I-M-D-M i dostosuj końcową objętość zawiesiny do 0,3 mililitra. Zawieś komórki i przenieś całą zawiesinę komórkową do trzymililitrowej podwielokrotności pożywki wzrostu kultu metylowego.

Stwórz jednorodną zawiesinę komórkową poprzez energiczne wirowanie. Pozostaw rurkę nieruchomo na trzy minuty. Aby pokryć komórki, przymocuj igłę z końcem o rozmiarze 16 do trzymililitrowej strzykawki i pobierz 2,2 mililitra.

Uważając, aby uniknąć wchłaniania dużych pęcherzyków, wypchnij po 1,1 mililitra do dwóch 30-milimetrowych niepoddanych działaniu naczyń do hodowli tkankowych i równomiernie rozprowadź mieszaninę, obracając zduplikowane płytki na 100-milimetrowej płytce wraz z naczyniem na wodę. Kontynuacja trzech litrów sterylnej hodowli wodnej przez dwa tygodnie. Scharakteryzuj i oceń kolonie zgodnie z ich morfologią za pomocą odwróconego mikroskopu przy 40-krotnym powiększeniu w naczyniu hodowlanym oznaczonym siatką punktacji.

W celu udokumentowania wyników hodowli należy zeskanować całą płytkę testową CFC za pomocą zwykłego skanera o rozdzielczości 600 DPI i wykonać mikrofotografie o małej mocy reprezentatywnych kolonii za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w kolorową kamerę w celu dalszej analizy komórek różnicowania i proliferacji z całej płytki testowej CFC, które są odzyskiwane przez zawieszenie w kilku objętościach temperatury pokojowej 2% F-B-S-I-M-D-M umyte i policzone do analiz morfologicznych. Przenieś 30 000 komórek, które zostały odzyskane z płytek testowych CFC, na szkiełko. Za pomocą wirówki STO wysusz szkiełka na powietrzu przez noc, aby skutecznie zabarwić szkiełka.

Skonfiguruj linię montażową składającą się z dziewięciu naczyń barwiących zawierających roztwory w następującej kolejności. Absolutny metanol prawy roztwór podstawowy gemsa prawy bufor gemsa, 50% metanol i woda, dwa naczynia z buforem fosforanowym wody pH sześć i wreszcie dwa naczynia wody. Umieść szkiełka w nośniku szkiełka i zanurz w absolutnym metanolu na dwie minuty i usuń nadmiar metanolu z krwi.

Natychmiast zanurz nośnik szkiełka i napisz roztwór podstawowy gemsa na pięć minut. Przenieś nośnik do odpowiedniego buforu gemsa o pH 6,4 i inkubuj przez 10 minut. Zanurz nośnik dwukrotnie w 50% metanolu, 10 razy w wodzie i kolejne 10 razy w następnym naczyniu wodnym, a następnie pięć razy w buforze fosforanowym.

Odczyn pH 6,0. Przenieś nośnik do wody i inkubuj przez dwie minuty. Powtórz mycie w ostatnim naczyniu na wodę.

Teraz pozwól szkiełkom całkowicie wyschnąć na powietrzu w nosidełku. Wyjmij każde szkiełko i przetrzyj tylną część szkiełka chusteczkami Kim nasączonymi metanolem, aby usunąć plamy. Umieść kroplę cyto seal 60 i szklankę nakrywkową do uszczelnienia.

Wykonaj różnicową liczbę 500 komórek dla każdego trwałego szkiełka GM za pomocą mikroskopu. Na potrzeby tego eksperymentu komórki dzieli się na pięć kategorii: komórki pierwotne, pośrednie komórki szpikowe, dojrzałe komórki szpikowe, pośrednie komórki erytroidalne i dojrzałe komórki erytroidalne. Na przykład, w porównaniu z kontrolną ekspresją nowych 98 jastrzębi, dziewięcioonkogen zwiększył tworzenie czerwonych kolonii erytroidalnych.

Ten wpływ onkogenu na rynek jest wyraźnie widoczny, gdy kolonie są obserwowane w małym powiększeniu. Dalsze badanie morfologiczne za pomocą GEM sustaining dostarcza informacji na temat linii i stopnia dojrzałości populacji komórek. W tym przykładzie wprowadzenie nowych 98 jastrzębi, dziewięć spowodowało ogólny wzrost liczby komórek z przerostem erytroidalnym i zahamowało hamowanie dojrzewania zarówno erytroidalnego, jak i szpikowego.

Ten SA zapewnia wgląd w różnicowanie komórek krwiotwórczych poprzez pomiar zdolności preparatu komórki wejściowej do namnażania, różnicowania i tworzenia kolonii w pożywce półstałej.