Name: Określanie liczby komórek podczas hodowli komórek za pomocą licznika komórek z berła (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-26T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj automatyczne liczenie komórek w hodowli przy użyciu licznika Scepter. To przenośne urządzenie zapewnia dokładność, łatwość obsługi i analizę histogramów dla lepszej reprodukowalności eksperymentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Znaczenie liczenia komórek
<ol>
<li>Liczenie komórek jest niezbędnym, lecz żmudnym etapem hodowli komórkowych in vitro.</li>
<li>Stałe stężenia komórek zapewniają powtarzalność i dokładność eksperymentów.</li>
<li>Liczenie komórek jest istotne dla monitorowania stanu zdrowia i tempa proliferacji komórek, oceny uniesmiertelnienia lub transformacji, wysiewu komórek do kolejnych eksperymentów, transfekcji lub infekcji, a także przygotowania do testów opartych na komórkach.</li>
<li>Mimo zapotrzebowania na szybkość i dokładność w liczeniu komórek, 71% z 400 ankietowanych badaczy liczy komórki przy użyciu hemocytometru. Choć hemocytometria jest tania, jest pracochłonna i podatna na błędy oraz niewłaściwe użytkowanie, co skutkuje niedokładnymi wynikami.</li>
<li>Źródła błędów w hemocytometrii obejmują: nierównomierny rozkład komórek w próbce, zbyt dużą lub zbyt małą liczbę komórek w próbce, subiektywne decyzje dotyczące tego, czy dana komórka znajduje się w zdefiniowanym obszarze liczenia, zanieczyszczenie hemocytometru, różnice między użytkownikami oraz zmienność szybkości napełniania hemocytometru.</li>
<li>Aby zmniejszyć żmudność związaną z ręcznym liczeniem, 29% badaczy wykorzystuje automatyczne urządzenia do liczenia komórek. Jednak dla większości badaczy ceną tych dużych instrumentów laboratoryjnych jest bariera uniemożliwiająca ich zastosowanie.</li>
<li>Licznik komórek Scepter to automatyczne urządzenie ręczne, które oferuje automatyzację i dokładność liczenia metodą Coultera przy stosunkowo niskim koszcie.</li>
<li>System wykorzystuje zasadę Coultera opartą na detekcji cząstek za pomocą impedancji w zminiaturyzowanym formacie, stosując kombinację analogowego i cyfrowego sprzętu do detekcji, przetwarzania sygnałów, przechowywania danych i wyświetlania graficznego.</li>
<li>Jednorazowy sensor został zaprojektowany z mikrofabrykowaną strefą detekcji komórek, która umożliwia rozróżnianie komórek ze względu na ich rozmiar i objętość z rozdzielczością poniżej mikrona i pikolitra.</li>
<li>Dzięki precyzyjnym kanałom do obsługi cieczy i zaawansowanej elektronice, licznik komórek Scepter graficznie prezentuje statystyki populacji komórek w formie histogramu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek do liczenia
<ol>
<li>Aby skorzystać z licznika komórek Scepter, należy rozpocząć od rozcieńczenia zawiesiny pojedynczych komórek w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Optymalne stężenie wynosi od 10,000 do 500,000 komórek na mL.</li>
<li>Przenieś 100 μL rozcieńczonych komórek do probówki do mikrowirówki o pojemności 1.5 mL.</li>
</ol>
3. Wykonywanie zliczeń komórek przy użyciu Scepter
<ol>
<li>Włącz licznik komórek Scepter, naciskając i przytrzymując przełącznik z tyłu urządzenia, a następnie poczekaj na pojawienie się instrukcji na ekranie.</li>
<li>Po wyświetleniu prośby podłącz sensor do końca jednostki Scepter tak, aby panel elektrod pomiarowych był skierowany w stronę przedniej części urządzenia.</li>
<li>Sensory Scepter składają się z precyzyjnie uformowanej komory próbkowania z elektroniczną strefą pomiarową i zintegrowanymi elektrodami do wykrywania komórek. Sensory te umożliwiają rozróżnianie wielkości komórek z rozdzielczością submikronową oraz objętości komórek z rozdzielczością subpikolitrową.</li>
<li>Jednolita konstrukcja sensorów zapewnia przeliczanie równych objętości próbek oraz dokładność pomiarów wielkości.</li>
<li>Po podłączeniu sensora wykonaj każdy krok procesu liczenia zgodnie z instrukcjami na ekranie w następujący sposób:</li>
<li>Gdy na ekranie pojawi się komunikat „Hold down the plunger to begin” (Naciśnij tłok, aby rozpocząć), naciśnij tłok. Na ekranie pojawi się wówczas komunikat „submerge the sensor” (zanurz sensor). Zanurz sensor w roztworze zawiesiny komórkowej i zwolnij tłok, aby zassać zawiesinę komórek do sensora.</li>
<li>Tłok działa jako sygnał elektryczny i wciągnie próbkę wraz z objętością martwą do sensora. Prędkość lub precyzja naciskania tłoka nie mają znaczenia, w przeciwieństwie do pipetowania. Proces ten potrwa kilka sekund. Po zakończeniu instrument wyemituje sygnał dźwiękowy, a na ekranie pojawi się napis „Sample loaded” (Próbka załadowana).</li>
<li>Po załadowaniu próbki do sensora jest ona przeciągana przez strefę pomiarową w celu oceny wielkości i objętości komórek, a następnie przez mikrokanały. Po przeliczeniu 50 μL próbki sensor przesyła do urządzenia sygnał o zakończeniu liczenia.</li>
<li>Po zakończeniu liczenia na ekranie urządzenia pojawi się komunikat „Count Complete. Please remove sensor and discard” (Liczenie zakończone. Proszę wyjąć i wyrzucić sensor). Postępuj zgodnie z instrukcją: wyjmij i wyrzuć sensor.</li>
<li>Następnie urządzenie wyświetli na ekranie histogram wielkości lub średnicy komórek oraz stężenie komórek na mL.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
<li>Po zakończeniu pomiaru i wyświetleniu histogramu na urządzeniu, należy ustawić bramki (gates), naciskając przycisk przełącznika. Wybierz opcję „auto gating”, aby automatycznie ustawić bramkę na podstawie profilu histogramu, lub „use last”, aby użyć bramek z poprzedniego pomiaru.</li>
<li>Niezależnie od wyboru, bramki można przesuwać ręcznie w celu precyzyjnego dostrojenia danych. Ponownie naciśnij przycisk przełącznika, aby zaznaczyć lewą bramkę, a następnie przesuń przełącznik, aby ustawić ją w pożądanym miejscu.</li>
<li>Następnie ponownie naciśnij przełącznik, aby aktywować prawą bramkę i przesuń go, by ją ustawić. Kliknij ponownie; wyświetlone zostanie nowe stężenie komórek, średnia objętość oraz średnica komórek.</li>
<li>Przełącznikiem można również sterować w obie strony, aby przełączać widok między datą, godziną, średnią wielkością a średnią objętością komórek.</li>
<li>W pamięci urządzenia można zapisać do 72 histogramów. Aby przesłać dane na komputer osobisty, podłącz urządzenie za pomocą kabla USB do portu znajdującego się przy ekranie wyświetlacza.</li>
<li>Na komputerze dwukrotnie kliknij aplikację Scepter Software, aby uruchomić oprogramowanie, a następnie kliknij „connect”. Wszystkie wyniki pomiarów zostaną automatycznie przesłane do programu.</li>
<li>Oprogramowanie Scepter Application wyświetla histogram szczegółowo przedstawiający rozkład populacji hodowli w odniesieniu do objętości lub średnicy. Pobrane pliki można następnie wyeksportować do programu Microsoft Excel, w którym surowe dane zostaną wyświetlone w przedziałach (bins) dla określonych średnic lub objętości komórek.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
<ol>
<li>Przygotowano dziewiętnaście różnych linii komórkowych do liczenia, a teoretyczne stężenia początkowe określono za pomocą licznika Coulter. Następnie zawiesiny te poddano dalszemu rozcieńczeniu, aby uzyskać zawiesiny o teoretycznych stężeniach komórek.</li>
<li>Do wyznaczenia stężeń komórek wykorzystano licznik komórek Scepter. Rysunek 1 przedstawia 5 rozcieńczeń zmierzonych dla 5 reprezentatywnych linii komórkowych wraz z teoretycznym stężeniem komórek.</li>
<li>Wysoki stopień liniowości, wskazany przez wartości R2, dowodzi, że liczenie systemem Scepter jest niezawodną metodą dla przetestowanych linii komórkowych w szerokim liniowym zakresie pracy.</li>
<li>Ogólną względną dokładność liczenia systemem Scepter przedstawiono na Rysunku 2, na którym dane uzyskane z licznika Scepter porównano z wynikami uzyskanymi za pomocą licznika Coulter.</li>
<li>Wykreślono logarytm liczby komórek z systemu Scepter względem logarytmu liczby komórek z licznika Coulter, co wykazuje, że dla wszystkich badanych linii komórkowych wyniki z Scepter są zgodne z wynikami z licznika Coulter.</li>
<li>Liczenie 19 linii komórkowych przeprowadzono z użyciem licznika Coulter Z2, licznika komórek Scepter, zautomatyzowanego licznika opartego na analizie obrazu, takiego jak system Vi-Cell lub Countless, oraz hemocytometru.</li>
<li>Liczenie przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta, używając tej samej początkowej zawiesiny komórkowej i identycznych rozcieńczeń. Wyniki przedstawione na Rysunku 3 wykazują, że stężenia komórek zmierzone za pomocą Scepter ściśle odpowiadają teoretycznym stężeniom komórek przy zachowaniu wysokiej liniowości.</li>
<li>Współczynnik zmienności w procentach, czyli CV, obliczono dla każdego rozcieńczenia każdej linii komórkowej dla każdego systemu liczenia. Rysunek 4 przedstawia średnie wartości %CV dla 19 linii komórkowych w zależności od stężenia komórek i metody liczenia.</li>
<li>W zakresie pracy licznik komórek Scepter jest bardziej precyzyjny niż liczenie hemocytometrem opartym na analizie obrazu, wykazując mniejsze odchylenia standardowe i mniejsze średnie współczynniki zmienności.</li>
<li>Liczenie systemem Scepter jest dziesięciokrotnie szybsze niż hemocytometria i szybsze również niż inne automatyczne liczniki. Na Rysunku 5 przedstawiono liczenie komórek SF9, MCF7 i HEK293 metodami opisanymi w tym filmie.</li>
<li>Zarejestrowano średni czas potrzebny na pomiar stężenia komórek. Należy zauważyć, że hemocytometria była wykonywana tylko raz na próbkę.</li>
<li>Scepter wykonuje pomiary w oparciu o rozmiar komórek. W związku z tym wszelkie zmiany w morfologii komórkowej mogą zostać uchwycone na histogramie. Zdrowe kultury wykazują prawidłowy, dzwonowaty rozkład Gaussa, podczas gdy komórki niezdrowe ulegają lizie, co powoduje przesunięcie histogramu w lewo (Rysunek 6, panel lewy).</li>
<li>Podobnie, gdy populację składającą się w 50% z martwych komórek zmieszano z 50% żywych komórek, zaobserwowano również przesunięcia histogramu (Rysunek 6, panel prawy).</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig1.jpg" alt="Wykres liczby komórek w funkcji stężenia teoretycznego; regresja liniowa; dane dla K562, U266, HeLa, SC, SF9." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 1">
<img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig2.jpg" alt="Wykres rozrzutu porównujący stężenie komórek zmierzone za pomocą Scepter i Coulter Z2; analiza ilościowa komórek." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 2">
<img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig3.jpg" alt="Wykres liczenia komórek porównujący licznik Coulter, hemocytometr i cytometr Scepter; przedstawiono słupki błędów." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 3">
<img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig4.jpg" alt="Wykres zmienności stężenia komórek: przedstawia dane z licznika Coultera, cytometru Scepter oraz hemocytometru." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 4">
<img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig5.jpg" alt="Porównanie czasu liczenia komórek, wykres słupkowy, Scepter, cytometr przepływowy, Coulter, automatyczny, hemocytometr." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 5">
<img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig6.jpg" alt="Porównanie średnicy hodowli komórkowych, analiza wykresu dla komórek 3T3 prawidłowych, zaniedbanych oraz z 50% udziałem komórek martwych/żywych." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 6">
<img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig7.jpg" alt="Różnicowanie komórek ES, wykresy rozkładu wielkości, analiza danych, monitorowanie wzrostu komórek." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 7">

<ol><li>Barghshoon, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarghshoon%2C+S+%22Cell+Counting+Survey%22">Cell Counting Survey</a>. , Millipore. (2009).</li>
<li>Tucker, K. G., Chalder, S., al-Rubeai, M., Thomas, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+hybridoma+cell+number%2C+viability%2C+and+morphology+using+fully+automated+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+Microb+Technol%22%5BJournal%5D)">Measurement of hybridoma cell number, viability, and morphology using fully automated image analysis.</a> Enzyme Microb Technol. 16 (1), 29-35 (1994).</li>
<li>Houwen, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHouwen%2C+B+%22Fifty+years+of+hematology+innovation%3A+the+Coulter+principle%22">Fifty years of hematology innovation: the Coulter principle</a>. , Medical Laboratory Observer. (2003).</li>
</ol>

Kathleen Ongena, Chandreyee Das, Janet L. Smith, Sónia Gil i Grace Johnston są zatrudnione przez firmę Millipore, która produkuje instrumenty wykorzystane w niniejszym artykule.

Porównując wydajność licznika komórek Scepter z wynikami uzyskanymi przy użyciu innych metod liczenia, stwierdzamy, że ten nowy, automatyczny, ręczny licznik komórek zapewnia precyzyjne, szybkie i wiarygodne zliczanie komórek w szerokim zakresie operacyjnym. Funkcjonalność licznika Scepter jest wynikiem precyzyjnie zaprojektowanej technologii wbudowanej w końcówkę czujnika oraz zaawansowanej aparatury pomiarowej opartej na zasadzie Coulter'a. Jakość działania sugeruje, że metoda liczenia Scepter pozwala na zwiększenie szybkości i poprawę powtarzalności testów opartych na komórkach. Format ręczny umożliwia szybkie i wygodne liczenie bezpośrednio w dygestorium do hodowli komórkowych.

<table><tbody><tr><td>Ręczny automatyczny licznik komórek Scepter 2.0 z czujnikami Scepter 40 &amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>PHCC20040</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny automatyczny licznik komórek Scepter 2.0 z czujnikami Scepter 60 &amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>PHCC20060</td><td></td></tr><tr><td>Czujniki Scepter, 60 &amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>PHCC60050</td><td>Opakowanie 50 czujników</td></tr><tr><td>Czujniki Scepter, 40 &amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>PHCC40050</td><td>Opakowanie 50 czujników</td></tr><tr><td>Uniwersalny adapter zasilania</td><td>EMD Millipore</td><td>PHCCPOWER</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw pierścieni O-ring Scepter</td><td>EMD Millipore</td><td>PHCCOCLIP</td><td>2 pierścienie O-ring i jedna pokrywa filtra</td></tr></tbody></table>

oznaczanie liczby komórek podczas hodowli komórkowej przy użyciu licznika komórek scepter

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Liczenie komórek jest często niezbędnym, ale żmudnym etapem hodowli komórkowych in vitro. Stałe stężenia komórek zapewniają powtarzalność i dokładność eksperymentów. Liczenie komórek jest istotne w celu monitorowania stanu zdrowia i szybkości proliferacji komórek, oceny immortalizacji lub transformacji, wysiewania komórek do kolejnych doświadczeń, transfekcji lub infekcji, a także w przygotowaniu do testów opartych na komórkach. Ważne jest, aby liczenie komórek było dokładne, spójne i szybkie, szczególnie w przypadku ilościowych pomiarów odpowiedzi komórkowych.
Pomimo zapotrzebowania na szybkość i dokładność w liczeniu komórek, 71% z 400 przebadanych naukowców1 nadal stosuje hemocytometr do tego celu. Choć hemocytometria jest niedroga, jest pracochłonna i podatna na błędy użytkownika oraz niewłaściwe zastosowanie, co prowadzi do niedokładnych wyników. Hemocytometry wykonane są ze specjalnego szkła optycznego, na które nanosi się określone objętości zawiesin komórkowych, a następnie zlicza je pod mikroskopem. Źródłami błędów w hemocytometrii są: nierównomierny rozkład komórek w próbce, zbyt duża lub zbyt mała liczba komórek w próbce, subiektywne decyzje dotyczące tego, czy dana komórka znajduje się w wyznaczonym obszarze liczenia, zanieczyszczenie hemocytometru, różnice między użytkownikami oraz zmienność stopnia wypełnienia hemocytometru2.
Aby uniknąć żmudnego procesu ręcznego liczenia, 29% badaczy wykorzystuje do liczenia komórek zautomatyzowane urządzenia; należą do nich liczniki obrazowe, systemy wykrywające komórki w oparciu o zasadę Coultera lub cytometria przepływowa1. Dla większości badaczy główną barierą w stosowaniu systemów zautomatyzowanych jest cena tych dużych instrumentów laboratoryjnych1.
Licznik komórek Scepter to zautomatyzowane urządzenie ręczne, które zapewnia automatyzację i dokładność zliczania metodą Coultera przy stosunkowo niskim koszcie. System wykorzystuje zasadę Coultera opartą na detekcji cząstek za pomocą impedancji3 w zminiaturyzowanej formie, stosując kombinację analogowego i cyfrowego sprzętu do wykrywania, przetwarzania sygnałów, przechowywania danych oraz wyświetlania graficznego. Jednorazowa końcówka została zaprojektowana z mikrofabrykowaną strefą wykrywania komórek, która umożliwia rozróżnianie według rozmiaru i objętości komórek z rozdzielczością poniżej mikrona i pikolitra. Dzięki precyzyjnym kanałom do obsługi cieczy i zaawansowanej elektronice, licznik komórek Scepter raportuje statystyki populacji komórek przedstawione graficznie w formie histogramu.

Scepter Cell Counter to przenośne, zautomatyzowane urządzenie, które umożliwia zliczanie komórek, monitorowanie ich średnicy i objętości oraz sprawdzanie stanu zdrowia i jakości populacji komórkowych w kolejnych kulturach.

Oznaczanie liczby komórek podczas hodowli komórkowej przy użyciu licznika komórek Scepter

Liczenie komórek jest często niezbędnym, lecz żmudnym etapem hodowli komórkowych in vitro. Spójne stężenia komórek zapewniają powtarzalność eksperymentów oraz ...

Licznik komórek scepter to przenośne zautomatyzowane urządzenie służące do liczenia komórek, monitorowania ich średnicy i objętości oraz sprawdzania stanu zdrowia i jakości populacji komórkowych. Oferuje on istotne zalety w porównaniu z innymi metodami liczenia, w tym zwiększoną dokładność, łatwość obsługi oraz niski koszt liczenia komórek. Korzystając z urządzenia scepter, należy postępować zgodnie z instrukcjami na wyświetlaczu graficznym, aby pobrać komórki do jednorazowego sensora.Następnie zlicza się komórki, a urządzenie raportuje ich stężenia oraz statystyki, które można przesłać do komputera i przeanalizować. Cześć, nazywam się Sonya. Jestem naukowcem w Millport i dzisiaj pokażę wam, jak korzystać z urządzenia scepter.Licznik komórek Liczenie komórek jest niezbędnym, lecz żmudnym etapem hodowli komórkowych in vitro. Stałe stężenia komórek zapewniają powtarzalność i dokładność eksperymentów. Liczenie komórek jest istotne dla monitorowania stanu zdrowia i tempa proliferacji komórek, oceny komórek nieśmiertelnych lub transformowanych, wysiewania komórek do kolejnych doświadczeń, transfekcji lub infekcji, a także przygotowywania testów opartych na komórkach, przy jednoczesnej potrzebie szybkości i precyzji.W badaniu dotyczącym liczenia komórek 71% z 400 ankietowanych badaczy wykonuje tę czynność przy użyciu komory countingowej (hemocytometru). Choć metoda ta jest niedroga, jest ona pracochłonna oraz podatna na błędy użytkownika i niewłaściwe zastosowanie, co prowadzi do niedokładnych wyników. Źródła błędów w hemocytometrii obejmują nierównomierny rozkład komórek w próbce oraz zbyt dużą lub zbyt małą liczbę komórek w próbce.Subiektywne decyzje dotyczące tego, czy dana komórka znajduje się w obrębie zdefiniowanego obszaru zliczania. Zanieczyszczenie hemocytometru, różnice w sposobie postępowania użytkowników oraz zmienność szybkości napełniania hemocytometru, aby złagodzić monotonię związaną z ręcznym zliczaniem. 29% badaczy zlicza komórki przy użyciu zautomatyzowanych urządzeń do zliczania komórek.Jednak dla większości badaczy cena związana z tymi dużymi urządzeniami laboratoryjnymi stanowi barierę w ich stosowaniu. Liczak komórek Scepter to zautomatyzowane urządzenie ręczne, które zapewnia automatyzację i dokładność zliczania komórek przy stosunkowo niskim koszcie w łatwej w obsłudze formie kompaktowej. System wykorzystuje zasadę Coultera w detekcji cząstek opartej na impedancji w zminiaturyzowanej formie, wykorzystując kombinację sprzętu analogowego i cyfrowego do przetwarzania sygnałów pomiarowych, przechowywania danych oraz wyświetlania graficznego.Jednorazowy czujnik został zaprojektowany z mikrofabrykowaną strefą detekcji komórek, która umożliwia rozróżnianie komórek na podstawie ich wielkości i objętości z rozdzielczością submikronową i subpikolitrową, wspieraną przez precyzyjne kanały do prowadzenia cieczy oraz układ elektroniczny. Licznik komórek Scepter graficznie przedstawia statystyki populacji komórek w formie histogramu. Prace z licznikiem komórek Scepter rozpoczyna się od rozcieńczenia zawiesiny pojedynczych komórek w roztworze soli fosforanowej (PBS).Optymalne stężenie wynosi od 10 000 do 500 000 komórek na mililitr. Przenieś 100 µL rozcieńczonych komórek do probówki typu microview o pojemności 1,5 mL. Włącz licznik komórek Scepter, naciskając i przytrzymując przełącznik z tyłu urządzenia, a następnie poczekaj na wyświetlenie instrukcji na ekranie.Po wyświetleniu komunikatu, przymocuj czujnik do końca jednostki scepter, tak aby panel detekcyjny elektrody był skierowany w stronę przedniej części instrumentu. Czujniki scepter składają się z precyzyjnie formowanej komory próbkowania z elektroniczną strefą detekcyjną i zintegrowanymi elektrodami do detekcji komórek. Czujniki te umożliwiają rozróżnienie wielkości komórek z rozdzielczością submikronową oraz objętości komórek z rozdzielczością poniżej pikolitra.Spójna konstrukcja sensora zapewnia przeliczanie równych objętości próbek oraz dokładne pomiary rozmiarów. Po zamocowaniu sensora należy wykonać każdy etap procesu liczenia zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie w następujący sposób. Gdy na ekranie pojawi się komunikat „hold down the plunger to begin” (przytrzymaj tłok, aby rozpocząć), należy nacisnąć tłok; następnie na ekranie pojawi się komunikat „submerge the sensor” (zanurz sensor) – należy wtedy zanurzyć sensor w roztworze zawiesiny komórkowej, a następnie zwolnić tłok, aby wciągnąć zawiesinę komórkową do wnętrza sensora.Tłok pełni rolę sygnału elektrycznego i zaciągnie próbkę wraz z objętością martwą do czujnika. Prędkość lub precyzja ruchu tłoka nie mają takiego znaczenia, jak w przypadku pipetowania. Proces ten potrwa kilka sekund po przygotowaniu urządzenia.Urządzenie wyemituje sygnał dźwiękowy, a na ekranie pojawi się komunikat o załadowaniu próbki. Po wprowadzeniu próbki do czujnika zostanie ona przeprowadzona przez strefę pomiarową w celu oceny wielkości i objętości komórek. Następnie, po przejściu przez mikrokanały i odliczeniu 50 µL próbki, czujnik wyśle sygnał do urządzenia w celu zatrzymania liczenia.Po zakończeniu zliczania na ekranie urządzenia pojawi się komunikat count complete. Należy wyjąć czujnik i go zutylizować. Postępuj zgodnie z instrukcją na ekranie, wyjmij czujnik i go zutylizuj.Następnie urządzenie wyświetli na ekranie histogram wielkości lub średnicy komórek, a także stężenie komórek na mililitr. Po zakończeniu pomiaru i wyświetleniu histogramu na urządzeniu, należy zastosować bramki, naciskając przycisk przełącznika, a następnie wybrać auto gating lub use last, aby automatycznie ustawić bramkę na podstawie profilu histogramu lub użyć bramek z poprzedniego pomiaru. Niezależnie od wyboru, bramki można przesuwać ręcznie w celu ich precyzyjnego dostrojenia.Dostrój dane, naciśnij ponownie przycisk przełącznika, aby wybrać bramkę lewą, a następnie przesuń przełącznik, aby ustawić bramkę w pożądanej pozycji. Następnie naciśnij przełącznik ponownie, aby aktywować bramkę prawą, i przesuń przełącznik, aby umieścić bramkę prawą. Kliknij ponownie.Wyświetlone zostanie nowe stężenie komórek, średnia objętość oraz średnica komórek. Przełącznik może być przesunięty na dowolną stronę, aby zmienić widok między datą i godziną, średnim rozmiarem komórek a średnią objętością komórek; w pamięci instrumentu można zapisać do 72 histogramów. Aby przesłać dane na komputer osobisty, podłącz urządzenie za pomocą kabla USB, a następnie otwórz ekran wyświetlania w komputerze.Kliknij dwukrotnie aplikację scepter, aby uruchomić oprogramowanie. Następnie kliknij przycisk połącz. Wszystkie wyniki zliczeń zostaną automatycznie przeniesione do programu.Oprogramowanie aplikacyjne Scepter wyświetla histogram szczegółowo przedstawiający rozkład populacji hodowli w zależności od objętości lub średnicy. Pobrane pliki można następnie wyeksportować do programu Microsoft Excel, w którym surowe dane zostaną wyświetlone w przedziałach określonych średnic lub objętości komórek. Do liczenia przygotowano 19 różnych linii komórkowych, a teoretyczne stężenia początkowe określono za pomocą licznika komórek.Następnie zawiesiny komórek poddano dalszemu rozcieńczeniu w celu uzyskania zawiesin o teoretycznych stężeniach komórek. Do wyznaczenia stężeń komórek wykorzystano licznik komórek Scepter. Rysunek przedstawia pięć rozcieńczeń zmierzonych dla pięciu reprezentatywnych linii komórkowych wraz z teoretycznym stężeniem komórek.Wysoki stopień liniowości, wskazany przez wartości r-squared, dowodzi, że liczenie za pomocą scepter jest niezawodną metodą dla badanych linii komórkowych w szerokim liniowym zakresie pracy. Ogólną względną dokładność liczenia scepter wykazano tutaj poprzez porównanie danych uzyskanych z liczenia scepter z wynikami uzyskanymi z liczenia coter. Wykres logarytmu liczby komórek z licznika scepter w funkcji logarytmu liczby z licznika coter pokazuje, że we wszystkich badanych liniach komórkowych wyniki z licznika scepter są zgodne z wynikami z licznika coter.Zliczanie 19 linii komórkowych przeprowadzono przy użyciu licznika Coulter Z two. Pomiary za pomocą licznika Scepter, zautomatyzowanego licznika obrazowego, takiego jak system V cell lub count oraz licznika hemo TER wykonano zgodnie z instrukcjami producenta, wykorzystując tę samą zawiesinę wyjściową komórek i identyczne rozcieńczenia. Wyniki przedstawione na tej rycinie wykazują, że stężenia komórek zmierzone za pomocą licznika Scepter ściśle odpowiadają teoretycznym stężeniom komórek przy wysokiej liniowości.Współczynnik zmienności (CV), wyrażony w procentach, obliczono dla każdego rozcieńczenia każdej linii komórkowej. Dla każdego systemu liczenia przedstawiono średnie wartości procentowe CV dla 19 linii komórkowych w zależności od stężenia komórek i metody liczenia w zakresie operacyjnym. Licznik komórek Scepter jest bardziej precyzyjny niż liczenie za pomocą hemocytometru, wykazując mniejsze odchylenia standardowe i mniejsze średnie współczynniki zmienności.Liczenie za pomocą Scepter jest 10 razy szybsze niż hemo-cytometria i szybsze niż w przypadku innych liczników automatycznych. Tutaj zliczony zostało 93 komórki SF nine, MCF seven oraz HC 2, stosując metody opisane w tym filmie. Odnotowano średni czas potrzebny na pomiar stężenia komórek.Należy zauważyć, że cytometry krwi przeprowadzono tylko raz dla każdej próbki. Urządzenie Scepter wykonuje pomiary w oparciu o rozmiar komórek. W związku z tym wszelkie zmiany w morfologii komórkowej mogą zostać zarejestrowane na histogramie.Zdrowe kultury wykazują prawidłowy rozkład Gaussa w kształcie dzwonu, natomiast niezdrowe komórki obumierają, co powoduje przesunięcie histogramu w lewo. Podobnie zaobserwowano przesunięcia histogramu w przypadku zmieszania populacji składającej się w 50% z martwych i w 50% z żywych komórek. Przedstawiłem właśnie sposób obsługi nowego licznika komórek Scepter firmy Millipore, który rewolucjonizuje sposób, w jaki badacze liczą komórki.

determining-cell-number-during-cell-culture-using-scepter-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Określanie liczby komórek podczas hodowli komórek za pomocą licznika komórek z berła

Znajomość dokładnej liczby żywych komórek jest niezbędna przy wielu manipulacjach w hodowlach tkankowych. Niniejszy protokół opisuje sposób rozróżniania komórek żywych od martwych oraz ilościowego oznaczania komórek przy użyciu hemacytometru. Choć opisano w nim liczenie ludzkich neuralnych komórek macierzystych/prekursorowych (hNSPCs), można go zastosować również do innych typów komórek.

Liczenie ludzkich neuralnych komórek macierzystych

Oznaczanie liczby komórek w hodowli jest istotne dla standaryzacji warunków hodowli oraz przeprowadzania dokładnych eksperymentów ilościowych. W tym filmie demonstrujemy sposób zliczania komórek przy użyciu hemacytometru.

Liczenie i określanie żywotności hodowli komórkowych

Miniaturowy automatyczny licznik komórek Moxi Z to nowoczesny instrument, który łączy zasadę Coultera z opatentowaną technologią cienkowarstwowych czujników oraz autorskim algorytmem oprogramowania, aby umożliwić pomiar rozmiaru i zliczanie cząstek z szerokiego zakresu wielkości, a także ocenę ogólnego stanu hodowli monodyspersyjnych komórek ssaków. Niniejszy protokół opisuje zastosowanie tego urządzenia do zliczania i oceny kondycji hodowli komórkowych.

Oznaczanie liczby komórek ssaczych, wielkości komórek i stanu zdrowia komórek przy użyciu automatycznego licznika komórek Moxi Z Mini

Ten protokół opisuje użycie trzech różnych metod analizy proliferacji komórek w liniach komórkowych raka piersi. Obejmuje to stosowanie konwencjonalnego zliczania komórek, żywotności komórek na podstawie luminescencji oraz zliczania komórek za pomocą obrazowania komórek. Każdy z nich oferuje korzyści w zakresie powtarzalnego pomiaru proliferacji komórek.

Porównanie trzech różnych metod określania proliferacji komórek w liniach komórkowych raka piersi

Ten artykuł opisuje kwantyfikację hemocytometru i mikrofotografii migracji/inwazji za pomocą dwóch nowych wtyczek ImageJ o otwartym kodzie źródłowym: Kalkulatora Stężenia Komórek i Licznika Testu Migracji.  Ponadto opisano w nim protokoły akwizycji i kalibracji obrazu, a także szczegółowo omówiono wymagania wejściowe wtyczek.

Zautomatyzowana kwantyfikacja i analiza procedur zliczania komórek za pomocą wtyczek ImageJ

Często konieczne jest oszacowanie potencjalnej cytotoksyczności zestawu związków na hodowanych komórkach. W tym miejscu opisujemy strategię niezawodnego badania przesiewowego pod kątem toksycznych związków w formacie 96-dołkowym.

Strategia identyfikacji związków, które wpływają na wzrost i przeżycie komórek w hodowanych komórkach ssaków przy niskiej lub umiarkowanej przepustowości

Wzajemne oddziaływanie między komórkami nabłonka sutka a komórkami śródbłonka przyczynia się do progresji raka piersi, wzrostu guza i przerzutów. W tym badaniu sferoidy zostały wykonane z komórek raka piersi wraz z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych i/lub limfatycznych i wykazują ich przydatność jako systemu in vitro do badań nad rakiem piersi.

Sferoidy komórek nabłonka i śródbłonka sutka jako potencjalny funkcjonalny model in vitro do badań nad rakiem piersi

Ten protokół dostarcza wyczerpujących wytycznych dotyczących konfiguracji i ilościowego monitorowania kokultur, w tym fotoautotroficznych cyjanobakterii wydzielających cukier i drożdży heterotroficznych.

Składanie i kwantyfikacja kokultur łączących drożdże heterotroficzne z fototroficznymi cyjanobakteriami wydzielającymi cukier

Niniejszy artykuł opisuje protokół mechanicznej charakterystyki żywych sferoidów w macierzy 3D za pomocą mikrospektroskopii Brillouina. Ta całkowicie optyczna metoda umożliwia wizualizację sferoidów o rozdzielczości mikroskalowej oraz ilościowych właściwościach mechanicznych. To podejście ma znaczenie dla fenotypowania mechanicznego; na przykład określanie stanów patologicznych kulistych nowotworów w mikrośrodowisku 3D.

Mechaniczne mapowanie sferoidów za pomocą spektroskopii Brillouina

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Poznaj automatyczne liczenie komórek w hodowli przy użyciu licznika Scepter. To przenośne urządzenie zapewnia dokładność, łatwość obsługi i analizę histogramów dla lepszej reprodukowalności eksperymentów.

Oznaczanie liczby komórek podczas hodowli komórkowej przy użyciu licznika komórek Scepter

Przeglądaj więcej filmów