Określanie liczby komórek podczas hodowli komórek za pomocą licznika komórek z berła

Licznik komórek z berła to ręczne zautomatyzowane urządzenie do zliczania komórek, monitorowania średnicy i objętości komórek oraz sprawdzania zdrowia i jakości populacji komórkowych. Oferuje znaczące zalety w porównaniu z innymi metodami liczenia, w tym zwiększoną dokładność, łatwość użycia i niski koszt zliczania komórek. Korzystając z berła, postępuj zgodnie z instrukcjami na jego wyświetlaczu graficznym, aby zassać komórki do jednorazowego czujnika.

Komórki są następnie zliczane, a urządzenie raportuje stężenia komórek i statystyki, które można przesłać do komputera i przeanalizować. Cześć, jestem Sonya. Jestem naukowcem w Millport i dzisiaj pokażę wam, jak używać berła.

Licznik komórek Liczenie komórek jest koniecznym, ale żmudnym krokiem w hodowli komórek in vitro. Stałe stężenia komórek zapewniają eksperymentalną odtwarzalność i dokładność. Liczba komórek jest ważna dla monitorowania zdrowia komórek i tempa proliferacji, oceny komórek nieśmiertelnych lub transformacyjnych do kolejnych eksperymentów, transfekcji lub infekcji oraz przygotowania do testów opartych na komórkach, pomimo potrzeby szybkości i dokładności.

Podczas zliczania komórek 71% z 400 badaczy zliczyło komórki za pomocą hemocytometru. Chociaż hemocytometria jest niedroga, jest pracochłonna i podatna na uprzedzenia użytkowników i nadużycia, co skutkuje niedokładnymi obliczeniami. Źródła błędów w hemocytometrii obejmują nierównomierny rozkład komórek w próbce, zbyt wiele lub zbyt mało komórek w próbce.

Subiektywne decyzje o tym, czy dana komórka mieści się w zdefiniowanym obszarze zliczania. Zanieczyszczenie hemocytometru, zmienność użytkownika i zmiana szybkości napełniania hemocytometru w celu złagodzenia nudy związanej z ręcznym liczeniem. 29% badaczy liczy komórki za pomocą automatycznych urządzeń do liczenia komórek.

Jednak dla większości badaczy cena związana z tymi dużymi instrumentami laboratoryjnymi stanowi barierę w ich użytkowaniu. Licznik komórek berła to zautomatyzowane urządzenie ręczne, które oferuje automatyzację i dokładność liczenia koter przy stosunkowo niskich kosztach w łatwym w użyciu formacie ręcznym. System wykorzystuje zasadę Coter detekcji cząstek w oparciu o impedancję w zminiaturyzowanym formacie, wykorzystując połączenie sprzętu analogowego i cyfrowego do przetwarzania sygnału czujnikowego, przechowywania danych i wyświetlania graficznego.

Jednorazowy czujnik został zaprojektowany z mikrofabrykowaną strefą wykrywania komórek, która umożliwia rozróżnianie na podstawie rozmiaru i objętości komórki w rozdzielczości submikronowej i subpikolitrowej, wzbogaconej o precyzyjne kanały obsługi cieczy i elektronikę. Licznik komórek berła wyświetla graficznie statystyki populacji komórek w postaci histogramu do użycia. Licznik komórek berła rozpoczyna się od rozcieńczenia zawiesiny komórek z pojedynczej komórki w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.

Stężenie od 10 000 do 500 000 komórek na mililitr jest optymalne. Przenieś 100 mikrolitrów rozcieńczonych komórek do 1,5 mililitrowej probówki mikroview. Włącz licznik komórek berła, naciskając i przytrzymując przełącznik z tyłu instrumentu i poczekaj, aż pojawią się instrukcje na ekranie.

Po wyświetleniu monitu przymocuj czujnik do końca jednostki berła tak, aby panel wykrywania elektrod był skierowany w stronę przodu przyrządu. Czujniki Scepter składają się z precyzyjnie formowanej komory do pobierania próbek z elektroniczną strefą wykrywania i zintegrowanymi elektrodami wykrywającymi ogniwa. Czujniki umożliwiają rozróżnienie wielkości komórki w rozdzielczości submikronowej i objętości komórki w rozdzielczości subpikolitrowej.

Konsekwentna inżynieria czujników zapewnia zliczanie równych objętości próbek i dokonywanie dokładnych pomiarów wielkości. Po zamocowaniu czujnika wykonaj każdy krok procesu liczenia zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie w następujący sposób. Gdy ekran odczyta, przytrzymaj tłok, aby zacząć naciskać tłok, ekran odczyta zanurzenie czujnika, zanurz czujnik w roztworze zawiesiny ogniw i zwolnij tłok, aby zassać zawiesinę ogniw do czujnika.

Tłok działa jak sygnał elektryczny i wciąga próbkę wraz z objętością martwą do czujnika. Szybkość i dokładność wgłębnego nie ma znaczenia, tak jak w przypadku pipetowania. Ten proces zajmie kilka sekund, gdy będzie gotowy.

Przyrząd wyda sygnał dźwiękowy, a na ekranie zostanie wyświetlona załadowana próbka. Po załadowaniu próbki do czujnika jest ona przeciągana przez strefę wykrywania w celu oceny wielkości i objętości komórki. Następnie przez mikrokanały, po zliczeniu 50 mikrolitrów próbki, czujnik mówi urządzeniu, aby przestało liczyć.

Po zakończeniu liczenia na ekranie przyrządu pojawi się komunikat zliczanie zakończone. Wyjmij czujnik i wyrzuć. Postępuj zgodnie z instrukcjami, a następnie wyjmij i wyrzuć czujnik.

Przyrząd wyświetli następnie histogram wielkości lub średnicy komórki na ekranie, a także stężenie komórek na mililitr. Po zakończeniu zliczania i wyświetleniu histogramu na instrumencie, zastosuj bramki, naciskając przycisk przełączania, wybierz automatyczne bramkowanie lub użyj ostatniego, aby automatycznie ustawić bramkę na podstawie profilu histogramu lub użyć bramek z poprzedniego zliczania. Niezależnie od wyboru, bramy można ręcznie przesunąć do dokładnego.

Dostrój dane, ponownie naciśnij przycisk przełączania, aby wybrać lewą bramę i przewiń przełącznik, aby przesunąć bramę zgodnie z potrzebami. Następnie ponownie naciśnij przełącznik, aby aktywować prawą bramę i przewiń przełącznik, aby umieścić prawą bramę. Kliknij ponownie.

Zostanie wyświetlone nowe stężenie komórek, średnia objętość i średnica komórek. Przełącznik może być również przesunięty po dowolnej stronie, aby przełączać wyświetlacz między datą i godziną, średnim rozmiarem komórki i średnią głośnością komórki do 72 histogramów, które można przechowywać w samym instrumencie. Aby przesłać dane do komputera osobistego, podłącz instrument za pomocą portu USB, na ekranie wyświetlacza komputera.

Kliknij dwukrotnie aplikację scepter, aby uruchomić oprogramowanie. Następnie kliknij Połącz. Wszystkie zliczenia zostaną automatycznie przeniesione do oprogramowania.

Oprogramowanie aplikacyjne scepter wyświetla histogram szczegółowo opisujący rozmieszczenie populacji kultury pod względem objętości lub średnicy. Pobrane pliki można następnie wyeksportować do programu Microsoft Excel, gdzie surowe dane zostaną wyświetlone w pojemnikach o określonych średnicach komórek lub objętościach komórek. Do zliczania przygotowano 19 różnych linii komórkowych i określono teoretyczne stężenia wyjściowe za pomocą licznika akultera.

Te zawiesiny komórek były następnie dalej rozcieńczane w celu uzyskania zawiesin komórkowych o teoretycznych stężeniach komórek. Licznik komórek berła został następnie użyty do określenia stężeń komórek. Rysunek ten przedstawia pięć rozcieńczeń, które zmierzono dla pięciu reprezentatywnych linii komórkowych wraz z teoretycznym stężeniem komórek.

Wysoki stopień liniowości, na który wskazują wartości r-kwadrat, pokazuje, że liczenie berła jest niezawodną metodą dla linii komórkowych testowanych w szerokim liniowym zakresie roboczym. Ogólna względna dokładność liczenia berła jest pokazana tutaj, w której dane uzyskane z liczenia berła są porównywane z liczeniami uzyskanymi z liczenia berła. Log liczby komórek berła jest wykreślany w stosunku do logarytmu liczby komórek berła i pokazuje, że we wszystkich badanych liniach komórkowych liczba berła jest zgodna z liczbą komórek.

Zliczenia 19 linii komórkowych przeprowadzono przy użyciu licznika redlic Z z dwa. Licznik komórek berła, zautomatyzowany licznik wizyjny, taki jak komórka V lub system testowania liczby, oraz zliczanie TER hemo przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta przy użyciu tej samej zawiesiny wyjściowej komórek i identycznych rozcieńczeń. Wyniki przedstawione na tym rysunku pokazują, że stężenia komórek mierzone za pomocą liczenia berła ściśle odpowiadają teoretycznym stężeniom komórek o wysokiej liniowości.

Procentowy współczynnik zmienności lub CV obliczono dla każdego rozcieńczenia każdej linii komórkowej. Dla każdego pokazanego tutaj systemu liczenia przedstawiono średni procent CVS na 19 liniach komórkowych w odniesieniu do stężenia komórek i metody liczenia w zakresie operacyjnym. Licznik komórek berła jest bardziej precyzyjny niż liczenie hemocytometru, wyświetlając mniejsze odchylenia standardowe i mniejsze średnie współczynniki zmienności.

Liczenie berła jest 10 razy szybsze niż hemocytometria i szybsze niż inne automatyczne liczniki. Tutaj komórki SF dziewięć, MCF siedem i HC 2 93 zostały policzone przy użyciu metod opisanych w tym filmie. Zarejestrowano średni czas potrzebny do zmierzenia stężenia komórek.

Należy pamiętać, że hemocytometria została wykonana tylko raz na próbkę. Berło dokonuje pomiarów na podstawie rozmiaru komórki. W ten sposób wszelkie zmiany w morfologii komórki można uchwycić na histogramie.

Zdrowe kultury wykazują ładny rozkład Gaussa w kształcie dzwonu, podczas gdy niezdrowe komórki powodują i powodują przesunięcie histogramu w lewo. Podobnie, gdy populacja 50% martwych komórek została zmieszana z 50% żywymi komórkami, zaobserwowano również przesunięcia histogramu. Właśnie pokazałem wam, jak używać nowego licznika komórek z berła dla miliporów, który rewolucjonizuje sposób, w jaki naukowcy liczą swoje komórki.