Name: Protokół hodowli komarów (A. gambiae) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T01:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: Poznaj metody hodowli komarów Anopheles gambiae w warunkach laboratoryjnych, obejmujące wszystkie etapy rozwoju. Technika ta wspiera badania nad malarią i kontrolą wektorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pokarm dla komarów:
<ol>
<li>Pokarm A: zmielony pokarm dla ryb (Aquaricare). Należy dodać małą szczyptę. </li>
<li>Pokarm B: zmielony pokarm dla kotów (Purina). Należy dodać małą szczyptę. </li>
<li>Pokarm C: pokarm dla kotów (Purina). Należy dodać dwie tabletki. </li>
</ol>
Krew:
Do hodowli komarów można wykorzystać krew zwierzęcą lub ludzką. Świeżą krew pobiera się strzykawką i przelewa do sterylnej probówki Falcon o pojemności 15 ml zawierającej 1 ml CPD (antykoagulantu) na każde 10 ml krwi, a następnie delikatnie miesza i wiruje w temperaturze pokojowej przy 2000 rpm przez 5 min. Nadpływ odrzuca, dbając o usunięcie warstwy białkowoeleukocytarnej (buffy coat), która składa się z pozostałych komórek krwi (np. WBC). Osad RBC zawiesza się poprzez pipetowanie w równymt objętości medium RPMI, a następnie przemywa w tym medium trzykrotnie. Po ostatnim przemyciu osad RBC resuspensuje się w równymt objętości medium RPMI i przechowuje w temperaturze 4°C (można przechowywać przez 8-10 dni). Bezpośrednio przed karmieniem RBC (w medium RPMI) wiruje się (2000 rpm przez 5 min) w celu osadzenia komórek, a upakowane RBC resuspensuje się w surowicy (ludzka surowica grupy O+) do uzyskania 40% hematokrytu. Krew przeznaczona do karmienia musi być stale utrzymywana w temperaturze 37°C.
DZIEŃ 1:
<ol>
<li>Samice dorosłych komarów w wieku 3-5 dni są karmione krwią w celu zniesienia jaj. </li>
<li>Do karmienia krwią stosuje się metodę z wykorzystaniem sztucznej membrany (parafilmu) w następujący sposób: <ol>
<li>Erytrocyty (patrz powyżej w sekcji przygotowania krwi) miesza się z serum inaktywowanym ciepłem, aby uzyskać hematokryt na poziomie ~40% (40% skonsolidowanych erytrocytów i 60% serum). Mieszaninę tę wprowadza się do szklanego karmnika.</li>
<li>Karmnik zostaje podłączony do ciepłej płaszcza wodnego (37°C) i umieszczony na klatce, aby umożliwić komarom dostęp do powierzchni membrany.</li>
<li>Komarom pozwala się żerować przez ~30 minut. </li>
</ol></li>
</ol>
DZIEŃ 3:
<ol>
<li>Samice złożą jaja dwa dni po spożyciu krwi. Mały kawałek papieru filtru owinięty w kształt stożka umieszcza się w małym zlewce z wodą destylowaną, dbając o to, aby papier filtracyjny był wilgotny. Zlewkę pozostawia się w klatce na noc, aby komary mogły złożyć jaja.</li>
</ol>
DZIEŃ 4:
<ol>
<li>Papier filtracyjny zawierający jaja komarów umieszcza się w plastikowej kuwecie z ~300 ml wody destylowanej. Do kuwety dodaje się szczyptę pożywki A i pozostawia jaja do wyklucia się larw w ciągu kolejnych dni.</li>
</ol>
DNI 5 - 8:
<ol>
<li>Rozwijające się larwy karmiono codziennie dwiema tabletkami pożywki C, monitorując jednocześnie zagęszczenie oraz liczebność populacji. Ósmego dnia (larwy 5-dniowe) populację larw przeniesiono z 1 kuwety do ok. 10 kuwet, dodając do każdej szczyptę pożywki A oraz dwie tabletki pożywki C. (~30 min) </li>
</ol>
DNI 9 - 12:
<ol>
<li>Larwy są karmione codziennie pokarmem C. W 12. dniu (larwy w wieku 9 dni) wodę wymienia się na świeżą i dodaje pokarm (szczyptę pokarmu B oraz dwie tabletki pokarmu C). Na tym etapie rozpoczyna się rozwój poczwarek. Tace przykrywa się siatkami, aby zapobiec ucieczce osobników dorosłych. (~ 8-10 mins) </li>
</ol>
DZIEŃ 13 - 15:
Przez kolejne 2 - 3 dni oczekuje się na wyjście imago z pociorek. Larwy/pociorek są karmione codziennie, przy czym siatkę zdejmuje się ostrożnie, aby zapobiec ucieczce osobników dorosłych.
DZIEŃ 16:
<ol>
<li>Osobniki dorosłe zbiera się do klatki za pomocą aspiratora podłączonego do pompy próżniowej. Klatka składa się z małej butelki o pojemności 100 ml z bawełnianym knotkiem nasączonym 10% sacharozą (autoklawowaną) oraz wyłożonym na dnie ręcznikiem papierowym, który ma wchłaniać ewentualne wycieki cukru mogące wystąpić podczas manipulowania klatką. (~ 30-40 mins) </li>
</ol>
DZIEŃ 17 - 21:
<ol>
<li>Osobniki dorosłe (zarówno samce, jak i samice) są następnie utrzymywane w insektarium przez 4-5 dni i karmione 10% sacharozą przed kolejnym karmieniem krwią w celu rozpoczęcia następnego cyklu. Te same komary mogą być wykorzystywane do składania jaj wielokrotnie.</li>
<li>Komary, które nie są potrzebne do eksperymentów lub hodowli, można zabić, umieszczając klatkę w zamrażarce. Używane tace i klatki należy oczyścić i wysuszyć przed ponownym użyciem.</li>
</ol>
UWAGA: Metoda hodowli komarów może wykazywać pewne różnice, a poszczególne laboratoria mogą stosować odmienne techniki.

<ol><li>Bangs, M. J., Soelarto, T., Barodji,, Wicaksana, B. P., Boewono, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+Anopheles+maculatus+from+Central+Java%2C+Indonesia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Mosq+Control+Assoc%22%5BJournal%5D)">Colonization of Anopheles maculatus from Central Java, Indonesia.</a> J Am Mosq Control Assoc. 18, 359-363 (2002).</li>
<li>Beier, M. S., Beier, J. C., Merdan, A. A., el Sawaf, B. M., Kadder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+rearing+techniques+and+adult+life+table+parameters+for+Anopheles+sergentii+from+Egypt%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Mosq+Control+Assoc%22%5BJournal%5D)">Laboratory rearing techniques and adult life table parameters for Anopheles sergentii from Egypt.</a> J Am Mosq Control Assoc. 266, 266-270 (1987).</li>
<li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenedict%2C+MQ+%22Care+and+maintenance+of+anopheline+mosquitoes%2C+The+molecular+biology+of+disease+vectors%3A+A+methods+manual%22">Care and maintenance of anopheline mosquitoes, The molecular biology of disease vectors: A methods manual</a>. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. , Champman & Hall. London. 3-12 (1997).</li>
<li>Casanges, A. H., Mcgovran, E. R., Chiles, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearing+of+Anopheles+quadrimaculatus+Say+and+Aedes+aegypti+%28L.%29+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Mosq+News%22%5BJournal%5D)">Rearing of Anopheles quadrimaculatus Say and Aedes aegypti (L.) in the laboratory.</a> Mosq News. 9, 112-117 (1949).</li>
<li>Merritt, R. W., Dadd, R. H., Walker, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+behavior%2C+natural+food+and+nutritional+relation+ships+of+larval+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Feeding behavior, natural food and nutritional relation ships of larval mosquitoes.</a> Annual Rev. Entomol. 37, 349-376 (1992).</li>
<li>Nasirian, H., Ladonni, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+bloodfeeding+of+Anopheles+stephensi+on+a+membrane+apparatus+with+human+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Mosq+Control+Assoc%22%5BJournal%5D)">Artificial bloodfeeding of Anopheles stephensi on a membrane apparatus with human whole blood.</a> J Am Mosq Control Assoc. 22, 54-56 (2006).</li>
<li>Ng'habi, K. R., John, B., Nkwengulila, G., Knols, B. G., Killeen, G. F., Ferguson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+larval+crowding+on+mating+competitiveness+of+Anopheles+gambiae+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Effect of larval crowding on mating competitiveness of Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Malar J. 30 (4), 49(2005).</li>
<li>Stobart, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+control+of+body+volume+in+the+larvae+of+the+mosquitoes+Aedes+aegypti+and+Aedes+detritus%5BTitle%5D)+AND+%22Edw.+J.+Exp.+Boil%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the control of body volume in the larvae of the mosquitoes Aedes aegypti and Aedes detritus.</a> Edw. J. Exp. Boil. 54, 67-82 (1971).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Pokarm A</td><td></td><td>Aquaricare</td><td></td><td>Zmielony pokarm dla ryb. Należy dodać małą szczyptę.</td></tr><tr><td>Pokarm B</td><td></td><td>Purina</td><td></td><td>Zmielony pokarm dla kotów. Należy dodać małą szczyptę.</td></tr><tr><td>Pokarm C</td><td></td><td>Purina</td><td></td><td>Pokarm dla kotów. Należy dodać dwa tablety</td></tr><tr><td>RBC</td><td></td><td></td><td></td><td>przygotowane erytrocyty: 40% hematokrytu w ludzkim serum</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Pożywka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CPD</td><td></td><td></td><td></td><td>antykoagulant</td></tr><tr><td>serum</td><td></td><td></td><td></td><td>ludzkie serum grupy O+</td></tr><tr><td>Karmiarka do komarów</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>parafilm</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anopheles gambiae</td><td></td><td></td><td></td><td>komary</td></tr><tr><td>10% sacharozy</td><td></td><td></td><td></td><td>pokarm dla komarów</td></tr><tr><td>insektarium</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protokół hodowli komarów (a. gambiae)

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

Niniejszy protokół opisuje hodowlę komarów w insekterium. W pomieszczeniach insekterium utrzymuje się temperaturę 28°C i wilgotność ~80% przy 12-godzinnym cyklu dnia i nocy. Do przeprowadzenia tej procedury będą potrzebne: klatki dla komarów, 10% sterylny roztwór sacharozy, ręczniki papierowe, zlewka, papier filtracyjny Whatman, szklane karmniki, krew oraz surowica ludzka, łaźnia wodna, parafilm, woda destylowana, czyste plastikowe tace, pokarm dla komarów (opisany poniżej), siatka przeciwkomarowa do przykrycia tac, odkurzacz oraz komora do zbierania osobników dorosłych.

Niniejszy film przedstawia ogólne techniki stosowane w hodowli Anopheles gambiae w warunkach laboratoryjnych. Metody opieki nad komarami laboratoryjnymi są zaprezentowane na wszystkich etapach cyklu życiowego organizmu: od larw i poczwarek po dorosłe osobniki pobierające krew.

Protokół hodowli komarów (A. gambiae)

Niniejszy protokół opisuje hodowlę komarów w insekterium. W pomieszczeniach insekterium utrzymywana jest temperatura 28°C oraz wilgotność na poziomie ~80%, przy 12-godzinnym cyklu dzień/noc...

Nazywam się Shish i jestem pracownikiem podoktorskim w laboratorium dr. George'a OU w John Hopkins School of Public Health. W Katedrze Mikrobiologii Molekularnej i Immunologii pokażę, jak hodować komary z gatunku Anopheles gambiae. W laboratorium utrzymujemy je w insektarium, w którym temperatura wynosi zazwyczaj 27 stopni Celsjusza, a wilgotność 80%.W pomieszczeniu insektarium utrzymywany jest również 12-godzinny cykl dnia i nocy, aby móc naśladować warunki naturalne. Jest to nasze pomieszczenie insektarium, które stanowi tutejszą jednostkę centralną służącą do hodowli owadów. Jak widać, znajdują się tutaj różne tace z komarami na wszystkich etapach rozwoju: jajami, różnymi stadiami larw oraz poczwarkami.W tych tackach znajdują się larwy w wieku około 11 lub 12 dni, a tutaj znajduje się klatka, w której gromadzimy dorosłe komary i utrzymujemy je na 10% roztworze sacharozy. Aby rozpocząć hodowlę komarów, musimy podać im krew, ponieważ komary potrzebują białka zawartego we krwi do zniesienia jaj. Zatem dzień pierwszy przypada po zebraniu osobników dorosłych do klatki i utrzymywaniu ich na 10% roztworze sacharozy.Pierwszego dnia należy nakarmić komary krwią, dlatego stosuje się sztuc

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokół hodowlany komarów (A. gambiae)

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie odpornego na malarię, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom Plasmodium w organizmie komara. Niniejszy protokół ilustruje sposób przeprowadzania analizy stopnia infekcji komarów przez Plasmodium. Przedstawiono techniki przygotowania hodowli gametocytów, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania mian wirusów w jelicie środkowym komara.

Protokół zakażania komarów *Plasmodium falciparum* i określania fenotypu zakażenia

Metody genetyki odwrotnej okazały się niezwykle użyteczne w określaniu, które geny odpowiadają za odporność komarów na patogeny przenoszone przez wektory. Niniejszy protokół wideo przedstawia metodę stosowaną w laboratorium Dimopoulosa do wstrzykiwania dsRNA komarom Anopheles gambiae, będącym nosicielami pasożyta malarii. Przedstawiono technikę przygotowania zestawu do iniekcji oraz proces wstrzykiwania dsRNA do klatki piersiowej owada.

Protokół analiz RNAi u dorosłych komarów (A. gambiae)

Krzyżowanie genetyczne pasożytów malarii gryzoni przeprowadza się poprzez podanie dwóch genetycznie odmiennych pasożytów komarom. Potomstwo rekombinacyjne jest klonowane z krwi mysiej po tym, jak komary ukąsiły zainfekowane myszy. Niniejszy film pokazuje, jak przeprowadzić krzyżowanie genetyczne Plasmodium yoelii; metoda ta ma zastosowanie również do innych pasożytów malarii gryzoni.

Protokół otrzymywania krzyżówki genetycznej pasożytów malarii gryzoni

Analizy RNA-Seq stają się coraz ważniejsze dla identyfikacji molekularnych podstaw cech adaptacyjnych w organizmach niemodelowych. W tym miejscu opisano protokół identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji między komarami Aedes albopictus z diapauzą i bez diapauzy, od hodowli komarów po sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne danych RNA-Seq.

Eksperymentalny i bioinformatyczny protokół do analiz sekwencyjnych RNA diapauzy fotoperiodycznej u azjatyckiego komara tygrysiego, Aedes albopictus

Poprzez inokulację koralikami, opisana technika umożliwia stymulację reakcji melanizacji komarów w układzie krążenia hemolimfy. Ilość melaniny pokrywającej koraliki można zmierzyć po rozbiorze jako miarę odpowiedzi immunologicznej.

Inokulowanie komarów Anopheles gambiae koralikami w celu wywołania i zmierzenia odpowiedzi immunologicznej melanizacji

Komary Aedes aegypti zakażone Wolbachią są uwalniane do naturalnych populacji w celu zahamowania transmisji arbowirusów. Opisujemy metody hodowli Ae. aegypti z infekcjami Wolbachia w laboratorium do eksperymentów i uwolnienia w terenie, podejmując środki ostrożności w celu zminimalizowania adaptacji i selekcji laboratoryjnej.

Utrzymywanie komarów Aedes aegypti zakażonych Wolbachia

Dwuczęściowy system GAL4-UAS jest wszechstronnym narzędziem do modyfikacji ekspresji genów w kontrolowany sposób czasoprzestrzenny, co pozwala na funkcjonalną analizę genetyczną w Anopheles gambiae. Opisane procedury korzystania z tego systemu to częściowo ustandaryzowana strategia klonowania, określanie płci i badanie przesiewowe poczwarek pod kątem fluorescencyjnych markerów białkowych i utrwalanie zarodków.

Wykorzystanie systemu GAL4-UAS do genetyki funkcjonalnej u Anopheles gambiae

Protokół opisuje, jak dokonać zmian w genomie komarów malarii Anopheles za pomocą systemu φC31. Opisane modyfikacje obejmują zarówno integrację, jak i wymianę transgenicznych kaset w genomie linii dokujących zawierających attP.

Ukierunkowana na miejsce integracja za pośrednictwem φC31 i wymiana kaset w wektorach Anopheles malarii

Technika sterylnych owadów (SIT) jest używana do kontrolowania określonych, ważnych z medycznego punktu widzenia populacji komarów, które mogą być odporne na chemiczne kontrole. W tym miejscu opisujemy metodę masowego chowu i przygotowania bezpłodnych samców komarów do wypuszczenia na wolność w operacyjnym programie SIT ukierunkowanym na komara Aedes aegypti.

Przygotowanie napromieniowanych i oznakowanych samców komarów Aedes aegypti do uwolnienia w operacyjnym programie techniki sterylnych owadów

Techniki mikroiniekcji są niezbędne do wprowadzenia egzogennych genów do genomów komarów. Protokół ten wyjaśnia metodę stosowaną przez laboratorium Jamesa do mikrowstrzykiwania konstruktów DNA do embrionów Anopheles gambiae w celu wygenerowania przekształconych komarów.

Metoda mikroiniekcji dla zarodków Anopheles gambiae

Poznaj metody hodowli komarów Anopheles gambiae w warunkach laboratoryjnych, obejmujące wszystkie etapy rozwoju. Technika ta wspiera badania nad malarią i kontrolą wektorów.

Protokół hodowli komarów (A. gambiae)

Przeglądaj więcej filmów