Protokół hodowli komarów (A. gambiae)

Nazywam się Shish i jestem pracownikiem podoktorskim w laboratorium dr. George'a OU w John Hopkins School of Public Health. W Katedrze Mikrobiologii Molekularnej i Immunologii pokażę, jak hodować komary z gatunku Anopheles gambiae. W laboratorium utrzymujemy je w insektarium, w którym temperatura wynosi zazwyczaj 27 stopni Celsjusza, a wilgotność 80%.

W pomieszczeniu insektarium utrzymywany jest również 12-godzinny cykl dnia i nocy, aby móc naśladować warunki naturalne. Jest to nasze pomieszczenie insektarium, które stanowi tutejszą jednostkę centralną służącą do hodowli owadów. Jak widać, znajdują się tutaj różne tace z komarami na wszystkich etapach rozwoju: jajami, różnymi stadiami larw oraz poczwarkami.

W tych tackach znajdują się larwy w wieku około 11 lub 12 dni, a tutaj znajduje się klatka, w której gromadzimy dorosłe komary i utrzymujemy je na 10% roztworze sacharozy. Aby rozpocząć hodowlę komarów, musimy podać im krew, ponieważ komary potrzebują białka zawartego we krwi do zniesienia jaj. Zatem dzień pierwszy przypada po zebraniu osobników dorosłych do klatki i utrzymywaniu ich na 10% roztworze sacharozy.

Pierwszego dnia należy nakarmić komary krwią, dlatego stosuje się sztuczną membranę do karmienia. Jest to karmidło szklane, którego używamy do karmienia komarów przez membranę. Krew wprowadza się do środka przez widoczny mały otwór, gdzie zostaje ona zatrzymana.

Na dole z boku znajdują się dwie dysze, które są podłączone do kąpieli wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C. Aby utrzymać krew w temperaturze 37 °C i przygotować dozownik do karmienia, pobieramy mały kawałek perilu. Rozciągamy go z dwóch końców oraz z wszystkich czterech boków, a następnie nakładamy na otwartą stronę szklanego dozownika, aby stworzyć cienką błonę imitującą skórę.

Jest to tzw. karmienie przez membranę. Jest to cyrkulacyjna łaźnia wodna, która utrzymuje wodę w temperaturze 37 °C i jednocześnie tłoczy ją przez szklany podajnik, aby krew pozostawała rozgrzana do 37 °C. Podłączamy szklany podajnik za pomocą małych kapilar do cyrkulacyjnej łaźni wodnej i włączamy urządzenie, aby woda zaczęła krążyć; woda i krew nigdy się nie mieszają, ponieważ znajdują się w dwóch oddzielnych komorach.

Jest to klatka z dorosłymi komarami Phis Gambi. Jest to szklany podajnik, który jest podłączony do łaźni cyrkulacyjnej; na górze klatki mocujemy zacisk i dodajemy 200 µL krwi. W klatce znajdują się zarówno samce, jak i samice komarów.

Tylko samice żywią się krwią. Żywienie trwa około 30 minut. Dwa dni po żywieniu krwią umieszczamy w klatce z komarami pojemniki z wodą, aby mogły złożyć w nich jaja.

Oto sposób przeprowadzenia tej procedury. Pobieramy mały zlew, wypełniamy go częściowo wodą destylowaną, a następnie nasączamy papier, zwijamy go w kształt stożka i umieszczamy w zlewce z wodą destylowaną, upewniając się, że papier zostanie odpowiednio zwilżony. Teraz powoli otwieramy klatkę z komarami, dbając o to, aby żadne owady nie uciekły, i umieszczamy wewnątrz kubeczki z jajami.

Następnego dnia po umieszczeniu kubków w klatce, czyli w czwartym dniu, są one powoli z niej wyjmowane. To są jaja, te czarne, wśród których znajdują się również martwe komary. Po przygotowaniu jaj należy umieścić je na plastikowej tacy.

Następnie plastikową tackę napełnia się wodą destylowaną. Należy wyjąć papier filtracyjny z ikrami i umieścić go w tacy. Dodajemy również szczyptę pokarmu A, będącego zmieloną karmą dla ryb, a następnie wstawiamy tackę do stojaka.

Taca powinna zostać wypoziomowana w dniu jej przygotowania, a tutaj wskazano, jakie to gatunki. Dzieje się to następnego dnia po umieszczeniu jaj w tacy. Oznacza to, że mają one jeden dzień, ale właściwy protokół rozpoczyna się w piątym dniu rozwoju komarów.

Te czarne obiekty to jaja, z których za chwilę wyklują się larwy. A to jest pokarm dla komarów. Do hodowli komarów zazwyczaj stosujemy trzy rodzaje pokarmów.

Pokarm A to w rzeczywistości zmielona karma dla ryb; dodajemy go podczas rozpoczynania hodowli komarów, gdy znajdują się one w stadium X, podając każdego dnia dwie tabletki pokarmu C, którym jest karma dla kotów marki Purina. Po ośmiu lub dziewięciu dniach wymieniamy wodę w kuwecie na świeżą. W tym czasie, zamiast pokarmu A, dodajemy szczyptę pokarmu B, który jest po prostu zmielonym pokarmem C (zmieloną karmą dla kotów), a także dwie tabletki pokarmu C, aby jaja wykluły się w larwy.

Wyróżniamy trzy różne stadia larw. Pierwsze stadium w instalacji, drugie stadium w instalacji oraz trzecie stadium w instalacji. Są to tacki zawierające larwy w wieku pięciu lub sześciu dni.

Są to Ravi, które znajdują się na znacznie późniejszym etapie rozwoju, mają około 9 do 10 dni. W międzyczasie woda była wymieniana i dodawano świeżą wodę oraz świeży pokarm. W tej tacy znajdują się zarówno osobniki dorosłe, jak i ppe.

Oto osobniki dorosłe, jak widać, latające pod moskitierami. Na krawędzi widoczne są ciemnobarwne poczwarki, z których wyklują się osobniki dorosłe. Po pojawieniu się dorosłych osobników są one gotowe do zebrania do klatki, która wygląda w ten sposób.

Wewnątrz znajduje się wyściółka z ręcznika papierowego, mała buteleczka zawierająca 10% super solution oraz bawełniana puszka z mydłem, które będą służyć jako źródło pożywienia dla komarów. Przykryliśmy pokrywę; jest to aparatura, aspirator, który jest podłączony do pompy próżniowej, za pomocą której będziemy zbierać osobniki dorosłe z tych tacek. Ta część aspiratora jest podłączona tutaj i znajduje się na drugim końcu.

Podłączono do pompy próżniowej. Wkładamy klatkę, do której będziemy zbierać osobniki dorosłe w tym małym pudełku. To kolejna część aspiratora z długą rurką, którą umieścimy wewnątrz tacy z komarami.

Drugi koniec zostanie podłączony do klatki. Należy upewnić się, że wszystkie połączenia są szczelne, aby próżnia działała prawidłowo. Zamykamy pokrywę i sprawdzamy szczelność całego układu.

Powoli uruchom system sterujący. Gdy konfiguracja będzie gotowa, ostrożnie wsuwamy tę długą rurkę do tacy z komarami, upewniając się, że siatka jest zamknięta i komary nie uciekły. Jak widać, komary są zbierane w małej klatce.

Powoli przesuwaj pipetę po całej powierzchni, aby zebrać wszystkie osobniki dorosłe. Już prawie kończę. Wszystkie osobniki dorosłe zostały zebrane i znajdują się w tej klatce, którą możecie zobaczyć.

Następnie powoli zwalniamy próżnię i demontujemy aparat do zbierania. Są to dorosłe komary Anopheles gambiae, które będą przebywać w tej klatce przez kilka dni. Będą żywić się 10% sacharozą, a krew zostanie im podana w celu pobudzenia do składania jaj.

Właśnie pokazałem Państwu, jak hodować komary. W warunkach laboratoryjnych najważniejszymi etapami są: przygotowanie pokarmu krwi, następnie umieszczenie pojemników na jaja, monitorowanie jaj, a potem przejście przez kolejne stadia rozwojowe, takie jak larwy, poczwarki i osobniki dorosłe.

Na koniec zbieramy osobniki dorosłe. Znaczenie tej techniki polega na konieczności odtworzenia warunków panujących w naturze, aby uzyskać zdrowe komary, które następnie zakażamy plasmodium i poddajemy różnym badaniom nad malarią, których głównym celem jest całkowite wyeliminowanie tej choroby ze świata.