Name: Analiza interakcji Schwann-astrocyty za pomocą testów in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-13T23:59:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Poznaj metody in vitro do badania interakcji komórek Schwanna z astrocytami. Techniki te pomagają zrozumieć mechanizmy regeneracji rdzenia kręgowego i poprawić skuteczność terapii komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Philippie Warren za okazaną pomoc.

1. Analiza granic:
<ol>
<li>Podstawowe przygotowanie: Slajdy komorowe są powlekane poli-D-lizyną przez noc, a sterylizowane szkiełka przedmiotowe są przygotowywane przed rozpoczęciem eksperymentu. Pożywkę przygotowuje się, stosując Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) uzupełnione o 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) oraz 1% penicyliny-streptomycyny-fungizonu (PSF). Przygotowywana jest również butelka zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) wolnego od wapnia i magnezu.</li>
<li>Pierwotne hodowle komórek Schwanna szczura w kolbach są trypsynizowane przez 3 minuty przy użyciu 0,1% trypsyny. Pierwotne hodowle astrocytów szczura są trypsynizowane przez 5 minut przy użyciu 0,1% trypsyny. 
Trypsynę dezaktywuje się poprzez dodanie DMEM uzupełnionego o 10% FCS i 1% PSF.</li>
<li>Trypsynizowane komórki Schwanna i astrocyty przenosi się do oddzielnych probówek Falcon o pojemności 15 mL i wiruje przy 300G przez 5 minut.</li>
<li>Komórki Schwanna i astrocyty resuspenduje się do gęstości 2 x 106 (zmiany w gęstości komórek opisano w sekcji wyników reprezentatywnych).</li>
<li>Kroplę 50 μL zawiesiny komórek Schwanna umieszcza się na jednym końcu dołków slajdu komorowego powleczonego PDL. Do rozmazania kropli w kierunku centrum komory w celu uzyskania prostej krawędzi użyto paska szklanego. (Za pomocą przecinaka do szkła wycinane są podłużnie prostokątne szkiełka zakrywki tak, aby pasowały do szerokości slajdów komorowych używanych w testach granic).</li>
<li>Drugą kroplę 50 μL zawiesiny astrocytów umieszczono na przeciwległym końcu tego samego dołka i rozmazano w kierunku centrum, aby utworzyć prostą krawędź równoległą do rozmazania pierwszej kropli, z niewielką przerwą 0,2 mm między nimi.</li>
<li>Slajdy komorowe z kroplami umieszcza się w inkubatorze w temperaturze 37°C na 2 godziny.</li>
<li>Po 2 godzinach hodowle przemyto DMEM w celu usunięcia nieprzylegających szczątków komórkowych i dodano świeżą pożywkę DMEM/ 10%FCS/ 1% PSF. 
Uwaga: Pożywkę DMEM/ 10%FCS/ 1% PSF można uzupełnić o forskolinę (2μM) i ekstrakt z przysadki wołowej (BPE) (10μg/mL), aby stymulować proliferację komórek Schwanna. BPE dostarcza czynników wzrostu niezbędnych do długoterminowej hodowli komórek Schwanna, a forskolina podnosi poziom cyklicznego adenozynomonofosforanu w komórkach Schwanna w celu indukcji proliferacji.</li>
<li>Komórki hoduje się przez około 8-10 dni w inkubatorze w temperaturze 37°C i 7% CO2. Pożywkę należy wymieniać co 3 dni. Dwa fronty komórek ostatecznie spotkają się, a między dwoma typami komórek utworzy się wyraźna granica. Na tym etapie można przeprowadzić eksperymenty analizujące czynniki zaangażowane w tworzenie granicy.</li>
<li>Współhodowlę można utrwalić za pomocą 4% formaldehydu; komórki Schwanna można poddać immunobarwieniu przeciwciałem anty-P75, a astrocyty przeciwciałami anty-GFAP, aby zidentyfikować komórki w współhodowli. Przeciwciało P75 rozpoznaje receptor NGF o niskim powinowactwie na komórkach Schwanna, którego brakuje astrocytom. Przeciwciało anty-GFAP rozpoznaje kwaśne białko włókniste glii, które lokalizuje się w cytoplazmie astrocytów. (Przedstawicielską granicę przedstawiono na rysunku 1A).</li>
</ol>
2. Test migracji:
<ol>
<li>Płytki 4-dołkowe (dołki 15 mm) są powlekane PDL przez noc i przygotowywane do tworzenia monowarstw astrocytów.</li>
<li>Pierwotna hodowla astrocytów jest trypsynizowana przez 5 minut przy użyciu 0,1% trypsyny.
Trypsynę inaktywuje się poprzez dodanie DMEM uzupełnionego o 10% FCS i 1% PSF, a następnie komórki odwiruje się przy 300G przez 5 minut. (Patrz Rysunek 2)</li>
<li>Astrocytów resuspenduje się do stężenia 1x105 cells/ mL. 1 mL tego roztworu dodaje się do każdego powlekanego PDL dołka w płytkach 4-dołkowych. Astrocytów hoduje się przez 24-48 godzin, aż monowarstwa stanie się całkowicie konfluenta.</li>
<li>Aby ocenić migrację komórek Schwanna na monowarstwach astrocytów, równolegle do tworzenia monowarstw astrocytów, okrągłe, powlekane PDL szklane przykrywki umieszcza się w probówce 50 mL i kruszy za pomocą plastikowej pipety, aby stworzyć małe fragmenty szkła.</li>
<li>Fragmenty szkła przenosi się do dołka w płytce 6-dołkowej, a następnie za pomocą pincety wybiera się fragmenty o odpowiedniej wielkości i umieszcza je w pozostałych dołkach. W każdym dołku płytki 6-dołkowej umieszcza się 5 fragmentów szkła.</li>
<li>Pierwotne komórki Schwanna hodowane w kolbie są trypsynizowane przez 3 minuty przy użyciu 0,1% trypsyny. Trypsynizowane komórki Schwanna przenosi się do oddzielnej probówki Falcon 15 mL i odwiruje przy 300 G przez 5 minut. Komórki Schwanna resuspenduje się do stężenia 2x 106 cells/ mL w DMEM/10% FCS/1% PSF.</li>
<li>Kropelki 20 μL zawiesiny komórek Schwanna dodaje się na każde 5 fragmentów przykrywek umieszczonych w płytkach 6-dołkowych, a następnie komórki inkubuje przy 37°C, 7% CO2 przez 2 godziny.</li>
<li>Po 2 godzinach komórki Schwanna przywierają do fragmentów przykrywek i do każdego dołka dodaje się DMEM/10% FCS/1% PSF (uzupełniony o 2μM forskoliny i 10μg/ mL BPE) tak, aby fragmenty były całkowicie przykryte medium.</li>
<li>Płytki 6-dołkowe zawierające fragmenty umieszcza się następnie w inkubatorze na 24-48 godzin, aż fragmenty szkła zostaną całkowicie pokryte konfluentnymi komórkami Schwanna.</li>
<li>Gdy fragmenty staną się konfluentne z komórkami Schwanna, każdy fragment ostrożnie podnosi się za pomocą ostrej pincety, zanurza w HBSS w celu usunięcia nieprzywierających komórek, a następnie odwraca stroną komórek do dołu na monowarstwę astrocytów.</li>
<li>Każdy dołek przykrywa się następnie 1 mL DMEM/10% FCS/1% PSF i pozwala komórkom Schwanna migrować przez okres od 24 do 48 godzin. W tym czasie można dodawać odczynniki eksperymentalne, takie jak czynniki wzrostu, aby ocenić ich wpływ na liczbę i dystans migracji komórek Schwanna.</li>
<li>Po okresie migracji fragmenty szkła utrwala się do dna każdego dołka, dodając 4% paraformaldehydu (PFA) na 30 minut. Po utrwaleniu wykonuje się immunostynowanie komórek Schwanna przeciwko p75 (rozpoznając receptor NGF o niskim powinowactwie), a następnie barwi się je przy użyciu zestawu ABC strepavidin-diaminobenzydyna (DAB), aby umożliwić wizualizację komórek Schwanna pod mikroskopem świetlnym.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki:
Po 8–10 dniach kokultury komórek Schwanna i astrocytów wykazują wyraźną granicę między tymi dwoma typami komórek. Granica ta jest bardziej zaznaczona w przypadku zastosowania forskoliny i BPE w hodowli, ponieważ wzmacnia to proliferację komórek Schwanna.
Jeśli w ciągu 10 dni nie zaobserwowano granicy, czas hodowli można dodatkowo wydłużyć do momentu ukształtowania się granic. Alternatywnym sposobem na zwiększenie formowania się granic jest zmiana stosunku gęstości komórek. Podczas przygotowywania zawiesin komórkowych można zastosować stosunek gęstości komórek Schwanna do astrocytów wynoszący 3:1 8,18.
Po przeprowadzeniu immunobarwienia w celu identyfikacji komórek Schwanna i astrocytów, aby ocenić stopień przemieszania się komórek, można wyznaczyć linię stanowiącą granicę i pod mikroskopem fluorescencyjnym policzyć liczbę komórek Schwanna migrujących na obszar zajęty przez astrocyty.
Poniżej przedstawiono dwa przykłady obrazów uzyskanych granic, jeden z dobrze uformowaną segregacją komórek Schwanna i astrocytów (Rycina 1A) oraz jeden, w którym komórki nie oddzieliły się prawidłowo na różne obszary z powodu błędnej techniki (Rycina 1B).
<img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig2.jpg" alt="Tworzenie sieci neuronalnej w mikroskopii fluorescencyjnej; barwienie zielone i czerwone, badanie interakcji komórkowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Test granicy: interakcja komórek Schwanna i astrocytów. A) 10-dniowy test kokultury w obecności forskoliny i BPE w celu stymulacji proliferacji komórek Schwanna wykazuje wyraźną granicę między dwoma typami komórek (czerwony=P75, zielony=GFAP). B) 10-dniowy test kokultury, w którym nie utworzyła się granica, a fronty obu typów komórek wymieszały się. Było to spowodowane zmieszaniem dwóch kropel podczas umieszczania kropel astrocytów i komórek Schwanna obok siebie podczas przygotowywania granicy (czerwony=P75, zielony=GFAP).
<img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopowy hodowli komórkowej, badanie morfologii i struktury komórek, narzędzie badawcze w biologii." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywny obraz konfluencyjnej monowarstwy astrocytów
Testy migracji oceniają przemieszczanie się jednego typu komórek po powierzchni innego typu komórek, a zatem analizują zjawisko odmienne od formowania się granicy.
Wymagana jest praktyka, aby upewnić się, że odwracanie szkiełek nakrywkowych na monowarstwy nie prowadzi do uszkodzenia fragmentów szkła pokrytych komórkami Schwanna oraz monowarstw astrocytów przez ostre pęsety. Aby ocenić migrację komórek Schwanna, pod mikroskopem świetlnym można zmierzyć maksymalny dystans migracji oraz liczbę komórek migrujących z krawędzi szkiełka nakrywkowe.
Poniżej znajduje się obraz komórek Schwanna wybarwionych przeciwciałem P75 z zastosowaniem barwienia DAB na powierzchni monowarstwy astrocytów (Rysunek 3). 
<img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig3.jpg" alt="Obraz mikroskopowy wzrostu strzępek grzyba; analiza mikrobiologiczna, badanie strukturalne, morfologia komórki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Test migracji z wykorzystaniem metody odwróconego szkiełka podstawowego.
A) Komórki Schwanna (brązowe, wybarwione immunochemicznie przeciwciałem p75) migrujące od krawędzi szkiełka podstawowego. Strzałka wskazuje kierunek migracji komórek od szkiełka.

<ol><li>Assouline, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+astrocytes+and+Schwann+cells+in+culture+synthesize+nerve+growth+factor-like+neurite-promoting+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors.</a> Brain Res. 428, 103-118 (1987).</li>
<li>Taylor, J. S., Bampton, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+secreted+by+Schwann+cells+stimulate+the+regeneration+of+neonatal+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells.</a> J Anat. 204, 25-31 (2004).</li>
<li>Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+and+cell+adhesion+molecules%3A+neuronal+receptors+that+regulate+axon+growth+on+extracellular+matrices+and+cell+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces.</a> Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).</li>
<li>Chiu, A. Y., Monteros,, Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+and+s-laminin+are+produced+and+released+by+astrocytes%2C+Schwann+cells%2C+and+schwannomas+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture.</a> Glia. 4, 11-24 (1991).</li>
<li>Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+of+CNS+axons+by+Schwann+cells+transplanted+from+the+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve.</a> Nature. 266, 68-69 (1977).</li>
<li>Andrews, M. R., Stelzner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+olfactory+ensheathing+and+schwann+cells+after+implantation+into+a+dorsal+injury+of+adult+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord.</a> J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).</li>
<li>Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+transplanted+into+normal+and+X-irradiated+adult+white+matter+do+not+migrate+extensively+and+show+poor+long-term+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival.</a> Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).</li>
<li>Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+and+Schwann+cells+differ+in+their+in+vitro+interactions+with+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes.</a> Glia. 32, 214-225 (2000).</li>
<li>Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+induce+less+host+astrocyte+response+and+chondroitin+sulphate+proteoglycan+expression+than+Schwann+cells+following+transplantation+into+adult+CNS+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter.</a> Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).</li>
<li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-Schwann+cell+interactions+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-Schwann cell interactions in culture.</a> Glia. 11, 367-377 (1994).</li>
<li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfate+proteoglycan+staining+in+astrocyte-Schwann+cell+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures.</a> Glia. 14, 145-152 (1995).</li>
<li>Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+proteoglycan+immunoreactivity+is+higher+at+the+caudal+than+the+rostral+Schwann+cell+graft-transected+spinal+cord+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface.</a> Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).</li>
<li>Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrogliosis+limits+the+integration+of+peripheral+nerve+grafts+into+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord.</a> Brain Res. 277, 175-180 (1983).</li>
<li>Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+oligodendrocyte+precursors+on+astrocytes+and+meningeal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells.</a> Dev Biol. 171, 1-15 (1995).</li>
<li>Wilby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Cadherin+inhibits+Schwann+cell+migration+on+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes.</a> Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).</li>
<li>Grimpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+proteoglycans+in+Schwann+cell%2Fastrocyte+interactions+and+in+regeneration+failure+at+PNS%2FCNS+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces.</a> Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).</li>
<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+migration+is+integrin-dependent+and+inhibited+by+astrocyte-produced%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced.</a> Glia. , (2010).</li>
<li>Santos-Silva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF%2Fheparin+differentially+regulates+Schwann+cell+and+olfactory+ensheathing+cell+interactions+with+astrocytes%3A+a+role+in+astrocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis.</a> J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).</li>
<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-produced+ephrins+inhibit+schwann+cell+migration+via+VAV2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling.</a> J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisane powyżej testy zostały wykorzystane w różnych badaniach wykazujących rolę wielu czynników zaangażowanych w tworzenie granicy między astrocytami a komórkami Schwanna oraz ograniczoną migrację komórek Schwanna w środowisku astrocytarnym.
Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw tych zdarzeń jest kluczowe, ponieważ pozwoliłoby na opracowanie strategii optymalizacji i poprawy integracji przeszczepów komórek Schwanna po transplantacji, a tym samym ułatwiłoby wyjście regenerujących się aks...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>PSF</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Invitrogen</td><td>13028-014</td><td></td></tr><tr><td>Forskolina</td><td>Calbiochem</td><td>344273</td><td></td></tr><tr><td>Kryszki</td><td>VWR international</td><td>631-0149</td><td></td></tr><tr><td>Kryszki (prostokątne)</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka z komorami</td><td>Nalge Nunc international</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 4-dołkowe, płytki 6-dołkowe</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td>Płytki 4-dołkowe, płytki 6-dołkowe</td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwko rat p75</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB365</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwko GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała wtórne (sprzężone z Alexa)</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004 A-11034</td><td>Kozie anty-mysie 568, Kozie anty-królicze 488</td></tr><tr><td>Przeciwciała wtórne biotynylowane</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td>Kozie anty-mysie</td></tr><tr><td>Tabletki DAB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4418</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ABC elite</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna pęseta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6168</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosave</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza interakcji między komórkami schwanna a astrocytami z wykorzystaniem testów in vitro

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Komórki Schwanna są jednymi z najczęściej wykorzystywanych komórek w strategiach naprawczych po urazach rdzenia kręgowego. Komórki Schwanna są zdolne do wspierania regeneracji i kiełkowania aksonów poprzez wydzielanie czynników wzrostu 1,2 oraz dostarczanie promujących wzrost cząsteczek adhezyjnych 3 i cząsteczek macierzy zewnątrzkomórkowej 4. Dodatkowo mielinizują one zdemielinizowane aksony w miejscu urazu 5.
Jednakże po transplantacji komórki Schwanna nie migrują z miejsca implantacji i nie mieszają się z astrocytami gospodarza 6,7. Prowadzi to do powstania ostrej granicy między komórkami Schwanna a astrocytami, co stanowi przeszkodę dla rosnących aksonów próbujących opuścić przeszczep i powrócić do tkanki gospodarza proksymalnie i dystalnie. Astrocyty w kontakcie z komórkami Schwanna ulegają również hipertrofii i zwiększają ekspresję cząsteczek inhibicyjnych 8-13.
In vitro testy były wykorzystywane do modelowania interakcji między komórkami Schwanna a astrocytami i odegrały istotną rolę w zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw zachowania komórkowego.
Te testy in vitro obejmują test granicy, w którym tworzona jest ko-kultura z dwóch różnych typów komórek, przy czym każdy typ zajmuje odrębne obszary, oddzielone jedynie niewielką przerwą między frontami komórkowymi. W miarę jak komórki dzielą się i migrują, dwa fronty komórkowe zbliżają się do siebie, aż w końcu dochodzi do ich zderzenia. Pozwala to na analizę zachowania dwóch populacji komórkowych na granicy styku. Inną odmianą tej samej techniki jest zmieszanie dwóch populacji komórkowych w kulturze, co z czasem prowadzi do segregacji obu typów komórek, w wyniku czego komórki Schwanna skupiają się w postaci wysepek pomiędzy astrocytami, tworząc w ten sposób liczne granice między komórkami Schwanna a astrocytami.
Drugim testem stosowanym w badaniu interakcji dwóch typów komórek jest test migracji, w którym ruch komórek może być śledzony na powierzchni monowarstwy drugiego typu komórek 14,15. Test ten jest powszechnie znany jako test odwróconego szkiełka podstawowego. Komórki Schwanna hoduje się na małych fragmentach szkła, które następnie odwraca się i kładzie powierzchnią do dołu na powierzchni monowarstw astrocytów, a migrację ocenia się od krawędzi szkiełka.
Oba testy odegrały kluczową rolę w badaniu mechanizmów leżących u podstaw wykluczania komórkowego i tworzenia granic. Do cząsteczek zidentyfikowanych przy użyciu tych technik należą m.in. N-kadheryny 15, proteoglikany siarczanu chondroityny (CSPGs) 16,17, FGF/heparyna 18 oraz Eph/efryny19.
Niniejszy artykuł ma na celu opisanie testu granicznego (boundary assay) oraz testu migracji w sposób etapowy i wyjaśnienie możliwych problemów technicznych, które mogą wystąpić.

Niniejszy artykuł ma na celu opisanie w sposób etapowy powszechnie stosowanych testów in vitro wykorzystywanych w badaniu oddziaływań między komórkami Schwanna a astrocytami.

Analiza interakcji między komórkami Schwanna a astrocytami z wykorzystaniem testów in vitro

Komórki Schwanna są jednymi z najczęściej wykorzystywanych komórek w strategiach naprawczych po urazach rdzenia kręgowego. Komórki Schwanna są zdolne do wspierania aksonalnego...

Komórki Schwanna to komórki glejowe obwodowego układu nerwowego, które są wykorzystywane w naprawie uszkodzeń rdzenia kręgowego. Dostarczają one przede wszystkim czynników wzrostu wspierających regenerację aksonów oraz promujących wzrost cząsteczek adhezyjnych i macierzy pozakomórkowej. Ponadto mielinizują one aksony w miejscu urazu.Niestety, przeszczepione komórki swan nie migrują z miejsca implantacji i nie mieszają się z astrocytami gospodarza. Prowadzi to do powstania ostrej granicy i uniemożliwia integrację rosnących aksonów z tkanką gospodarza. W tym filmie zastosowano dwie metody badania oddziaływań komórek swan i astrocytów in vitro.W pierwszej kolejności zaprezentowano test graniczny, w którym na szkiełku ustanowiono i wyhodowano obszary zajęte przez komórki łabędziowe oraz astrocyty. Następnie do szkiełka dodano różne odczynniki i kontynuowano hodowlę. Szkiełka zostały następnie poddane obrazowaniu i analizie w celu określenia wpływu odczynników na migrację komórek łabędziowych do obszaru astrocytowego lub odwrotnie.Następnie zaprezentowano test migracji, w którym fragmenty szkiełek podstawowych pokryte gniazdami komórek Schwanna są odwracane na monowarstwy astrocytów. Ponownie do pożywki hodowlanej dodaje się różne odczynniki, a następnie wykonuje obrazowanie hodowli w celu oceny zakresu i dystansu migracji komórek Schwanna na monowarstwach astrocytów. Ostatecznie ten rodzaj testu powinien ułatwić opracowanie strategii optymalizacji i poprawy integracji przeszczepów komórek Schwanna po transplantacji.Zaletą tych testów in vitro w porównaniu z istniejącymi metodami, w których ocenia się migrację na czystych podłożach, jest ich większa korelacja z badaniami in vivo, w których przeszczepione kom clergy wchodzą w kontakt z astrocytami. Ponadto testy in vitro te mogą być wykorzystywane w innych dziedzinach, takich jak biologia komórki, w celu udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące m.in. inwazji i migracji komórek nowotworowych. Przed rozpoczęciem testu należy przygotować następujące elementy: szkiełka komorowe pokryte poli-D-lizyną, sterylne szkiełka przedmiotowe, pożywkę do hodowli komórek oraz butelkę z wapniem.W przypadku roztworu wyjściowego zrównoważonej soli Hanksa bez magnezu należy rozpocząć od inkubacji pierwotnych komórek Schwanna z trypsyną przez trzy minuty oraz pierwotnych astrocytów szczura przez pięć minut. Po odklejeniu się komórek należy dezaktywować trypsynę, dodając pożywkę hodowlaną. Następnie komórki Schwanna oraz astrocyty należy przenieść do oddzielnych probówek Falcon o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 ×g przez pięć minut.W międzyczasie, używając przecinaka do szkła, należy przeciąć prostokątne szkiełka nakrywkowe wzdłuż, tak aby pasowały do szerokości szkiełek komorowych stosowanych w testach granicznych i ułatwiały rozcieranie kropli zawiesiny komórek. Po resuspensji w wirówce, należy zawiesić komórki Schwanna oraz astrocyty w zagęszczeniu 2 × 10⁶ komórek/ml. Na jednym końcu szkiełka komorowego pokrytego polilizyną należy umieścić jedną kroplę 50 µL zawiesiny komórek Schwanna.Użyj szklanej lamellipse, aby rozmazać kroplę w kierunku środka komory, tworząc prostą krawędź. Następnie nanieś drugą kroplę 50 µL zawiesiny astrocytów na przeciwległym końcu tej samej studzienki i rozmaż ją w stronę środka. Aby utworzyć prostą krawędź równoległą do pierwszej, pomiędzy nimi powinna pozostać przerwa o szerokości 0,2 mm.Umieść slajd komorowy z kroplami w inkubatorze w temperaturze 37°C na dwie godziny. Po dwóch godzinach przemyj hodowle medium DMEM, aby usunąć wszelkie nieprzytwierdzone szczątki komórkowe.Aby stymulować proliferację komórek Schwanna, należy dodać pożywkę do szkiełek z komorami. Pożywka ta jest uzupełniona o forskolinę oraz ekstrakt z przysadki wołowej (BPE). Forskolina podnosi poziom cyklicznego AMP w komórkach Schwanna w celu indukcji proliferacji, natomiast BPE dostarcza czynników wzrostu niezbędnych do długoterminowej hodowli.Inkubować preparat od ośmiu do 10 dni. Dwa fronty komórek w końcu spotkają się, a między dwoma typami komórek utworzy się wyraźna granica. Na tym etapie można przeprowadzić eksperymenty.Aby przeanalizować czynniki uczestniczące w formowaniu granicy i zbadać tę granicę, należy utrwalić kokulturę 4% formaldehydem. Aby odróżnić komórki Schwanna od astrocytów, należy przeprowadzić barwienie immunohistochemiczne odpowiednio z przeciwciałem anty-P75 oraz przeciwciałem anty-GFAP. Przeciwciało anty-P75 rozpoznaje receptor NGF o niskim powinowactwie obecny w komórkach Schwanna, którego brakuje w astrocytach, natomiast przeciwciało anty-GFAP rozpoznaje kwaśne białko włókienstwa gliae, które lokalizuje się w astrocytach, w celu przeprowadzenia testu migracji.Rozpocznij wysiewanie komórek. Do każdej studni płytki czterostudniowej z dołkami o średnicy 15 mm dodaj 1×10⁵ astrocytów w 1 ml medium. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 24 do 48 godzin, aż warstwa jednorodna osiągnie pełną konfluencję.W międzyczasie, aby przygotować komórki swan do oceny migracji na monowarstwach astrocytów, umieść okrągłe szkiełka podstawkowe pokryte polilizyną w probówce o pojemności 50 ml i użyj plastikowego tłoka, aby je rozbić, tworząc małe fragmenty szkła. Przenieś fragmenty szkła do jednej dołki płytki sześciodołkowej za pomocą pęsety. Wybierz fragmenty o szerokości około 5 mm i przenieś po pięć z nich do każdego z pozostałych dołków.Inkubuj komórki Schwanna z trypsyną przez trzy minuty. Następnie przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj je przy 300 ×g przez pięć minut. Resuspenduj komórki Schwanna w pożywce hodowlanej do stężenia 2 × 10⁶ komórek/ml.Następnie nanieś 20 µL zawiesiny komórek Schwanna na każdy fragment i inkubuj w temperaturze 37 °C i 7% CO2 przez dwie godziny. Po dwóch godzinach wyjmij komórki Schwanna z inkubatora. Do każdej studzienki dodaj odpowiednią ilość pożywki hodowlanej uzupełnionej o 2 µM, 4 scale in oraz 10 µg/mL BPE.Następnie fragmenty z przytwierdzonymi komórkami należy całkowicie przykryć pożywką i inkubować przez 24 do 48 godzin, aż fragmenty szkła zostaną w pełni zarośnięte przez komórki typu swan. Gdy fragmenty zostaną zarośnięte przez komórki typu swan, należy wyjąć z inkubatora zarówno komórki typu swan, jak i astrocyty. Za pomocą pincety należy ostrożnie podnieść każdy fragment z przytwierdzonymi komórkami typu swan.Zanurz fragment w HBSS, aby usunąć nieprzytwierdzone komórki, a następnie odwróć go powierzchnią do dołu na monowarstwę astrocytów. Po przeniesieniu wszystkich fragmentów dodaj jeden mililitr pożywki hodowlanej do każdej dołki.Jeśli oceniane będą efekty odczynników eksperymentalnych, takich jak czynniki wzrostu, należy dodać je do pożywki. Płytkę należy zwrócić do inkubatora i pozostawić komórki Schwanna do migracji na 24 do 48 godzin po okresie migracji. Fragmenty szkła utrwala się do dna każdej studni poprzez dodanie 4% paraformaldehydu na 30 minut po utrwaleniu.Przeprowadź barwienie immunohistochemiczne komórek Schwanna na P 75, a następnie zabarw je przy użyciu zestawu ABC Strept ADIN z dodatkiem DAB, aby umożliwić wizualizację komórek Schwanna pod mikroskopem świetlnym po 10 dniach. Ko-kultura komórek Schwanna i astrocytów wykazuje wyraźną granicę między dwoma typami komórek. Tutaj komórki Schwanna są zidentyfikowane za pomocą P 75.Barwienie receptora NGF o niskim powinowactwie przedstawiono w kolorze czerwonym, natomiast astrocyty zidentyfikowano za pomocą barwienia GFAP w kolorze zielonym. Granica między tymi komórkami jest bardziej wyraźna w przypadku zastosowania forskoliny i BPE w hodowli, ponieważ następuje zwiększenie proliferacji komórek Schwanna. W przeciwieństwie do tego, w niniejszym 10-dniowym teście kokultury komórki nie wyodrębniły się wyraźnie w różne obszary.Było to spowodowane nieprawidłową techniką i wymieszaniem dwóch typów komórek. Podczas przygotowywania testu granicy, testy migracji oceniają ruch jednego typu komórek po powierzchni innego typu komórek i tym samym oceniają zjawisko inne niż formowanie granicy. Ten obraz przedstawia komórki łabędzia migrujące od krawędzi szkiełka podstawowego, a strzałka wskazuje kierunek migracji komórek.Podczas przeprowadzania tych testów in vitro należy pamiętać, że odczynniki mogą oddziaływać albo na astrocyty, albo na komórki Schwanna, dlatego wymagane są kolejne eksperymenty, aby wykazać, który dokładnie typ komórek odpowiada za zaobserwowany wzrost lub spadek migracji. Ponadto można zastosować inne techniki, takie jak immunochemia, zwłaszcza w teście granicy (boundary assay), aby wykazać, które cząsteczki ulegają nadekspresji lub obniżeniu ekspresji na granicy między komórkami Schwanna a astrocytami.

analysis-of-schwann-astrocyte-interactions-using-in-vitro-assays

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza interakcji Schwann-astrocytów przy użyciu in vitro metod badawczych

Niniejszy artykuł opisuje nowy protokół oraz zestaw odczynników opracowanych do czułego pomiaru efektów neurotoksyczności związków i metod leczenia w kokulturach neuronów i astrocytów z wykorzystaniem analizy wysokotreściowej (high content analysis). Wyniki wskazują, że analiza wysokotreściowa stanowi obiecującą, nową technologię w ocenie neurotoksyczności.

Test kokultury neuronów i astrocytów do wysokoprzepustowej analizy treści (high content analysis) w badaniach neurotoksyczności

Niniejsze badanie opisuje procedury tworzenia nowatorskiej platformy do kokultury aksonów neuronalnych i (astro)gleju. W tym systemie kokultury możliwa staje się manipulacja bezpośrednią interakcją między pojedynczym aksonem (i pojedynczą komórką glejową), co pozwala na analizę mechanistyczną wzajemnego sygnalizowania między neuronem a glejem.

Analiza obrazowa oddziaływań neuronów z glejem w systemie kokultury aksonów neuronowych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej (MCP)

Tutaj opisujemy test migracji komórek Schwanna (SC), w którym SC są w stanie rozwijać się wzdłuż rozszerzających się aksonów.

Analiza rozwoju mysich komórek Schwanna wzdłuż rosnących aksonów

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Ten protokół opisuje pośrednią kokulturę neuron-astrocyt do analizy interakcji neuron-glej.

Test pośredniej kokultury neuron-astrocyty: zestaw in vitro do szczegółowego badania interakcji neuron-glej

Utrzymanie zasięgu bariery krew-mózg jest kluczowe dla homeostazy ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje techniki in vitro w celu nakreślenia podstawowych i patologicznych procesów, które modulują pokrycie bariery krew-mózg.

In vitro Testy oceniające tworzenie i rozrywanie naczyń przypominających siatkę bariery krew-mózg

Opisany tutaj protokół AWESAM jest optymalny do hodowli mysich astrocytów w izolacji od innych komórek mózgowych w szybki, prosty i tani sposób. Astrocyty AWESAM wykazują spontaniczną sygnalizację Ca2 +, morfologię i profile ekspresji genów podobne do astrocytów in vivo.

Hodowla mysich astrocytów podobnych do vivo przy użyciu szybkiego, prostego i niedrogiego protokołu AWESAM

Tutaj prezentujemy protokoły do badania upośledzenia jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia in vivo. W szczególności zajmujemy się tym, jak określić przepuszczalność bariery krew-mózg i aktywność żelatynazy zaangażowaną w migrację leukocytów przez limity gleju.

Wizualizacja upośledzenia barier śródbłonkowych i glejowych jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia mięśniowego in vivo

Tutaj opisujemy metodę obrazowania na żywo in vitro, która umożliwia wizualizację wewnątrzkomórkowego transportu organelli i transportu białek błony komórkowej w mysich astrocytach. W protokole tym przedstawiono również metodologię analizy obrazu w celu wyznaczenia tras transportu i kinetyki transportu ładunków.

Wizualizacja i analiza transportu wewnątrzkomórkowego organelli i innych ładunków w astrocytach

Ten protokół prezentuje unikalny sposób generowania kultur komórkowych ośrodkowego układu nerwowego z embrionalnych mózgów myszy w 17. dniu do badań neuro(immunologicznych). Model ten można analizować przy użyciu różnych technik eksperymentalnych, w tym RT-qPCR, mikroskopii, ELISA i cytometrii przepływowej.

Ustanowienie mieszanych kultur komórek neuronalnych i glejowych z embrionalnych mózgów myszy w celu zbadania infekcji i odporności wrodzonej

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodologię izolowania siatkówki od oka myszy w celu przeprowadzenia rozszerzonych eksperymentów ex vivo. Protokół ten kładzie nacisk na udostępnienie tego wymagającego technicznie podejścia badaczom, którzy chcieliby skorzystać z możliwości badawczych, jakie daje utrzymanie gleju siatkówki in situ w żywej tkance.

Model eksplantatu ex vivo do badania interakcji glejowych w siatkówce myszy

Poznaj metody in vitro do badania interakcji komórek Schwanna z astrocytami. Techniki te pomagają zrozumieć mechanizmy regeneracji rdzenia kręgowego i poprawić skuteczność terapii komórkowych.

Analiza interakcji między komórkami Schwanna a astrocytami z wykorzystaniem testów in vitro

Przeglądaj więcej filmów