Name: Mikroprefabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 21 s
Description: Poznaj mikrofabrykację platform do dynamicznej hodowli komórkowej z zastosowaniem mikroaktuatorów pionowych. Ta metoda umożliwia kontrolowane mechaniczne stymulowanie komórek w kulturach 2D i 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przyznajemy, że otrzymaliśmy wsparcie finansowe z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada oraz Canadian Institutes of Health Research (CHRPJ 323533-06), z programu Ontario Graduate Scholarship dla CM, a także z programu Canada Research Chairs w zakresie Micro and Nano Engineering Systems dla YS oraz w zakresie Mechanobiology dla CAS.

<ol><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
<li>Schaffer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Device+for+the+application+of+a+dynamic+biaxially+uniform+and+isotropic+strain+to+a+flexible+cell+culture+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Device for the application of a dynamic biaxially uniform and isotropic strain to a flexible cell culture membrane.</a> J Orthop Res. 12, 709-719 (1994).</li>
<li>Jo, B., Lerberghe, L. V. an, Motsegood, K., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+micro-channel+fabrication+in+polydimethylsiloxane+%28PDMS%29+elastomer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microelectromechanical+Systems%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional micro-channel fabrication in polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 9, 76-81 (2000).</li>
<li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+the+shrinkage-induced+PDMS+alignment+registration+issue+in+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Micromech.+Microeng%22%5BJournal%5D)">Solving the shrinkage-induced PDMS alignment registration issue in multilayer soft lithography.</a> J. Micromech. Microeng. 19, 065015-065015 (2009).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
<li>Bongaerts, J., Fourtouni, K., Stokes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft-tribology%3A+Lubrication+in+compliant+PDMS-PDMS+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Tribology+International%22%5BJournal%5D)">Soft-tribology: Lubrication in compliant PDMS-PDMS contact.</a> Tribology International. 40, 1531-1542 (2007).</li>
<li>Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+arrays+for+high-throughput+screening+of+cellular+response+to+cyclic+substrate+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation.</a> Lab on a chip. 10, 227-234 (2010).</li>
<li>Liu, V. A., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+photopatterning+of+hydrogels+containing+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional photopatterning of hydrogels containing living cells.</a> Biomedical Microdevices. 4, 257-266 (2002).</li>
<li>Hahn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+patterning+of+polyethylene+glycol+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels.</a> Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).</li>
<li>Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+platform+for+high-throughput+unconfined+compression+of+micropatterned+biomaterial+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays.</a> Biomaterials. 31, 577-584 (2010).</li>
<li>Wipff, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+covalent+attachment+of+adhesion+molecules+to+silicone+membranes+for+cell+stretching+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications.</a> Biomaterials. 30, 1781-1789 (2009).</li>
<li>Moraes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+polyurethane+culture+substrates+into+poly%28dimethylsiloxane%29+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Integrating polyurethane culture substrates into poly(dimethylsiloxane) microdevices.</a> Biomaterials. 30, 5241-5250 (2009).</li>
<li>Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+photopolymerizable+and+degradable+biomaterials+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Review: photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications.</a> Tissue engineering. 13, 2369-2385 (2007).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Mimo że koncepcyjnie jest to proste, wytwarzanie urządzeń wymaga pewnych umiejętności eksperymentalnych i praktyki. Szczególnie w przypadku dwuwymiarowej hodowli komórkowej, dopasowanie wielu warstw w urządzeniu może być trudne, zwłaszcza w przypadku matryc o dużej powierzchni. W praktyce możemy niezawodnie osiągnąć 100% skuteczności dopasowania, stosując urządzenia z tolerancją 50 μm w odstępach między sąsiadującymi elementami w wielu warstwach. Pomyślnie zademonstrowaliśmy również dopasowanie przy tolerancjach tak nisk...

<table><tbody><tr><td>Zestaw monomeru i sieciowania PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>matryce SU-8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do silanizacji: (tridekafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahydrooktylo)-1-trichlorosilan</td><td>United Chemical Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podkładki piankowe</td><td></td><td></td><td>Sklepy z artykułami plastycznymi, grubość 1–2 mm</td></tr><tr><td>Przezroczystości do drukarek atramentowych</td><td>Duża zabawka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki z pleksiglasu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ścisk C</td><td></td><td></td><td>sklep z narzędziami</td></tr><tr><td>System mikromanipulacyjny</td><td>Siskiyou, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dedykowany uchwyt próżniowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>System wizyjny, zoom Navitar 12x</td><td>Navitar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Łączenie rurek</td><td>VWR international</td><td>Clay Adam Intramedic PE190</td><td></td></tr><tr><td>Tępe igły 18G</td><td>Small Parts (www.smallparts.com)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekscentryczna mikropompa membranowa</td><td>Schwarzer Precision</td><td>SP 500 EC-LC4,5V DC</td><td></td></tr><tr><td>Zawory elektromagnetyczne</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-30-12-3</td><td></td></tr><tr><td>Kolektor elektrozaworów</td><td>Pneumadyne</td><td>MSV10-1</td><td></td></tr><tr><td>Generator funkcji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-(trimetoksyisilylo) propylmetakrylan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diglakrylan glikolu polietylenowego 3,4 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 8 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-winylo-2-pirolidynon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standardowe odczynniki do hodowli komórkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Możliwość systematycznego badania odpowiedzi komórkowej in vitro na kombinacje bodźców mechanobiologicznych w inżynierii tkankowej, poszukiwaniu nowych leków lub w fundamentalnych badaniach biologii komórki jest ograniczona przez obecne technologie bioreaktorów, które nie pozwalają na jednoczesne przykładanie różnorodnych bodźców mechanicznych do hodowanych komórek. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy serię mikrofabrykowanych platform zaprojektowanych do przesiewowego badania efektów bodźców mechanicznych w formacie wysokoprzepustowym. W niniejszym protokole demonstrujemy wykonanie macierzy mikroaktuatorów z pionowo przemieszczanymi słupkami, na której oparta jest ta technologia, a następnie pokazujemy, w jaki sposób technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodowli komórkowych w paradygmatach hodowli dwu- i trójwymiarowych.

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Zdolność do systematycznego badania odpowiedzi komórkowej in vitro na kombinacje bodźców mechanobiologicznych w inżynierii tkankowej, poszukiwaniu nowych leków lub...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest mikrofabrykacja urządzeń służących do mechanicznej stymulacji komórek w dwu- i trójwymiarowych środowiskach hodowlanych. Jest to realizowane poprzez zastosowanie techniki wielowarstwowego formowania i układania warstw (sandwich molding and stacking), aby wytworzyć macierz pionowo aktywowanych mikrosłupków. W drugim kroku macierz pionowo aktywowanych mikrosłupków jest modyfikowana w celu rozciągania filmu hodowlanego, co pozwala na przykładanie precyzyjnie kontrolowanych odkształceń do komórek hodowanych na tym filmie.Alternatywnie matrycę można zmodyfikować w celu kompresowania mikrowzorowanych konstrukcji z biomateriałów, aby zastosować stymulację mechaniczną do komórek. Hodowla w matrycy trójwymiarowych hydrożeli pozwala na uzyskanie wyników, które na podstawie analizy obrazu fluorescencyjnych markerów referencyjnych wykazują jednoczesne zastosowanie zakresu dwuwymiarowych odkształceń echo-dwuosiowych oraz trójwymiarowych odkształceń kompresyjnych w całej matrycy. Cześć, jestem Chris Mariahs z laboratoriów Craiga Simmonsa i U Suna w Departamencie Inżynierii Mechanicznej i Przemysłowej oraz Instytucie Biomateriałów i Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie w Toronto.Dzisiaj przedstawimy procedurę wykonania mikrourządzeń służących do mechanicznej stymulacji komórek. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę, aby badać reakcje komórek na różne siły mechaniczne w hodowli in vitro. Przejdźmy zatem do części praktycznej.Proces wykonania formy kanapkowej obejmuje nałożenie folii przezroczystej na nieutwardniony polidimetylosiloksan (PDMS) na matrycy SU8. Kanapka zostaje umieszczona w stosie z pianki szklanej i metalu, a następnie utwardzona w piecu pod kompresją. Na koniec stos zostaje rozmontowany, a folia przezroczysta oddzielona, co pozwala na zachowanie warstwy PDMS z nadanym wzorem.Aby rozpocząć ten proces, należy dokładnie wymieszać PDMS, monomer i utwardzacz. W standardowym stosunku 10:1 nanieś trzy mililitry nieutwardzonej mieszaniny PDMS na wcześniej wykonaną matrycę SU-8, a następnie odgazuj polimer w komorze próżniowej. Następnie umieść podkładkę z pianki oraz matrycę SU-8 na pleksiglasowej płytce podstawowej.Ostrożnie nałóż gładką stronę folii do drukarek atramentowych na nieutwardzony PDMS, uważając, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza. Następnie umieść zasiloną szkiełkiem przedmiotowym podkładkę szklaną na folii, pod drugą podkładką z pianki i pleksiglasową płytą górną. Zaciśnij cały zestaw za pomocą ścisku śrubowego.Utwardzaj kanapkę z PDMS w piekarniku w temperaturze 80 °C przez co najmniej cztery godziny. Po utwardzeniu wyjmij kanapkę z piekarnika i poczekaj, aż ostygnie. Po ostygnięciu zdejmij zacisk i rozmontuj kanapkę.Ostrożnie odklej folię przezroczystą od matrycy SU-8, zachowując naniesioną warstwę PDMS. Przytnij krawędzie folii z wzorem, aby usunąć nadmiar PDMS; przechowuj warstwy wzoru w środowisku wolnym od kurzu do momentu ich użycia. Kolejna część tego protokołu obejmuje konstrukcję mikrofabrykowanej macierzy pionowo sterowanych słupków.Do wykonania macierzy mikrofilarów wymagany jest wielowarstwowy proces wytwarzania. Najniższa wzorowana warstwa PDMS jest przygotowywana metodą odlewu kanapkowego. W tych eksperymentach zastosowano wzory okrągłe o średnicy od 600 do 1 200 mikronów.Aby przenieść warstwę PDMS na czystą szkiełko przedmiotowe, należy użyć urządzenia do wyładowań koronowych w celu potraktowania powierzchni PDMS oraz szkła plazmą tlenową. Następnie należy doprowadzić do kontaktu obu powierzchni. Cały zestaw należy umieścić na płycie grzejczej w temperaturze 80 °C przez 10 minut, aby zakończyć proces wiązania.Oderwij folię przezroczystą i wyrzuć ją. Proces ten gwarantuje, że wzorowana warstwa PDMS nie zostaje oddzielona od sztywnego podłoża, co zapobiega kurczeniu się poszczególnych warstw. Druga warstwa formowana metodą kanapkową powstaje jako negatywowa kopia formy pożądanej membrany i struktury słupków.W tej demonstracji do utworzenia tej warstwy wykorzystano okrągłe słupki o średnicy 500 µm. Najpierw tymczasowo przymocowano negatywową formę odlewniczą do szkiełka przedmiotowego za pomocą dwustronnej taśmy, a następnie w przenośniku próżniowym naniesiono nieutwardzony PDMS na tak przygotowany układ. Odgazowano i rozwirowano przez 45 s z prędkością 1000 obr/min, otrzymując membranę aktywacyjną o grubości 60 µm. Warstwę PDMS naniesioną metodą spin-coatingu częściowo utwardzono w temperaturze 80 °C przez około 20 min lub do momentu, aż PDMS stał się lepki, ale nie ulegał trwałej deformacji przy dotyku. Następnie usunięto szkiełko przedmiotowe oraz dwustronną taśmę z częściowo utwardzonej warstwy PDMS i folii przezroczystej, a następnie przymocowano ją do pary szkiełek manipulacyjnych i poddano działaniu plazmy.Poddaj częściowo utwardzony PDMS obróbce, a następnie odwróć go i umieść w specjalnie wykonanym pozycjonerze. Pozycjoner składa się z uchwytu próżniowego zamontowanego na mikromanipulatorze. Następnie poddaj pierwszej warstwie PDMS obróbce plazmowej, a potem umieść ją na stole obrotowym pod uchwytem próżniowym.Obserwuj dopasowanie obu warstw za pomocą systemu wizyjnego z 12-krotnym powiększeniem. Używając manipulatora, wyrównaj warstwy i ostrożnie doprowadź do ich kontaktu. Przyciśnij warstwy lekko palcem, aby je do siebie przytwierdzić.Następnie wyjmij kanapkę z wyrównywacza. Usuń szklane slajdy manipulacyjne i upewnij się, że warstwy w pełni ze sobą kontaktują. Utwardzaj w piecu w temperaturze 80 °C przez dodatkowe 30 minut.Po 30 minutach przezroczystą i zsiloksylowaną formę replikacyjną z PDMS można odkleić od urządzenia i wyrzucić. Następnie urządzenie jest w pełni utwardzane w temperaturze 80 °C przez co najmniej cztery godziny, aby można było przeprowadzić eksperymenty na komórkach hodowanych na odkształcalnym podłożu dwuwymiarowym. Matryca mikroaktuatorów zostaje zmodyfikowana poprzez przyłączenie trzeciej warstwy PDMS do urządzenia.Trzecia warstwa PDMS składa się z dwuwarstwowej struktury. Dolne koło odpowiada rozmiarowi komory sterującej znajdującej się pod ruchomymi mikrosłupkami. Średnica górnego koła jest o 100 mikronów większa od średnicy słupków do ładowania.Mikrokanał o szerokości 200 micronów łączy te elementy z obszarem przyłącza i służy do smarowania słupków załadowczych oraz folii hodowlanej. Aby zmodyfikować urządzenie do hodowli 2D, należy najpierw wykonać i przykleić do niego złącza zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Następnie należy nanieść metodą spin-coatingu warstwę PDMS o grubości od 10 do 15 micronów na gładką stronę folii przezroczystej i utwardzić ją.Cienka warstwa PDMS w temperaturze 80 °C przez co najmniej cztery godziny. Kolejnym krokiem jest zastosowanie próżni w siłownikach i połączenie warstwy PDMS z urządzeniem. Aby to osiągnąć.W pierwszej kolejności zastosuj próżnię o niskim poziomie do siłowników, obniżając matrycę słupków poddanych obróbce plazmowej i wiązaniu. Po naniesieniu metodą spin-coatingu filmu PDMS na urządzanie mikrofluidyczne z siłownikami, zgodnie z opisem w protokole pisemnym, słupki i film hodowlany pozostaną hydrofilowe przez krótki czas. Następnie podłącz strzykawkę z lubrykantem do urządzenia i wypełnij kanały smarne 90% roztworem glicerolu w wodzie dejonizowanej.Oprócz smarowania, ta formulacja nieograniczoną w czasie utrzymuje hydrofilowość PDMS, redukując współczynniki tarcia. Umieść urządzenie na płycie grzejnej w temperaturze 40 °C i kontynuuj wstrzykiwanie środka smarnego do kanału, powodując niewielki wzrost ciśnienia. Po kilku minutach pęcherzyki powietrza rozprzestrzenią się przez PDMS, a wszystkie powierzchnie zostaną nasmarowane.W ostatnim kroku należy usunąć podciśnienie, uwalniając słupki za pomocą skalpela. Wyciąć obszar wokół cienkiej folii PDMS. Ostrożnie oddzielić folię zabezpieczającą od połączenia plazmowego urządzenia.Ręcznie wycięta uszczelka z PDMS wokół obszaru hodowli urządzenia. Sterylizujemy urządzenie poprzez namoczenie go w 70% etanolu przez pięć minut, a następnie naświetlanie bakteriobójczym światłem UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez 45 minut. Powierzchnię poddajemy działaniu plazmy i inkubujemy z 100 µg/mL kolagenu przez noc w temperaturze 4 °C.Po inkubacji przez noc urządzenie należy przemyć sterylnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym lub PBS, a następnie zasiać komórki w zagęszczeniu od 10 do 15 000 komórek na centymetr kwadratowy. Zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych, matrycę mikroaktuatorów można zmodyfikować w celu prowadzenia eksperymentów na komórkach hodowanych w trójwymiarowych fotowzorowanych konstrukcjach hydrożelowych. W pierwszej kolejności przygotowuje się wielowarstwową platformę opartą na PDMS.Po pokryciu podstawy platformy szkłem przedmiotowym, wstrzykiwany jest związany z nim roztwór prekursora hydrożelu. Następnie fotopolimeryzowalny biomateriał jest mikrostrukturyzowany w postaci macierzy, a pozostały roztwór prekursora jest wypłukiwany. Macierz pionowo działających słupków obciążających może być następnie wykorzystana do przyłożenia ściskających sił mechanicznych do komórek hodowanych w trójwymiarowych biomateriałach; przy użyciu kawałków taśmy klejącej maskuje się obszary wokół słupków, a następnie urządzenie pokrywa się paraleną C w systemie PDS 2010 Lab Coater 2.Zwiększy to kinetykę polimeryzacji dla systemu biomateriałowego. Po pokryciu wyjąć urządzenie z systemu powlekania i odkleić taśmę klejącą, pozostawiając konformalną warstwę parylenu C na słupkach. Następnie przeprowadzić metylację szkiełka przedmiotowego ACRL poprzez zanurzenie w 2% (obj. obj.) roztworze trimetoksysilanu propylmetakrylanu w 95% etanolu przez dwie minuty.Opłucz szkiełko przykrywowe. Zanurz je w 100% etanolu, a następnie poddaj wypalaniu w temperaturze 100 °C, aby na powierzchni pozostały grupy metakrylowe. Odlej odstępnik z PDMS o grubości 200 micron.Wyściełij szalkę Petriego folią i potnij ją na małe fragmenty. Przymocuj za pomocą wiązania plazmowego cztery z tych małych fragmentów wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego powiązanego z meac. Następnie przymocuj za pomocą wiązania plazmowego wolne przestrzenie do obszarów PDMS urządzenia, pokrywając obszary powlekane Lene C.Na koniec wysterylizowano urządzenie, myjąc je w 70% etanolu, a następnie poddano działaniu środka bakteriobójczego lub światła UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 45 minut. W celu fotolitograficznego wzorowania hydrożeli PEG z zawartością komórek w urządzeniach, należy przygotować roztwory prekursora i fotoinicjatora zgodnie z opisem w protokole pisemnym i dokładnie je wymieszać, aby uzyskać roztwór o stężeniu 0,4% w/v fotoinicjatora.Przefiltruj mieszaninę przez filtr strzykawkowy 0,45 mikrona w celu sterylizacji i usunięcia cząstek stałych, potraktuj hodowle komórkowe trypsyną w lodzie i przygotuj zawiesinę komórkową w pożywce hodowlanej o dwukrotnym stężeniu komórek względem pożądanej wartości końcowej. Następnie zmieszaj zawiesinę komórkową i przefiltrowany roztwór fotoinicjatora prekursora hydrożelu w stosunku jeden do jednego. Wstrzyknij roztwór do mikrourządzenia, używając długiej igły 25G.Należy starannie unikać uwięzienia pęcherzyków powietrza w urządzeniu. Dopasować wydrukowaną maskę na folii przezroczystej do znaczników wyrównawczych na powierzchni urządzenia. Skonfigurować system naświetlania UV tak, aby zapewnić dawkę UV o długości fali 365 nanometrów o natężeniu 17,5 milliwatt per square centimeter na powierzchni urządzenia.Naświetlaj hydrożel przez maskę przez 195 sekund po rozpoczęciu iluminacji. Wypłucz niepolimeryzowany roztwór prekursora hydrożelu za pomocą PBS, a następnie zastąp PBS pożywką hodowlaną i uruchom słupki ładunkowe, aby skompresować konstrukty hydrożelowe. Tutaj przedstawiono gotowe urządzenie próbkowe do 2D mechano-stymulowanej hodowli.Czerwony barwnik służy do oznakowania kanałów doprowadzających ciśnienie sterujące, a niebieski barwnik D do oznakowania kanałów smarowania podczas charakterystyki odkształceń. Eksperymenty mogą służyć do wyznaczania pól przyłożonego odkształcenia poprzez śledzenie ruchu fluorescencyjnych kulek na podłożach. Czerwone punkty reprezentują położenie początkowe kulek, natomiast zielone punkty reprezentują ich położenia po odkształceniu.Przykładowe urządzenie do trójwymiarowych eksperymentów ściskania przedstawiono tutaj, gdzie zielony barwnik służy do oznaczenia kanałów ciśnienia aktywacyjnego. Widok z góry matrycy mikrofilarów ukazuje konstrukt hydrożelowy ukształtowany na szczycie filarów; obok znajdują się zrekonstruowane obrazy kulek fluorescencyjnych w konstrukcie hydrożelowym. Stan spoczynku oraz ciśnienie aktywacyjne 55 kPa demonstrują proces charakterystyki odkształcenia w trójwymiarowym systemie hodowlanym.Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak wykonać urządzenia służące do mechanicznej stymulacji komórek w dwu- lub trójwymiarowych systemach hodowli. Przeprowadzając tę procedurę, należy pamiętać o utrzymaniu urządzeń w maksymalnej czystości, bez kurzu, oraz o zachowaniu cierpliwości, szczególnie podczas etapów wyrównywania. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

microfabricated-platforms-for-mechanically-dynamic-cell-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikrofabrykowane platformy dla mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Tutaj prezentujemy protokół kohodowli komórek pierwotnych, modeli tkanek i biopsji dziurkowania w mikroprzepływowym chipie wielonarządowym przez okres do 28 dni. Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka skóry, agregaty wątroby i biopsje skóry z powodzeniem połączono we wspólnym krążeniu pożywki.

Wielonarządowy chip - platforma mikroprzepływowa do długoterminowej kokultury wielotkankowej

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Opisujemy metodę konstruowania urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi. Urządzenie to umożliwia analizę odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne w mikrośrodowiskach 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu. Organoidy są lepsze niż pojedyncze komórki w wykrywaniu słabych hałaśliwych sygnałów.

Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu

Ten artykuł zawiera szczegółowe metody wytwarzania i charakteryzowania pneumatycznie uruchamiającego urządzenia mikroprzepływowego do kompresji chondrocytów.

Platforma mikroprzepływowa do stymulacji chondrocytów za pomocą dynamicznej kompresji

Prezentujemy napędzane silnikiem odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe, które może hodować sferoidy komórek. Za pomocą tego urządzenia sferoidy jednego lub wielu typów komórek mogą być łatwo hodowane w warunkach wysokiej grawitacji.

Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Ten protokół opisuje rekonfigurowalną platformę hodowli komórkowych opartą na membranie, która integruje format otwartej studni z możliwościami przepływu płynów. Platforma ta jest kompatybilna ze standardowymi protokołami i umożliwia odwracalne przejścia między trybem hodowli w studni otwartej a mikroprzepływowym, dostosowując się do potrzeb zarówno laboratoriów inżynieryjnych, jak i biologicznych.

Przekształcanie statycznych modeli tkanek barierowych w dynamiczne systemy mikrofizjologiczne

Opisano proste techniki szybkiego wytwarzania mikrofabrykowanych systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem cyfrowego urządzenia z mikrolustrami do litografii z dynamiczną projekcją maski na standardowych podłożach do hodowli komórkowej. Systemy hodowlane te mogą lepiej odzwierciedlać naturalną architekturę biologiczną, a opisane techniki można dostosować do licznych zastosowań.

Wytwarzanie mikrowzorowanych hydrożeli dla systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem fotolitografii z dynamiczną projekcją maski

Poznaj mikrofabrykację platform do dynamicznej hodowli komórkowej z zastosowaniem mikroaktuatorów pionowych. Ta metoda umożliwia kontrolowane mechaniczne stymulowanie komórek w kulturach 2D i 3D.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Przeglądaj więcej filmów