Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest mikrofabrykacja urządzeń służących do mechanicznej stymulacji komórek w dwu- i trójwymiarowych środowiskach hodowlanych. Osiąga się to poprzez zastosowanie wielowarstwowej techniki formowania i układania warstw („sandwich molding and stacking”), aby wytworzyć macierz pionowo aktualizowanych mikrosłupków. W drugim kroku macierz pionowo aktualizowanych mikrosłupków jest modyfikowana w celu rozciągania filmu hodowlanego, co pozwala na przykładanie precyzyjnie kontrolowanych odkształceń do komórek hodowanych na tym filmie.

Alternatywnie macierz można zmodyfikować w celu kompresji mikrostrukturalnych konstrukcji z biomateriałów, aby zastosować stymulację mechaniczną do komórek. Hodowla w macierzy trójwymiarowych hydrożeli pozwala na uzyskanie wyników wykazujących jednoczesne zastosowanie zakresu dwuwymiarowych naprężeń echo-dwuosiowych oraz trójwymiarowych naprężeń kompresyjnych w obrębie macierzy, na podstawie analizy obrazu fluorescencyjnych znaczników referencyjnych. Cześć, jestem Chris Mariahs z laboratoriów Craiga Simmonsa i U Suna w Departamencie Inżynierii Mechanicznej i Przemysłowej oraz Instytucie Biomateriałów i Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie w Toronto.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wytwarzania mikrourządzeń służących do mechanicznej stymulacji komórek. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać, w jaki sposób komórki reagują na różne siły mechaniczne w hodowli in vitro. Zacznijmy zatem.

Proces wytwarzania formy typu „sandwich” obejmuje nałożenie folii przezroczystej na nieutwardzony polidimetylosiloksan (PDMS) na matrycy SU-8. Tak przygotowany zestaw umieszcza się w stosie z pianki szklanej i metalu, a następnie utwardza w piecu pod naciskiem. Na koniec stos zostaje rozmontowany, a folia przezroczysta odklejona, co pozwala na zachowanie ukształtowanej warstwy PDMS.

Aby rozpocząć ten proces, należy dokładnie wymieszać PDMS, monomer i sieciujący. W standardowym stosunku 10:1 nanieś 3 mL nieutwardzonej mieszaniny PDMS na wcześniej wykonaną matrycę SU-8 i odgazuj polimer w komorze próżniowej. Następnie umieść podkład piankowy oraz matrycę SU-8 na pleksiglasowej płytce podstawowej.

Ostrożnie opuść gładką stronę folii do drukarek atramentowych na niewutwardzony PDMS, upewniając się, że nie uwięziono żadnych pęcherzyków powietrza. Następnie umieść silikonizowane szkiełko przedmiotowe na folii, pod drugą podkładką z pianki oraz pleksiglasową płytą górną. Zaciśnij całą strukturę za pomocą ścisku śrubowego.

Utwardzaj konstrukcję z PDMS w piecu w temperaturze 80 °C przez co najmniej cztery godziny. Po utwardzeniu wyjmij konstrukcję z pieca i pozwól jej ostygnąć. Po ochłodzeniu zdejmij zacisk i rozmontuj konstrukcję.

Ostrożnie oddziel folię przezroczystą od matrycy SU-8, zachowując utwardzoną warstwę PDMS. Przytnij krawędzie folii z wzorem, aby usunąć nadmiar PDMS, a następnie przechowuj warstwy z wzorem w środowisku wolnym od kurzu do momentu ich użycia. Kolejna część niniejszego protokołu dotyczy konstrukcji mikrofabrykowanej macierzy pionowo aktualizowanych słupków.

W celu wykonania macierzy mikrofilarów wymagany jest wielowarstwowy proces wytwarzania. Najniższa wzorowana warstwa PDMS jest przygotowywana za pomocą techniki odlewu kanapkowego. W tych eksperymentach zastosowano wzory okrągłe o średnicach od 600 do 1 200 mikronów.

Aby przenieść warstwę PDMS na czyste szkiełko przedmiotowe, należy użyć urządzenia do wyładowań koronowych w celu potraktowania powierzchni PDMS i szkła plazmą tlenową. Następnie należy zetknąć obie powierzchnie ze sobą. Cały układ należy umieścić na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C przez 10 minut, aby zakończyć proces wiązania.

Oderwij folię przezroczystą i wyrzuć ją. Proces ten gwarantuje, że ustrukturyzowana folia PDMS nie zostaje oddzielona od sztywnego podłoża, co zapobiega kurczeniu się poszczególnych warstw. Druga warstwa formowana metodą kanapkową powstaje jako negatywowa forma odlewnicza pożądanej struktury membrany i słupków.

W niniejszym pokazie do utworzenia tej warstwy zastosowano okrągłe słupki o średnicy 500 µm. Najpierw tymczasowo przymocowano formę odlewu negatywowego do szkiełka przedmiotowego za pomocą dwustronnej taśmy, a następnie w desykatorze próżniowym nałożono nieutwardzony PDMS na tak przygotowaną warstwę. Po odgazowaniu i wirowaniu przez 45 sekund przy prędkości 1000 obr./min otrzymano membranę aktywującą o grubości 60 µm. Warstwę PDMS naniesioną metodą wirowania częściowo utwardzono w temperaturze 80 °C przez około 20 minut lub do momentu, aż PDMS stał się lepki, ale nie odkształcał się trwale pod wpływem dotyku. Następnie usunięto szkiełko przedmiotowe i dwustronną taśmę z częściowo utwardzonej warstwy PDMS, a folię transparentną przymocowano do pary szkiełek manipulacyjnych i poddano działaniu plazmy.

Poddaj częściowo utwardzony PDMS obróbce, następnie odwróć PDMS i umieść go w specjalnie wykonanym pozycjonerze. Pozycjoner składa się z uchwytu próżniowego zamontowanego na mikromanipulatorze. Następnie poddaj pierwszej warstwie PDMS obróbce plazmowej, a potem umieść ją na stole obrotowym pod uchwytem próżniowym.

Obserwuj dopasowanie obu warstw za pomocą systemu wizyjnego z 12-krotnym powiększeniem. Używając manipulatora, wyrównaj warstwy i ostrożnie doprowadź do ich kontaktu. Przyciśnij warstwy lekko palcem, aby je ze sobą skleić.

Następnie wyjmij kanapkę z wyrównywacza. Usuń szklane slidy mocujące i upewnij się, że warstwy w pełni ze sobą przylegają. Poddaj próbkę utwardzaniu w piecu w temperaturze 80 °C przez dodatkowe 30 minut.

Po 30 minutach przezroczystą i zsiloksylowaną replikę formy PDMS można odkleić od urządzenia i wyrzucić. Następnie urządzenie jest w pełni utwardzane w temperaturze 80 °C przez co najmniej cztery godziny w celu przeprowadzenia eksperymentów na komórkach hodowanych na odkształcalnym podłożu dwuwymiarowym. Matryca mikroaktuatorów zostaje zmodyfikowana poprzez przyklejenie trzeciej warstwy PDMS do urządzenia.

Trzecia warstwa PDMS składa się z dwuwarstwowej struktury. Dolne koło odpowiada rozmiarom wnęki aktywacyjnej znajdującej się pod aktywowanymi mikrofilarami. Średnica górnego koła jest o 100 mikronów większa od średnicy filarów załadowczych.

Mikrokanał o szerokości 200 mikronów łączy te elementy z obszarem przyłącza i będzie służył do smarowania słupków załadowczych oraz błony hodowlanej. Aby zmodyfikować urządzenie do hodowli 2D, należy najpierw wykonać i przykleić do niego złącza zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Następnie należy nanieść metodą spin-coatingu warstwę PDMS o grubości od 10 do 15 mikronów na gładką stronę folii przezroczystej i utwardzić ją.

Cienką błonę PDMS w temperaturze 80°C przez co najmniej cztery godziny. Następnym krokiem jest przyłożenie próżni do aktuatorów i połączenie warstwy PDMS z urządzeniem. Aby to osiągnąć.

W pierwszej kolejności należy przyłożyć niskie podciśnienie do siłowników, obniżając tym samym zestaw słupków poddanych obróbce plazmowej i wiązaniu. Po naniesieniu metodą spin-coatingu filmu PDMS na uruchamiane urządzenie mikroprzepływowe, zgodnie z opisanym protokołem, słupki oraz film hodowlany pozostaną hydrofilowe przez krótki czas. Następnie należy podłączyć strzykawkę ze środkiem smarnym do urządzenia i wypełnić kanały smarowania roztworem 90% glicerolu w wodzie dejonizowanej.

Oprócz smarowania, ta formulacja na stałe utrzymuje hydrofilowość PDMS, redukując współczynniki tarcia. Umieść urządzenie na płycie grzejnej w temperaturze 40 °C i kontynuuj wstrzykiwanie środka smarnego do kanału, powodując niewielki wzrost ciśnienia. Po kilku minutach pęcherzyki powietrza rozproszą się w PDMS, a wszystkie powierzchnie zostaną nasmarowane.

W ostatnim kroku usuń podciśnienie, uwalniając słupki za pomocą skalpela. Przetnij cienką warstwę PDMS. Ostrożnie oddziel folię transparentną od wiązania plazmowego urządzenia.

Ręcznie wycięta uszczelka z PDMS wokół obszaru hodowli urządzenia. Sterylizujemy urządzenie, mocząc je w 70% etanolu przez pięć minut, a następnie poddając działaniu bakteriobójczego światła UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez 45 minut. Powierzchnię traktujemy plazmą i inkubujemy z 100 µg/mL kolagenu przez noc w temperaturze 4 °C.

Po inkubacji przez noc urządzenie należy przemyć sterylnym solą fosforanową w buforze lub PBS, a następnie zasiać komórki w zagęszczeniu od 10 do 15 000 komórek na centymetr kwadratowy. Zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych, macierz mikroaktuatorów można zmodyfikować w celu przeprowadzenia eksperymentów na komórkach hodowanych w trójwymiarowych, fotowzorowanych konstrukcjach hydrożelowych. W pierwszej kolejności wytwarza się wielowarstwową platformę opartą na PDMS.

Po pokryciu platformy bazowej szkłem podstawowym, wstrzyknięty zostaje odpowiedni prekursor roztworu hydrożelu. Następnie fotopolimeryzowalny biomateriał jest mikrostrukturowany w postaci macierzy, a pozostały roztwór prekursora zostaje wypłukany. Macierz pionowo sterowanych słupków obciążających może być następnie wykorzystana do przyłożenia sił sprężania do komórek hodowanych w trójwymiarowych biomateriałach; obszary wokół słupków zostają zamaskowane kawałkami taśmy klejącej, a urządzenie zostaje powleczone paraleną C w systemie PDS 2010 Lab COTER 2.

Poprawi to kinetykę polimeryzacji dla systemu biomateriału. Po nałożeniu powłoki należy wyjąć urządzenie z systemu powlekania i odkleić taśmę klejącą, pozostawiając konformalną warstwę parylenu C na słupkach. Następnie należy zmetakrylować szkiełko nakrywkę ACRL poprzez zanurzenie w 2% (obj./obj.) roztworze trimetoksysilanu metakrylowego w 95% etanolu przez dwie minuty.

Opłucz szkiełko zakrywkowe. Zanurz je w 100% etanolu, a następnie poddaj wygrzewaniu w temperaturze 100 °C, aby pozostawić grupy metakrylanowe na powierzchni. Odlej przekładkę z PDMS o grubości 200 µm.

Wyłóż szalkę Petriego folią i potnij ją na małe fragmenty. Za pomocą wiązania plazmowego przymocuj cztery z tych małych fragmentów wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego powiązanego z meac. Następnie za pomocą wiązania plazmowego przymocuj przerwy do obszarów PDMS urządzenia, pokrywając Lene C.

Na koniec wysterylizowano urządzenie, przemywając je 70% etanolem i poddając działaniu środka bakteriobójczego lub światła UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez 45 minut. Aby uformować za pomocą fotolitografii hydrożele PEG z zawieszonymi komórkami wewnątrz urządzeń, należy przygotować roztwory prekursora i fotoinicjatora zgodnie z opisem w protokole pisemnym, a następnie dokładnie je wymieszać, aby uzyskać roztwór o stężeniu 0,4% w/v fotoinicjatora.

Przefiltruj mieszaninę przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,45 mikrona, aby ją wysterylizować i usunąć zanieczyszczenia stałe, zneutralizuj trypsyną hodowle komórkowe i przygotuj zawiesinę komórek w pożywce hodowlanej o dwukrotnie większym stężeniu komórek niż docelowe. Następnie zmieszaj zawiesinę komórkową i przefiltrowany roztwór fotoinicjatora prekursora hydrożelu w stosunku jeden do jednego. Wstrzyknij roztwór do mikrourządzenia za pomocą długiej igły o rozmiarze 25 G.

Należy uważać, aby w urządzeniu nie powstały pęcherzyki powietrza. Dopasuj wydrukowaną maskę z folii przezroczystej do znaczników wyrównania na powierzchni urządzenia. Skonfiguruj system naświetlania UV tak, aby zapewnić dawkę promieniowania UV o długości fali 365 nanometrów o natężeniu 17,5 milliwatt per square centimeter na powierzchni urządzenia.

Naświetlaj hydrożel przez maskę przez 195 sekund po rozpoczęciu iluminacji. Wypłucz niepolimeryzowany roztwór prekursora hydrożelu za pomocą PBS, a następnie zastąp PBS pożywką hodowlaną i uruchom słupki ładunkowe, aby skompresować konstrukty hydrożelowe. Tutaj przedstawiono gotowe urządzenie próbne do 2D mechano-stymulującej hodowli.

Czerwony barwnik służy do oznaczenia kanałów doprowadzających ciśnienie robocze, a niebieski barwnik D do oznaczenia kanałów smarowania w celu charakterystyki odkształceń. Do wyznaczenia przyłożonych pól odkształceń można wykorzystać eksperymenty polegające na śledzeniu ruchu fluorescencyjnych kulek na podłożach. Czerwone punkty reprezentują położenie kulek przed odkształceniem, natomiast zielone punkty reprezentują położenia po odkształceniu.

Przykładowe urządzenie do trójwymiarowych eksperymentów ściskania można zobaczyć tutaj; zielony barwnik służy do oznaczenia kanałów ciśnienia aktywacyjnego. Widok z góry matrycy mikrofilarków ukazuje konstrukcję z hydrożelu uformowaną na szczycie filarków oraz zrekonstruowane obrazy fluorescencyjnych kulek w konstrukcji z hydrożelu. Stan spoczynku oraz ciśnienie aktywacyjne wynoszące 55 kPa demonstrują proces charakteryzacji odkształceń w trójwymiarowym systemie hodowlanym.

Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak wykonać urządzenia służące do mechanicznej stymulacji komórek w dwu- lub trójwymiarowych systemach hodowlanych. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o utrzymaniu urządzeń w maksymalnej czystości i wolności od kurzu oraz o zachowaniu cierpliwości, szczególnie podczas etapów wyrównywania. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.