Mikroprefabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórkowej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest mikrofabrykacja urządzeń służących do mechanicznej stymulacji komórek w dwu- i trójwymiarowych środowiskach hodowli. Osiąga się to dzięki zastosowaniu wielowarstwowej techniki formowania warstwowego i układania w stosy w celu wytworzenia szeregu pionowo uruchamianych mikrosłupków. W drugim etapie, pionowo uruchamiany układ mikro słupków jest modyfikowany w celu rozciągnięcia filmu hodowlanego, który nakłada dobrze kontrolowane szczepy na komórki hodowane na folii.

Alternatywnie, matryca może być zmodyfikowana w celu skompresowania mikrowzorów biomateriałów w celu zastosowania mechanicznej stymulacji komórek. Uzyskano wyniki hodowli w układzie trójwymiarowych hydrożeli, które pokazują jednoczesne zastosowanie szeregu dwuwymiarowych, dwuosiowych i trójwymiarowych szczepów kompresyjnych echa w całej matrycy w oparciu o analizę obrazu fluorescencyjnych markerów powierniczych. Cześć, nazywam się Chris Mariahs i pracuję w laboratoriach Craiga Simmonsa i U Sun na Wydziale Inżynierii Mechanicznej i Przemysłowej oraz w Instytucie Biomateriałów i Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie w Toronto.

Dzisiaj pokażemy Wam procedurę wytwarzania mikrourządzeń służących do mechanicznej stymulacji komórek. Używamy tej procedury w naszym laboratorium, aby zbadać, jak komórki reagują na różne siły mechaniczne w hodowli in vitro. Więc zacznijmy.

Proces wytwarzania form warstwowych obejmuje umieszczenie górnej przezroczystości na nieutwardzonym polidimetylu Sloane lub PDMS na wzorcu SU eight. Kanapkę umieszcza się w stosie ze szkła piankowego i metalu i utwardza w piekarniku pod ciśnieniem. Na koniec stos jest demontowany, a przezroczystość odklejana zasłania, zachowując wzorzystą warstwę PDMS.

Aby rozpocząć ten proces, dokładnie wymieszaj PDMS, monomer i środek sieciujący. W standardowym stosunku 10 do jednego umieść trzy mililitry nieutwardzonej mieszaniny PDMS na wcześniej wyprodukowanym wzorcu SU eight i DGA polimer w komorze próżniowej. Następnie umieść podkładkę piankową i SU eight master na płycie podstawy z pleksiglasu.

Ostrożnie opuść gładką stronę przezroczystości drukarki atramentowej na nieutwardzony PDMS, uważając, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza. Następnie umieść szkiełko Siloized na górze przezroczystości pod drugą podkładką piankową i górną płytą z pleksiglasu. Zaciśnij kanapkę razem za pomocą zacisku C.

Kanapkę PDMS utwardzamy w piekarniku w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny. Po peklowaniu wyjmij kanapkę z piekarnika i pozwól jej ostygnąć. Po ostygnięciu zdejmij zacisk i zdemontuj kanapkę.

Ostrożnie oderwij przezroczystość od ósmego wzorca SU, zachowując opatentowaną folię PDMS. Przytnij krawędzie folii wzoru, aby usunąć nadmiar PDMS, przechowuj warstwy wzoru w środowisku wolnym od kurzu, aż będą gotowe do użycia. Następna część tego protokołu obejmuje budowę mikro prefabrykowanego zestawu pionowo uruchamianych słupków.

Do wykonania szeregu mikrosłupków wymagany jest wielowarstwowy proces produkcyjny. Najniższa, najbardziej wzorzysta warstwa PDMS jest przygotowywana przez produkcję form warstwowych. Do tych eksperymentów wykorzystano okrągłe wzory o średnicy od 600 do 1 200 mikronów.

Aby przenieść warstwę PDMS na czyste szkiełko podstawowe, należy użyć jednostki wyładowczej Corona do potraktowania PDMS i powierzchni szklanych plazmą tlenową. Następnie umieść dwie powierzchnie stykające się ze sobą. Umieść stos na gorącej płycie w temperaturze 80 stopni Celsjusza na 10 minut, aby zakończyć proces klejenia.

Oderwij przezroczystość i wyrzuć. Proces ten zapewnia, że wzorzysta folia PDMS nigdy nie jest uwalniana ze sztywnego podłoża, co zapobiega kurczeniu się poszczególnych warstw. Druga warstwa formowana warstwowo jest formowana jako ujemna replika formy o pożądanej strukturze membrany i słupka.

W tej demonstracji do utworzenia tej warstwy użyto okrągłych słupków o średnicy 500 mikronów. Najpierw tymczasowo przymocuj ujemną formę repliki do szkiełka za pomocą taśmy dwustronnej i załóż w próżniowym osadzaniu nieutwardzonego PDMS na kanapce, warstwie formy, odgazowywaniu i wirowaniu przez 45 sekund Przy 1000 obrotach na minutę, co daje membranę uruchamiającą o grubości 60 mikronów, częściowo utwardź warstwę PDMS pokrytą spinem w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez około 20 minut lub do momentu, gdy PDMS stanie się lepki, ale nie odkształci się trwale. Po dotknięciu usuń szkiełko i taśmę dwustronną z częściowo utwardzonej warstwy PDMS, a przezroczystą folię przymocuj do pary szkiełek do przenoszenia szkła i plazmy.

Traktuj częściowo utwardzony PDMS, a następnie odwróć PDMS i umieść go w specjalnie wykonanej nakładce. Aligner składa się z uchwytu próżniowego zamontowanego na mikromanipulatorze. Następnie należy poddać plazmie pierwszą warstwę PDMS, a następnie umieścić ją na stoliku obrotowym pod uchwytem próżniowym.

Obserwuj wyrównanie między dwiema warstwami za pomocą awatara z 12-krotnym powiększeniem systemu wizyjnego. Za pomocą manipulatora wyrównaj warstwy i ostrożnie doprowadź je do kontaktu. Lekko dociśnij palcem, aby skleić warstwy.

Następnie wyjmij kanapkę z nakładki. Zdejmij szkiełka do przenoszenia szkła i upewnij się, że warstwy są ze sobą w pełnym kontakcie. Utwardzanie piekarnika w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dodatkowe 30 minut.

Po 30 minutach przezroczystą i silosową formę repliki PDMS można oderwać od urządzenia i wyrzucić. Urządzenie jest następnie w pełni utwardzane w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny w celu przeprowadzenia eksperymentów na komórkach hodowanych na deformującym się dwuwymiarowym podłożu. Układ mikro siłowników jest modyfikowany poprzez przyklejenie trzeciej warstwy PDMS do urządzenia.

Trzecia warstwa PDMS składa się ze struktury dwuwarstwowej. Dolny okrąg odpowiada rozmiarowi wnęki uruchamiającej pod uruchamianymi mikrosłupkami. Średnica górnego koła jest o 100 mikronów większa niż średnica słupków załadowczych.

Mikrokanał o szerokości 200 mikronów łączy te elementy z obszarem połączenia i będzie używany do smarowania słupków załadowczych i folii hodowlanej. Aby zmodyfikować urządzenie do hodowli 2D, najpierw wyprodukuj i przymocuj do niego złącza zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Następnie odwiruj warstwę PDMS o grubości od 10 do 15 mikronów na gładkiej stronie przezroczystego utwardzania.

Cienka folia PDMS w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny. Kolejnym krokiem jest przyłożenie podciśnienia do siłowników i przyklejenie warstwy PDMS do urządzenia. Aby to osiągnąć.

Po pierwsze, zastosuj podciśnienie o niskim poziomie do siłowników, obniżając układ słupków do obróbki plazmowej i wiązania. Powlekana wirowo folia PDMS do uruchamianego mikrourządzenia zgodnie z opisem w pisemnym protokole, słupki i folia hodowlana pozostaną hydrofilowe przez krótki czas. Następnie podłącz strzykawkę ze smarem do urządzenia i napełnij kanały smarowania 90% glicerolem w roztworze wody dejonizowanej.

Oprócz smarowania, preparat ten utrzymuje hydrofilowość PDMS w nieskończoność, zmniejszając współczynniki tarcia. Umieść urządzenie na płycie grzejnej w temperaturze 40 stopni Celsjusza i kontynuuj wstrzykiwanie smaru do kanału, powodując niewielki wzrost ciśnienia. Po kilku minutach pęcherzyki powietrza zostały rozproszone przez PDMS i wszystkie powierzchnie zostaną nasmarowane.

Na koniec usuń podciśnienie, zwalniając słupki za pomocą skalpela. Wytnij cienką folię PDMS. Ostrożnie oderwij folię spodnią od spoiwa plazmowego urządzenia.

Ręcznie wycinana uszczelka PDMS wokół obszaru hodowli urządzenia. Wysterylizuj urządzenie, mocząc je w 70% etanolu przez pięć minut, a następnie poddaj działaniu bakteriobójczego światła UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 45 minut. Osocze, potraktuj powierzchnię i inkubuj ze 100 mikrogramami na mililitr kolagenu przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po całonocnej inkubacji umyj urządzenie sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem lub PBS i komórkami nasiennymi w ilości od 10 do 15 000 komórek na centymetr kwadratowy. Zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych, układ mikrosiłowników może być modyfikowany w celu przeprowadzania eksperymentów dla komórek hodowanych w trójwymiarowych konstrukcjach hydrożelowych z fotowzorem. Najpierw wytwarzana jest wielowarstwowa platforma oparta na PDMS.

Po pokryciu platformy podstawowej metamfetaminą, wstrzykuje się odpowiedni roztwór prekursora hydrożelu w postaci szkiełka szklanego. Następnie biomateriał z fotopolimeru, który można zarezerwować, jest mikrowzorowywany do matrycy, a pozostały roztwór prekursorowy jest wypłukiwany. Układ pionowo uruchamianych słupków załadowczych może być następnie wykorzystany do przyłożenia ściskających sił mechanicznych do komórek hodowanych w trójwymiarowych biomateriałach z kawałkami taśmy klejącej maskującymi obszary wokół słupków, pokryj urządzenie paralinią C w systemie PDS 2010 lab COTER two.

Poprawi to kinetykę polimeryzacji systemu biomateriałów. Po pokryciu usuń urządzenie z systemu powlekania i odklej taśmę klejącą, pozostawiając warstwę ochronną paraliny C na słupkach. Następnie szkiełko nakrywkowe metamfetaminy ACRL przez zanurzenie w roztworze o stężeniu 2% objętości na objętość trzech trimeth profilu tlenowego metakrylanu w 95% etanolu na dwie minuty.

Wypłucz pokrywę. Wsunąć 100% etanol, a następnie upiec w temperaturze 100 stopni Celsjusza, pozostawiając grupy metakrylanów na powierzchni. Odlew przekładkę PDMS o grubości 200 mikronów.

Folię na szalce Petriego i pokrój na małe kawałki. Spajaj plazmowo cztery z tych małych odcinków wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego związanego z meac. Następnie plazma łączy przestrzenie z obszarami PDMS urządzenia pokrywającymi powłokę Lene C.

Na koniec wysterylizowałem urządzenie, myjąc je w 70% etanolu i wystawiając na działanie środków bakteriobójczych lub światła UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 45 minut. Aby sfotografować litograficznie, należy umieścić w urządzeniach hydrożele PEG obciążone komórkami. Przygotować roztwory prekursora i fotoinicjatora zgodnie z opisem w pisemnym protokole i dokładnie je wymieszać do uzyskania roztworu o stężeniu 0,4% wagowym na objętość fotoinicjatora.

Przefiltruj mieszaninę przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,45 mikrona, aby wysterylizować i usunąć cząstki stałe, hodowle komórek lodu trypsyny i przygotować zawiesinę komórek w pożywce hodowlanej o dwukrotnie wyższym stężeniu komórek w punkcie końcowym. Następnie wymieszaj zawiesinę komórkową i przefiltrowany roztwór fotoinicjatora prekursora hydrożelu w stosunku jeden do jednego. Wstrzyknąć roztwór do mikrourządzenia za pomocą długiej igły o rozmiarze 25G.

Ostrożnie unikaj uwięzienia bąbelków w urządzeniu. Wyrównaj wydrukowaną maskę przezroczystości do znaczników wyrównania na powierzchni urządzenia. Skonfiguruj system oświetlenia UV, aby zapewnić dawkę UV o długości fali 365 nanometrów wynoszącą 17,5 miliwata na centymetr kwadratowy na powierzchni urządzenia.

Rozświetlaj hydrożel przez maskę przez 195 sekund po rozświetleniu. Zmyć niespolimeryzowany roztwór prekursora hydrożelu PBS i zastąpić PBS pożywką hodowlaną, uruchomić słupki ładujące, aby ścisnąć konstrukcje hydrożelowe. Tutaj pokazano ukończone przykładowe urządzenie do mechanostymulacyjnej hodowli 2D.

Czerwony barwnik służy do oznaczania uruchamiających kanałów doprowadzania ciśnienia, a niebieski D służy do oznaczania charakterystyki odkształceń kanałów smarowania. Eksperymenty można wykorzystać do określenia zastosowanych pól odkształceń poprzez śledzenie ruchu koralików fluorescencyjnych na podłożach. Czerwone plamki reprezentują nieuformowane położenie koralików, podczas gdy zielone plamy reprezentują zdeformowane miejsca.

Przykładowe urządzenie do eksperymentów z kompresją trójwymiarową można zobaczyć tutaj, gdzie zielony barwnik jest używany do oznaczania kanałów ciśnieniowych aktywacji. Widok z góry na matrycę mikrosłupków ujawnia konstrukcję hydrożelową wzorowaną na zrekonstruowanych obrazach koralików fluorescencyjnych w konstrukcji hydrożelowej po stronie słupka. W stanie spoczynku i ciśnieniu aktywacji 55 kilo paskala demonstruje proces charakterystyki szczepu w trójwymiarowym systemie hodowli.

Właśnie pokazaliśmy, jak wytwarzać urządzenia używane do mechanicznej stymulacji komórek w dwu- lub trójwymiarowych systemach hodowli. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby urządzenia były jak najbardziej czyste i wolne od kurzu oraz zachować cierpliwość, zwłaszcza podczas etapów wyrównywania. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.