Name: Test zabijania in vivo specyficzny dla antygenu przy użyciu komórek docelowych znakowanych CFSE (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj metodę oceny cytotoksyczności komórek CD8+ T in vivo przy użyciu znaczników CFSE i cytometrii przepływowej. Protokół umożliwia pomiar jakości odpowiedzi immunologicznej w myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chciałbym podziękować Biance Mothé, Carli Oseroff oraz Marie-France DelGuercio za wprowadzenie mnie w zakres testów immunologicznych i obsługi myszy. Prace w laboratorium G. A. Splittera są finansowane z grantu NIH 1-RO1-AI-073558, grantu GLRCE 1-U54-AI-057153 oraz BARD US-3829-06.

1. Indukowanie specyficznych dla celu efektorowych limfocytów T cytotoksycznych (CTL) poprzez immunizację (dzień 0)
<ol>
<li>Przed rozpoczęciem należy wybrać konkretny układ efektor:cel. W tym przykładzie klasycznego testu CTL in vivo wykorzystamy immunizację oczyszczonym peptydem w celu wywołania specyficznych limfocytów T CD8 +. Ten sam peptyd zostanie użyty do pulsowania syngenicznych komórek docelowych, tworząc specyficzny układ efektor:cel. Alternatywnie można zdecydować się na użycie całego patogenu lub białka w celu uzyskania specyficznych efektorów i celów.</li>
<li>Zdezynfekować powierzchnię roboczą wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza (BSC), aby zapewnić sterylność wstrzykiwań. Przygotować immunizację peptydową, umieszczając najpierw 50 μg oczyszczonego peptydu w 10 μL 10% DMSO w PBS/mysim w probówce o pojemności 2 mL. Następnie dodać taką samą ilość bardzo schłodzonego niepełnego adjuwantu Freunda i uzupełnić do poziomu 0,2 mL, dodając kuleczki o średnicy 1 mm do mieszania. Od tego momentu przechowywać immunogen na lodzie aż do momentu wstrzyknięcia. Zamknąć pokrywkę Parafilmem.</li>
<li>Użyć homogenizatora kulowego (bead beater) ustawionego na maksymalne RPM, aby mieszać emulsję przez 3 minuty, a następnie niezwłocznie umieścić emulsję z powrotem na lodzie. Otrzymana emulsja powinna mieć konsystencję zbliżoną do majonezu. Jeśli czas na to pozwala, pozostawić emulsję w temperaturze 4° C na noc (do tygodnia), mieszając ponownie w przypadku zauważenia rozwarstwienia.</li>
<li>Użyć strzykawki 1 mL i igły o rozmiarze 20 lub 20,5 G, aby pobrać emulsję, uważając, by nie pobrać żadnych kuleczek (kuleczki powinny być większe niż światło igły, niemniej należy zachować ostrożność).</li>
<li>Utrzymać mysz w celu wykonania wstrzyknięcia podskórnego u nasady ogona. Używamy zmodyfikowanej plastikowej probówki stożkowej 50 mL, aby bezpiecznie i delikatnie unieruchomić mysz do iniekcji. Wstrzyknąć myszy 0,2 mL emulsji.</li>
</ol>
2. Pozyskiwanie komórek docelowych (Dzień 8)
<ol>
<li> Do uzyskania komórek docelowych będą potrzebne naiwne myszy syngeniczne. Eutanazję naiwnych myszy należy przeprowadzić zgodnie ze standardami AAALAC. </li>
<li> Zdezynfekuj mysz, rozpylając 70% etanol, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia włosami myszy lub innymi zanieczyszczeniami zewnętrznymi.</li>
<li> Za pomocą nożyczek do sekcji wykonaj niewielkie nacięcie skóry po lewej stronie myszy. Odchyl płat skóry, aby odsłonić jamę otrzewną i organy wewnętrzne.</li>
<li> Przetnij otrzewną, uważając, aby nie uszkodzić żadnego z leżących poniżej organów. Śledziona znajduje się blisko powierzchni i ma kolor podobny do wątroby (ciemnoczerwony), ale jest mniejsza i ma kształt fasoli. Myszy zainfekowane zazwyczaj mają znacznie większe śledziony niż niezinfekowane kontrolne. </li>
<li> Ostrożnie wyjmij śledzionę, dbając o delikatność, aby nie rozbić jej na kilka części, w celu odzyskania maksymalnej liczby komórek. Natychmiast umieść śledzionę w probówce stożkowej 15 mL zawierającej 10 mL przygotowanego medium na lodzie. Powtórz czynność dla pozostałych myszy.</li>
<li> Przelej zawartość probówki stożkowej 15 mL (medium i śledzionę) do szklanego homogenizatora tkankowego. Rozetrzyj śledzionę, używając znacznej siły ramienia. Gdy cała tkanka straci swój kolor, można założyć, że wszystkie komórki zostały wydzielone z tkanki łącznej.</li>
<li> Przelej zawartość homogenizatora przez filtr komórkowy 70 μm do probówki stożkowej 50 mL. Przepłucz homogenizator świeżym medium i przelej przez sito komórkowe.</li>
<li> Wiruj przy 4° C, 130 RPM przez 7 minut. Odlej nadsącz.</li>
<li> Resuspenduj w 10 mL przygotowanego odczynnika lizującego i inkubuj przy 37° przez 7 minut.</li>
<li> Uzupełnij objętość do 50 mL świeżym medium i wiruj w tych samych warunkach, co powyżej.</li>
<li> Resuspenduj w 50 mL świeżego medium i wiruj w tych samych warunkach, co powyżej (etap płukania). *Uwaga: Na tym etapie można przeprowadzić magnetyczną separację komórek w celu wyizolowania konkretnego typu komórek (np. makrofagów), jeśli do transferu do myszy biorców wymagana jest czysta populacja komórek docelowych. Ponadto na tym etapie można wprowadzić do hodowli czynnik eksperymentalny, aby zbadać wpływ tego działania na specyficzne zabijanie komórek.</li>
<li> Policz komórki i nanieś 1 x 107 na studzienkę w 10μL na 96-dołkową płytkę do hodowli tkankowej z okrągłym dnem. *Jest to wysoka koncentracja komórek na studzienkę, ale ponieważ test jest krótki, nie zaobserwowano spadku żywotności komórek przy tej koncentracji.</li>
</ol>
3. Traktowanie i znakowanie komórek docelowych
<ol>
<li> Hulkuj odpowiednie komórki i powtórzenia peptydem specyficznym dla patogenu lub kontrolnym peptydem nieistotnym: dodaj 1 μg/mL peptydu. Inkubuj w temperaturze 4° C przez 1,5 godziny. Przenieś do inkubatora 37° C na ostatnie 30 minut. W tym czasie przygotuj odczynnik CFSE.</li>
<li> Przygotuj CFSE zgodnie ze specyfikacjami producenta i rozcieńcz do stężenia roboczego między 0,5 a 25 μM. Przygotuj stężenie „niskie” 10x mniejsze niż stężenie „wysokie” CFSE. Na przykład, dla [niskiego] dodaj 0,5 μL CFSE do 10 mL PBS, a dla [wysokiego] dodaj 5 μL CFSE do 10 mL PBS. Podgrzej przygotowany CFSE do 37° C przed znakowaniem.</li>
<li> Wyjmij płytkę z komórkami z inkubatora i odwiruj w wirówce do wysokich prędkości w temperaturze pokojowej, 130 RPM przez 7 minut. Odchyl płytkę, aby usunąć nadsącz.</li>
<li> Resuspenduj komórki w CFSE o stężeniu [niskim] lub [wysokim], dodając 20 μL odpowiedniego odczynnika do odpowiadających im studzienek i inkubuj przez 15 minut w 37° C. </li>
<li> Wyjmij płytkę z komórkami z inkubatora i ponownie odwiruj w temperaturze pokojowej, 130 RPM przez 7 minut. Odchyl płytkę, aby usunąć nadsącz.</li>
<li> Resuspenduj komórki w 20 μL/studzienkę podgrzanej świeżej pożywki i inkubuj przez 30 minut w 37°C.</li>
<li> Wyjmij płytkę z komórkami z inkubatora i odwiruj w temperaturze pokojowej, 130 RPM przez 7 minut. Odchyl płytkę, aby usunąć nadsącz.</li>
<li> Resuspenduj komórki w 10 μL/studzienkę PBS.</li>
<li> Dla transferu adoptywnego dodaj komórki oznakowane stężeniem [niskim] z jednej studzienki do komórek oznakowanych stężeniem [wysokim] z jednej studzienki na mysz. Wynikowa iniekcja powinna zawierać 50% specyficznych celów i 50% komórek nieistotnych w objętości .2 mLs.</li>
<li> Pamiętaj, aby odłożyć część oznakowanych komórek, które będą służyć jako kontrole nietransferowane podczas analizy danych i pomiarów w cytometrze przepływowym (patrz Rysunek 1).</li>
</ol>
4. Transfer adopcyjny
<ol>
<li>Zanurzyć w narkozie myszy uprzednio immunizowane peptydem (z części nr 1 niniejszego protokołu) zgodnie ze standardami AAALAC.</li>
<li>Wstrzyknąć .2 mL oznakowanych komórek docelowych drogą zakrwawno-orbitarną myszom biorcom.</li>
<li>Odczekać 6 godzin lub inny ustalony optymalny czas przed uśmierceniem myszy biorców.</li>
</ol>
5. Pozyskiwanie znakowanych komórek
*Uwaga: Kroki od 5.1 do 5.1 są takie same jak kroki od 2.1 do 2.1
<ol start="12">
<li>Policz komórki i wysiej w ilości 1 x 106 na studnię w 100 μL do 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej z okrągłym dnem.</li>
<li>Utrwal odzyskane i nieprzeniesione komórki, dodając 100 μL 2% paraformaldehydu do wszystkich studni, aby uzyskać końcowe stężenie 1% paraformaldehydu.</li>
</ol>
6. Cytometria przepływowa i analiza danych
<ol>
<li >Przeanalizuj próbki za pomocą cytometru przepływowego i dokonaj analizy danych.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Zmniejszający się pik specyficzny dla epitopu na otrzymanym histogramie jest wskaźnikiem specyficznego zabijania komórek (Rycina 1). Należy zastosować następujące równania (wykorzystane w Tabeli 1) w celu określenia rzeczywistej wartości specyficznej lizy komórek: 
Stosunek = Procent nieistotny : Procent specyficzny dla epitopu (pik [niski]:pik [wysoki]), 
Procent specyficznej lizy = [1-(Stosunek kontroli bez transferu/Stosunek eksperymentalny)] x 100
<img src="/files/ftp_upload/2250/2250fig1.jpg" alt="Histogramy z cytometrii przepływowej, analiza CFSE, wykazująca specyficzność epitopu, porównanie odpowiedzi peptydowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Profil CFSE odzyskanych splenocytów myszy szczepu BALB/c. Liczby wskazują procent komórek o wysokim lub niskim fenotypie CFSE. A) Kontrola bez transferu. Wszystkie piki CFSE [high] reprezentują komórki docelowe specyficzne dla epitopu, natomiast piki CFSE [low] reprezentują komórki docelowe stymulowane nieistotnym peptydem. B) Komórki znakowane CFSE odzyskane z myszy biorcy immunizowanej PBS (kontrola). C) Komórki znakowane CFSE odzyskane z dwóch różnych myszy biorców specyficznych dla peptydu; zwróć uwagę na zmniejszenie pików specyficznych dla epitopu.
<img src="/files/ftp_upload/2250/2250fig2.jpg" alt="Wykres słupkowy procentowej specyficznej cytotoksyczności; eksperyment porównujący grupy badawcze; wyniki analizy danych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Graficzna prezentacja analizowanych danych. Dla każdej grupy myszy (PBS, Peptyd A i Peptyd B) przedstawiono trzy punkty danych.
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Próbka</td>
 <td>CFSE HIGH % po stymulacji epitopem</td>
 <td>% CFSE LOW Nieistotne</td>
 <td>Stosunek niskiego do wysokiego</td>
 <td>Procent specyficznej cytotoksyczności wobec epitopu</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>42.8</td>
 <td>57.2</td>
 <td>1.34</td>
 <td>16.97</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>43.1</td>
 <td>56.9</td>
 <td>1.32</td>
 <td>15.94</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>44.3</td>
 <td>55.7</td>
 <td>1.26</td>
 <td>11.74</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peptyd A</td>
 <td>39.7</td>
 <td>60.3</td>
 <td>1.52</td>
 <td>32.56</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peptyd A</td>
 <td>38.6</td>
 <td>61.4</td>
 <td>1.59</td>
 <td>35.61</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peptyd A</td>
 <td>40.6</td>
 <td>59.4</td>
 <td>1.46</td>
 <td>29.99</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peptyd B</td>
 <td>38.7</td>
 <td>61.3</td>
 <td>1.58</td>
 <td>24.68</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peptyd B</td>
 <td>38.5</td>
 <td>61.5</td>
 <td>1.60</td>
 <td>25.32</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peptyd B</td>
 <td>39.3</td>
 <td>60.7</td>
 <td>1.54</td>
 <td>22.76</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kontrola PBS NT</td>
 <td>47.4</td>
 <td>52.6</td>
 <td>1.11</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kontrola Pep A NT</td>
 <td>49.4</td>
 <td>50.6</td>
 <td>1.02</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kontrola Pep B NT</td>
 <td>45.6</td>
 <td>54.4</td>
 <td>1.19</td>
 <td> </td>
 </tr>
</tbody>
</table>
Tabela 1. Analiza reprezentatywnych danych. "NT" oznacza brak transferu (non-transferred).

<ol><li>Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+epitope+escape+on+PD-1+expression+and+CD8+T-cell+exhaustion+during+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection.</a> J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).</li>
<li>Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strength+of+T+cell+receptor+signal+controls+the+polarization+of+cytotoxic+machinery+to+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse.</a> Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).</li>
<li>Ingulli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+tolerance+and+immunity+in+vivo+by+CFSE-labeling+of+administered+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells.</a> Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).</li>
<li>Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discordant+Brucella+melitensis+antigens+yield+cognate+CD8%2B+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo.</a> Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).</li>
<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).</li>
<li>Weston, S. A., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+studies.+Analysis+by+flow+cytometry+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy.</a> J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).</li>
<li>Akondy, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yellow+fever+virus+vaccine+induces+a+broad+and+polyfunctional+human+memory+CD8%2B+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response.</a> J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).</li>
<li>Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+antigen-driven+responses+by+flow+cytometry%3A+monitoring+proliferation+by+dye+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution.</a> Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).</li>
<li>Labadi, A., Balogh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+preferences+in+serosal+homing+and+distribution+of+peritoneal+B-cell+subsets+revealed+by+in+situ+CFSE+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling.</a> Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).</li>
<li>Suffner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+support+homeostatic+expansion+of+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+in+Foxp3.LuciDTR+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice.</a> J Immunol. 184 (4), 1810-1820 Forthcoming.</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów. Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami ustanowionymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na The University of Wisconsin-Madison.

Metodę tę można zmodyfikować w celu zbadania zdolności komórek do proliferacji, w tym ekspansji klonalnej, ponieważ CFSE dzieli się stosunkowo równomiernie pomiędzy komórki potomne10,11. Możliwe jest również wykorzystanie znakowania CFSE do badania migracji komórek6,12, choć w zależności od postawionej hipotezy mogą istnieć inne, bardziej odpowiednie metody śledzenia komórek, na przykład tetramery i bioluminescencja13, które mogą być również łączone ze znakowaniem CFSE.
<p class="jov...

<table><tbody><tr><td>Kuleczki szklane 1 mm</td><td>Biospec Products</td><td>11079110</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek 70 &amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Niepełny adjuwant Freunda Adjulite Incomplete Freund&amp;rsquo;s Adjuvant</td><td>Pacific Immunology</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5879</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000-077</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy FC 500</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Szklany homogenizator do tkanek Kontes</td><td>Kontes Corp</td><td>885300-0015</td><td></td></tr><tr><td>Mini Beadbeater</td><td>Biospec Products</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Igła</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot;</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik lizujący PharmLyse</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Vybrant CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>V12883</td><td></td></tr></tbody></table>

swoisty dla antygenu in vivo test zabijania z użyciem komórek docelowych znakowanych cfse

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

estrym sukcynimidylowym diacetatu karboksyfluoresceiny (CFSE) można wykorzystać do łatwego i szybkiego znakowania populacji komórek interesujących badacza w celu przeprowadzenia badań in vivo. Znakowanie to klasycznie stosowano do badania proliferacji i migracji. W prezentowanej tutaj metodzie skrócono czas po transferze adopcyjnym, aby zbadać przeżywalność i eliminację specyficznych dla epitopu komórek docelowych znakowanych CFSE4-6. Poziom specyficznej eliminacji klonu limfocytów T CD8+ może wskazywać na jakość odpowiedzi, ponieważ ich liczba może być myląca. Specyficzne limfocyty T CD8+ mogą z czasem ulec funkcjonalnemu wyczerpaniu, co objawia się spadkiem produkcji cytokin i zdolności do eliminacji komórek7,8. Ponadto niektóre klony limfocytów T CD8+ mogą nie eliminować komórek tak skutecznie jak inne o odmiennej specyficzności TCR9. Aby zapewnić skuteczną odporność komórkową (CMI), należy zidentyfikować antygeny, które indukują nie tylko odpowiednią liczbę reagujących limfocytów T, ale także limfocyty T reagujące w sposób funkcjonalnie wydajny. W niniejszej pracy oceniamy procent specyficznej eliminacji komórek przez dwa klony limfocytów T specyficznych dla peptydów u myszy BALB/c.

Wiele infekcji wywołuje silną odpowiedź CTL, jednak sporadycznie liczba komórek odpowiadających nie koreluje z kontrolą patogenu1. Jedną z miar jakości CTL jest ich zdolność do specyficznego zabijania2. Oznakowanie komórek docelowych za pomocą CFSE może być wykorzystane do zbadania jakości tej odpowiedzi CTL in vivo3,4.

Swoisty dla antygenu In vivo Test zabijania z użyciem komórek docelowych znakowanych CFSE

ester sukcynimidyloowy diacetatu karboksyfluoresceiny (CFSE) może być wykorzystany do łatwego i szybkiego znakowania wybranej populacji komórek w celu prowadzenia badań in vivo. ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ocena jakości funkcjonalnej limfocytów T CD8+ w odpowiedzi na konkretny antygen poprzez zbadanie ich zdolności do zabijania komórek docelowych in vivo. Osiąga się to najpierw poprzez wywołanie swoistej dla antygenu odpowiedzi efektorowej limfocytów T CD8+ poprzez immunizację myszy biorców. W drugim kroku pierwotne komórki docelowe zostają uprzywilegione pod kątem specyficzności lub poddane innej obróbce, co kończy tworzenie specyficznego systemu efektorowo-docelowego.Następnie komórki docelowe są podawane myszom biorcom poprzez adoptywny transfer zaoczny. Aby ocenić skuteczność zabijania przez efektory in vivo, uzyskano wyniki wykazujące, czy efektory zniszczyły któreś z komórek docelowych, na podstawie analizy cytometrii przepływowej komórek barwionych CF SE. Cześć, nazywam się Marina Ward.Jestem studentem studiów doktoranckich w laboratorium Gary'ego Splittera na University of Wisconsin Madison. Ta metoda pozwoli na zrozumienie mechanizmów zabijania przez CTL i może być również zastosowana do badania proliferacji oraz przeżywalności komórek. Procedurę transferu adoptywnego zaprezentuje dr Jerome Harms, naukowiec z mojego laboratorium. Ro

antigen-specific-in-vivo-killing-assay-using-cfse-labeled-target-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Test Eliminacji Antygenowo-Specyficznych In Vivo z wykorzystaniem Oznaczonych CFSE Komórek Celowych

CFSE kowalencyjnie znakuje długożyjące cząsteczki wewnątrzkomórkowe barwnikiem fluorescencyjnym, karboksyfluoresceiną. W związku z tym, gdy komórka znakowana CFSE dzieli się, jej potomstwo posiada połowę ilości fluorescencji, co może być wykorzystane do oceny podziałów komórkowych. Niniejszy artykuł opisuje procedury zazwyczaj stosowane do znakowania limfocytów mysich przy użyciu CFSE.

Zastosowanie estru bursztynianowego diacetatu karboksyfluoresceiny (CFSE) do monitorowania proliferacji limfocytów

Testy limfocytotoksyczności komórkowej (CML) mogą być wykorzystywane do badania odpowiedzi autoreaktywnych oraz mechanizmów śmierci komórek in vitro. Jednak dzięki zastosowaniu technik obrazowania konfokalnego żywych komórek z użyciem barwników fluorescencyjnych, typ i kinetyka śmierci komórkowej, a także wykorzystywane szlaki, mogą być badane w znacznie większych szczegółach.

Metody oceny śmierci komórek beta pośredniczonej przez cytotoksyczne limfocyty T

Opisano prosty protokół przygotowania ekstraktów z ludzkich tkanek, które służą jako źródło antygenów w funkcjonalnych testach limfocytów T. Metoda ta pozwala na pomiar odpowiedzi limfocytów T na antygeny pochodzące z tkanek in vitro.

Ekstrakcja antygenów tkankowych do analiz funkcjonalnych

Film prezentuje test oparty na cytometrii przepływowej do oznaczania dominacji immunologicznej w cytotoksycznych limfocytach T lub odpowiedziach CTL. Wstrzyknięte fluorescencyjne komórki docelowe wykazują różną fluorescencję odpowiadającą epitopom immunogennym. Pobranie i sortowanie po śledzionie ujawnia zmniejszenie liczby komórek fluorescencyjnych o wysokiej intensywności, co potwierdza dominację immunologiczną w odpowiedziach CTL.

Test do oceny immunodominacji w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T

Ten protokół opisuje czuły, komórkowy test cytotoksyczności. Wyliczając spadek częstości żywych docelowych limfocytów T CD4 + w obecności rosnącej liczby efektorowych limfocytów T CD8 +, test ten pozwala na bezpośrednią ocenę aktywności cytolitycznej limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu.

Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Możliwość szczegółowego monitorowania odpowiedzi limfocytów T in vivo jest ważna dla rozwoju naszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisujemy zastosowanie docelowych macierzy fluorescencyjnych (FTA) w teście in vivo limfocytów T, który ocenia &gt;250 parametrów jednocześnie za pomocą cytometrii przepływowej.

Zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo

Celem tego protokołu jest umożliwienie wykrywania in vivo specyficznego dla antygenu zabijania komórki docelowej w modelu mysim.

In vivo (in vivo) Test do wykrywania swoistej dla antygenu funkcji cytolitycznej limfocytów T przy użyciu modelu szczepienia

Opisujemy tutaj test zabijania in vivo oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia badanie dominacji immunologicznej w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na modelowy antygen nowotworowy. Podajemy przykłady, w jaki sposób ten elegancki test może być wykorzystany do badań mechanistycznych i do testowania skuteczności leków.

Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

Prezentowany tutaj jest protokół pomiaru proliferacji limfocytów T CD4+ w odpowiedzi na antygenowe białka lub peptydy za pomocą rozcieńczenia barwnika. Test ten jest szczególnie czuły w przypadku rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu i może być modyfikowany w celu ułatwienia klonowania komórek specyficznych dla antygenu.

Kwantyfikacja proliferujących ludzkich limfocytów T CD4 + specyficznych dla antygenu przy użyciu estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny

Ten protokół zapewnia zstandaryzowany in vitro przepływ pracy dla spójnego pomiaru naturalnej, chimerycznej receptora antygenowego–pośredniczonej i zależnej od przeciwciał cytotoksyczności ludzkich naturalnych komórek zwanych zbójcami przy użyciu żywego obrazu komórkowego i cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórek NK potencjowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek i cytometrii przepływowej

Poznaj metodę oceny cytotoksyczności komórek CD8+ T in vivo przy użyciu znaczników CFSE i cytometrii przepływowej. Protokół umożliwia pomiar jakości odpowiedzi immunologicznej w myszy.

Swoisty dla antygenu In vivo Test zabijania z użyciem komórek docelowych znakowanych CFSE

Przeglądaj więcej filmów