Swoisty dla antygenu In vivo Test zabijania z użyciem komórek docelowych znakowanych CFSE

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ocena jakości funkcjonalnej limfocytów T CD8+ w odpowiedzi na konkretny antygen poprzez zbadanie ich zdolności do zabijania komórek docelowych in vivo. Osiąga się to najpierw poprzez wywołanie swoistej dla antygenu odpowiedzi efektorowej limfocytów T CD8+ poprzez immunizację myszy biorców. W drugim kroku pierwotne komórki docelowe zostają uprzywilegione pod kątem specyficzności lub poddane innej obróbce, co kończy tworzenie specyficznego systemu efektorowo-docelowego.

Następnie komórki docelowe są podawane myszom biorcom poprzez adoptywny transfer zaoczny. Aby ocenić skuteczność zabijania przez efektory in vivo, uzyskano wyniki wykazujące, czy efektory zniszczyły któreś z komórek docelowych, na podstawie analizy cytometrii przepływowej komórek barwionych CF SE. Cześć, nazywam się Marina Ward.

Jestem studentem studiów doktoranckich w laboratorium Gary'ego Splittera na University of Wisconsin Madison. Ta metoda pozwoli na zrozumienie mechanizmów zabijania przez CTL i może być również zastosowana do badania proliferacji oraz przeżywalności komórek. Procedurę transferu adoptywnego zaprezentuje dr Jerome Harms, naukowiec z mojego laboratorium. Rozpocznij strategicznie od zdefiniowania konkretnego systemu celu efektorowego.

Na przykład w klasycznym badaniu CTL in vivo, zastosuj immunizację oczyszczonym peptydem w celu wywołania specyficznych limfocytów T CD8+, a następnie wykorzystaj ten sam peptyd do pulsowania syngenicznych komórek docelowych, tworząc w ten sposób specyficzny układ efektorowo-docelowy. Zdezynfekuj powierzchnię roboczą komory z laminarnym przepływem powietrza, aby zapewnić sterylność iniekcji. Przygotuj immunizację peptydową, umieszczając go w pierwszej kolejności w probówce o pojemności 2 ml.

50 µg oczyszczonego peptydu w 100 µl 10% DMSO w PBS na mysz. Następnie należy dodać równą ilość bardzo zimnego, niepełnego roztworu unju z kuleczkami o średnicy 1 mm w celu wymieszania. Zamknąć wieczko probówki parafimem i przechowywać immunogen w lodzie do momentu wstrzyknięcia.

Użyj homogenizatora kuleczkowego ustawionego na maksymalną liczbę obrotów na minutę, aby mieszać emulsję przez trzy minuty, a następnie niezwłocznie umieść emulsję z powrotem w lodzie po zakończeniu mieszania. Powstała emulsja powinna mieć konsystencję podobną do majonezu. Pozostaw emulsję w temperaturze 4°C przez noc lub do tygodnia, mieszając ją ponownie, jeśli w momencie immunizacji zauważone zostanie jakiekolwiek rozwarstwienie.

Zidentyfikuj myszy do tej części eksperymentu. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml i igły o rozmiarze 20 G, aby pobrać emulsję. Zachowaj ostrożność, aby nie pobrać żadnych kulek w celu przygotowania komórek docelowych.

Do doświadczenia wykorzystuje się naiwne myszy syngeniczne; myszy te poddaje się eutanazji zgodnie z zatwierdzonymi standardami A-A-A-L-A-C. Odpowiedni obszar ciała myszy spryskuje się 70% ethanol, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia przez sierść lub inne zanieczyszczenia zewnętrzne, a następnie za pomocą nożyczek sekcyjnych wykonuje się niewielkie nacięcie skóry po lewej stronie ciała myszy.

Odciągnij płat skóry, aby odsłonić worek otrzewny i narządy wewnętrzne. Przetnij otrzewną, uważając, aby nie uszkodzić żadnego z leżących pod nią narządów. Zlokalizuj śledzionę, która znajduje się blisko powierzchni i ma ciemnoczerwony kolor.

Ostrożnie wyciągnąć śledzionę i natychmiast umieścić ją w 15 mililitrowej probówce stożkowej zawierającej 10 mililitrów przygotowanego medium RPMI w lodzie. Powtórzyć czynność dla pozostałych myszy. Przenieść śledzionę wraz z medium do szklanego homogenizatora do tkanek.

Rozcierać śledzionę, aż cała tkanka straci kolor. Przesiać homogenizaty przez filtr komórkowy o oczkach 70 µm do probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Przepłukać homogenizator raz świeżą pożywką i połączyć z homogenizatem śledziony, przelewając go przez filtr; odwirować próbki w temperaturze 4 °C przy 1 300 obr./min.

Przez siedem minut odcedzać i usunąć supernatant. Resuspender osad komórkowy w 10 mililitrach lizatu i inkubować w temperaturze 37°C przez siedem minut. Uzupełnić objętość do 50 mililitrów świeżym medium i zebrać komórki poprzez wirowanie.

Powtórz to płukanie. Policz komórki i rozdziel 10 milionów komórek na każdą studzienkę w 96-dołkowej płytce hodowlanej z okrągłym dnem.

Inkubować w temperaturze 4 °C przez półtorej godziny. Przenieść do inkubatora w temperaturze 37 °C na ostatnie 30 minut. Przygotować świeży odczynnik CFSE zgodnie z instrukcją producenta i rozcieńczyć do stężenia roboczego od 0,5 do 25 µM.

Przygotuj dwa roztwory CFSE o stężeniach różniących się dziesięciokrotnie. Przed przystąpieniem do znakowania doprowadź oba roztwory CFSE (o niskim i wysokim stężeniu) do temperatury 37 °C. Wyjmij z inkubatora płytkę 96-dołkową z komórkami docelowymi i odwiruj komórki w celu ich osadzenia.

W temperaturze pokojowej potrząśnij płytką, aby usunąć nadsącz SUP. Resuspenduj komórki w 200 µL roztworu CFSE o niskim lub wysokim stężeniu i inkubuj przez 15 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Odwiruj komórki przez wirowanie w temperaturze pokojowej, potrząśnij płytką, aby usunąć nadsącz SUP, a następnie resuspenduj komórki w 200 µL świeżej pożywki i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Ponownie odwiruj komórki przez wirowanie, odlej nadsącz i resuspenduj osad w 50 µL PBS. Odstaw część oznakowanych komórek jako kontrole braku transferu do analizy danych oraz do badania na cytometrze przepływowym w celu transferu adopcyjnego.

Dodaj jedną studnię z komórkami znakowanymi CFSE o niskim stężeniu do jednej studni z komórkami znakowanymi CFSE o wysokim stężeniu na jedną mysz. W ten sposób powstały zastrzyk składa się w 50% z docelowych komórek specyficznych i w 50% z komórek nieistotnych w objętości 0,1 mililitra. Aby ułatwić transfer adopcyjny, znieczul myszy immunizowane peptydem i wstrzyknij 0,1 mililitra znakowanych komórek docelowych drogą zaoczno-orbitową do biorcy.

Po sześciu godzinach uśmierć myszy biorców w celu zbioru komórek, wyizoluj śledzionę myszy i oczyść populację komórek zgodnie z zastosowanym wcześniej protokołem. Przygotowując docelowe komórki śledzionowe, wysiej komórki w liczbie 1 miliona na studzienkę do 96-dołkowej płytki hodowlanej z okrągłym dnem, utrwal odzyskane i nietransferowane komórki paraformaldehydem, przeanalizuj próbki za pomocą cytometru przepływowego i dokonaj analizy danych. Typowe przedstawienie wyników specyficznej cytotoksyczności komórkowej ukazano na dwa sposoby.

Zmniejszony szczyt specyficzny dla epitopu na histogramie FACS oraz obliczona wartość oznaczają lizę specyficzną dla komórek. Tutaj liczby wskazują procent komórek o wysokim lub niskim fenotypie CFSE w komórkach kontrolnych znakowanych CFSE, które nie były transferowane, odzyskanych z myszy biorcy immunizowany PBS, oraz komórkach znakowanych CFSE odzyskanych z dwóch różnych myszy biorców specyficznych dla peptydów. Należy zwrócić uwagę na zmniejszone szczyty specyficzne dla epitopu, które wskazują na specyficzne zabijanie komórek.

Alternatywnie wyniki można przedstawić graficznie, aby wskazać specyficzną lizę komórek dla każdej grupy myszy: PBS, peptyd A i peptyd B. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak opracować własny test zabijania CTL in vivo z wykorzystaniem myszy.