In vivo wewnątrznaczyniowe obrazowanie molekularne blaszek zapalnych z wykorzystaniem fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF) – multimodalne podejście do obrazowania miażdżycy

W tej procedurze zastosowano nowy cewnik do fluorescencji w bliskiej podczerwieni (cewnik NIRF) w celu obrazowania dwuwymiarowej biologii naczyniowej wewnątrz tętnic oraz monitorowania procesów biologicznych, w tym miażdżycy, stanu zapalnego i angiogenezy. W pierwszej kolejności, w odpowiednim czasie, tworzony jest eksperymentalny model miażdżycy w aorcie i tętnicach biodrowych nowozelandzkiego królika białego. Następnie wstrzykiwany jest nanoczujnik NIRF Activat w celu oznakowania zapalonej blaszki miażdżycowej.

Po 24 godzinach wykonuje się zarejestrowaną wspólnie angiografię tętniczą, wewnątrznaczne badanie USG oraz wewnątrznaczne obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni in vivo i ex vivo. Wymagane są obrazy królika z rasy Roma. Następnie aortę i tętnice biodrowe wycina się w celu przeprowadzenia ex vivo obrazowania refleksyjnego fluorescencji oraz analizy immunohistochemicznej stanu zapalnego blaszki miażdżycowej.

Ostateczne wyniki wykazują mierzalne sygnały korelujące ze stanem zapalnym blaszki miażdżycowej. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu obrazowania molekularnego, takie jak detekcja stanu zapalnego i blaszek w czasie rzeczywistym in vivo, identyfikacja kluczowych markerów blaszek niestabilnych lub prekursorów ostrego zawału mięśnia sercowego. Zastosowania tej techniki obejmują terapię miażdżycy, ponieważ umożliwia ona detekcję stanu zapalnego in vivo w czasie rzeczywistym, co może przełożyć się na terapie celowane i spersonalizowane, redukujące stan zapalny u ludzi.

Miażdżyca tętnic wieńcowych u ludzi stanowi klucz do zapobiegania groźnemu zawałowi ostremu mięśnia sercowego. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat miażdżycy wieńcowej, można ją również zastosować do innych układów, w tym do chorób naczyniowych obwodowych, na przykład w celu charakterystyki zmian w aorcie szyjnej, tętnicach biodrowych lub udowych, które są przyczyną chorób naczyniowych obwodowych. Po denudacji balonowej i ustanowieniu modelu miażdżycy, zwierzęta są utrzymywane na diecie z 1% cholesterol przez cztery tygodnie, a w piątym tygodniu są one przenoszone na dietę z 0,3% cholesterol.

Osiem tygodni po uszkodzeniu balonem i 24 godziny przed obrazowaniem, królikowi podaje się dożylnie przez żyłę uszną nanoczujnik wstrzykiwalny pro sense 750 VM 110 w celu oznakowania aktywnych zapalnych blaszek miażdżycowych, po upływie 24 godzin. Zwierzęta przygotowuje się do zabiegu poprzez ogolenie pola operacyjnego, a następnie dokładną dezynfekcję 10% jodopowidonem; zwierzęta są następnie znieczulane, a dostęp tętniczy uzyskuje się poprzez prawą wspólną tętnicę szyjną. Aby ułatwić obrazowanie tkanek, podaje się dożylnie heparynę, a następnie wykonuje angiografię wyjściową.

Cewnik IVUS zostaje załadowany na kliniczny drut prowadzący do tętnicy wieńcowej o średnicy 0,014 cala i wprowadzony do pochewki przy użyciu kontroli fluoroskopowej. Końcówka drutu z markerem radiologicznym zostaje umieszczona dystalnie w prawej tętnicy biodrowej. Rozpoczęto wycofanie cewnika (pullback) na odcinku 100 milimetrów, obejmującym obszar od rozwidlenia tętnic biodrowych AOR do tętnic nerkowych, i zarejestrowano obrazy.

Wykonuje się rekonstrukcję podłużną naczynia i identyfikuje blaszkę miażdżycową w świetle naczynia. Następnie stosuje się cofnięcie cewnika (pullback) o 100 mm, aby objąć całą długość aorty. Na podstawie serii dwuwymiarowych obrazów osiowych generowane są rekonstrukcje podłużne przy użyciu oprogramowania MATLAB.

Cewnik NIRF zostaje załadowany na prowadnik. Cewnik jest ostrożnie wprowadzany do pochewki, a głowica obrazująca zostaje umieszczona dystalnie w lewej tętnicy biodrowej, podczas gdy wykonuje się wielokrotne zautomatyzowane wycofania cewnika NIRF. Odnotowuje się sygnały fluorescencyjne w obrębie obszarów miażdżycy.

Obrazy te są rejestrowane, a następnie przetwarzane przy użyciu oprogramowania MATLAB, z zastosowaniem odpowiedniego skalowania i okienkowania w zależności od uzyskanego zakresu sygnału. Następnie zwierzę zostaje poddane eutanazji, a tkanka aortowo-biodrowa zostaje wyizolowana ex-vivo. Zidentyfikowano aortę miażdżycową oraz tętnice biodrowe, które następnie wypreparowano z otaczających je tkanek.

Dodatkowo pobierane są niewielkie fragmenty wątroby, nerek, śledziony i serca o wymiarach 2×2 cm. Po wyizolowaniu drzewo tętnicze jest przepłukiwane solą fizjologiczną do momentu, aż żyła główna dolna zostanie oczyszczona z krwi. Po zakończeniu badania Exvivo NIRF, wypreparowana tkanka miednicy AOR jest umieszczana w 10–20 cm³ soli fizjologicznej i transportowana w celu przeprowadzenia obrazowania fluorescencyjnego w odbiciu lub analizy FRI.

Aorta oraz naczynia miedniczne są wydłużane, aby przybliżyć ich rzeczywistą długość, a obrazy są pozyskiwane przy użyciu wielu długości fali z zastosowaniem dostępnego komercyjnie systemu obrazowania fluorescencyjnego z odbiciem, wyposażonego w filtry wielokanałowe; dla każdej długości fali stosuje się i rejestruje szereg czasów ekspozycji. Obrazy są eksportowane jako pliki DICOM do dalszych analiz w charakterze kontroli pozytywnej i negatywnej. Wybrane organy, takie jak wątroba, śledziona, nerka i serce, są obrazowane przy użyciu podobnych kanałów i czasów ekspozycji.

W tętnicach miażdżycowych odnotowuje się wszelkie obszary o zwiększonym sygnale fluorescencyjnym w kanale bliskiej podczerwieni. Zwiększony sygnał koreluje z obszarami zwiększonej ilości blaszki miażdżycowej, sygnałem katepsyny B oraz makrofagami w blaszkach, które są markerami stanu zapalnego wyznaczającymi blaszki o wysokim ryzyku pęknięcia. Identyfikuje się obszary prawidłowej, nieuszkodzonej tkanki, takie jak lewa tętnica biodrowa, oraz obszary blaszki miażdżycowej, a następnie małe pierścienie tkanki o średnicy od 5 do 10 mm zatapia się w medium OCT (optimal cutting temperature) do czasu ich użycia.

Bloki do sekcjonowania są przechowywane w temperaturze -80 °C przy użyciu standardowych technik sekcjonowania i analizy immunohistochemicznej. Wykonuje się barwienie hematoksyliną i eozyną oraz barwienie RAM 11. Pliki DICOM są wykorzystywane do przetwarzania danych obrazowych z NIRF i FRI, które są rejestrowane w bliskiej podczerwieni.

Kanał 750 nanometrów oraz wycofania (pullbacks) są przetwarzane odpowiednio przy użyciu oprogramowania MATLAB i OIC. Zastosowano odpowiednie okienkowanie w celu wyświetlenia pełnego zakresu intensywności sygnału. Końcowe obrazy są eksportowane jako pliki TIFF.

Pliki są importowane do standardowej analizy obrazu. Oprogramowanie i obrazy są wyrównywane w oparciu o punkty odniesienia, takie jak kręgi, rozwidlenie tętnicy biodrowej wspólnej oraz tętnica nerkowa. Na angiogramie identyfikuje się obszary prawidłowych naczyń oraz blaszek miażdżycowych.

Obszary zainteresowania (ROI) dla tkanki prawidłowej oraz obszarów blaszki miażdżycowej są obrysowywane ręcznie w celu zapewnienia prawidłowego wyznaczenia granic. Wykorzystuje się podłużny obraz IVUS naczynia, na którym tkanka naczynia i blaszka są łatwo identyfikowalne. Średnie intensywności sygnału dla obrazów FRI i NIRF są pozyskiwane odpowiednio za pomocą oprogramowania MATLAB oraz oix.

Na koniec oblicza się docelowe wartości tła lub stosunki TBR dla stref blaszki miażdżycowej. Aby obliczyć TBR, średni sygnał ROI obszaru blaszki dzieli się przez sygnał ROI szumu tła. Po zakończeniu powyższego protokołu możemy zidentyfikować i scharakteryzować obszary zwiększonej aktywności kaspazy lub proteaz cząsteczek zapalnych w blaszkce zapalnej w obrębie aorty i naczyń biodrowych po wstrzyknięciu aktywowanego nanoczujnika.

Urządzenie pro sense VM 110 pozwala na identyfikację blaszek aktywnych proteolitycznie. Pojawiają się one jako jasne strefy o intensywnym sygnale podczas obrazowania metodą FRI w kanale bliskiej podczerwieni. Wycofania NIRF korelują ze zwiększoną intensywnością sygnału FRI oraz dopasowaniami IVUS, co umożliwia rejestrację anatomiczną sygnałów NIRF; obliczone wskaźniki tbr blaszek uzyskane z FRI i NIRF, w połączeniu z podobną analizą immunohistochemiczną jasnych blaszek, potwierdzają intensywną obecność aktywności RAM 11 w obszarach blaszki. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w czasie od dwóch do czterech godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo.

Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu ostrożności w zakresie spójności okienkowania i obrazowania danych oraz o prawidłowym wyrównaniu z angiografią. Ultradźwięki wewnątrznaczyniowe oraz FRI są kluczowe dla poprawnej interpretacji danych. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie obrazowania molekularnego do badania miażdżycy w humanizowanych naczyniach wieńcowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania multimodalnej strategii obrazowania, która z użyciem tego nowatorskiego wewnątrznaczyniowego cewnika nerwowego in vivo pozwala na obrazowanie i ilościowe określanie blaszek zapalnych w proteolitycznie aktywnych, zapalnych i szybko rozwijających się miażdżycach. Należy pamiętać, że praca z narzędziami chirurgicznymi i płynami ustrojowymi, takimi jak krew, może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak staranne techniki chirurgiczne oraz stosowanie środków ochrony osobistej, w tym rękawiczek i masek.