Name: In vivo (in vivo) Wewnątrznaczyniowe obrazowanie molekularne blaszki miażdżycowej za pomocą fluorescencji bliskiej podczerwieni (NIRF), multimodalne podejście do obrazowania miażdżycy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj metodę wewnątrznaczyniowego obrazowania NIRF blaszki miażdżycowej u królików. Technika umożliwia wizualizację stanu zapalnego w czasie rzeczywistym i kwantyfikację biologii płytki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie dla niniejszej pracy zapewnili: National Institutes of Health w ramach grantu nr R01 HL 108229, American Heart Association w ramach Scientist Development Grant nr 0830352N, Howard Hughes Medical Institute w ramach Career Development Award, Broadview Ventures, Wspólnota Europejska w ramach Siódmego Programu Ramowego (FP7/2007-2013 zgodnie z umową o grant nr 235689) oraz MGH William Schreyer Fellowship.

In vivo Model zwierzęcy: Tworzenie eksperymentalnej miażdżycy aortalno-biodrowej
1) Angiografia wyjściowa i denudacja balonowa
<ol>
 <li>Przed wykonaniem angiografii wyjściowej i denudacją balonową, królik nowozelandzki otrzymuje dietę wysokocholesterolową (1%) przez 1 tydzień. Zwierzę to jest wykorzystywane ze względu na istotność translacyjną, ponieważ 1) naczynia aortylowo-biodrowe u królików mają tę samą średnicę co ludzkie tętnice wieńcowe (2,5-3,5 mm) oraz 2) hiperlipidemiczny model uszkodzenia balonowego generuje zapalną miażdżycę z udziałem komórek zapalnych (makrofagów) i cząsteczek (katepsyn) podobnych do tych występujących w ludzkiej miażdżycy.</li>
 <li>Po żywieniu cholesterolowym zwierzę zostaje zanestezjowane propofolem i ketaminą. Za pomocą skalpela o rozmiarze 15 wykonuje się jedno UNCowe nacięcie wzdłuż linii środkowej brzusznej strony szyi. Stosując techniki rozczepiania tępego, odsłania się mięśnie znajdujące się pod powięzią po prawej stronie tchawicy. Lewy mięsień mostkowo-głowowy zostaje oddzielony wzdłuż złącza tkanki łącznej, a następnie odsłania się prawą wspólną tętnicę szyjną. Tętnicę oddziela się od nerwu błędnego. Na tętnicy umieszcza się pętle szwów proksymalnych i dystalnych, aby umożliwić retrakcję i okluzję. Wykonuje się ukośną arteriotomię o szerokości 1 do 2 mm, przez którą wprowadza się osłonkę naczyniową 5 French (średnica zewnętrzna 1,67 mm) i podaje heparynę (1000μ/mL, ~150units/kg) doglebowo do tętnicy za pomocą osłonki.</li>
 <li>Następnie w czasie 2 sekund wstrzykuje się barwnik kontrastowy (Ultravist) (1 do 2 mL), aby uzyskać kontrolny angiogram dystalnej aorty i obu tętnic biodrowych.</li>
 <li>Następnie tętnice biodrowo-udowe i aortę uszkadza się poprzez denudację śródbłonka. Wykorzystując standardowe metody fluoroskopii, cewnik do embolektomii Fogarty 3Fr umieszcza się w dystalnej tętnicy biodrowo-udowej i nadmuchuje 0,3 do 0,5 cc kontrastu (50% kontrastu/50% soli fizjologicznej) lub powietrza. Następnie cewnik w stanie nadmuchanym wycofuje się proksymalnie wzdłuż prawej tętnicy biodrowej i dystalnej aorty aż do odejścia lewej tętnicy nerkowej. Po denudacji balonowej powtarza się angiografię, aby udokumentować drożność naczyń. Po angiografii wszystkie cewniki i osłonki są usuwane, a proksymalny odcinek prawej wspólnej tętnicy szyjnej zostaje podwiązany; mięśnie i powięź zszywa się wchłanialnym szwem 4/0, a nacięcie skóry zamyka się niewchłanialnym szwem 4/0.</li>
 <li>Następnie zwierzę przechodzi rekonwalescencję przy podaniu jednej dawki antybiotyku (cefazolina, 0,5 grama IM). Podaje się leki przeciwbólowe, w tym buprenorfinę 0,01 mg/kg IM (dwukrotnie dziennie w razie potrzeby). Zwierzęta pozostają na diecie z 1% cholesterolem przez 4 tygodnie po denudacji balonowej. W 5. tygodniu zwierzęta przechodzą na dietę z 0,3% cholesterolem.</li>
</ol>
Zintegrowane obrazowanie multimodalne zmian miażdżycowych u królika
2) Znakowanie proteolitycznie aktywnej zapalnej blaszki miażdżycowej z użyciem wstrzykiwalnego nanoczujnika; Angiografia, wewnątrznaczna ultrasonografia (IVUS) oraz wewnątrznaczne obrazowanie NIRF in vivo miażdżycy u królika
<ol>
 <li>Osiem tygodni po urazie balonowym i 24 godziny przed obrazowaniem, królikowi podaje się dożylnie 500 nmol/kg Prosense/VM110 (PerkinElmer) poprzez żyłę uszną.</li>
 <li>Dwadzieścia cztery godziny po wstrzyknięciu zwierzęta są znieczulane, a dostęp tętniczy uzyskuje się poprzez lewą wspólną tętnicę szyjną (patrz krok 1.2). Podaje się heparynę do tętnicy (150 units/kg). Wykonuje się angiografię wyjściową zgodnie z powyższym opisem.</li>
 <li>Cewnik IVUS zostaje załadowany na kliniczny drut prowadzący do tętnic wieńcowych o średnicy 0.014 inch i wprowadzony do pochewki. Pod kontrolą fluoroskopii radioprzepuszczalny koniec drutu zostaje umieszczony dystalnie w prawej tętnicy biodrowej. Następnie cewnik IVUS jest przesuwany do proksymalnej części tętnicy biodrowej przy użyciu standardowej klinicznej techniki monorail.</li>
 <li>Inicjuje się cofanie cewnika (pullback) na odcinku 100 mm i rejestruje obrazy. Wykonuje się rekonstrukcję podłużną naczynia i identyfikuje blaszkę miażdżycową w świetle naczynia.</li>
 <li>Cewnik NIRF11,12 zostaje załadowany na drut 0.014 inch (system monorail), a następnie ostrożnie wprowadzony do pochewki, przy czym głowica obrazująca zostaje umieszczona dystalnie w prawej tętnicy biodrowej.</li>
 <li>Wykonuje się wielokrotne zautomatyzowane cofnięcia (pullback podłużny z prędkością 1 mm/sec, 30 obrotów na minutę) i odnotowuje sygnały fluorescencyjne w strefach miażdżycy. Obrazy są rejestrowane, a następnie poddawane dalszej obróbce z odpowiednim skalowaniem i ustawieniem okna na podstawie zakresu sygnału.</li>
</ol>
3) Eutanazja i izolacja tkanki aortalno-biodrowej ex vivo
<ol>
 <li>Eutanazję przeprowadza się poprzez pojedynczy wtrysk dożylny 1cc środka eutanatycznego (roztworu 390mg pentobarbitalu sodu i 50mg fenytoiny sodu).</li>
 <li>Drzewo tętnicze jest perfundowane 0,9% solą fizjologiczną do momentu całkowitego oczyszczenia żyły głównej dolnej z krwi. Zidentyfikowano aortę z miażdżycą oraz tętnice biodrowe, a następnie wypreparowano je z otaczających tkanek. Dodatkowo pobiera się niewielkie fragmenty wątroby, nerek, śledziony i serca o wymiarach 2 x 2 cm.</li>
 <li>Ex vivo obrazowanie NIRF z użyciem wewnątrznaczyniowego cewnika do obrazowania NIRF może zostać wykonane na tym etapie. Naczynie jest wydłużane, a cewnik NIRF ponownie wprowadzany do proksymalnej części aorty, aż głowica obrazująca zostanie umieszczona w tętnicy biodrowej prawej lub w miejscu jej rozwidlenia. Wykonuje się wielokrotne automatyczne cofnięcia cewnika (pullback), zgodnie z opisem powyżej (patrz 2.6).</li>
</ol>
4) Obrazowanie fluorescencyjnej refleksji (Ex vivo Fluorescence Reflectance Imaging, FRI) wypreparowanej aorty i tętnic biodrowych
<ol>
 <li>Wypreparowaną tkankę umieszcza się w 10-20 cc soli fizjologicznej i transportuje do analiz FRI (Kodak Image Station 4000MM Pro, Carestream Health, Inc.).</li>
 <li>Aortę oraz naczynia biodrowe rozciąga się, aby przybliżyć ich rzeczywistą długość, a następnie wykonuje się obrazy przy użyciu wielu długości fal [światło białe, zielony kanał fluorescencyjny (ex 495 nm, em 515 nm), Cy5 (ex 565 nm, em 670 nm) oraz Cy7 (ex 650 nm, em 760 nm)]. Dla każdej długości fali stosuje się serię czasów naświetlania (0,1-30 s), a uzyskane obrazy eksportuje się jako pliki DICOM lub 16-bitowe nieskalowane pliki TIFF do dalszych analiz. Jako kontrole pozytywne i negatywne obrazuje się narządy (wątrobę, śledzionę, nerkę i serce) przy użyciu podobnych kanałów i czasów naświetlania.</li>
 <li>W tętnicach miażdżycowych odnotowuje się obszary zwiększonego sygnału w kanale bliskiej podczerwieni (780 nm+).</li>
</ol>
5) Osadzanie tkanek w parafinie do krojenia i analizy immunohistochemicznej
<ol>
 <li>Identyfikuje się obszary tkanek prawidłowych (nieuszkodzonych; np. lewa tętnica biodrowa) oraz obszary blaszek miażdżycowych, a następnie małe pierścienie tkanki o średnicy 5-10 mm zatapia się w medium OCT (Optimal Cutting Temperature). Blokami przechowuje się w temperaturze -80 C do czasu wykonania skrawków.</li>
 <li>Stosuje się standardowe techniki krojenia i analiz immunohistochemicznych. Wykonuje się barwienie hematoksyliną i eozyną oraz barwienia na Ram-11 i katepsynę B.</li>
</ol>
Analiza i integracja obrazów multimodalnych (angiografia, IVUS, NIRF i FRI)
6) Przetwarzanie obrazów NIRF i FRI
<ol>
 <li>Pliki DICOM zawierające dane obrazowe z wycofania NIRF i FRI (wykonanego w kanale bliskiej podczerwieni 780 nm) są przetwarzane odpowiednio przy użyciu oprogramowania MATLAB i Osirix. Stosuje się odpowiednie okienkowanie w celu wyświetlenia pełnego zakresu intensywności sygnału. Końcowe obrazy są eksportowane jako pliki TIFF.</li>
 <li>Pliki są importowane do standardowego oprogramowania do przetwarzania obrazów (można użyć Keynote). Obrazy są wyrównywane w oparciu o punkty odniesienia (np. kręgi na angiogramie, bifurkację tętnicy biodrowej wspólnej oraz tętnicę nerkową). Identyfikuje się obszary prawidłowego naczynia oraz blaszki miażdżycowej.</li>
 <li>Obszary zainteresowania (ROI) są obrysowywane ręcznie (dla tkanki prawidłowej i obszarów blaszki miażdżycowej), a średnie intensywności sygnału są pozyskiwane odpowiednio za pomocą programów Osirix i MATLAB dla obrazów FRI i NIRF. W celu prawidłowego obrysowania wykorzystuje się podłużny obraz IVUS naczynia, co ułatwia identyfikację prawidłowego naczynia i blaszki miażdżycowej.</li>
 <li>Dla stref blaszki miażdżycowej oblicza się stosunek sygnału z obszaru docelowego do tła (TBR).</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Po zakończeniu powyższego protokołu możemy zidentyfikować i scharakteryzować obszary zwiększonej aktywności proteaz katepsyn w blaszkach zapalnych w obrębie aorty i naczyń biodrowych. Wstrzyknięcie aktywnego nanosensora (Prosense/VM110) pozwala nam zidentyfikować proteolitycznie aktywne blaszki. Pojawiają się one jako strefy jasne lub o intensywnym sygnale podczas obrazowania za pomocą FRI w kanale bliskiej podczerwieni (750 nm). Obrazy NIRF korelują ze zwiększoną intensywnością sygnału w FRI i są zgodne z IVUS, co umożliwia rejestrację anatomiczną sygnałów NIRF. Obliczone wartości TBR blaszek uzyskane z FRI i NIRF były podobne (patrz Rycina 3: średnie TBR NIRF 4,2, średnie TBR FRI 2,9). Analiza immunohistochemiczna jasnych blaszek potwierdza intensywną obecność RAM-11 oraz aktywność katepsyny B w obszarach blaszek (dane nie przedstawiono).
<img alt="Schemat optyczny cewnika z laserem i czujnikami PMT oraz zdjęcie sprzętu do badania wzbudzenia." src="/files/ftp_upload/2257/2257fig1.jpg" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat 2D cewnika NIRF Aby rozszerzyć potencjał kliniczny metody detekcji 1D NIRF6, skonstruowaliśmy nowy cewnik 2D NIRF do obrazowania wewnątrznaczyniowego.11,12 Cewnik wykonany na specjalne zamówienie składa się z włókna optycznego (średnica 125 µm umieszczona w rurce polietylenowej: 2,9F), które jest oświetlane za pomocą źródła wzbudzenia w postaci lasera 750 nm. Światło laserowe jest emitowane pod kątem 90 stopni względem osi włókna. System wykorzystuje dwa zautomatyzowane silniki (obrotowy i translacyjny), aby umożliwić jednoczesne obrazowanie w zakresie 360 stopni i cofanie podłużne w celu uzyskania rzeczywistego obrazowania 2D. Obrazy wykorzystane za zgodą autorów z referencji 11.
<img alt="Schemat aktywności proteazy; przedstawiający proces molekularny i aktywację środków obrazujących w badaniach." src="/files/ftp_upload/2257/2257fig2.jpg" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat przedstawiający aktywację nanoczujnika Prosense/VM110 opośredniczoną przez proteazy. Obraz wykorzystany za zgodą z literatury 10.
 
<img alt="Wykres słupkowy TBR blaszki in vivo vs. ex vivo; analiza porównawcza wartości TBR blaszki." src="/files/ftp_upload/2257/2257table1.jpg" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Tabela 1"> 
Rycina 3. TBR (stosunki sygnału docelowego do tła) blaszki in vivo oraz ex vivo

<ol><li>Andersson, J., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+immunity+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adaptive immunity and atherosclerosis.</a> Clin Immunol. 134, 33-46 (2010).</li>
<li>Calfon, M. A., Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+near-infrared+fluorescence+molecular+imaging+of+atherosclerosis%3A+toward+coronary+arterial+visualization+of+biologically+high-risk+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Intravascular near-infrared fluorescence molecular imaging of atherosclerosis: toward coronary arterial visualization of biologically high-risk plaques.</a> Journal of Biomedical Optics. 15, 011107-011107 (2010).</li>
<li>Chen, J., Tung, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+Proteolytic+Activity+in+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of Proteolytic Activity in Atherosclerosis.</a> Circulation. 105, 2766-2771 (2002).</li>
<li>Jaffer, F. A., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Imaging+of+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Molecular Imaging of Cardiovascular Disease.</a> Circulation. 116, 1052-1061 (2007).</li>
<li>Jaffer, F. A., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+and+Multimodality+Molecular+Imaging%3A+Insights+Into+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical and Multimodality Molecular Imaging: Insights Into Atherosclerosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29, 1017-1024 (2009).</li>
<li>Jaffer, F. A., Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Catheter+Molecular+Sensing+of+Inflammation+in+Proteolytically+Active+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Real-Time Catheter Molecular Sensing of Inflammation in Proteolytically Active Atherosclerosis.</a> Circulation. 118, 1802-1809 (2008).</li>
<li>Kim, D. -E., Kim, J. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease+Imaging+of+Human+Atheromata+Captures+Molecular+Information+of+Atherosclerosis%2C+Complementing+Anatomic+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease Imaging of Human Atheromata Captures Molecular Information of Atherosclerosis, Complementing Anatomic Imaging.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 449-456 (2010).</li>
<li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inflammation in atherosclerosis.</a> Nature. 420, 868-874 (2002).</li>
<li>Naghavi, M., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Vulnerable+Plaque+to+Vulnerable+Patient%3A+A+Call+for+New+Definitions+and+Risk+Assessment+Strategies%3A+Part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">From Vulnerable Plaque to Vulnerable Patient: A Call for New Definitions and Risk Assessment Strategies: Part I.</a> Circulation. 108, 1664-1672 (2003).</li>
<li>Weissleder, R., Tung, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+tumors+with+protease-activated+near-infrared+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes.</a> Nat Biotech. 17, 375-375 (1999).</li>
<li>Razansky, R. N., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescence+catheter+system+for+two-dimensional+intravascular+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescence catheter system for two-dimensional intravascular imaging in vivo.</a> Optics Express. 18, 11372-11381 (2010).</li>
<li>Jaffer, F. A., Calfon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Dimensional+Intravascular+Near-Infrared+Fluorescence+Molecular+Imaging+of+Inflammation+in+Atherosclerosis+and+Stent-Induced+Vascular+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Two-Dimensional Intravascular Near-Infrared Fluorescence Molecular Imaging of Inflammation in Atherosclerosis and Stent-Induced Vascular Injury.</a> Journal of the American College of Cardiology. 57, 2516-2526 (2011).</li>
</ol>

FAJ - były konsultant w VisEn Medical; honoraria od Boston Scientific

Zapalne blaszki miażdżycowe wysokiego ryzyka lub tzw. blaszki podatne są prawdopodobnie odpowiedzialne za większość zawałów mięśnia sercowego. Identyfikacja takich blaszek przed wystąpieniem objawów ma istotne znaczenie kliniczne zarówno w przewidywaniu wyników, jak i w prowadzeniu terapii medycznej. Konwencjonalne metody obrazowania tętnic wieńcowych, takie jak angiografia rentgenowska, zazwyczaj koncentrują się na charakterystyce zwężeń światła naczynia, zamiast wyjaśniać biologiczne profile zmian wysokiego ryzyka, któ...

<table><tbody><tr><td>Prosense 750</td><td>Visen Medical</td><td>VM110</td><td>wstrzyknięcie dożylne 500 nmol/kg</td></tr><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>401586D</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolina</td><td>NovaPlus</td><td>46015683</td><td></td></tr><tr><td>Lidokaina HCL 2%</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-4277-01</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Bedford Laboratories</td><td>NDC 55390-100-10</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Dieta wysokocholesterolowa 1%</td><td>Research Diets</td><td>C30293</td><td></td></tr><tr><td>Dieta wysokocholesterolowa 0,3%</td><td>Research Diets</td><td>C30255</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo wewnątrznaczyniowe obrazowanie molekularne blaszek zapalnych z wykorzystaniem fluorescencji w bliskiej podczerwieni (nirf) – multimodalne podejście do obrazowania miażdżycy

In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

Odpowiedź naczyniowa na uszkodzenie jest dobrze skoordynowaną reakcją zapalną wywołaną przez gromadzenie się makrofagów w ścianie naczynia, co prowadzi do akumulacji wewnątrzświatowej blaszki bogatej w lipidy, proliferacji komórek mięśni gładkich i postępującego zwężenia światła naczynia. Powstawanie takich podatnych na pęknięcie blaszek leży u podstaw większości przypadków ostrego zawału mięśnia sercowego. Złożona molekularna i komórkowa kaskada zapalna jest sterowana przez rekrutację limfocytów T i makrofagów oraz ich efekty parakrynne na komórki śródbłonka i mięśni gładkich.1
Obrazowanie molekularne w miażdżycy ewoluowało w istotne narzędzie kliniczne i badawcze, które umożliwia wizualizację stanu zapalnego oraz innych procesów biologicznych in vivo. Kilka niedawnych przykładów wykazuje możliwość wykrywania blaszek o wysokim ryzyku u pacjentów oraz oceny efektów farmakoterapii w miażdżycy.4 Chociaż szereg metod obrazowania molekularnego (w szczególności MRI i PET) pozwala na obrazowanie aspektów biologicznych dużych naczyń, takich jak tętnice szyjne, możliwości obrazowania tętnic wieńcowych są ograniczone.2 Pojawienie się strategii obrazowania optycznego o wysokiej rozdzielczości, w szczególności fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF), w połączeniu z aktywowalnymi sondami fluorescencyjnymi, zwiększyło czułość i doprowadziło do opracowania nowych strategii wewnątrznaczyniowych w celu usprawnienia obrazowania biologicznego miażdżycy tętnic wieńcowych u ludzi.
Molekularne obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni (NIRF) wykorzystuje światło wzbudzenia o określonej szerokości pasma (650-900 nm) jako źródło fotonów, które po dostarczeniu do optycznego środka kontrastowego lub sondy fluorescencyjnej emitują fluorescencję w oknie NIR, możliwą do wykrycia przy użyciu odpowiedniego filtra emisyjnego i wysokoczułej kamery CCD. W przeciwieństwie do światła widzialnego, światło NIR głęboko penetruje tkankę, jest znacznie mniej tłumione przez endogenne absorbenty fotonów, takie jak hemoglobina, lipidy i woda, oraz umożliwia uzyskanie wysokich stosunków sygnału docelowego do tła dzięki zredukowanej autofluorescencji w oknie NIR. Obrazowanie w „oknie” NIR może znacząco zwiększyć potencjał obrazowania in vivo.2,5
Zapalne proteazy cysteinowe zostały szczegółowo zbadane z wykorzystaniem aktywowalnych sond NIRF10 i odgrywają istotną rolę w aterogenezie. Poprzez degradację macierzy zewnątrzkomórkowej proteazy cysteinowe w znacznym stopniu przyczyniają się do progresji i powikłań miażdżycy8. W szczególności proteaza cysteinowa, katepsyna B, jest silnie eksprymowana i kolokalizuje z makrofagami w eksperymentalnych blaszkach miażdżycowych u myszy, królików i ludzi.3,6,7 Ponadto aktywność katepsyny B w blaszkach może być wykrywana in vivo przy użyciu wcześniej opisanej jednowymiarowej (1-D) wewnątrznaczyniowej technologii fluorescencji bliskiej podczerwieni6, w połączeniu z wstrzykiwalnym nanoczujnikiem składającym się z polimerowego szkieletu polilizyny zderywatyzowanego wieloma fluorochromami NIR (VM110/Prosense750, ex/em 750/780nm, VisEn Medical, Woburn, MA), co skutkuje silnym wygaszaniem wewnątrzmolekularnym w stanie spoczynku.10 Po ukierunkowanym rozszczepieniu enzymatycznym przez proteazy cysteinowe, takie jak katepsyna B (która kolokalizuje z makrofagami w blaszkach), fluorochromy oddzielają się, co prowadzi do znacznego wzmocnienia sygnału NIRF. Wewnątrznaczyniowa detekcja sygnału fluorescencji NIR za pomocą zastosowanego nowoczesnego dwuwymiarowego (2D) wewnątrznaczyniowego cewnika NIRF umożliwia obecnie wysokorozdzielczą i geometrycznie dokładną detekcję in vivo aktywności katepsyny B w zapalnej blaszce miażdżycowej.
In vivo obrazowanie molekularne miażdżycy z wykorzystaniem cewnikowego obrazowania 2D NIRF, w przeciwieństwie do wcześniejszego podejścia spektroskopowego 1-D,6 jest nowatorskim i obiecującym narzędziem, które wykorzystuje zwiększoną aktywność proteaz w bogatych w makrofagi blaszkach miażdżycowych do wykrywania stanu zapalnego naczyń.11,12 Poniższy protokół badawczy opisuje zastosowanie wewnątrznacznego cewnika 2D NIRF do obrazowania i charakteryzacji struktury blaszki z wykorzystaniem kluczowych aspektów biologii blaszki miażdżycowej. Jest to platforma translacyjna, która po zintegrowaniu z istniejącymi klinicznymi technologiami obrazowania, w tym angiografią i wewnątrznacznie ultrasonografią (IVUS), oferuje unikalną i nowatorską zintegrowaną multimodalną technikę obrazowania molekularnego, która pozwala odróżnić miażdżycowe zmiany zapalne oraz umożliwia detekcję sygnałów NIRF w wewnątrznacznych tętnicach wieńcowych o rozmiarach ludzkich.

Szczegółowo opisujemy nowy cewnik do fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF), służący do dwuwymiarowego wewnątrznaczyniowego obrazowania molekularnego biologii blaszki miażdżycowej in vivo. Cewnik NIRF umożliwia wizualizację kluczowych procesów biologicznych, takich jak zapalenie, poprzez wykrywanie obecności aktywowalnych i celowanych fluorochromów NIR wykazujących powinowactwo do blaszki miażdżycowej. Cewnik spełnia wymogi inżynieryjne i energetyczne stosowane w klinice i jest przeznaczony do zastosowania w ludzkich tętnicach wieńcowych. Poniższe badanie opisuje multimodalną strategię obrazowania, która wykorzystuje nowatorski wewnątrznaczyniowy cewnik NIRF in vivo do obrazowania i ilościowego oznaczania zapalnej blaszki miażdżycowej w proteolitycznie aktywnych, zapalnych miażdżycach u królików.

In vivo wewnątrznaczyniowe obrazowanie molekularne blaszek zapalnych z wykorzystaniem fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF) – multimodalne podejście do obrazowania miażdżycy

Odpowiedź naczyniowa na uszkodzenie jest precyzyjnie skoordynowaną reakcją zapalną wywołaną przez gromadzenie się makrofagów w ścianie naczynia, co prowadzi ...

W tej procedurze zastosowano nowy cewnik do fluorescencji w bliskiej podczerwieni (cewnik NIRF) w celu obrazowania dwuwymiarowej biologii naczyniowej wewnątrz tętnic oraz monitorowania procesów biologicznych, w tym miażdżycy, stanu zapalnego i angiogenezy. W pierwszej kolejności, w odpowiednim czasie, tworzony jest eksperymentalny model miażdżycy w aorcie i tętnicach biodrowych nowozelandzkiego królika białego. Następnie wstrzykiwany jest nanoczujnik NIRF Activat w celu oznakowania zapalonej blaszki miażdżycowej.Po 24 godzinach wykonuje się zarejestrowaną wspólnie angiografię tętniczą, wewnątrznaczne badanie USG oraz wewnątrznaczne obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni in vivo i ex vivo. Wymagane są obrazy królika z rasy Roma. Następnie aortę i tętnice biodrowe wycina się w celu przeprowadzenia ex vivo obrazowania refleksyjnego fluorescencji oraz analizy immunohistochemicznej stanu zapalnego blaszki miażdżycowej.Ostateczne wyniki wykazują mierzalne sygnały korelujące ze stanem zapalnym blaszki miażdżycowej. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu obrazowania molekularnego, takie jak detekcja stanu zapalnego i blaszek w czasie rzeczywistym in vivo, identyfikacja kluczowych markerów blaszek niestabilnych lub prekursorów ostrego zawału mięśnia sercowego. Zastosowania tej techniki obejmują terapię miażdżycy, ponieważ umożliwia ona detekcję stanu zapalnego in vivo w czasie rzeczywistym, co może przełożyć się na terapie celowane i spersonalizowane, redukujące stan zapalny u ludzi.Miażdżyca tętnic wieńcowych u ludzi stanowi klucz do zapobiegania groźnemu zawałowi ostremu mięśnia sercowego. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat miażdżycy wieńcowej, można ją również zastosować do innych układów, w tym do chorób naczyniowych obwodowych, na przykład w celu charakterystyki zmian w aorcie szyjnej, tętnicach biodrowych lub udowych, które są przyczyną chorób naczyniowych obwodowych. Po denudacji balonowej i ustanowieniu modelu miażdżycy, zwierzęta są utrzymywane na diecie z 1% cholesterol przez cztery tygodnie, a w piątym tygodniu są one przenoszone na dietę z 0,3% cholesterol.Osiem tygodni po uszkodzeniu balonem i 24 godziny przed obrazowaniem, królikowi podaje się dożylnie przez żyłę uszną nanoczujnik wstrzykiwalny pro sense 750 VM 110 w celu oznakowania aktywnych zapalnych blaszek miażdżycowych, po upływie 24 godzin. Zwierzęta przygotowuje się do zabiegu poprzez ogolenie pola operacyjnego, a następnie dokładną dezynfekcję 10% jodopowidonem; zwierzęta są następnie znieczulane, a dostęp tętniczy uzyskuje się poprzez prawą wspólną tętnicę szyjną. Aby ułatwić obrazowanie tkanek, podaje się dożylnie heparynę, a następnie wykonuje angiografię wyjściową.Cewnik IVUS zostaje załadowany na kliniczny drut prowadzący do tętnicy wieńcowej o średnicy 0,014 cala i wprowadzony do pochewki przy użyciu kontroli fluoroskopowej. Końcówka drutu z markerem radiologicznym zostaje umieszczona dystalnie w prawej tętnicy biodrowej. Rozpoczęto wycofanie cewnika (pullback) na odcinku 100 milimetrów, obejmującym obszar od rozwidlenia tętnic biodrowych AOR do tętnic nerkowych, i zarejestrowano obrazy.Wykonuje się rekonstrukcję podłużną naczynia i identyfikuje blaszkę miażdżycową w świetle naczynia. Następnie stosuje się cofnięcie cewnika (pullback) o 100 mm, aby objąć całą długość aorty. Na podstawie serii dwuwymiarowych obrazów osiowych generowane są rekonstrukcje podłużne przy użyciu oprogramowania MATLAB.Cewnik NIRF zostaje załadowany na prowadnik. Cewnik jest ostrożnie wprowadzany do pochewki, a głowica obrazująca zostaje umieszczona dystalnie w lewej tętnicy biodrowej, podczas gdy wykonuje się wielokrotne zautomatyzowane wycofania cewnika NIRF. Odnotowuje się sygnały fluorescencyjne w obrębie obszarów miażdżycy.Obrazy te są rejestrowane, a następnie przetwarzane przy użyciu oprogramowania MATLAB, z zastosowaniem odpowiedniego skalowania i okienkowania w zależności od uzyskanego zakresu sygnału. Następnie zwierzę zostaje poddane eutanazji, a tkanka aortowo-biodrowa zostaje wyizolowana ex-vivo. Zidentyfikowano aortę miażdżycową oraz tętnice biodrowe, które następnie wypreparowano z otaczających je tkanek.Dodatkowo pobierane są niewielkie fragmenty wątroby, nerek, śledziony i serca o wymiarach 2×2 cm. Po wyizolowaniu drzewo tętnicze jest przepłukiwane solą fizjologiczną do momentu, aż żyła główna dolna zostanie oczyszczona z krwi. Po zakończeniu badania Exvivo NIRF, wypreparowana tkanka miednicy AOR jest umieszczana w 10–20 cm³ soli fizjologicznej i transportowana w celu przeprowadzenia obrazowania fluorescencyjnego w odbiciu lub analizy FRI.Aorta oraz naczynia miedniczne są wydłużane, aby przybliżyć ich rzeczywistą długość, a obrazy są pozyskiwane przy użyciu wielu długości fali z zastosowaniem dostępnego komercyjnie systemu obrazowania fluorescencyjnego z odbiciem, wyposażonego w filtry wielokanałowe; dla każdej długości fali stosuje się i rejestruje szereg czasów ekspozycji. Obrazy są eksportowane jako pliki DICOM do dalszych analiz w charakterze kontroli pozytywnej i negatywnej. Wybrane organy, takie jak wątroba, śledziona, nerka i serce, są obrazowane przy użyciu podobnych kanałów i czasów ekspozycji.W tętnicach miażdżycowych odnotowuje się wszelkie obszary o zwiększonym sygnale fluorescencyjnym w kanale bliskiej podczerwieni. Zwiększony sygnał koreluje z obszarami zwiększonej ilości blaszki miażdżycowej, sygnałem katepsyny B oraz makrofagami w blaszkach, które są markerami stanu zapalnego wyznaczającymi blaszki o wysokim ryzyku pęknięcia. Identyfikuje się obszary prawidłowej, nieuszkodzonej tkanki, takie jak lewa tętnica biodrowa, oraz obszary blaszki miażdżycowej, a następnie małe pierścienie tkanki o średnicy od 5 do 10 mm zatapia się w medium OCT (optimal cutting temperature) do czasu ich użycia.Bloki do sekcjonowania są przechowywane w temperaturze -80 °C przy użyciu standardowych technik sekcjonowania i analizy immunohistochemicznej. Wykonuje się barwienie hematoksyliną i eozyną oraz barwienie RAM 11. Pliki DICOM są wykorzystywane do przetwarzania danych obrazowych z NIRF i FRI, które są rejestrowane w bliskiej podczerwieni.Kanał 750 nanometrów oraz wycofania (pullbacks) są przetwarzane odpowiednio przy użyciu oprogramowania MATLAB i OIC. Zastosowano odpowiednie okienkowanie w celu wyświetlenia pełnego zakresu intensywności sygnału. Końcowe obrazy są eksportowane jako pliki TIFF.Pliki są importowane do standardowej analizy obrazu. Oprogramowanie i obrazy są wyrównywane w oparciu o punkty odniesienia, takie jak kręgi, rozwidlenie tętnicy biodrowej wspólnej oraz tętnica nerkowa. Na angiogramie identyfikuje się obszary prawidłowych naczyń oraz blaszek miażdżycowych.Obszary zainteresowania (ROI) dla tkanki prawidłowej oraz obszarów blaszki miażdżycowej są obrysowywane ręcznie w celu zapewnienia prawidłowego wyznaczenia granic. Wykorzystuje się podłużny obraz IVUS naczynia, na którym tkanka naczynia i blaszka są łatwo identyfikowalne. Średnie intensywności sygnału dla obrazów FRI i NIRF są pozyskiwane odpowiednio za pomocą oprogramowania MATLAB oraz oix.Na koniec oblicza się docelowe wartości tła lub stosunki TBR dla stref blaszki miażdżycowej. Aby obliczyć TBR, średni sygnał ROI obszaru blaszki dzieli się przez sygnał ROI szumu tła. Po zakończeniu powyższego protokołu możemy zidentyfikować i scharakteryzować obszary zwiększonej aktywności kaspazy lub proteaz cząsteczek zapalnych w blaszkce zapalnej w obrębie aorty i naczyń biodrowych po wstrzyknięciu aktywowanego nanoczujnika.Urządzenie pro sense VM 110 pozwala na identyfikację blaszek aktywnych proteolitycznie. Pojawiają się one jako jasne strefy o intensywnym sygnale podczas obrazowania metodą FRI w kanale bliskiej podczerwieni. Wycofania NIRF korelują ze zwiększoną intensywnością sygnału FRI oraz dopasowaniami IVUS, co umożliwia rejestrację anatomiczną sygnałów NIRF; obliczone wskaźniki tbr blaszek uzyskane z FRI i NIRF, w połączeniu z podobną analizą immunohistochemiczną jasnych blaszek, potwierdzają intensywną obecność aktywności RAM 11 w obszarach blaszki. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w czasie od dwóch do czterech godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo.Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu ostrożności w zakresie spójności okienkowania i obrazowania danych oraz o prawidłowym wyrównaniu z angiografią. Ultradźwięki wewnątrznaczyniowe oraz FRI są kluczowe dla poprawnej interpretacji danych. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie obrazowania molekularnego do badania miażdżycy w humanizowanych naczyniach wieńcowych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania multimodalnej strategii obrazowania, która z użyciem tego nowatorskiego wewnątrznaczyniowego cewnika nerwowego in vivo pozwala na obrazowanie i ilościowe określanie blaszek zapalnych w proteolitycznie aktywnych, zapalnych i szybko rozwijających się miażdżycach. Należy pamiętać, że praca z narzędziami chirurgicznymi i płynami ustrojowymi, takimi jak krew, może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak staranne techniki chirurgiczne oraz stosowanie środków ochrony osobistej, w tym rękawiczek i masek.

in-vivo-near-infrared-fluorescence-nirf-intravascular-molecular

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

In vivo (in vivo) Wewnątrznaczyniowe obrazowanie molekularne blaszki miażdżycowej za pomocą fluorescencji bliskiej podczerwieni (NIRF), multimodalne podejście do obrazowania miażdżycy

Istnieje ogromna potrzeba nieinwazyjnego rozpoznawania miażdżycy; w niniejszej pracy demonstrujemy, w jaki sposób badanie FDG-PET/CT może zostać wykorzystane do wykrywania i ilościowego określania aktywności blaszki miażdżycowej oraz stanu zapalnego naczyń.

Ilościowe oznaczanie aktywności blaszki miażdżycowej i stanu zapalnego naczyń krwionośnych za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej z tomografią komputerową z użyciem [18-F] fluorodeoksyglukozy (FDG-PET/CT)

Źródło: Kim, D. E., et al. Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i mikrotomografia komputerowa do bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni (NIRF) w celu wizualizacji skrzeplin w wyciętej tkance mózgowej znakowanej sondą specyficzną dla fibryny. Światło bliskiej podczerwieni pobudza sondę, powodując fluoryzację skrzepliny, umożliwiając wizualizację skrzeplin o...

Wizualizacja zakrzepów mózgowych myszy za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Opisujemy system wielokątowego rotacyjnego obrazowania optycznego (MAROI) do ilościowego oznaczania in vivo markera fluorescencyjnego dostarczanego przez nanopęcherzyki saposyny C (SapC)-dioleoilofosfatydyloseryny (DOPS). Wykorzystując mysie modele raka i zapalenia stawów, pokazujemy, w jaki sposób analiza krzywej sygnału MAROI może być wykorzystana do precyzyjnego mapowania i biologicznej charakterystyki procesów chorobowych.

In vivo (in vivo) Obrazowanie optyczne guzów mózgu i zapalenia stawów za pomocą fluorescencyjnych nanopęcherzyków SapC-DOPS

Technologia mikrofalowa umożliwia niezwykle szybką syntezę nanocząsteczek tlenku żelaza w celu scharakteryzowania blaszek miażdżycowych. Zastosowanie aminobisfosfonianu w zewnętrznej stronie nanocząstki zapewnia szybką akumulację w obszarze miażdżycowym.

Synteza nanocząstek tlenku żelaza sterowana mikrofalami w celu szybkiego wykrywania miażdżycy

Zwapnienie naczyń krwionośnych jest ważnym czynnikiem predykcyjnym i przyczyniającym się do chorób sercowo-naczyniowych u ludzi. Protokół ten opisuje metody indukowania zwapnienia hodowanych pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz ilościowego określania zwapnienia i obciążenia makrofagami w aorcie zwierzęcej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni.

zwapnienie komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz obrazowanie zwapnień i stanów zapalnych aorty

Ten protokół opisuje zastosowanie połączonego obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni (NIRF) i mikrotomografii komputerowej (microCT) do wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. Technika ta pozwala na ilościowe określenie obciążenia skrzepliną i ewolucji. Technika obrazowania NIRF wizualizuje znakowaną fluorescencyjnie skrzeplinę w wyciętym mózgu, podczas gdy technika mikroCT wizualizuje skrzeplinę wewnątrz żywych zwierząt za pomocą nanocząstek złota.

Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i tomografia mikrokomputerowa do bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu

Obecny protokół opisuje szczegółową operację obrazowania fluorescencyjnego NIR-II w czasie rzeczywistym myszy za pomocą urządzenia do obrazowania optycznego NIR-II.

Jasna sonda fluorescencyjna NIR-II do obrazowania naczyń krwionośnych i nowotworów

Tutaj opisujemy protokół do wykorzystania w czterowymiarowym obrazowaniu ultrasonograficznym in vivo i obrazowaniu spektrometrii mas ex vivo do oceny biomechanicznych i biomolekularnych zmian w mysim układzie sercowo-naczyniowym. Technika ta jest stosowana do analizy przebudowy serca w chirurgicznie wywołanym zawale mięśnia sercowego i zmianach naczyniowych u starzejących się zwierząt.

Multimodalne badanie przebudowy układu sercowo-naczyniowego u myszy: czterowymiarowe obrazowanie ultrasonograficzne i spektrometria mas

Tutaj prezentujemy zoptymalizowane protokoły oczyszczania tkanek do obrazowania mysiej aorty w trzech wymiarach (3D). Opisujemy najnowocześniejsze procedury barwienia immunologicznego, oczyszczania optycznego i obrazowania z zamiarem określenia anatomicznej bliskości obwodowego układu nerwowego z blaszkami miażdżycowymi i przydanką w miażdżycy.

Trójwymiarowe obrazowanie tkanek aorty w miażdżycy

Poznaj metodę wewnątrznaczyniowego obrazowania NIRF blaszki miażdżycowej u królików. Technika umożliwia wizualizację stanu zapalnego w czasie rzeczywistym i kwantyfikację biologii płytki.

In vivo (in vivo) Wewnątrznaczyniowe obrazowanie molekularne blaszki miażdżycowej za pomocą fluorescencji bliskiej podczerwieni (NIRF), multimodalne podejście do obrazowania miażdżycy (Wideo) | JoVE Journal

In vivo wewnątrznaczyniowe obrazowanie molekularne blaszek zapalnych z wykorzystaniem fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF) – multimodalne podejście do obrazowania miażdżycy

Przeglądaj więcej filmów