Name: Zmiany w morfologii gruczołu sutkowego i ryzyku raka piersi u szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Poznaj metodę preparowania całych preparatów gruczołu sutkowego szczura i analizy morfologicznej w celu oceny ryzyka raka piersi. Technika obejmuje pomiar wydłużenia nabłonkowego oraz liczenie pąków terminalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

NCI (U54 CA00100970), NCI (1 R03 CA150040-01), ACS(116602-PF-09-018-01-CNE)

1. Usunięcie brzusznego gruczołu mlekowego i przygotowanie preparatu całego organu
<ol>
 <li>Uśmierć zwierzę zgodnie z wytycznymi IACUC. Przypnij zwierzę na plecach za nogi za pomocą igieł lub przyklej nogi taśmą do płytki operacyjnej, a następnie przemyj skórę etanolem (EtOH). Delikatnie unieś skórę pęsetą i za pomocą ostrych nożyczek wykonaj cięcie w linii środkowej skóry, zaczynając pomiędzy piersiami z pary nr 5, prowadząc cięcie w stronę szyi. Wykonaj cięcie w kształcie odwróconej litery Y od linii środkowej w kierunku tylnych kończyn. Jeśli planowane jest również pobranie gruczołów mlecznych klatki piersiowej, wykonaj cięcie w kształcie litery Y od linii środkowej pomiędzy piersiami z pary nr 2 w kierunku przednich kończyn.</li>
 <li>Rozcinaj skórę nożyczkami po jednej stronie odwróconej litery Y, aby odsłonić jamy brzuszne gruczoły mleczne nr 4; gruczoły mleczne są przytwierdzone do skóry. Przypnij skórę igłami do płytki operacyjnej, aby całkowicie odsłonić gruczoł. Pracuj nad jedną stroną i jednym gruczołem na raz.</li>
 <li>Oddziel gruczoł mleczny od skóry za pomocą ostrych nożyczek i/lub skalpela, zaczynając od obszaru proksymalnego blisko sutka i przesuwając się w stronę końca dystalnego gruczołu, w kierunku kręgosłupa zwierzęcia. (Może to zająć kilka minut, zwłaszcza w przypadku starszczego szczura).</li>
 <li>Natychmiast rozłóż oddzielony gruczoł na odpowiednio opisanym szkiełku przedmiotowym (użyj trwałego markera i/lub „rylnicy diamentowej”), rozkładając gruczoł ostrożnie zgodnie z jego pierwotnym rozmiarem i kształtem in situ. Szkiełko przedmiotowe musi być większe od gruczołu. Po rozłożeniu gruczołu na szkiełku pozostaw go na stole przez chwilę, aby gruczoł przywarł do szkła, ale nie dopuść do jego wyschnięcia.</li>
 <li>Włóż szkiełko do słoika zawierającego utrwalacz Carnoya (75% lodowaty kwas octowy, 25% absolutny etanol=EtOH); pozostaw do utrwalenia w temperaturze pokojowej (RT) pod wyciągiem przez 2 dni lub dłużej. Szkiełka mogą pozostać w utrwalaczu przez dłuższy czas.</li>
 <li>Przemyj szkiełka w 70% EtOH przez 1 godzinę w RT.</li>
 <li>Opłucz w wodzie destylowanej przez 30 min w RT.</li>
 <li>Barwi w barwniku Carmine Alum*) przez 2 dni lub dłużej (aż zauważysz, że węzły chłonne zostały całkowicie zabarwione; sprawdź tył szkiełka).</li>
 <li>Przemyj w rosnących stężeniach EtOH, po 1 godzinie w każdym: 70% -&gt; 95% -&gt; 10%. Po ostatnim płukaniu w absolutnym EtOH umieść gruczoły w ksylenie. Pozostaw pod wyciągiem w RT przez co najmniej 2 dni. Ten ostatni krok to przejaśnianie gruczołu mlecznego, co oznacza odtłuszczanie tkanki tłuszczowej gruczołu i następujący po tym wzrost przezroczystości. Im bardziej tłusty jest gruczoł, tym dłuższy czas przejaśniania jest wymagany.</li>
 <li>Zamknij preparaty szkiełek przykrywkami, używając medium montażowego, takiego jak Permount. Pozostaw szkiełka do całkowitego wyschnięcia (kilka dni) przed obserwacją pod stereomikroskopem. *Barwnik Carmine Alum: Wprowadź 1 g karminu (Sigma C1022) i 2,5 g siarczanu glino-potasowego (Sigma A7167) do 500 mL wody destylowanej i gotuj przez 20 min. Doprowadź objętość końcową do 50 mL wodą. Przefiltruj i przechowuj w lodówce. Roztwór może być używany przez kilka miesięcy. Wymień, gdy kolor stanie się słaby.</li>
</ol>
2. Analiza morfologii całego preparatu gruczołu mlekowego
Morfologię preparatów całych gruczołów mlekowych analizuje się pod kątem następujących punktów końcowych, a wyniki koreluje się z ryzykiem wystąpienia raka piersi.
<ol>
 <li>Całkowity preparat gruczołu mlekowego w dniu PND 21 (wiek przedpokwitkowy):
 <ul>
 <li>Wzrost nabłonkowy:
 <ul>
 <li>Odległość od sutka do końca drzewa nabłonkowego (w milimetrach), mierzona przy użyciu linijki</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Potencjał do transformacji złośliwej:
 <ul>
 <li>Liczba TEB (pączków końcowych), policzona pod mikroskopem świetlnym. TEB to największe struktury cebulowate, zlokalizowane wyłącznie na dystalnym końcu nabłonkowego drzewa mlekowego</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Różnicowanie:
 <ul>
 <li>Ocena AB1 (pączek pęcherzykowy) (0-5). Pączki pęcherzykowe są rozmieszczone w całym nabłonku.</li>
 <li>Ocena AB2 (0-5)</li>
 </ul>
 </li>
 </ul>
 Preparaty całkowite są oceniane pod mikroskopem świetlnym. Wartości ocen AB1 i AB2 są sumowane w celu uzyskania końcowego wyniku różnicowania.</li>
 <li>Całkowity preparat gruczołu mlekowego pobrany w dniu PND 50 (wiek pokwitkowy):
 <ul>
 <li>Wzrost nabłonkowy:
 <ul>
 <li>Odległość od węzła chłonnego do końca drzewa nabłonkowego (w milimetrach), mierzona przy użyciu linijki.</li>
 <li>Odległość od wierzchołka drzewa nabłonkowego do końca poduszki tłuszczowej, mierzona przy użyciu linijki.</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Potencjał do transformacji złośliwej:
 <ul>
 <li>Liczba TEB, policzona pod mikroskopem świetlnym</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Różnicowanie:
 <ul>
 <li>Ocena AB1 (0-5)</li>
 <li>Ocena AB2 (0-5)</li>
 <li>Ocena lobul (0-5)</li>
 </ul>
 </li>
 </ul>
 
 Preparaty całkowite są oceniane pod mikroskopem świetlnym. Różnicowanie zostanie ocenione na dwa sposoby. Po pierwsze, wartości ocen AB1, AB2 i lobul są sumowane w celu uzyskania końcowego wyniku różnicowania. Dodatkowo obliczony zostanie stosunek oceny lobul do sumy ocen AB1+AB2. Pączki pęcherzykowe różnicują się w lobule, zatem im wyższy stosunek lobul do AB, tym bardziej zróżnicowany jest gruczoł.</li>
</ol>
3. Palpacja i pomiar guzów sutriczych u szczurów oraz korelacja z morfologią gruczołów mlekowych
<ol>
<li>Aby rozpocząć tę procedurę, należy utrzymać szczura, obejmując całe ciało dłonią opartą o grzbiet, z palcem wskazującym za głową oraz kciukiem i palcem środkowym pod przeciwległą pachą. Przebukuj szczura na grzbiet i przeprowadź palpację w celu wykrycia ewentualnych guzów piersiowych; wyczuwalne guzy powinny przypominać „grudkę”.</li>
<li>Następnie za pomocą suwmiarki zmierz szerokość, długość i wysokość guza. Oblicz objętość guza, korzystając ze wzoru na elipsoidę: Objętość = 1/6πabc, gdzie „a” = szerokość, „b” = długość i „c” = wysokość.</li>
<li>Lokalizację i wielkość guza zapisuj ręcznie w zeszycie raz w tygodniu. Dane te zostaną później przeniesione do arkusza kalkulacyjnego.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Staranna dysekcja tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego oraz jej przygotowanie do analizy całego preparatu (wholemount) pozwalają na ocenę stanu rozwojowego gruczołu mlekowego. Przy prawidłowym wykonaniu każdego etapu, całe drzewo nabłonka gruczołu mlekowego jest wyraźnie widoczne w obrębie tkanki tłuszczowej, co umożliwia łatwe określenie liczby TEB oraz obliczenie gęstości pączków pęcherzykowych i lobul. Błędy w przygotowaniu preparatów całego organu mogą obejmować niepełną dysekcję tkanki tłuszczowej, niewystarczającą fiksację oraz niewłaściwe przejaśnianie.
Ocena morfologii gruczołu piersiowego dostarczy informacji o liczbie struktur, z których mogą rozwijać się guzy piersi (TEB), stopniu zróżnicowania struktur nabłonkowych (pąki pęcherzykowe i lobule) oraz mierze wzrostu (wydłużenie przewodów). Ważne jest odróżnienie TEB od końców terminalnych; te drugie znajdują się na dystalnym końcu nabłonka, podobnie jak TEB, jednak są od nich mniejsze i nie prowadzą do powstania nowotworów złośliwych. Końce terminalne są również widoczne w obrębie drzewa nabłonkowego.
<img src="/files/ftp_upload/2260/2260fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopowy barwionego preparatu komórki roślinnej; struktura komórkowa, edukacyjne studium biologii." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1: Reprezentatywny wynik prawidłowo przygotowanego preparatu całego gruczołu mlekowego. Wszystkie elementy gruczołu zostały prawidłowo wypreparowane, a barwienie karminem jest optymalne.
<img src="/files/ftp_upload/2260/2260fig2.jpg" alt="Przekrój histologiczny ilustrujący technikę barwienia komórek; obraz mikroskopowy do analizy strukturalnej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2: Reprezentatywny wynik błędnie przygotowanego preparatu całego gruczołu mlekowego. Gruczoł został prawidłowo wypreparowany (brak dystalnej części gruczołu), nie został jednak odpowiednio rozciągnięty, a proces delipidacji nie zakończył się całkowicie.

<ol><li>Rasmussen, S. B., Young, L. J. T., Smith, G. H. Preparing mammary gland whole mounts form mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasmussen%2C+SB+%22Methods+in+Mammary+Gland+Biology+and+Breast+Cancer+Research%22">Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research</a>. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic / Plenum Publishers. New York. 75-85 (2000).</li>
<li>Consensus statements from Mammary Gland Whole Mount Round Robin meeting. Oakland, CA, , (2009).</li>
<li>Hilakivi-Clarke, L., Clarke, R., Onojafe, I., Raygada, M., Cho, E., &amp, L. ippman, E, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+maternal+diet+high+in+n-6+polyunsaturated+fats+alters+mammary+gland+development%2C+puberty+onset%2C+and+breast+cancer+risk+among+female+rat+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A maternal diet high in n-6 polyunsaturated fats alters mammary gland development, puberty onset, and breast cancer risk among female rat offspring.</a> Proc Natl Acad Sci. 94, 9372-9377 (1997).</li>
<li>Russo, I. H., Russo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+gland+neoplasia+in+long-term+rodent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Mammary gland neoplasia in long-term rodent studies.</a> Environ. Health Perspect. 104 (9), 938-967 (1996).</li>
<li>Hilakivi-Clarke, L., de Assis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+origins+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22TRENDS+in+Endocrinol+and+Metabol%22%5BJournal%5D)">Fetal origins of breast cancer.</a> TRENDS in Endocrinol and Metabol. 17 (9), 340-348 (2006).</li>
<li>Hilakivi-Clarke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+modulation+of+terminal+end+buds%3A+its+relevance+to+breast+cancer+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Cancer+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Nutritional modulation of terminal end buds: its relevance to breast cancer prevention.</a> Curr Cancer Drug Targets. 7 (4), 465-474 (2007).</li>
<li>Silva Idos, S., De Stavola, B., Mccormack, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+Group+On+Pre-Natal+Risk+Factors+And+Subsequent+Risk+Of+Breast+Cancer.+Birth+size+and+breast+cancer+risk%3A+re-analysis+of+individual+participant+data+from+32+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Collaborative Group On Pre-Natal Risk Factors And Subsequent Risk Of Breast Cancer. Birth size and breast cancer risk: re-analysis of individual participant data from 32 studies.</a> PloS Medicine. 5, e193-e193 (2008).</li>
<li>Warri, A., Saarinen, N. M., Makela, S., Hilakivi-Clarke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+early+life+genistein+exposures+in+modifying+breast+cancer+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of early life genistein exposures in modifying breast cancer risk.</a> Br J Cancer. 98, 1485-1493 (2008).</li>
<li>Russo, J., Hu, Y. F., Yang, X., Russo, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental%2C+cellular%2C+and+molecular+basis+of+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Developmental, cellular, and molecular basis of human breast cancer.</a> J Natl Cancer Inst Monogr. , 17-37 (2000).</li>
<li>Oza, A. M., Boyd, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammographic+parenchymal+patterns%3A+A+marker+of+breast+cancer+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mammographic parenchymal patterns: A marker of breast cancer risk.</a> Epidemiological Reviews. 15, 196-208 (1993).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Ocena parametrów morfologicznych gruczołu mlekowego oraz wzrostu drzewa nabłonkowego może być wykorzystana do przewidywania, czy manipulacje dietetyczne we wczesnych etapach życia lub inne interwencje zmieniające środowisko hormonalne in utero lub w okresie przedpokwitności modyfikują późniejsze ryzyko raka piersi. Ponieważ rak piersi u ludzi inicjuje się w strukturach gruczołu mlekowego (jednostkach końcowych przewodowo-płacowych, TDLUs) podobnych do TEB u szczurów, technikę tę można zastosować do określenia potencjału ekspozycji we wczesnych etapach życia w zakresie wpływu na ryzyko raka piersi. Co więcej, u kobiet wysoka gęstość mammograficzna zwiększa ryzyko raka piersi 4–6 krotnie, a ocena wzrostu nabłonkowego drzewa gruczołu mlekowego może służyć do identyfikacji czynników determinujących gęstość mammograficzną oraz czynników ją redukujących. Aby uzyskać te informacje, gruczoł mlekowy należy w pełni wypreparować i odpowiednio rozciągnąć na szkiełku przedmiotowym, tak aby wszystkie jego elementy były widoczne pod mikroskopem. Ponadto właściwe barwienie karminem oraz odtłuszczanie w ksylenie pozwoli na uzyskanie preparatów całych organów odpowiednich do oceny ryzyka raka piersi.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy lodowaty</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>AX0073-9</td><td>Fiksatyw Carnoy&amp;rsquo;a</td></tr><tr><td>Etanol bezwodny</td><td>The Waner-Graham Co.</td><td>64-17-5</td><td>Fiksatyw Carnoy&amp;rsquo;a</td></tr><tr><td>Karmin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022</td><td>Roztwór karminu</td></tr><tr><td>Siarczan glino-potasowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7167</td><td>Roztwór karminu</td></tr></tbody></table>

zmiany w morfologii gruczołów mlekowych a ryzyko raka piersi u szczurów

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Badania na modelach gryzoni z rakiem piersi wykazują, że ekspozycja na czynniki dietetyczne/hormonalne w okresie in utero oraz w okresie dojrzewania, kiedy gruczoł mlekowy przechodzi intensywny proces modelowania i remodelowania, zmienia podatność na nowotwory gruczołu mlekowego indukowane kancerogenami. Podobne wyniki opisano u ludzi: na przykład wysoka masa urodzeniowa zwiększa późniejsze ryzyko rozwoju raka piersi, a spożycie soi w diecie w dzieciństwie zmniejsza to ryzyko. Przypuszcza się, że te prenatalne i postnatalne modyfikacje dietetyczne wywołują trwałe zmiany morfologiczne w gruczole mlekowym, które z kolei modyfikują ryzyko raka piersi w późniejszym życiu. Zmiany morfologiczne te prawdopodobnie odzwierciedlają modyfikacje epigenetyczne, takie jak zmiany w metylacji DNA, histonach i ekspresji miRNA, które następnie wpływają na transkrypcję genów. W niniejszym artykule opisujemy, w jaki sposób zmiany w morfologii gruczołu mlekowego mogą pozwolić na przewidywanie ryzyka raka gruczołu mlekowego u szczurów. Nasz protokół szczegółowo opisuje sposób preparowania i usuwania brzusznego gruczołu mlekowego szczura oraz sposób przygotowania całych preparatów gruczołu mlekowego. Opisano również, jak analizować morfologię gruczołu mlekowego według trzech punktów końcowych (liczba pąków końcowych, elongacja nabłonka i różnicowanie) oraz jak wykorzystać te dane do przewidywania ryzyka rozwoju raka gruczołu mlekowego.

Nasz protokół opisuje sposób wycinania brzusznego gruczołu mlekowego szczura oraz przygotowywania preparatów całych gruczołów mlekowych. Opisuje on również analizę morfologii gruczołu mlekowego z wykorzystaniem trzech punktów końcowych (liczba pąków końcowych, elongacja nabłonka i różnicowanie) oraz wykorzystanie tych wyników do przewidywania ryzyka raka piersi u szczurów poddanych modyfikacjom diety in utero lub w okresie przedpokwitaniowym.

Zmiany w morfologii gruczołów mlekowych a ryzyko raka piersi u szczurów

Badania na modelach gryzoni z rakiem piersi wykazują, że ekspozycja na czynniki dietetyczne/hormonalne w okresie płodowym i pokwitaniu, kiedy gruczoł mlekowy...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie sposobu wycięcia i przygotowania preparatu z otworu gruczołu pamięci oraz analiza jego morfologii w celu przewidzenia ryzyka raka pamięci. Cel ten osiąga się poprzez najpierw wycięcie gruczołu pamięci z jamy brzusznej szczura, a następnie przygotowanie preparatu z otworu gruczołu pamięci z wyciętego narządu. Kolejnym krokiem jest analiza gruczołu pamięci.Morfologia widoczna w preparatach z wycinków. Ostatnim krokiem procedury jest badanie palpacyjne szczura w celu wykrycia guza gruczołu Hardera oraz pomiar objętości guza w milimetrach. Przy użyciu suwmiarki można uzyskać wyniki obrazujące zmiany w morfologii gruczołu Hardera poprzez identyfikację struktur w preparatach z wycinków oraz zliczanie lub ocenę ich ilości pod mikroskopem.Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu ekspozycji we wczesnych etapach życia oraz raka piersi, takie jak wpływ ekspozycji dietetycznych lub środowiskowych podczas rozwoju na różnicowanie gruczołów mlekowych (MA) w płucach, co może przekładać się na ryzyko wystąpienia raka piersi w późniejszym życiu. Zastosowanie tej techniki rozciąga się również na profilaktykę raka piersi. Możemy na przykład badać ekspozycje środowiskowe i dietetyczne podczas rozwoju i obserwować zmiany w gruczole mlekowym, sprawdzając, czy są one powiązane ze zwiększonym lub zmniejszonym ryzykiem raka piersi.Procedurę palpacji guza zademonstruje Idli Cruz, technik laboratoryjny i kierownik ds. wspólnych zasobów zwierzęcych. Aby rozpocząć procedurę usunięcia gruczołu mlekowego, należy najpierw za pomocą igieł przytwierdzić uśpione zwierzę do deski powierzchniowej, mocując je za nogi w pozycji na plecach. Następnie należy przetrzeć skórę nasączoną etanolem.Lekko unieś skórę za pomocą pęsety i przetnij ją ostrymi nożyczkami. Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry, zaczynając pomiędzy sutkami pary numer pięć, i tnij w kierunku szyi. Następnie wykonaj nacięcie w kształcie odwróconego Y od linii środkowej w kierunku tylnych kończyn.Rozetnij skórę nożyczkami po jednej stronie nacięcia w kształcie odwróconej litery Y, aby odsłonić brzuszną czwartą gruczoł pamięciowy, która jest przytwierdzona do skóry. Przytwierdź skórę do płytki za pomocą szpilek, aby całkowicie odsłonić gruczoł. Następnie, używając ostrych nożyczek, oddziel gruczoł pamięciowy od skóry.Zacznij od obszaru proksymalnego w pobliżu sutka i kieruj się w stronę końca dystalnego gruczołu, w stronę kręgosłupa zwierzęcia. Po oddzieleniu gruczołu pamięciowego natychmiast rozłóż go na szkiełku przedmiotowym w celu przygotowania preparatu całego organu. Szkiełko przedmiotowe musi być większe od gruczołu i odpowiednio oznakowane. Używając markera permanentnego i/lub rylca diamentowego, ostrożnie rozłóż gruczoł, zachowując jego pierwotny rozmiar i kształt w C two.Po rozprzestrzeniu gruczołu na szkiełku przedmiotowym, pozostawić go na stole na około 30 minut, aby gruczoł przywarł do szkiełka, dbając jednocześnie o to, by nie wyschł. Następnie umieścić szkiełko w słoiku z fiksatywem Carnoy'a i pozostawić w temperaturze pokojowej w dygestorium na dwa dni lub dłużej. Przemyć szkiełko w 70% etanolu przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Płucz preparat wodą destylowaną przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie barwi żołądź barwnikiem karminowo-ałunowym przez dwa dni lub dłużej. Barwienie jest zakończone, gdy po sprawdzeniu rewersu szkiełka stwierdzisz, że węzły chłonne zostały całkowicie zabarwione.Przemyj preparat na szkiełku w serii roztworów etanolu o rosnącym stężeniu, pozostawiając go w każdym z nich na jedną godzinę. Rozpocznij od 70% etanolu, następnie zastosuj 95% etanol, a na koniec 100% etanol. Aby uzyskać preparaty całego gruczołu mlekowego odpowiednie technicznie do analizy morfologicznej, niezbędne są dwa etapy: wycięcie całego gruczołu oraz całkowite usunięcie tkanki tłuszczowej z podłoża gruczołu mlekowego.Gruczoł umieszcza się w ksylenie w celu usunięcia lipidów i zwiększenia przejrzystości. Przejaśnianie to trwa dwa dni lub dłużej, w zależności od wielkości gruczołu oraz zawartości tłuszczu. Po ostatnim płukaniu w etanolu bezwodnym, umieść preparat w ksylenie.Pozostaw gruczoł w ksylenie w temperaturze pokojowej przez co najmniej dwa dni. Po zakończeniu procesu rozluźnienia, zamocuj preparat na szkiełku za pomocą szkiełka nakrywkowego. Używając medium montażowego, takiego jak Permount, pozostaw szkiełko do wyschnięcia na kilka dni w dygestorium przed obserwacją pod mikroskopem stereoskopowym; morfologię zamontowanego otworu gruczołu pamięci analizuje się według trzech punktów końcowych: wydłużenia nabłonka, liczby pąków końcowych oraz różnicowania.Następnie wyniki są korelowane z ryzykiem raka gruczołu mlekowego. W pierwszej kolejności przedstawimy analizę preparatu całego gruczołu mlekowego u zwierzęcia w wieku przedpokwitaniowym w celu oceny wydłużania nabłonka. Za pomocą linijki zmierz w milimetrach odległość od sutka do końca drzewa nabłonkowego.Drugi punkt końcowy, liczba pąków końcowych (TBs), odzwierciedla potencjał do transformacji złośliwej. Pod mikroskopem świetlnym należy policzyć liczbę TBs, które są największymi strukturami miąższowymi, zlokalizowanymi wyłącznie na dystalnym końcu nabłonkowego drzewa mleczowego, dla trzeciego punktu końcowego, którym jest różnicowanie. Cały preparat jest również badany pod mikroskopem świetlnym.Stopień różnicowania ocenia się poprzez punktację pączków pęcherzykowych, które są rozproszone w nabłonku. Dwiema wyznaczonymi typami pączków pęcherzykowych są AB one oraz AB two; każdemu z nich przypisuje się wartość od zera do pięciu w zależności od ich liczebności w gruczole. Wartości punktowe dla AB one i AB two są następnie sumowane, aby uzyskać końcowy wynik różnicowania.Analiza morfologiczna preparatu całej gruczołu mlekowego H po okresie dojrzewania jest podobna do analizy preparatu gruczołu mlekowego H sprzed okresu dojrzewania, z następującymi różnicami. Aby zbadać wydłużenie nabłonka, w pierwszej kolejności należy za pomocą linijki zmierzyć w milimetrach odległość od węzła chłonnego do końca drzewa nabłonkowego. Następnie należy zmierzyć odległość od wierzchołka drzewa nabłonkowego do końca poduszki tłuszczowej.Również w milimetrach dla analizy różnicowania. W preparacie całego gruczołu mlekowego myszy w okresie po okresie dojrzewania, oprócz pączków pęcherzykowych, ocenia się obecność lobul w skali od zera do pięciu pod mikroskopem świetlnym. Wynik odzwierciedla obfitość lobul w gruczole.Różnicowanie oceniane jest następnie na dwa sposoby. Po pierwsze, wartości punktowe z AB one, AB two oraz LOEs są sumowane w celu uzyskania końcowego wyniku różnicowania. Po drugie, oblicza się stosunek wyniku LOEs do sumy wyników AB one i AB two.Ponieważ ABS różnicują dwa LOE, gruczoł o wyższym stopniu zróżnicowania będzie charakteryzował się wyższym stosunkiem LOE do abs. Aby rozpocząć tę procedurę, unieruchom szczura, obejmując całe ciało dłonią opartą o grzbiet, z palcem wskazującym za głową oraz kciukiem i palcem środkowym pod przeciwległą pachą. Odwróć szczura tak, aby leżał na grzbiecie, i przeprowadź palpację w celu wykrycia ewentualnych guzów pamięciowych; wyczuwalne guzy powinny być odczuwalne jako zgrubienia.Następnie za pomocą suwmiarki zmierz szerokość, długość i wysokość guza. Oblicz objętość guza, korzystając ze wzoru dla elipsoidy. Objętość równa się jednej szóstej pi, A, B, C, gdzie A to szerokość, B to długość, a C to wysokość.Ręcznie zapisuj lokalizację i rozmiar guza w notatniku raz w tygodniu. Dane te zostaną później przeniesione do arkusza kalkulacyjnego po prawidłowym przeprowadzeniu sekcji i obróbce. Preparat z otworem gruczołu pamięciowego powinien mieć wszystkie komponenty wyraźnie widoczne, tak jak pokazano na tym przykładzie.Dla przeciwieństwa, ten przykład przedstawia niewłaściwie przygotowany preparat całego gruczołu mlekowego. Gruczoł nie został poprawnie wypreparowany, ponieważ brakuje jego części dystalnej. Ponadto gruczoł nie został odpowiednio rozciągnięty i nie doszło do rozczłonkowania.Przedstawiono w całości. Poniżej znajdują się reprezentatywne wyniki obrazujące, w jaki sposób zmiany w morfologii gruczołu mlekowego mogą przewidywać ryzyko raka piersi. U szczurów eksponowanych na kancerogen DMBA, podczas zliczania liczby terminalnych pąków N lub TBS, w grupie badanej odnotowano wyższą liczbę TBS w 21. dniu w porównaniu z grupą kontrolną.Zmiany w morfologii gruczołu mlekowego były powiązane z wyższą proporcją guzów pamięciowych u szczurów z grupy badawczej w porównaniu z grupą kontrolną, co przedstawiono na tym wykresie. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wycięciu całego gruczołu mlekowego i usunięciu wszystkich lipidów, aby zapewnić dobrą wizualizację struktur gruczołu mlekowego.Po obejreniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzić sekcję i przygotować preparat całego gruczołu mlekowego oraz jak analizować jego morfologię w celu oceny ryzyka wystąpienia raka piersi.

changes-in-mammary-gland-morphology-and-breast-cancer-risk-in-rats

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zmiany w morfologii gruczołów sutkowych i ryzyko raka piersi u szczurów

Niniejszy artykuł prezentuje procedurę opracowaną przez DeOme KB et al. (1959) oraz procedurę oszczędzającą opracowaną przez Brill B et al. (2008), służące do oczyszczania 4. podskórnej tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego w pachwinie u myszy w okresie dojrzewania, w celu przygotowania do transplantacji fragmentów gruczołu mlekowego, komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego lub komórek nowotworowych gruczołu mlekowego.

Procedura transplantacji nabłonka gruczołu mlekowego

Ta metoda opisuje sposób preparowania oraz oceny rozwoju i funkcji gruczołów mlekowych u myszy. Wycięte gruczoły mlekowe oceniane są pod kątem stopnia rozwoju za pomocą metody całego preparatu (whole mount), natomiast wydzielanie mleka jest oceniane przy użyciu testu skurczu komórek mioepitelialnych indukowanego oksytocyną.

Ocena rozwoju i funkcji gruczołu mlekowego w modelach mysich

Protokół immunofluorescencji pośredniej opisany w tym artykule pozwala na wykrywanie i lokalizację białek w gruczole sutkowym myszy. Podano kompletną metodę przygotowania próbek gruczołu mlecznego, przeprowadzenia immunohistochemii, obrazowania skrawków tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz rekonstrukcji obrazów.

Immunofluorescencja pośrednia na zamrożonych odcinkach mysiego gruczołu sutkowego

Procedura chirurgiczna została opracowana w celu dostarczenia komórek guza sutka do mysiej wątroby poprzez wstrzyknięcie do żyły wrotnej. Model ten umożliwia badanie późnych stadiów przerzutów do wątroby u w pełni kompetentnego immunologicznie gospodarza, w tym wynaczynienia komórek nowotworowych, siewu, przeżycia i przerzutowego wzrostu w wątrobie.

Model iniekcji żyły wrotnej do badania przerzutów raka piersi do wątroby

Rozwój gruczołu sutkowego u gryzonia był zazwyczaj oceniany za pomocą ocen opisowych lub poprzez pomiar podstawowych cech fizycznych. Gęstość rozgałęzień jest wskaźnikiem rozwoju sutka, który jest trudny do obiektywnego oszacowania. Protokół ten opisuje wiarygodną metodę ilościowej oceny charakterystyki rozgałęzień gruczołu mlekowego.

Kwantyfikacja gęstości rozgałęzień w całych wierzchowcach gruczołu sutkowego szczura przy użyciu metody analizy Sholla

Opracowaliśmy metodę skutecznego usuwania, przetwarzania, cięcia i barwienia, w celu oceny histopatologicznej, tkanki sutka, która pierwotnie była utrwalona na szkiełkach jako całe wierzchowce. Metoda ta może sprzyjać gromadzeniu i ocenie całych wierzchowców gruczołu mlekowego w badaniach wytycznych dotyczących badań reprodukcyjnych i rozwojowych.

Cięcie gruczołu sutkowego w całości w celu identyfikacji zmian chorobowych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji całych, nienaruszonych gruczołów sutkowych myszy w celu zbadania ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i morfologii przewodowej. Gruczoły brzuszne myszy #4 wyekstrahowano od 8-10 tygodniowych samic myszy nieródek, utrwalono w neutralnej buforowanej formalinie, pocięto i wybarwiono przy użyciu immunohistochemii białek ECM.

Izolacja nienaruszonych, całych gruczołów sutkowych myszy w celu analizy ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii gruczołów

Celem tego protokołu jest opisanie nowego podejścia do modelowania raka piersi opartego na doprzewodowym wstrzykiwaniu adenowirusa z ekspresją Cre do mysich gruczołów sutkowych. Takie podejście pozwala na manipulowanie zdarzeniami onkogennymi zarówno w zależności od typu komórki, jak i narządu, w sposób kontrolowany czasowo.

Modelowanie raka piersi poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie adenowirusa z ekspresją Cre do mysiego gruczołu sutkowego

Ten artykuł opisuje metodę przeszczepiania komórek nabłonka sutka szczura dawcy do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami u zwierząt biorców. Metoda ta może być stosowana do badania wpływu gospodarza i/lub dawcy na rozwój nabłonka sutka i eliminuje potrzebę wstępnego oczyszczania, zwiększając w ten sposób przydatność tej techniki.

Przeszczep komórek nabłonkowych sutka szczura do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami

Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) oraz genetycznie modyfikowane modele myszy do przeszczepu wiernie odwzorowują ludzką chorobę i są preferowanymi modelami do podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem piersi. W tym miejscu opisano metodę ortotopowego przeszczepiania fragmentów guza piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka w celu zbadania biologii guza i oceny odpowiedzi na lek.

Ortotopowe przeszczepy guzów piersi jako modele przedkliniczne raka piersi

Opisano procedurę dostarczania chemicznego roztworu ablacyjnego do drzewa przewodowego sutka szczura w celu profilaktycznego leczenia raka piersi pod kontrolą obrazu. Komórki nabłonka sutka mogą być celowane przy minimalnym uszkodzeniu tkanek pobocznych poprzez kaniulację bezpośrednio do otworu brodawki sutkowej i doprzewodową infuzję 70% roztworu ablacyjnego na bazie etanolu.

Wizualizacja rentgenowska wewnątrzprzewodowego leczenia ablacyjnego opartego na etanolu w profilaktyce raka piersi w modelach szczurzych

Poznaj metodę preparowania całych preparatów gruczołu sutkowego szczura i analizy morfologicznej w celu oceny ryzyka raka piersi. Technika obejmuje pomiar wydłużenia nabłonkowego oraz liczenie pąków terminalnych.

Zmiany w morfologii gruczołów mlekowych a ryzyko raka piersi u szczurów

Przeglądaj więcej filmów