Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo- _L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (CCMS)

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest profilowanie metylotransferaz z złożonych mieszanin białek za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (capture compound mass spectrometry, CCMS). Metylotransferazy są izolowane funkcjonalnie za pomocą trójskładnikowych związków wychwytujących, które zawierają ogólny inhibitor produktu metylotransferazy, S-adenozylohomocysteinę (SAH), pełniącą funkcję selektywności w przedstawionym schemacie postępowania. Izolację funkcjonalną osiąga się w drugim kroku poprzez inkubację lizatu komórkowego ze związkiem wychwytującym w celu ustanowienia odwracalnej równowagi wiązania pomiędzy funkcją selektywności związku wychwytującego a białkami docelowymi. Mieszanina jest naświetlana światłem UV wewnątrz urządzenia Capra Box.

Naświetlanie fotoaktywuje funkcję reaktywną związku wychwytującego. Indukuje to powstanie nieodwrzymałego kowalencyjnego wiązania krzyżowego pomiędzy związkiem wychwytującym a białkami docelowymi. Następnie konjugaty białkowe związku wychwytującego są oddzielane od lizatu, dokładnie przemywane, uwalniane z nośnika stałego i trawione trypsyną w celu zidentyfikowania wychwyconych białek za pomocą analizy spektrometrycznej masy peptydów trypsynowych. Uzyskane wyniki wykazują bezpośrednią izolację i identyfikację metylotransferaz z lizatu komórkowego Escherichia coli w oparciu o spektrometrię masy związku wychwytującego.

Cześć, jestem Thomas Lentz z Laboratorium CaTECH w Katedrze Biochemii. Jestem Mathias Rega, również z Laboratorium Biochemii CapTech. Jestem Mer Linsky z działu analityki.

Dzisiaj przedstawimy procedurę wychwytywania metylotransferaz z wyrównanego lizatu komórkowego przy użyciu kulek magnetycznych. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania oddziaływań białek z małymi cząsteczkami. Procedura ta umożliwia izolację i identyfikację funkcjonalnych subproteomów, takich jak kinazy, metaloproteinazy czy GTPazy, wymieniając tylko niektóre z nich.

Tego podejścia używamy również do odkrywania celów terapeutycznych. Zacznijmy zatem. Do eksperymentów z wychwytywaniem wykorzystuje się zestaw snail L homocystine caper kit short SAH caper kit.

Zestaw ten zawiera związek wychwytujący SAH oraz wolny SAH jako konkurencyjny ligand. W skład zestawu wchodzą również magnetyczne kulki pokryte streptawidyną o średnicy jednej mikrona, pięciokrotnie skoncentrowany bufor do wychwytu oraz pięciokrotnie skoncentrowany bufor do płukania. W osobnych probówkach z jednej paski probówek PCR o objętości 200 µL przygotować magnetyczne kulki pokryte streptawidyną obciążone związkiem wychwytującym SAH, mieszając 50 µL magnetycznych kulek pokrytych streptawidyną w stężeniu 10 mg/mL z 25 µL związku wychwytującego SAH o stężeniu 100 µM dla każdego dołka, energicznie mieszając.

Wstrząsać otrzymane zawiesiny w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, aby umożliwić wiązanie motywu biotyny związku wychwytującego ze streptawidyną na powierzchni kulek magnetycznych. Następnie zebrać magnetycznie kulki capra w zakrętkach probówek PCR za pomocą capra mag, odrzucić nadsącz i resuspendować otrzymane kulki capra w 200 µl jednokrotnego buforu do mycia. Ponownie zebrać magnetycznie kulki capra w zakrętkach pasków probówek PCR i odrzucić nadsącz.

Następnie zamknąć probówki, aby zapobiec wysychaniu kulek. Dalej opisać nowe probówki do testu wychwytu oraz niezbędnych kontroli, w tym kontroli konkurencji. Przygotować kontrolę konkurencji dla procesu pull-down oraz połączony test wychwytu i pull-down, a następnie umieścić opisane probówki w boksie do regulacji temperatury w zakresie od 0 do 4 °C.

Następnie pipetujemy objętość wody milli Q obliczoną dla końcowej objętości reakcji 100 µL oraz 20 µL pięciokrotnie stężonego buforu do wychwytu (capture buffer). Do każdej reakcji dodajemy 0,26 mg lizatu całych komórek E. coli DH5α do każdej probówki i delikatnie mieszamy poprzez odwracanie. W przypadku kontroli konkurencji oraz kontroli konkurencji w badaniu pull-down dodajemy 20 µL 10 mM roztworu kompetytora SAH.

W przypadku testu wychwytu, testu pull-down oraz połączonego testu wychwytu z pull-down, należy dodać 20 µL wody milli Q zamiast roztworu SAH, delikatnie wymieszać wszystkie probówki poprzez odwracanie i krótko odwirować. Następnie należy zawiesić kuleczki capra w odpowiednim lizacie i inkubować przez trzy godziny w temperaturze 4 °C. Kuleczki należy utrzymywać w zawiesinie poprzez rotację, aby umożliwić odwracalne wiązanie białek wiążących SAH z funkcją selektywności SAH związku wychwytującego SAH.

Po inkubacji krótko odwiruj próbki i umieść zawiesiny w boksie do transportu. Rozdziel probówki i przenieś na lód zawiesiny przeznaczone do testu pull-down oraz kontroli konkurencji dla testu pull-down. Pozostałe zawiesiny pozostaw do kontroli konkurencji w teście wychwytywania oraz do połączonego testu wychwytywania.

Następnie wysuń tackę w urządzeniu Capra, aby naświetlić próbki światłem UV przy jednoczesnym ich chłodzeniu. Naświetlaj próbki w zamkniętych probówkach w temperaturze od zero do czterech stopni Celsius przez łączny czas 30 minut, stosując odstępy naświetlania co 2,5 minuty. Proces ten spowoduje utworzenie kowalencyjnego wiązania sieciującego pomiędzy funkcją reaktywną związku wychwytującego SAH a białkami wiążącymi SAH.

Wyjmij zawiesiny z urządzenia Capra po każdym 2,5-minutowym przedziale naświetlania. Chłodź w wodzie z lodem przez około 15 sekund i wymieszaj kilkukrotnie poprzez odwracanie. Następnie krótko odwiruj próbki, aby usunąć zawiesinę pozostałą na zakrętkach, i umieść je z powrotem w urządzeniu Capra na kolejny przedział naświetlania.

Następnie należy uwzględnić zawiesiny do testu pull down oraz kontrolę konkurencji dla testu pull down, a następnie dodać 20 µL roztworu SAH o stężeniu 10 mM do testu przechwytywania dla kontroli konkurencji, kontroli konkurencji pull down oraz połączonego testu przechwytywania i pull down; do pozostałych dodać 20 µL wody Milli-Q. Zawiesiny inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C, utrzymując kuleczki w zawiesinie poprzez rotację w przypadku testu przechwytywania. Białka wiążące SAH, które nie zostały sieciowane z związkiem przechwytującym SAH, zostaną wyparte.

Po inkubacji zebrać kuleczki Capra z zawiesin za pomocą magnesu Capra i odrzucić supernat. Następnie przemyć kuleczki, zawieszając je w 200 µL jednokrotnego buforu do mycia i zbierając je poprzez separację magnetyczną. Powtórzyć to przemywanie pięciokrotnie, a następnie ponownie zawiesić kuleczki w 200 µL wody Milli-Q i zebrać je poprzez separację magnetyczną.

Resuspender kuleczki w 200 µL 60% acetonitrylu i zebrać je za pomocą Capri Mag. Powtórzyć to płukanie acetonitrylem dwukrotnie. W przypadku trudności z resuspensją kuleczek zastosować ultradźwięki.

Następnie uwolnić wychwycone białka z kulek, dodając 200 µL świeżo przygotowanego 60% acetonitrylu i 0,2% kwasu trifluorooctowego, a następnie inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy intensywnym mieszaniu. Ponownie zastosować ultradźwięki, jeśli kulki nie dają się łatwo resuspenderować.

Na koniec zebrać magnetycznie kuleczki i je usunąć. Rozciąć pasek z probówkami na pojedyncze probówki, przebić pokrywki i odparować naddestylat do suchości. Na tym etapie, korzystając z ewaporatora wirówkowego, wyizolowane białka można poddać elektroforezie SDS-PAGE lub przetworzyć do spektrometrii mas zgodnie z opisem w następnej sekcji; rozpuścić wyizolowane białka uwolnione z kuleczek magnetycznych w 10 µL 50 mM wodorowęglanu amonu.

Umieść próbki w kąpieli ultradźwiękowej, a następnie poddaj je wortexowaniu. Następnie dodaj 1 µL trypsyny o stężeniu 0,5 µg/µL w 1 mM HCl, krótko odwiruj i inkubuj roztwór w temperaturze 37 °C przez noc. Po nocnej inkubacji odsol roztwór zawierający peptydy tryptyczne wychwyconych białek, wykorzystując materiał C 18, taki jak końcówki StageTip 20 µL od ProxiBiosystems, zgodnie z instrukcjami producenta; eluj peptydy dwukrotnie, używając 10 µL 50% metanolu i 5% kwasu mrówkowego.

Następnie odparuj rozpuszczalnik za pomocą ewaporatora odśrodkowego, aż do uzyskania suchych, odsolonych peptydów. Rozpuść peptydy w 5,5 µL 0,1% kwasu mrawkowego, stosując ultradźwięki w kąpieli ultradźwiękowej oraz wortexowanie. Na koniec przeanalizuj próbkę za pomocą nanprzepływowej chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Do analizy danych MSM S użyj algorytmu identyfikacji białek, takiego jak SeaQuest zaimplementowany w przeglądarce BioWorks w wersji 3.3 0.1, SPone oraz X!Tandem zaimplementowany w oprogramowaniu Scaffold 3.

Zautomatyzowane przeszukiwanie bazy danych jest przeprowadzane w odniesieniu do najnowszej uniwersalnej bazy wiedzy o białkach. Baza danych Swiss Prot udostępniona przez www.uniprot.org dla badanego organizmu.

Baza danych wykorzystana w niniejszym badaniu obejmuje szczep coli K12 release 57-11; w programie Seaquest skonfigurowano automatyczne przeszukiwanie bazy danych z tolerancją prekursora wynoszącą 5 ppm, tolerancją jonów fragmentacyjnych wynoszącą 1 amu oraz pełną specyficznością tryptyczną z dopuszczeniem do dwóch pominiętych miejsc cięcia.

Ustaw modyfikacje zmienne, aby umożliwić fosforylację seryny, treoniny i tyrozyny, utlenianie metioniny, deamidację asparaginy i glutaminy, acetylację lizyny i seryny, formylowanie lizyny oraz metylację argininy, lizyny, seryny, treoniny i asparaginy. W wyszukiwaniu w bazie danych nie należy używać modyfikacji stałych. Do oprogramowania Scaffold 3 wczytaj pliki DTA lub SRF wygenerowane przez Seaquest; program ten wykonuje ocenę prawdopodobieństwa przypisań peptydów i identyfikacji białek poprzez łączenie wyników wyszukiwań w bazach danych z Seaquest i X!Tandem. Scaffold jest przydatny do łatwego porównywania, walidacji i wizualizacji list białek z wielu próbek.

W oprogramowaniu Scaffold 3 należy ustawić parametry tak, aby przyjmowało ono wyłącznie identyfikację białek i raportowało je jako odrębne trafienia. Należy ustawić trafienia tak, aby zawierały co najmniej jeden peptyd różnicujący, który przeszedł walidację prawdopodobieństwa. Zgodnie z analizą w programie Scaffold 3, należy uwzględnić tylko peptydy o prawdopodobieństwie większym niż lub równym 95%, zgodnie ze specyfikacją algorytmu Peptide Prophet w oprogramowaniu.

Trzy programy ustaliły prawdopodobieństwo identyfikacji białek dla wielu przypisań peptydów na poziomie większym lub równym 95% zgodnie z algorytmem protein profit. W przypadku identyfikacji białek na podstawie pojedynczego peptydu prawdopodobieństwo białka ustawiono arbitralnie na wartość większą lub równą 50% i przeprowadzono ręczną inspekcję odpowiadającego mu peptydu. Białka w widmach Ms ms, które składają się z podobnych peptydów i których nie można odróżnić wyłącznie na podstawie analizy Ms MS, są grupowane przez oprogramowanie w celu spełnienia zasad parsymonii.

Szacowany wskaźnik fałszywych odkryć (false discovery rate) identyfikacji peptydów można określić, stosując metodę odwróconej bazy białek, a jego wartość powinna być mniejsza niż 1%. Analiza białek uchwyconych w całości za pomocą elektroforezy SDS-PAGE z barwieniem srebrem została przedstawiona w badaniu wychwytu. Po etapie naświetlania promieniami UV dodano nadmiar wolnego SAH, aby zapewnić izolację wyłącznie białek, do których związek wychwytujący został kowalencyjnie przyłączony dzięki funkcji fotoreaktywności.

Białka zidentyfikowano metodą MS z wyciętych prążków żelu białkowego po trawieniu metodą Ingel Triptych Digest. Dla porównania, skrajna lewa ścieżka przedstawia 0,25% lizatu całych komórek e coli DH five alpha, z których białka izolowano w teście wychwytu. Porównanie to wskazuje na drastyczną redukcję złożoności próbki osiągniętą dzięki technologii związków wychwytujących.

Kontrole przeprowadzono w centralnej części żelu i obejmują one kontrolę konkurencyjną testu. Kontrola ta zawiera nadmiar wolnego SAH jako kompetytora przed etapem naświetlania promieniami UVI, aby zapobiec wiązaniu białek z związkiem wychwytującym SAH poprzez funkcję selektywności SAH. Kontrola konkurencyjna jest niezbędna do zidentyfikowania białek wychwyconych niespecyficznie, które nie wiążą SAH.

Zatem białka zidentyfikowane w teście wychwytu, ale nie w kontroli konkurencji, są specyficznymi białkami wiążącymi SAH. Dołączono również eksperyment pull down bez naświetlania UV i bez dodania wolnego SAH.

Kontrola konkurencyjna procesu pull down nie jest również naświetlana, lecz zawiera SAH jako konkurent. W końcu, połączony test wychwytu (capture assay) oraz pull down jest naświetlany promieniami UV i w trakcie procedury nie dodawano wolnego SAH. Jest oczywiste, że fotousieciowanie zwiększa wydajność i czułość eksperymentu, a specyficzność można łatwo zweryfikować w doświadczeniach konkurencyjnych, stosując nadmiar wolnego SAH zamiast analizy wychwyconych nienaruszonych białek za pomocą SDS-PAGE.

Cała mieszanina wychwyconych białek może zostać przeanalizowana jednocześnie za pomocą nanoprzepływowej chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas po trawieniu Triptych. Jest to właściwe podejście CCMS, które jest znacznie czulsze niż analiza za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. W poniższej tabeli przedstawiono METHYLTRANSFERASES oraz inne wybrane białka zidentyfikowane w eksperymentach CCMS.

Podane liczby oznaczają nieważone zliczanie widm peptydowych na białko; w analizie typu capture zidentyfikowano znacznie więcej metylotransferaz i innych białek wiążących SAH w porównaniu z analizą typu pull down. Specyficzność względem SAH jest wykazana przez niemal całkowity brak tych białek w kontroli konkurencyjnej. Całkowita liczba zidentyfikowanych białek w przebiegach CCMS oraz stopień nakładania się białek między przebiegami zostały zestawione w tabeli.

Liczba białek zidentyfikowanych przy użyciu co najmniej dwóch peptydów podana jest w nawiasach. O wysokiej powtarzalności metody można wnioskować z dużego nakładania się białek, głównie niespecyficznych, pomiędzy porównywalnymi eksperymentami, szczególnie w przypadku białek zidentyfikowanych tutaj w sposób wiarygodny za pomocą co najmniej dwóch peptydów. Diagramy Venna przedstawiają nakładanie się zidentyfikowanych białek w teście wychwytywania (capture assay), kontroli konkurencji oraz w procedurze pull-down, podczas gdy całkowita liczba zidentyfikowanych białek podana jest po prawej stronie, z liczbą białek zidentyfikowanych za pomocą co najmniej dwóch peptydów w nawiasach; liczba metylotransferaz i nukleazy SAH przedstawiona jest po lewej stronie.

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób izolacji i identyfikacji metylotransferaz lub innych funkcjonalnych subproteomów z lizatu komórkowego E. coli lub z innych lizatów tkanek bądź komórek za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związku wychwytującego (capture compound mass spectrometry, CCMS). Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o unikaniu długotrwałej ekspozycji związku wychwytującego na światło widzialne oraz o utrzymywaniu próbek w niskiej temperaturze. Należy również świeżo przygotowywać roztwór TFA w acetonitrylu stosowany do uwalniania wychwyconych białek z kulek magnetycznych oraz unikać zanieczyszczenia eksperymentów zewnętrznymi źródłami białek, takimi jak keratyna pochodząca z kurzu lub od osoby przeprowadzającej badanie.

Ustaliliśmy również, że zależnie od konkretnej konfiguracji układu, lepsze wyniki daje albo konfiguracja off-beat, w której fotousieciowanie zachodzi pomiędzy związkiem przed odzyskanym a białkami i roztworem, albo obecnie opisana konfiguracja on-beat. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.