Name: Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo-L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas związków wychwytujących (CCMS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-20T16:20:00.000+00:00
Duration: 17 min 12 s
Description: Poznaj metodę izolacji metylotransferaz z lizatów komórek Escherichia coli za pomocą spektrometrii mas związków wychwytujących CCMS. Technika ta umożliwia identyfikację białek wiążących S-adenozylo-L-homocysteinę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Human Frontier Science Program Organization (HFSP Award 2007, RGP0058/2007-C). Dziękujemy prof. Richardowi Robertsowi za zainicjowanie projektu oraz za owocne dyskusje.

<ol><li>Katayama, H., Oda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+proteomics+for+drug+discovery+based+on+compound-immobilized+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Analyt.+Technol.+Biomed.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Chemical proteomics for drug discovery based on compound-immobilized affinity chromatography.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 855, 21-27 (2007).</li>
<li>Barglow, K. T., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+protein+profiling+for+the+functional+annotation+of+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Activity-based protein profiling for the functional annotation of enzymes.</a> Nat. Methods. 4, 822-827 (2007).</li>
<li>Koster, H., Little, D. P., Luan, P., Muller, R., Siddiqi, S. M., Marappan, S., Yip, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+compound+mass+spectrometry%3A+a+technology+for+the+investigation+of+small+molecule+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions.</a> Assay Drug Dev. Technol. 5, 381-390 (2007).</li>
<li>Dalhoff, C., Hueben, M., Lenz, T., Poot, P., Nordhoff, E., Koster, H., Weinhold, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+S-Adenosyl-L-homocysteine+Capture+Compounds+for+Selective+Photoinduced+Isolation+of+Methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of S-Adenosyl-L-homocysteine Capture Compounds for Selective Photoinduced Isolation of Methyltransferases.</a> ChemBioChem. 11, 256-265 (2010).</li>
<li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-Adenosylmethionine%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">S-Adenosylmethionine.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 32, 391-3952 (2000).</li>
<li>Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+methylation%3A+selected+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biological methylation: selected aspects.</a> Annu. Rev. Biochem. 44, 435-451 (1975).</li>
<li>Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Watson+and+Crick%3A+DNA+methylation+and+molecular+enzymology+of+DNA+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases.</a> ChemBioChem. 3, 274-293 (2002).</li>
<li>Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+nucleotide+repertoire+of+the+ribosome+with+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expanding the nucleotide repertoire of the ribosome with post-transcriptional modifications.</a> ACS Chem. Biol. 2, 610-619 (2007).</li>
<li>Grillo, M. A., Colombatto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-Adenosylmethionine+and+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">S-Adenosylmethionine and protein methylation.</a> Amino Acids. 28, 357-362 (2005).</li>
<li>Fujioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+small+molecule+methyltransferases%3A+their+structural+and+functional+features%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mammalian small molecule methyltransferases: their structural and functional features.</a> Int. J. Biochem. 24, 1917-1924 (1992).</li>
<li>Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBorchardt%2C+RT+%22The+Biochemistry+of+S-Adenosylmethionine%22">The Biochemistry of S-Adenosylmethionine</a>. Salvatore, F., Borek, E., Zappia, V., Williams-Ashman, H. G., Schlenk, F. , Columbia University Press. New York, NY. 151-171 (1977).</li>
<li>Hoffman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+analysis+of+the+chiral+and+covalent+instability+of+S-adenosyl-l-methionine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chromatographic analysis of the chiral and covalent instability of S-adenosyl-l-methionine.</a> Biochemistry. 25, 4444-4449 (1986).</li>
<li>Keller, A., Nesvizhskii, A. I., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empirical+statistical+model+to+estimate+the+accuracy+of+peptide+identifications+made+by+MS%2FMS+and+database+search%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Empirical statistical model to estimate the accuracy of peptide identifications made by MS/MS and database search.</a> Anal. Chem. 74, 5383-5392 (2002).</li>
<li>Nesvizhskii, A. I., Keller, A., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+statistical+model+for+identifying+proteins+by+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A statistical model for identifying proteins by tandem mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 75, 4646-4658 (2003).</li>
</ol>

Thomas Lenz, Olivia Grabner, Mirko Glinski, Mathias Dreger oraz Hubert Koster są zatrudnieni przez firmę caprotec bioanalytics GmbH, Inc, która produkuje niektóre z odczynników wykorzystanych w niniejszym artykule.

Podczas stosowania opisanego protokołu przydatne mogą być następujące środki ostrożności i uwagi: a) Główną zaletą CC jest tworzenie wiązania kowalencyjnego pomiędzy CC a MTazą, co umożliwia późniejsze zastosowanie rygorystycznych warunków płukania. Kowalencyjne sieciowanie jest osiągane poprzez fotoreakcję wywołaną światłem UV (max. 310 nm). Zwykłe oświetlenie górne zawiera jedynie niewielką frakcję UV, niemniej jednak należy chronić SAH-CC przed długotrwałą ekspozycją na światło górne lub słoneczne aż do momentu kontrolowanego i chłodzonego naświetlania w caproBoxie. b) Próbki biologiczne, z których mają zostać wyizolowane MTazy, mogą zawierać białka podatne na denaturację, w związku z czym konieczne jest utrzymywanie próbek w niskiej temperaturze i unikanie pienienia przez cały czas. c) Urządzenie caproBox chłodzi próbki do 0-4 °C, jednak lampy emitujące światło UV emitują również ciepło. Dlatego konieczne jest krótkie odwirowanie probówek przed naświetlaniem, aby białka przylegające do zakrętek lub ścianek probówek nie mogły tworzyć zarodków wytrącania. d) Jeśli resuspensja kulek magnetycznych (np. w roztworach płuczących) nie jest możliwa ręcznie, należy krótko zastosować ultradźwięki, umieszczając próbki w kąpieli ultradźwiękowej. e) Świeżo przygotuj roztwór 0,2% TFA/60 %ACN. Stwierdzono, że w przeciwnym razie wychwycone białka mogą nie zostać odczepione od kulek. f) Końcowa analiza wychwyconych białek jest przeprowadzana metodą LC-MS/MS. Spektrometria mas jest metodą o wysokiej czułości. W końcowych etapach (krok 2.11 i kolejne) konieczne jest stosowanie wyłącznie reagentów klasy LC-MS. Należy unikać zanieczyszczenia doświadczeń zewnętrznymi źródłami białek, np. keratyną pochodzącą z kurzu lub od eksperymentatora. Szczególnie podczas końcowych etapów trawienia zaleca się dbałość o czystość miejsca pracy, noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego oraz ewentualnie siatki na włosy lub w idealnym rozwiązaniu przeprowadzenie końcowych etapów w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Bufor wodorowęglanu amonu 50 mM stosowany do trawienia trypsyną należy przygotować w wodzie klasy LC-MS, przefiltrować przez filtr 0,22 μm, rozdzielić na aalikwoty, przechowywać w -20°C i używać każdej alikwoty tylko raz, aby uniknąć zanieczyszczeń. Roztwór trypsyny (klasy sekwencyjnej, Roche, przygotować roztwór 0,5 μg/μl poprzez dodanie 1 mM HCl do liofilizowanej trypsyny) można przechowywać w 4°C przez kilka tygodni. g) Aby uzyskać wiarygodne widma mas, niezbędny jest stabilny spray w analizie ESI-MS/MS. h) W przypadku innych systemów LC-MS/MS niż ten użyty w niniejszym badaniu, parametry pomiarowe i algorytmy identyfikacji peptydów muszą zostać dostosowane indywidualnie.
W odniesieniu do opisanego protokołu możliwe są następujące modyfikacje: a) Alternatywnie do uwalniania białek z kulek za pomocą 60% ACN/0,2% TFA (krok 2.11), białka można poddać bezpośredniemu trawieniu trypsyną w zawiesinie kulek (te same objętości co w kroku 5.1) lub, w przypadku SDS-PAGE, białka można uwolnić poprzez zawieszenie i podgrzanie kulek zebranych po kroku 2.9 do 95°C przez 10 min w buforze do próbek SDS (do kieszonki żelu można nałożyć zarówno całą zawiesinę, jak i sam nadsącz). Stwierdziliśmy, że podczas trawienia trypsyną na kulkach, nawet po kilku etapach płukania w fazie wodnej, kulki powoli uwalniają niewielkie ilości polimeru do wodnego roztworu trawiennego. Zanieczyszczenie polimerem zakłóca identyfikację peptydów metodą MS i można je wypłukać z kulek przy użyciu 80% ACN (co najmniej trzykrotnie). Po etapach płukania 80% ACN kulki należy raz przepłukać wodą przed trawieniem trypsyną na kulkach. b) Do wizualizacji skutecznego sieciowania zawierającego biotynę CC z białkami można również zastosować western blot z użyciem streptawidyny-peroksydazy chrzanowej i substratu ECL. W związku z tym można przeprowadzić transfer z żelu otrzymanego po kroku 3.2 lub, ponieważ czułość jest około 10-krotnie wyższa niż w przypadku barwienia żeli srebrem, analizą western blot można objąć również próbki o objętości 10 μl po kroku 2.7. Należy pamiętać, że w tym drugim przypadku, oprócz białek sztucznie biotynilowanych przez SAH-CC, wykryte zostaną również endogennie biotynilowane białka. c) Stwierdziliśmy, że to, czy lepsze wyniki daje konfiguracja „off-bead”, w której reakcja sieciowania zachodzi między wolnym CC a białkiem w roztworze 4, czy obecnie opisana konfiguracja „on-bead” (Rysunek 1B), zależy od konkretnego układu (lizatu, adresowanych białek docelowych, selektywności i funkcji reaktywności CC).
Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta powinna być również kompatybilna z każdą nowoczesną technologią znakowania białek lub peptydów stabilnymi izotopami, a także z analizą próbki wychwyconej za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy żelowej (2D). W konfiguracji „poza koralikiem” (off-bead) możliwe jest również wychwytywanie białek w obrębie całych komórek (wyniki niepublikowane). Ponadto miejsce wiązania leku lub kofaktora w białku można określić poprzez wyznaczenie bliskiej pozycji sieciowania CC w sekwencji białka za pomocą sekwencjonowania peptydów metodą MS. Sposób wiązania małej cząsteczki z białkiem można badać, stosując różne pozycje przyłączenia chemicznego w funkcji selektywności oraz różną długość łącznika. Jak pokazano w niniejszym badaniu, można zidentyfikować również białkowe partnery wiążące białka objęte funkcją selektywności (RplK jako substrat PrmA) lub nieznane oddziaływania małych cząsteczek z białkami (SAH z GlnA). Podsumowując, dodatkowa cecha CC, jaką jest reaktywność fotousieciowania, pozwala na izolację i identyfikację białek o niskiej zawartości lub funkcjonalnych rodzin białek z kompleksowych mieszanin białkowych z wysoką czułością i dostarcza naukowcom dodatkowego narzędzia do badania oddziaływań między małymi cząsteczkami a białkami.

<table><tbody><tr><td>SAH caproKit&amp;#8482;</td><td>caprotec bioanalytics GmbH</td><td>1-1010-050 (50 reakcji) 1-1010-010 (10 reakcji)</td><td>Zawiera SAH-CC, konkurencyjny SAH, magnetyczne kuleczki pokryte streptawidyną, bufor wychwytujący i bufor do płukania</td></tr><tr><td>caproBox&amp;#8482;</td><td>caprotec bioanalytics GmbH</td><td>1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)</td><td>Do powtarzalnej fotoaktywacji przy jednoczesnym chłodzeniu próbek</td></tr><tr><td>caproMag&amp;#8482;</td><td>caprotec bioanalytics GmbH</td><td>1-5100-001</td><td>Do łatwej obsługi cząsteczek magnetycznych bez użycia pipety</td></tr></tbody></table>

profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących s-adenozylo- l-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (ccms)

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Istnieje wiele podejść do redukcji złożoności proteomu w oparciu o funkcjonalne oddziaływania małych cząsteczek z białkami, takich jak chromatografia powinowactwa 1 lub profilowanie białek w oparciu o ich aktywność (Activity Based Protein Profiling) 2. Trójfunkcyjne związki wychwytujące (CC, Rysunek 1A) 3 stanowią podstawę uniwersalnego podejścia, w którym początkowe oddziaływanie między sondą w postaci małej cząsteczki (funkcja selektywności, w tym przypadku S-adenozylo-L-homocysteina, SAH, Rysunek 1A) a białka docelowe, sterowane równowagą chemiczną, zostaje nieodwracalnie utrwalone poprzez fotousieciowanie między niezależną, fotoaktywną funkcją reaktywną (tutaj azyd fenylowy) związku CC a powierzchnią białek docelowych. Funkcja sortująca (tutaj biotyna) służy do izolacji koniugatów CC – białko z złożonych mieszanin biologicznych przy użyciu fazy stałej (tutaj magnetyczne kulki z streptawidyną). Możliwe są dwie konfiguracje eksperymentów: „off-bead” 4 lub obecnie opisana konfiguracja „on-bead” (Rysunek 1B). Funkcja selektywności może być praktycznie dowolną interesującą małą cząsteczką (substratami, inhibitorami, cząsteczkami leków).
S-Adenozylo-L-metionina (SAM, Rysunek 1A) jest prawdopodobnie, po ATP, najpowszechniej występującym kofaktorem w przyrodzie 5, 6. Służy ona jako główny donor grup metylowych we wszystkich organizmach żywych, a reakcja chemiczna jest katalizowana przez metylotransferazy zależne od SAM (MTazy), które metylują DNA 7, RNA 8, białka 9 lub małe cząsteczki 10. Biorąc pod uwagę kluczową rolę reakcji metylacji w różnych scenariuszach fizjologicznych (regulacja genów, epigenetyka, metabolizm), można oczekiwać, że profilowanie MTaz stanie się w proteomice funkcjonalnej równie istotne jak profilowanie kinaz. Jednakże narzędzia analityczne do ich profilowania nie były dostępne. Niedawno wprowadziliśmy CC z SAH jako grupą selektywności, aby wypełnić tę lukę technologiczną (Rysunek 1A).
SAH, produkt SAM powstający po transferze grupy metylowej, jest znanym ogólnym inhibitorem produktu MTazy 11. Z tego powodu, a także ze względu na to, że naturalny kofaktor SAM jest wykorzystywany przez inne enzymy przenoszące pozostałe części kofaktora lub inicjujące reakcje rodnikowe, a także z powodu jego niestabilności chemicznej 12, SAH stanowi idealną funkcję selektywności dla CC w celu celowania w MTazy. W niniejszej pracy przedstawiamy użyteczność SAH-CC i CCMS poprzez profilowanie MTaz oraz innych białek wiążących SAH z szczepu DH5α Escherichia coli (E. coli), jednego z najlepiej scharakteryzowanych prokariontów, który służy jako preferowany organizm modelowy w niezliczonych badaniach biochemicznych, biologicznych i biotechnologicznych. Fotoaktywowane sieciowanie zwiększa wydajność i czułość eksperymentu, a specyficzność można łatwo zweryfikować w doświadczeniach konkurencyjnych z zastosowaniem nadmiaru wolnego SAH.

Związki wychwytujące (Capture Compounds) to trifunkcyjne małe cząsteczki służące do redukcji złożoności proteomu poprzez funkcjonalną, odwracalną oddziaływanie małej cząsteczki z białkiem, a następnie fotousieciowanie i oczyszczanie. W niniejszej procedurze wykorzystujemy związek wychwytujący z funkcją selektywności wiązania S-adenozylo-L-homocysteiny w celu wyizolowaniay metylotransferaz z lizatu całych komórek Escherichia coli oraz ich identyfikacji metodą MS.

Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo- L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (CCMS)

Istnieje wiele podejść pozwalających na zmniejszenie złożoności proteomu w oparciu o funkcjonalne oddziaływania małych cząsteczek z białkami, takie jak powinowactwo...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest profilowanie metylotransferaz z złożonych mieszanin białek za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (capture compound mass spectrometry, CCMS). Metylotransferazy są izolowane funkcjonalnie za pomocą trójskładnikowych związków wychwytujących, które zawierają ogólny inhibitor produktu metylotransferazy, S-adenozylohomocysteinę (SAH), pełniącą funkcję selektywności w przedstawionym schemacie postępowania. Izolację funkcjonalną osiąga się w drugim kroku poprzez inkubację lizatu komórkowego ze związkiem wychwytującym w celu ustanowienia odwracalnej równowagi wiązania pomiędzy funkcją selektywności związku wychwytującego a białkami docelowymi. Mieszanina jest naświetlana światłem UV wewnątrz urządzenia Capra Box.Naświetlanie fotoaktywuje funkcję reaktywną związku wychwytującego. Indukuje to powstanie nieodwrzymałego kowalencyjnego wiązania krzyżowego pomiędzy związkiem wychwytującym a białkami docelowymi. Następnie konjugaty białkowe związku wychwytującego są oddzielane od lizatu, dokładnie przemywane, uwalniane z nośnika stałego i trawione trypsyną w celu zidentyfikowania wychwyconych białek za pomocą analizy spektrometrycznej masy peptydów trypsynowych. Uzyskane wyniki wykazują bezpośrednią izolację i identyfikację metylotransferaz z lizatu komórkowego Escherichia coli w oparciu o spektrometrię masy związku wychwytującego.Cześć, jestem Thomas Lentz z Laboratorium CaTECH w Katedrze Biochemii. Jestem Mathias Rega, również z Laboratorium Biochemii CapTech. Jestem Mer Linsky z działu analityki.Dzisiaj przedstawimy procedurę wychwytywania metylotransferaz z wyrównanego lizatu komórkowego przy użyciu kulek magnetycznych. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania oddziaływań białek z małymi cząsteczkami. Procedura ta umożliwia izolację i identyfikację funkcjonalnych subproteomów, takich jak kinazy, metaloproteinazy czy GTPazy, wymieniając tylko niektóre z nich.Tego podejścia używamy również do odkrywania celów terapeutycznych. Zacznijmy zatem. Do eksperymentów z wychwytywaniem wykorzystuje się zestaw snail L homocystine caper kit short SAH caper kit.Zestaw ten zawiera związek wychwytujący SAH oraz wolny SAH jako konkurencyjny ligand. W skład zestawu wchodzą również magnetyczne kulki pokryte streptawidyną o średnicy jednej mikrona, pięciokrotnie skoncentrowany bufor do wychwytu oraz pięciokrotnie skoncentrowany bufor do płukania. W osobnych probówkach z jednej paski probówek PCR o objętości 200 µL przygotować magnetyczne kulki pokryte streptawidyną obciążone związkiem wychwytującym SAH, mieszając 50 µL magnetycznych kulek pokrytych streptawidyną w stężeniu 10 mg/mL z 25 µL związku wychwytującego SAH o stężeniu 100 µM dla każdego dołka, energicznie mieszając.Wstrząsać otrzymane zawiesiny w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, aby umożliwić wiązanie motywu biotyny związku wychwytującego ze streptawidyną na powierzchni kulek magnetycznych. Następnie zebrać magnetycznie kulki capra w zakrętkach probówek PCR za pomocą capra mag, odrzucić nadsącz i resuspendować otrzymane kulki capra w 200 µl jednokrotnego buforu do mycia. Ponownie zebrać magnetycznie kulki capra w zakrętkach pasków probówek PCR i odrzucić nadsącz.Następnie zamknąć probówki, aby zapobiec wysychaniu kulek. Dalej opisać nowe probówki do testu wychwytu oraz niezbędnych kontroli, w tym kontroli konkurencji. Przygotować kontrolę konkurencji dla procesu pull-down oraz połączony test wychwytu i pull-down, a następnie umieścić opisane probówki w boksie do regulacji temperatury w zakresie od 0 do 4 °C.Następnie pipetujemy objętość wody milli Q obliczoną dla końcowej objętości reakcji 100 µL oraz 20 µL pięciokrotnie stężonego buforu do wychwytu (capture buffer). Do każdej reakcji dodajemy 0,26 mg lizatu całych komórek E. coli DH5α do każdej probówki i delikatnie mieszamy poprzez odwracanie. W przypadku kontroli konkurencji oraz kontroli konkurencji w badaniu pull-down dodajemy 20 µL 10 mM roztworu kompetytora SAH.W przypadku testu wychwytu, testu pull-down oraz połączonego testu wychwytu z pull-down, należy dodać 20 µL wody milli Q zamiast roztworu SAH, delikatnie wymieszać wszystkie probówki poprzez odwracanie i krótko odwirować. Następnie należy zawiesić kuleczki capra w odpowiednim lizacie i inkubować przez trzy godziny w temperaturze 4 °C. Kuleczki należy utrzymywać w zawiesinie poprzez rotację, aby umożliwić odwracalne wiązanie białek wiążących SAH z funkcją selektywności SAH związku wychwytującego SAH.Po inkubacji krótko odwiruj próbki i umieść zawiesiny w boksie do transportu. Rozdziel probówki i przenieś na lód zawiesiny przeznaczone do testu pull-down oraz kontroli konkurencji dla testu pull-down. Pozostałe zawiesiny pozostaw do kontroli konkurencji w teście wychwytywania oraz do połączonego testu wychwytywania.Następnie wysuń tackę w urządzeniu Capra, aby naświetlić próbki światłem UV przy jednoczesnym ich chłodzeniu. Naświetlaj próbki w zamkniętych probówkach w temperaturze od zero do czterech stopni Celsius przez łączny czas 30 minut, stosując odstępy naświetlania co 2,5 minuty. Proces ten spowoduje utworzenie kowalencyjnego wiązania sieciującego pomiędzy funkcją reaktywną związku wychwytującego SAH a białkami wiążącymi SAH.Wyjmij zawiesiny z urządzenia Capra po każdym 2,5-minutowym przedziale naświetlania. Chłodź w wodzie z lodem przez około 15 sekund i wymieszaj kilkukrotnie poprzez odwracanie. Następnie krótko odwiruj próbki, aby usunąć zawiesinę pozostałą na zakrętkach, i umieść je z powrotem w urządzeniu Capra na kolejny przedział naświetlania.Następnie należy uwzględnić zawiesiny do testu pull down oraz kontrolę konkurencji dla testu pull down, a następnie dodać 20 µL roztworu SAH o stężeniu 10 mM do testu przechwytywania dla kontroli konkurencji, kontroli konkurencji pull down oraz połączonego testu przechwytywania i pull down; do pozostałych dodać 20 µL wody Milli-Q. Zawiesiny inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C, utrzymując kuleczki w zawiesinie poprzez rotację w przypadku testu przechwytywania. Białka wiążące SAH, które nie zostały sieciowane z związkiem przechwytującym SAH, zostaną wyparte.Po inkubacji zebrać kuleczki Capra z zawiesin za pomocą magnesu Capra i odrzucić supernat. Następnie przemyć kuleczki, zawieszając je w 200 µL jednokrotnego buforu do mycia i zbierając je poprzez separację magnetyczną. Powtórzyć to przemywanie pięciokrotnie, a następnie ponownie zawiesić kuleczki w 200 µL wody Milli-Q i zebrać je poprzez separację magnetyczną.Resuspender kuleczki w 200 µL 60% acetonitrylu i zebrać je za pomocą Capri Mag. Powtórzyć to płukanie acetonitrylem dwukrotnie. W przypadku trudności z resuspensją kuleczek zastosować ultradźwięki.Następnie uwolnić wychwycone białka z kulek, dodając 200 µL świeżo przygotowanego 60% acetonitrylu i 0,2% kwasu trifluorooctowego, a następnie inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy intensywnym mieszaniu. Ponownie zastosować ultradźwięki, jeśli kulki nie dają się łatwo resuspenderować.Na koniec zebrać magnetycznie kuleczki i je usunąć. Rozciąć pasek z probówkami na pojedyncze probówki, przebić pokrywki i odparować naddestylat do suchości. Na tym etapie, korzystając z ewaporatora wirówkowego, wyizolowane białka można poddać elektroforezie SDS-PAGE lub przetworzyć do spektrometrii mas zgodnie z opisem w następnej sekcji; rozpuścić wyizolowane białka uwolnione z kuleczek magnetycznych w 10 µL 50 mM wodorowęglanu amonu.Umieść próbki w kąpieli ultradźwiękowej, a następnie poddaj je wortexowaniu. Następnie dodaj 1 µL trypsyny o stężeniu 0,5 µg/µL w 1 mM HCl, krótko odwiruj i inkubuj roztwór w temperaturze 37 °C przez noc. Po nocnej inkubacji odsol roztwór zawierający peptydy tryptyczne wychwyconych białek, wykorzystując materiał C 18, taki jak końcówki StageTip 20 µL od ProxiBiosystems, zgodnie z instrukcjami producenta; eluj peptydy dwukrotnie, używając 10 µL 50% metanolu i 5% kwasu mrówkowego.Następnie odparuj rozpuszczalnik za pomocą ewaporatora odśrodkowego, aż do uzyskania suchych, odsolonych peptydów. Rozpuść peptydy w 5,5 µL 0,1% kwasu mrawkowego, stosując ultradźwięki w kąpieli ultradźwiękowej oraz wortexowanie. Na koniec przeanalizuj próbkę za pomocą nanprzepływowej chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Do analizy danych MSM S użyj algorytmu identyfikacji białek, takiego jak SeaQuest zaimplementowany w przeglądarce BioWorks w wersji 3.3 0.1, SPone oraz X!Tandem zaimplementowany w oprogramowaniu Scaffold 3.Zautomatyzowane przeszukiwanie bazy danych jest przeprowadzane w odniesieniu do najnowszej uniwersalnej bazy wiedzy o białkach. Baza danych Swiss Prot udostępniona przez www.uniprot.org dla badanego organizmu.Baza danych wykorzystana w niniejszym badaniu obejmuje szczep coli K12 release 57-11; w programie Seaquest skonfigurowano automatyczne przeszukiwanie bazy danych z tolerancją prekursora wynoszącą 5 ppm, tolerancją jonów fragmentacyjnych wynoszącą 1 amu oraz pełną specyficznością tryptyczną z dopuszczeniem do dwóch pominiętych miejsc cięcia.Ustaw modyfikacje zmienne, aby umożliwić fosforylację seryny, treoniny i tyrozyny, utlenianie metioniny, deamidację asparaginy i glutaminy, acetylację lizyny i seryny, formylowanie lizyny oraz metylację argininy, lizyny, seryny, treoniny i asparaginy. W wyszukiwaniu w bazie danych nie należy używać modyfikacji stałych. Do oprogramowania Scaffold 3 wczytaj pliki DTA lub SRF wygenerowane przez Seaquest; program ten wykonuje ocenę prawdopodobieństwa przypisań peptydów i identyfikacji białek poprzez łączenie wyników wyszukiwań w bazach danych z Seaquest i X!Tandem. Scaffold jest przydatny do łatwego porównywania, walidacji i wizualizacji list białek z wielu próbek.W oprogramowaniu Scaffold 3 należy ustawić parametry tak, aby przyjmowało ono wyłącznie identyfikację białek i raportowało je jako odrębne trafienia. Należy ustawić trafienia tak, aby zawierały co najmniej jeden peptyd różnicujący, który przeszedł walidację prawdopodobieństwa. Zgodnie z analizą w programie Scaffold 3, należy uwzględnić tylko peptydy o prawdopodobieństwie większym niż lub równym 95%, zgodnie ze specyfikacją algorytmu Peptide Prophet w oprogramowaniu.Trzy programy ustaliły prawdopodobieństwo identyfikacji białek dla wielu przypisań peptydów na poziomie większym lub równym 95% zgodnie z algorytmem protein profit. W przypadku identyfikacji białek na podstawie pojedynczego peptydu prawdopodobieństwo białka ustawiono arbitralnie na wartość większą lub równą 50% i przeprowadzono ręczną inspekcję odpowiadającego mu peptydu. Białka w widmach Ms ms, które składają się z podobnych peptydów i których nie można odróżnić wyłącznie na podstawie analizy Ms MS, są grupowane przez oprogramowanie w celu spełnienia zasad parsymonii.Szacowany wskaźnik fałszywych odkryć (false discovery rate) identyfikacji peptydów można określić, stosując metodę odwróconej bazy białek, a jego wartość powinna być mniejsza niż 1%. Analiza białek uchwyconych w całości za pomocą elektroforezy SDS-PAGE z barwieniem srebrem została przedstawiona w badaniu wychwytu. Po etapie naświetlania promieniami UV dodano nadmiar wolnego SAH, aby zapewnić izolację wyłącznie białek, do których związek wychwytujący został kowalencyjnie przyłączony dzięki funkcji fotoreaktywności.Białka zidentyfikowano metodą MS z wyciętych prążków żelu białkowego po trawieniu metodą Ingel Triptych Digest. Dla porównania, skrajna lewa ścieżka przedstawia 0,25% lizatu całych komórek e coli DH five alpha, z których białka izolowano w teście wychwytu. Porównanie to wskazuje na drastyczną redukcję złożoności próbki osiągniętą dzięki technologii związków wychwytujących.Kontrole przeprowadzono w centralnej części żelu i obejmują one kontrolę konkurencyjną testu. Kontrola ta zawiera nadmiar wolnego SAH jako kompetytora przed etapem naświetlania promieniami UVI, aby zapobiec wiązaniu białek z związkiem wychwytującym SAH poprzez funkcję selektywności SAH. Kontrola konkurencyjna jest niezbędna do zidentyfikowania białek wychwyconych niespecyficznie, które nie wiążą SAH.Zatem białka zidentyfikowane w teście wychwytu, ale nie w kontroli konkurencji, są specyficznymi białkami wiążącymi SAH. Dołączono również eksperyment pull down bez naświetlania UV i bez dodania wolnego SAH.Kontrola konkurencyjna procesu pull down nie jest również naświetlana, lecz zawiera SAH jako konkurent. W końcu, połączony test wychwytu (capture assay) oraz pull down jest naświetlany promieniami UV i w trakcie procedury nie dodawano wolnego SAH. Jest oczywiste, że fotousieciowanie zwiększa wydajność i czułość eksperymentu, a specyficzność można łatwo zweryfikować w doświadczeniach konkurencyjnych, stosując nadmiar wolnego SAH zamiast analizy wychwyconych nienaruszonych białek za pomocą SDS-PAGE.Cała mieszanina wychwyconych białek może zostać przeanalizowana jednocześnie za pomocą nanoprzepływowej chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas po trawieniu Triptych. Jest to właściwe podejście CCMS, które jest znacznie czulsze niż analiza za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. W poniższej tabeli przedstawiono METHYLTRANSFERASES oraz inne wybrane białka zidentyfikowane w eksperymentach CCMS.Podane liczby oznaczają nieważone zliczanie widm peptydowych na białko; w analizie typu capture zidentyfikowano znacznie więcej metylotransferaz i innych białek wiążących SAH w porównaniu z analizą typu pull down. Specyficzność względem SAH jest wykazana przez niemal całkowity brak tych białek w kontroli konkurencyjnej. Całkowita liczba zidentyfikowanych białek w przebiegach CCMS oraz stopień nakładania się białek między przebiegami zostały zestawione w tabeli.Liczba białek zidentyfikowanych przy użyciu co najmniej dwóch peptydów podana jest w nawiasach. O wysokiej powtarzalności metody można wnioskować z dużego nakładania się białek, głównie niespecyficznych, pomiędzy porównywalnymi eksperymentami, szczególnie w przypadku białek zidentyfikowanych tutaj w sposób wiarygodny za pomocą co najmniej dwóch peptydów. Diagramy Venna przedstawiają nakładanie się zidentyfikowanych białek w teście wychwytywania (capture assay), kontroli konkurencji oraz w procedurze pull-down, podczas gdy całkowita liczba zidentyfikowanych białek podana jest po prawej stronie, z liczbą białek zidentyfikowanych za pomocą co najmniej dwóch peptydów w nawiasach; liczba metylotransferaz i nukleazy SAH przedstawiona jest po lewej stronie.Właśnie zaprezentowaliśmy sposób izolacji i identyfikacji metylotransferaz lub innych funkcjonalnych subproteomów z lizatu komórkowego E. coli lub z innych lizatów tkanek bądź komórek za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związku wychwytującego (capture compound mass spectrometry, CCMS). Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o unikaniu długotrwałej ekspozycji związku wychwytującego na światło widzialne oraz o utrzymywaniu próbek w niskiej temperaturze. Należy również świeżo przygotowywać roztwór TFA w acetonitrylu stosowany do uwalniania wychwyconych białek z kulek magnetycznych oraz unikać zanieczyszczenia eksperymentów zewnętrznymi źródłami białek, takimi jak keratyna pochodząca z kurzu lub od osoby przeprowadzającej badanie.Ustaliliśmy również, że zależnie od konkretnej konfiguracji układu, lepsze wyniki daje albo konfiguracja off-beat, w której fotousieciowanie zachodzi pomiędzy związkiem przed odzyskanym a białkami i roztworem, albo obecnie opisana konfiguracja on-beat. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

profiling-methyltransferases-other-s-adenosyl-l-homocysteine-binding

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza metylotransferaz i innych białek wiązających S-adenozylo-L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związku chwytającego (CCMS)

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Wszechobecny drugi przekaźnik c-di-GMP kontroluje wzrost i zachowanie wielu bakterii. Opracowaliśmy nowatorską technologię opartą na spektrometrii mas wychwytywania związków do biochemicznej identyfikacji i charakterystyki białek wiążących c-di-GMP u praktycznie każdego gatunku bakterii.

Spektrometria mas związków chemicznych - potężne narzędzie do identyfikacji nowych białek efektorowych c-di-GMP

Przedstawiono protokół profilowania metabolicznego próbek biologicznych za pomocą elektroforezy kapilarnej - spektrometrii mas z wykorzystaniem projektu interfejsu porowatej końcówki bez osłony.

Elektroforeza kapilarna bez osłonki – spektrometria mas do profilowania metabolicznego próbek biologicznych

Tutaj opisujemy test chromatograficzny połączony z separacją ruchliwości jonów prekursorów peptydów, po której następuje detekcja MS w wysokiej rozdzielczości (~30 000) MS dla kwantyfikacji wzorców peptydów wzbogaconych w trawieniu przeciwciał monoklonalnych.

Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF

Tutaj opisujemy wysokoprzepustową metodę kompleksowego nadzoru nad narkotykami, która pozwala na lepszą rozdzielczość i wykrywanie dużych paneli nadużywanych narkotyków i ich metabolitów, z kontrolą jakości opartą na wielosegmentowej elektroforezie kapilarnej i spektrometrii mas.

Wysokowydajny i kompleksowy nadzór nad lekami za pomocą wielosegmentowej elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ulepszona strategia multipleksowania próbek, która jest w stanie zwiększyć liczbę próbek, które mogą być analizowane jednocześnie z dostępnymi znacznikami izobarycznymi. Zastosowanie platformy robotycznej znacznie zwiększyło przepustowość eksperymentalną, powtarzalność i dokładność ilościową.

Automatyczne multipleksowanie próbek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Poznaj metodę izolacji metylotransferaz z lizatów komórek Escherichia coli za pomocą spektrometrii mas związków wychwytujących CCMS. Technika ta umożliwia identyfikację białek wiążących S-adenozylo-L-homocysteinę.

Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo-L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas związków wychwytujących (CCMS) (Wideo) | JoVE Journal

Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo- _L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (CCMS)

Przeglądaj więcej filmów