Name: Zastosowanie przewodnictwa receptora NMDA w neuronach dopaminergicznych śródmózgowia szczura przy użyciu techniki dynamicznego zacisku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Poznaj technikę dynamicznego zacisku do badania przewodnictwa receptorów NMDA w neuronach dopaminergicznych szczura. Metoda umożliwia precyzyjną kontrolę aktywacji receptorów i analizę aktywności neuronalnej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty MH084494 (CJL) oraz MH079276 i NS060658 (CAP).

1. Przygotowanie skrawków
<ol>
	<li>Przygotuj skrawki mózgu za pomocą wibrotomu. Przygotowaliśmy poziome skrawki śródmózgowia o grubości 240 μm od szczura linii Sprague-Dawley (Charles River Laboratories) znieczulonego izofluranem, używając wibrotomu (Microm HM 650V) zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Teksańskiego w San Antonio.</li>
	<li>Przechowuj skrawki w komorze inkubacyjnej do momentu rozpoczęcia rejestracji. Użyliśmy pojemnika inkubacyjnego podgrzanego do 32°C i wypełnionego sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF; w mM): 126 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 4 MgCl2, 2 CaCl2, 10 dekstrozy, 25 NaHCO3, 1.3 kwasu askorbinowego, 2.4 pirogronianu sodu oraz 0.05 glutationu.</li>
</ol>
2. Rejestracja elektrofizjologiczna
<ol>
	<li>Przenieś skrawek do zestawu do rejestracji wewnątrzkomórkowej, w którym perfundowany jest sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) o temperaturze 35°C. Stosujemy ten sam aCSF co w punkcie 1.2, z wyjątkiem zastosowania 2mM MgCl2 oraz pominięcia glutationu. W przypadku skrawków przygotowanych poziomo, zazwyczaj przecinamy skrawek wzdłuż linii środkowej.</li>
	<li>Wizualizuj neuron docelowy. Wizualizowaliśmy poszczególne neurony dopaminergiczne istoty czarnej za pomocą systemu obrazowania gradientowego kontrastu.</li>
	<li>Wytnij elektrodę za pomocą elektronicznego wyciągacza elektrod. Wytnigamy elektrody o oporności końcówki od 4-10 MΩ, używając wyciągacza mikropipet P97 (Sutter Instrument Company).</li>
	<li>Napełnij elektrodę odpowiednim roztworem wewnętrznym. Stosujemy roztwór zawierający (w mM): 138 K-glukonianu, 10 HEPES, 2 MgCl2, 0,2 EGTA, 0,0001 CaCl2, 4 Na-ATP, 0,4 Na-GTP. pH roztworu wewnętrznego dostosowano do wartości 7,3 za pomocą 1M KOH, a osmolarność do poziomu 270-275 mOsms.</li>
	<li>Utwórz uszczelnienie gigaohmowe (giga-seal) na wybranym neuronie. Przerwij uszczelnienie za pomocą ssania. Czynność ta stanowi rozpoczęcie rejestracji z całej komórki (whole cell recording). W naszej konfiguracji wykorzystano wzmacniacz Multiclamp 700B. Wzmacniacz należy następnie przełączyć w tryb zacisku prądowego „I=0”.</li>
</ol>
3. Zastosowanie konduktancji z dynamicznym zaciskiem (Dynamic Clamp)
<ol>
	<li>Program RTXI (www.rtxi.org) został uruchomiony na komputerze do dynamicznego zacisku (dynamic clamp). Do pamięci załadowano stworzony na zamówienie model zawierający receptor NMDA. Prąd wstrzykiwany do komórki w czasie rzeczywistym jest obliczany według następującego równania: 
INMDA = -gNMDA * [1/(1+([Mg]/3.57) * e(-Vm*0.062))] * (Vm - ENMDA)
gdzie gNMDA to pożądana przewodność (w nS; domyślnie ustawiona na 0 nS), [Mg] to stężenie magnezu (w naszym poniższym przykładzie ustawione na 1.5 mM), ENMDA to potencjał odwracania dla receptora NMDA (ustawiony na 0 mV), a Vm to potencjał błonowy komórki mierzony przez wzmacniacz (w milivoltach).</li>
	<li>Wyjście z komputera do dynamicznego zacisku zostało podłączone do wejścia Command wzmacniacza za pomocą przetwornika analogowo-cyfrowego.</li>
	<li>Wzmacniacz został ustawiony w trybie zacisku prądowego (current clamp) „IC”.</li>
	<li>Wprowadź w RTXI pożądaną przewodność receptora NMDA (np. 40nS). Powinien pojawić się fazowy wybuch potencjałów czynnościowych. Alternatywnie, wartość przewodności może zostać przekazana do RTXI poprzez wyjście analogowe (Rysunek 1A, „g(t)”). W programie RTXI należy zastosować odpowiedni czynnik skalujący, aby przeliczyć sygnał z woltów na Siemensy.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Prawidłowa konfiguracja do aplikacji konduktancji z użyciem dynamic clamp przedstawiona jest na rysunku 1A. Korzystając z tego układu, wykonaliśmy rejestrację z całego somy neuronu dopaminergicznego w istocie czarnej części zwartej (substantia nigra pars compacta). Komórki dopaminergiczne zazwyczaj wykazują spontaniczną aktywność o niskiej częstotliwości z wzorcem przypominającym rozrusznik. Serię potencjałów czynnościowych można wywołać poprzez fazową aplikację konduktancji receptora NMDA za pomocą dynamic clamp (rysunek 1B).
<img src="/files/ftp_upload/2275/2275fig1.jpg" alt="Schemat rejestracji neuronalnej przedstawiający przetworniki A/D i konfigurację MC700B; wykres odpowiedzi NMDA 10 mV/s." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1: Symulacja przewodnictwa receptora NMDA z wykorzystaniem techniki dynamic clamp. A. Konfiguracja sprzętowa ilustrująca połączenia między zestawem do rejestracji wewnątrzkomórkowej a komputerem dynamic clamp. B. Seria potencjałów czynnościowych wywołana zastosowaniem przewodnictwa receptora NMDA o wartości 40nS w rejestracji whole-cell z neuronu dopaminergicznego istoty czarnej części zwartej.

<ol><li>Robinson, H. P., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> J Neurosci Methods. 49, 157-165 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp%3A+artificial+conductances+in+biological+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> J Neurophysiol. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends Neurosci. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Deister, C. A., Teagarden, M. A., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsic+neuronal+oscillator+underlies+dopaminergic+neuron+bursting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting.</a> J Neurosci. 29, 15888-15897 (2009).</li>
<li>Lobb, C. J., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+role+for+GABA+receptors+on+the+firing+pattern+of+midbrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons.</a> J Neurophysiol. 104, 403-413 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj technika dynamicznego zaciskania (dynamic clamp) ulepsza tradycyjną metodę bezpośredniej iniekcji prądu, umożliwiając eksperymentatorowi symulowanie efektów elektrycznych wynikających z aktywacji receptora. W tym filmie pokazaliśmy, że do spontanicznej aktywności neuronu dopaminergicznego można dodać efekty aktywacji receptora NMDA, co wywołuje serię potencjałów czynnościowych.
Dzięki elastyczności implementacji sprzętowej i programowej można zastosować szereg rozszerzeń. Znak wstrzykiwanego prądu może zostać zmieniony z ujemnego na dodatni, co odzwierciedla scenariusz, w którym efekty aktywacji receptora w neuronie zostają zniesione. Neurony modelowe, przedstawione w postaci układu równań różniczkowych, mogą być również rozwiązywane numerycznie, co pozwala eksperymentatorowi na badanie niewielkich sieci.

<table><tbody><tr><td>K-glukonian bezwodny</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; X 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenoglikol-bis(B-amino&amp;#8211;etylowy eteru)-N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetraoctowy</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Odczynnik</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Odczynnik</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, bezwodny</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Odczynnik</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CholCl</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pirowinian sodu</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Odczynnik</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutation</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus BX51WI (z obiektywem 40x)</td><td>Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 przetworniki A/C</td><td>Sprzęt</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B z głowicą CV-7B</td><td>Sprzęt</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica mikroelektrod P-97 Flaming/Brown</td><td>Sprzęt</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igły do strzykawek Microfil</td><td>Sprzęt</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sprzęt</td><td>Siskiyou, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monitor</td><td>Sprzęt</td><td>Triview</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie przewodnictwa receptora nmda w neuronach dopaminergicznych śródmózgowia szczura z wykorzystaniem techniki dynamicznej elektrodynamicznej kontroli prądu (dynamic clamp)

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neurobiolodzy badają funkcje mózgu, analizując sposób komunikacji między neuronami. Wielu badaczy przygląda się zmianom w aktywności elektrycznej jednego lub kilku neuronów w odpowiedzi na kontrolowany eksperymentalnie bodziec. Aktywność elektryczną neuronów można rejestrować w wyizolowanych skrawkach mózgu, stosując techniki patch clamp z wykorzystaniem szklanych mikropipet. Tradycyjnie eksperymentatorzy mogą naśladować wejście neuronalne poprzez bezpośrednią iniekcję prądu przez pipetę, stymulację elektryczną innych komórek lub pozostałych połączeń aksonalnych w skrawku, bądź manipulację farmakologiczną receptorów znajdujących się w błonie neuronalnej rejestrowanej komórki.
Wstrzykiwanie prądu stałego charakteryzuje się zaletami takimi jak możliwość wprowadzenia z góry określonej formy przebiegu prądu z wysoką precyzją czasową w miejscu rejestracji (zazwyczaj w somie). Jednak metoda ta nie zmienia oporności błony neuronalnej, ponieważ nie dochodzi do fizycznego otwarcia kanałów jonowych. Wstrzykiwanie prądu zazwyczaj wykorzystuje impulsy prostokątne, przez co nie modeluje kinetyki kanałów jonowych. Wreszcie, wstrzykiwanie prądu nie pozwala na odtworzenie zmian chemicznych w komórce, które występują podczas otwierania kanałów jonowych.
Receptory mogą być aktywowane fizycznie poprzez stymulację elektryczną lub farmakologiczną. W przypadku stymulacji elektrycznej skrawka badacz dysponuje wysoką precyzją czasową aktywacji receptorów. Istnieje jednak ograniczona precyzja przestrzenna aktywacji, a dokładny charakter elementów aktywowanych podczas stymulacji pozostaje nieznany. Ten drugi problem można częściowo rozwiązać za pomocą specyficznych czynników farmakologicznych. Niestety, przebieg czasowy aktywacji czynników farmakologicznych jest zazwyczaj powolny, a precyzja przestrzenna sygnałów wejściowych do rejestrowanej komórki nie jest znana.
Technika dynamicznego zacisku (dynamic clamp) pozwala eksperymentatorowi na zmianę prądu podawanego bezpośrednio do komórki w oparciu o sprzężenie zwrotne w czasie rzeczywistym dotyczące potencjału błonowego komórki (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; przegląd patrz: Prinz et al. 2004). Umożliwia to odwzorowanie zmian elektrycznych występujących w miejscu pomiaru w odpowiedzi na aktywację receptora. Zmiany prądu przyłożonego w czasie rzeczywistym są wyznaczane przez równanie matematyczne zaimplementowane w sprzęcie.
Niedawno wykorzystaliśmy technikę dynamicznego zacisku (dynamic clamp) do zbadania generowania serii potencjałów czynnościowych poprzez fazową aktywację receptorów NMDA w neuronach dopaminergicznych istoty czarnej części rozp𝓇zadzonej (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). W tym filmie prezentujemy procedury niezbędne do wprowadzenia konduktancji receptora NMDA do neuronu dopaminergicznego.

W tym filmie demonstrujemy, jak wprowadzić przewodnictwo do neuronu dopaminergicznego rejestrowanego w konfiguracji whole-cell w skrawkach mózgu szczura. Technika ta nazywa się dynamic clamp.

Zastosowanie przewodnictwa receptora NMDA w neuronach dopaminergicznych śródmózgowia szczura z wykorzystaniem techniki dynamicznej elektrodynamicznej kontroli prądu (dynamic clamp)

Neurobiolodzy badają funkcje mózgu, analizując sposób, w jaki komunikują się w nim neurony. Wielu badaczy przygląda się zmianom w...

Neuronaukowcy badają funkcje mózgu, analizując sposób komunikacji między neuronami. W tym przypadku zmiany aktywności elektrycznej pojedynczego neuronu są wywoływane poprzez zastosowanie eksperymentalnie kontrolowanego przewodnictwa z wykorzystaniem techniki dynamicznego zacisku (dynamic clamp). Najpierw wycinane są cienkie plastry mózgu, które następnie przechowywane są w komorze inkubacyjnej wypełnionej sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym.Następnie plaster przenosi się do zestawu do rejestracji metodą patch clamp. Wybierany jest neuron, a następnie, przy użyciu elektrody rejestrującej i komputera do dynamicznego clampowania podłączonego do wzmacniacza rejestrującego, wykonuje się patch. Do komórki aplikuje się przewodnictwo receptora NMDA.Otrzymane zapisy wykazują serie potencjałów czynnościowych, co sugeruje, że aktywacja receptorów NMDA jest jednym z mechanizmów komórkowych, za pomocą których neurony dopaminergiczne mogą generować serie impulsów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z obecnymi metodami, takimi jak wstrzykiwanie prądu stałego czy leczenie farmakologiczne, jest możliwość precyzyjnego określenia wpływu aktywacji eksperymentalnie zdefiniowanego receptora na aktywność elektryczną żywego neuronu. Po szybkim wyjęciu mózgu z znieczulonego szczura rasy Bragg dolly, wykonano poziome skrawki mózgu o grubości 240 µm przy użyciu wibrotomu.W miarę wycinania plastrów, użyj pipety transferowej, aby umieścić je w komorze inkubacyjnej o temperaturze 32 °C wypełnionej sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym do momentu rozpoczęcia eksperymentów rejestracyjnych. Stanowisko do rejestracji wewnątrzkomórkowej składa się z mikroskopu z obiektywami skonfigurowanymi do obrazowania kontrastowego gradientowego, monitora, systemu perfuzyjnego, wzmacniacza multi clamp 700 B, przetwornika analogowo-cyfrowego, mikromanipulatora oraz głowicy. Komputer Mac Pro uruchamia oprogramowanie do akwizycji danych Axo Graph X oraz oprogramowanie multi clamp commander. Obok stanowiska do rejestracji wewnątrzkomórkowej i komputera Mac Pro znajduje się komputer Sun Microsystems z systemem Linux czasu rzeczywistego oraz jego przetwornik analogowo-cyfrowy, który będzie wykorzystywany w technice dynamicznego zaciskania (dynamic clamp).Układ do rejestracji wewnątrzkomórkowej powinien perfundować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy w temperaturze około 35 °C. Jeśli preparat do rejestracji został przygotowany w przekroju poziomym, należy użyć pipety transferowej, aby umieścić go w szalce Petri z sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, a następnie za pomocą narzędzia tnącego przedzielić preparat wzdłuż linii środkowej. Następnie, w celu przeprowadzenia pomiarów elektrofizjologicznych, należy za pomocą pipety przenieść preparat do układu do rejestracji wewnątrzkomórkowej.Używając obiektywu 40x, zlokalizuj docelowy neuron; widoczny jest pojedynczy neuron dopaminergiczny istoty czarnej. Zwróć uwagę na eliptyczne ciało komórki z dwoma rozgałęziającymi się dendrytami. Za pomocą elektronicznej wyrzynarki do mikropipet P 97 przygotuj elektrody o oporności końcówki od 4 do 10 MΩ.Następnie, używając igły strzykawki do mikronapełniania, napełnij elektrodę roztworem wewnętrznym. Wprowadź napełnioną elektrodę do półogniwa połączonego z głowicą wzmacniacza, używając strzykawki podłączonej do półogniwa za pomocą krótkiego odcinka rurki. Przyłóż niewielkie dodatnie ciśnienie do elektrody rejestrującej.Pod kontrolą wizualną opuść elektrodę na docelowy neuron. Na powierzchni komórki pojawi się wgłębienie. Zastosuj niewielkie podciśnienie, aby utworzyć uszczelnienie typu giga seal na wybranym neuronie.Zastosuj ssanie ustne, aby przerwać szczelność połączenia. Stanowi to rejestrację z całej komórki (whole cell recording). Po przerwaniu szczelności użyj interfejsu oprogramowania Multi Clamp Commander, aby przełączyć wzmacniacz w tryb clamp prądowy (current clamp), w którym nie można wstrzykiwać prądu.Aby wprowadzić przewodnictwo NMDA do tej komórki, należy rozpocząć od uruchomienia oprogramowania RTXI na komputerze dynamic clamp. Następnie należy wczytać do pamięci niestandardowy model zawierający receptor NMDA. Po wczytaniu modelu do pamięci RTX, program obliczy w czasie rzeczywistym prąd, który zostanie wprowadzony do komórki, korzystając z przedstawionego tutaj równania, w którym G-N-M-D-A to pożądane przewodnictwo wyrażone w nS, ustawione na zero nS.W ustawieniach Semens domyślnie MG oznacza stężenie magnezu. E-N-M-D-A to potencjał odwracania dla receptora NMDA ustawiony na zero milivoltów, a VM to potencjał błonowy komórki mierzony przez wzmacniacz w milivoltach. Teraz, używając standardowego kabla BNC, połącz wyjście z komputera clampu dynamicznego z wejściem sterującym wzmacniacza za pomocą przetwornika analogowo-cyfrowego.Ustaw wzmacniacz w standardowym trybie clampingu prądowego ic, korzystając z interfejsu oprogramowania Multi Clamp Commander. System RTXI został skonfigurowany tak, aby odbierać pożądaną przewodność GFT w postaci sygnału napięcia z oprogramowania do akwizycji danych Axo Graph X. W tym miejscu wykonujemy prosty protokół w programie AXO Graph X, w którym do komórki aplikowany jest jednosekundowy skok przewodności o wartości 40 nS. seria potencjałów czynnościowych jest wywoływana w odpowiedzi na skok konduktancji przy użyciu układu opisanego w tym filmie; przeprowadzono rejestrację z całej komórki (whole-cell) z somy neuronu dopaminergicznego w zwartej części istoty czarnej (substantia nigra pars compacta). Komórki dopaminergiczne zazwyczaj wyładowują spontanicznie z niską częstotliwością, wykazując wzorzec podobny do rozrusznika. Seria potencjałów czynnościowych może zostać wywołana poprzez fazowe zastosowanie konduktancji receptora NMDA za pomocą zacisku dynamicznego (dynamic clamp).Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu aplikacji konduktancji NMDA do żywego neuronu dopaminergicznego w izolowanym skrawku mózgu. Technikę tę można jednak zastosować do każdego typu komórki, którą można rejestrować za pomocą standardowych technik elektrofizjologicznych. Podobnie, clamp dynamiczny może zostać rozszerzony w celu naśladowania efektów elektrycznych szerokiego zakresu typów receptorów.Mamy nadzieję, że ten film był pomocny w zademonstrowaniu, czym jest technika dynamic clamp oraz w jaki sposób wykorzystujemy ją w naszym laboratorium. Dziękujemy za obejrzenie.

application-nmda-receptor-conductance-rat-midbrain-dopaminergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zastosowanie przewodnictwa receptora NMDA w dopaminergicznych neuronach śródmózgowia szczurów przy użyciu techniki dynamicznego zacisku

Technika amperometryczna mierzy uwalnianie dopaminy z pojedynczej komórki poprzez wykrywanie prądu utleniania powstającego podczas spontanicznego utleniania dopaminy. Metodologia jednoczesnego zaciskania napięcia (voltage clamp) i amperometrii ujawnia mechanistyczną zależność między całkowitą „aktywnością” transportera dopaminy a regulacyjną rolą tej aktywności w transporcie zwrotnym dopaminy.

Pomiar uwalniania dopaminy z pojedynczej komórki przy jednoczesnym zastosowaniu zacisku napięciowego i amperometrii

In situ rejestracje metodą patch clamp są wykorzystywane do charakterystyki elektrofizjologicznej neuronów w nienaruszonych obwodach. W modelu genetycznym Drosophila technika patch clamp jest trudna, ponieważ OUN jest mały i otoczony wytrzymałą osłoną. Niniejszy artykuł opisuje procedurę usuwania osłony oraz oczyszczania neuronów w celu przeprowadzenia późniejszych rejestracji metodą patch clamp.

Przygotowanie neuronów ośrodkowych Drosophila do metody in situ patch clamp

Ten film demonstruje technikę nagrywania za pomocą zacisku krosowego z powierzchni membrany dendrytycznej. Pomaga to bezpośrednio badać właściwości elektryczne dendrytów i leżących u ich podstaw kanałów jonowych bramkowanych napięciem w neuronach dopaminergicznych.

Nagrania patch-clamp z dendrytu neuronu dopaminergicznego w wycinku mózgu

Ten film demonstruje procedurę badania efektywności synaptycznej w bocznej korze śródwęchowej (LEC) poprzez optogenetyczną stymulację aksonów przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) i rejestrowanie odpowiedzi neuronów piramidowych w LEC. Metoda ta łączy zapisy patch-clamp z aktywacją synaptyczną przez stymulację światłem w celu zbadania plastyczności synaptycznej.

Stymulacja optogenetyczna i elektrofizjologiczny zapis zdarzeń synaptycznych w wycinkach mózgu szczura

Ten film demonstruje badanie pobudliwości neuronów czuciowych w zwojach korzenia grzbietowego za pomocą techniki zacisku łatkowego do pomiaru potencjału reozasady i błony, analizując reakcje neuronów na przyrostowe wstrzyknięcia prądu.

Nagrania klamry krosowej całej komórki na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego szczura

Ten artykuł wideo ilustruje przygotowanie, procedury łatania ciał komórkowych oraz sposób implementacji dynamicznych zapisów zaciskowych z komórek zwojowych w całych siatkówkach myszy. Technika ta pozwala na zbadanie dokładnego udziału pobudzających i hamujących wejść synaptycznych oraz ich względnej wielkości i czasu na impulsy neuronalne.

Implementacja dynamicznego zacisku z przewodnictwem synaptycznym i sztucznym w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Aferentne neurony czuciowe przekazują informacje sensoryczne z peryferii do ośrodkowego układu nerwowego. Identyfikacja konkretnych neuronów aferentnych pomoże w zrozumieniu ich fizjologii. Opisujemy metodę znakowania wstecznego w celu identyfikacji neuronów aferentnych i badania kanałów jonowych bramkowanych napięciem w tych neuronach za pomocą elektrofizjologii i immunocytochemii za pomocą elektrofizjologii i immunocytochemii.

Identyfikacja specyficznych populacji neuronów czuciowych w celu badania ekspresji kanałów jonowych

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Ten manuskrypt opisuje, jak przygotować nienaruszone zwoje korzenia grzbietowego do nagrań z zaciskiem łatowym. Preparat ten utrzymuje mikrośrodowisko dla neuronów i satelitarnych komórek glejowych, unikając w ten sposób zmian fenotypowych i funkcjonalnych obserwowanych przy użyciu zdysocjowanych neuronów DRG.

Nagrania zacisków łatkowych na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego od dorosłych szczurów

Subcellular patch-clamp recordings dają możliwość zbadania funkcjonalnych właściwości dendrytów. Jednak te drobne struktury nie są łatwo dostępne ze względu na ich małą średnicę. Opisany tutaj protokół ma na celu ułatwienie zbierania stabilnych i wiarygodnych zapisów z dendrytów neuronów dopaminowych w wycinkach in vitro.

Subkomórkowe nagrania patch-clamp z domeny somatodendrycznej neuronów dopaminowych nigralnych

Dynamiczna elektrofizjologia zaciskowa może ustalić związki przyczynowe między deficytami wyładowania neuronów a dysfunkcją kanału jonowego. Opisujemy metody i protokoły dynamicznego zaciskania w myszowych neuronach Purkinjego w móźku, zwracając uwagę na przydatne zasoby i kwestie techniczne. W badaniu reprezentatywnym dodaliśmy modelowaną przewodność sodu do neuronów Tsc1-/- Purkinje, aby zapobiec powtarzalnemu wyładowaniu.

Metody dynamicznego zacisku do badania upośledzonej pobudliwości neuronów związanych z autyzmem

Poznaj technikę dynamicznego zacisku do badania przewodnictwa receptorów NMDA w neuronach dopaminergicznych szczura. Metoda umożliwia precyzyjną kontrolę aktywacji receptorów i analizę aktywności neuronalnej w czasie rzeczywistym.

Zastosowanie przewodnictwa receptora NMDA w neuronach dopaminergicznych śródmózgowia szczura przy użyciu techniki dynamicznego zacisku (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie przewodnictwa receptora NMDA w neuronach dopaminergicznych śródmózgowia szczura z wykorzystaniem techniki dynamicznej elektrodynamicznej kontroli prądu (dynamic clamp)

Przeglądaj więcej filmów