Zastosowanie przewodnictwa receptora NMDA w neuronach dopaminergicznych śródmózgowia szczura z wykorzystaniem techniki dynamicznej elektrodynamicznej kontroli prądu (dynamic clamp)

Neuronaukowcy badają funkcje mózgu, analizując sposób komunikacji między neuronami. W tym przypadku zmiany aktywności elektrycznej pojedynczego neuronu są wywoływane poprzez zastosowanie eksperymentalnie kontrolowanego przewodnictwa z wykorzystaniem techniki dynamicznego zacisku (dynamic clamp). Najpierw wycinane są cienkie plastry mózgu, które następnie przechowywane są w komorze inkubacyjnej wypełnionej sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym.

Następnie plaster przenosi się do zestawu do rejestracji metodą patch clamp. Wybierany jest neuron, a następnie, przy użyciu elektrody rejestrującej i komputera do dynamicznego clampowania podłączonego do wzmacniacza rejestrującego, wykonuje się patch. Do komórki aplikuje się przewodnictwo receptora NMDA.

Otrzymane zapisy wykazują serie potencjałów czynnościowych, co sugeruje, że aktywacja receptorów NMDA jest jednym z mechanizmów komórkowych, za pomocą których neurony dopaminergiczne mogą generować serie impulsów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z obecnymi metodami, takimi jak wstrzykiwanie prądu stałego czy leczenie farmakologiczne, jest możliwość precyzyjnego określenia wpływu aktywacji eksperymentalnie zdefiniowanego receptora na aktywność elektryczną żywego neuronu. Po szybkim wyjęciu mózgu z znieczulonego szczura rasy Bragg dolly, wykonano poziome skrawki mózgu o grubości 240 µm przy użyciu wibrotomu.

W miarę wycinania plastrów, użyj pipety transferowej, aby umieścić je w komorze inkubacyjnej o temperaturze 32 °C wypełnionej sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym do momentu rozpoczęcia eksperymentów rejestracyjnych. Stanowisko do rejestracji wewnątrzkomórkowej składa się z mikroskopu z obiektywami skonfigurowanymi do obrazowania kontrastowego gradientowego, monitora, systemu perfuzyjnego, wzmacniacza multi clamp 700 B, przetwornika analogowo-cyfrowego, mikromanipulatora oraz głowicy. Komputer Mac Pro uruchamia oprogramowanie do akwizycji danych Axo Graph X oraz oprogramowanie multi clamp commander. Obok stanowiska do rejestracji wewnątrzkomórkowej i komputera Mac Pro znajduje się komputer Sun Microsystems z systemem Linux czasu rzeczywistego oraz jego przetwornik analogowo-cyfrowy, który będzie wykorzystywany w technice dynamicznego zaciskania (dynamic clamp).

Układ do rejestracji wewnątrzkomórkowej powinien perfundować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy w temperaturze około 35 °C. Jeśli preparat do rejestracji został przygotowany w przekroju poziomym, należy użyć pipety transferowej, aby umieścić go w szalce Petri z sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, a następnie za pomocą narzędzia tnącego przedzielić preparat wzdłuż linii środkowej. Następnie, w celu przeprowadzenia pomiarów elektrofizjologicznych, należy za pomocą pipety przenieść preparat do układu do rejestracji wewnątrzkomórkowej.

Używając obiektywu 40x, zlokalizuj docelowy neuron; widoczny jest pojedynczy neuron dopaminergiczny istoty czarnej. Zwróć uwagę na eliptyczne ciało komórki z dwoma rozgałęziającymi się dendrytami. Za pomocą elektronicznej wyrzynarki do mikropipet P 97 przygotuj elektrody o oporności końcówki od 4 do 10 MΩ.

Następnie, używając igły strzykawki do mikronapełniania, napełnij elektrodę roztworem wewnętrznym. Wprowadź napełnioną elektrodę do półogniwa połączonego z głowicą wzmacniacza, używając strzykawki podłączonej do półogniwa za pomocą krótkiego odcinka rurki. Przyłóż niewielkie dodatnie ciśnienie do elektrody rejestrującej.

Pod kontrolą wizualną opuść elektrodę na docelowy neuron. Na powierzchni komórki pojawi się wgłębienie. Zastosuj niewielkie podciśnienie, aby utworzyć uszczelnienie typu giga seal na wybranym neuronie.

Zastosuj ssanie ustne, aby przerwać szczelność połączenia. Stanowi to rejestrację z całej komórki (whole cell recording). Po przerwaniu szczelności użyj interfejsu oprogramowania Multi Clamp Commander, aby przełączyć wzmacniacz w tryb clamp prądowy (current clamp), w którym nie można wstrzykiwać prądu.

Aby wprowadzić przewodnictwo NMDA do tej komórki, należy rozpocząć od uruchomienia oprogramowania RTXI na komputerze dynamic clamp. Następnie należy wczytać do pamięci niestandardowy model zawierający receptor NMDA. Po wczytaniu modelu do pamięci RTX, program obliczy w czasie rzeczywistym prąd, który zostanie wprowadzony do komórki, korzystając z przedstawionego tutaj równania, w którym G-N-M-D-A to pożądane przewodnictwo wyrażone w nS, ustawione na zero nS.

W ustawieniach Semens domyślnie MG oznacza stężenie magnezu. E-N-M-D-A to potencjał odwracania dla receptora NMDA ustawiony na zero milivoltów, a VM to potencjał błonowy komórki mierzony przez wzmacniacz w milivoltach. Teraz, używając standardowego kabla BNC, połącz wyjście z komputera clampu dynamicznego z wejściem sterującym wzmacniacza za pomocą przetwornika analogowo-cyfrowego.

Ustaw wzmacniacz w standardowym trybie clampingu prądowego ic, korzystając z interfejsu oprogramowania Multi Clamp Commander. System RTXI został skonfigurowany tak, aby odbierać pożądaną przewodność GFT w postaci sygnału napięcia z oprogramowania do akwizycji danych Axo Graph X. W tym miejscu wykonujemy prosty protokół w programie AXO Graph X, w którym do komórki aplikowany jest jednosekundowy skok przewodności o wartości 40 nS.

seria potencjałów czynnościowych jest wywoływana w odpowiedzi na skok konduktancji przy użyciu układu opisanego w tym filmie; przeprowadzono rejestrację z całej komórki (whole-cell) z somy neuronu dopaminergicznego w zwartej części istoty czarnej (substantia nigra pars compacta). Komórki dopaminergiczne zazwyczaj wyładowują spontanicznie z niską częstotliwością, wykazując wzorzec podobny do rozrusznika. Seria potencjałów czynnościowych może zostać wywołana poprzez fazowe zastosowanie konduktancji receptora NMDA za pomocą zacisku dynamicznego (dynamic clamp).

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu aplikacji konduktancji NMDA do żywego neuronu dopaminergicznego w izolowanym skrawku mózgu. Technikę tę można jednak zastosować do każdego typu komórki, którą można rejestrować za pomocą standardowych technik elektrofizjologicznych. Podobnie, clamp dynamiczny może zostać rozszerzony w celu naśladowania efektów elektrycznych szerokiego zakresu typów receptorów.

Mamy nadzieję, że ten film był pomocny w zademonstrowaniu, czym jest technika dynamic clamp oraz w jaki sposób wykorzystujemy ją w naszym laboratorium. Dziękujemy za obejrzenie.