Analiza allelo-specyficznej ekspresji genów w celu zbadania funkcjonalnych podstaw powiązań genetycznych

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest sprawdzenie, czy konkretny wariant DNA, na przykład taki, który jest powiązany z chorobą, wpływa na ekspresję konkretnego genu. Osiąga się to poprzez wybór linii komórkowych, które są heterozygnotyczne zarówno dla tego wariantu, jak i dla polimorfizmu jednego nukleotydu (SNP) w regionie kodującym badanego genu. W drugim kroku z komórek ekstrahuje się DNA i RNA, które następnie służą jako matryca dla reakcji specyficznej dla allelu pierwotnej elongacji.

Następnie produkty pierwotnej elongacji są analizowane metodą spektrometrii mas w celu określenia względnej liczebności obu alleli. Uzyskane wyniki pozwalają stwierdzić, czy pierwotny wariant DNA związany z chorobą wiąże się również z różnicą w ekspresji genu, na podstawie ilościowych pomiarów specyficznych dla alleli wykonanych za pomocą spektrometrii mas. Głównymi zaletami tej techniki są fakt, że w przeciwieństwie do testu z użyciem genu raportującego lucyferazy, nie wymaga ona manipulacji molekularnych i pozwala na pomiar endogennych poziomów ekspresji genów.

Ponadto jesteśmy w stanie porównać poziomy ekspresji między dwoma allelami w sposób z wewnętrzną kontrolą, co eliminuje część zmienności eksperymentalnej. Metoda ta pomaga nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie genetyki człowieka, takie jak mechanizmy molekularne leżące u podstaw asocjacji genetycznych. Pomysł zastosowania tej metody pojawił się po raz pierwszy, gdy zidentyfikowaliśmy asocjację genetyczną obejmującą trzy geny i nie mogliśmy zawęzić sygnału do jednego z nich.

Poprzez dalsze mapowanie genetyczne. Komórki wykorzystywane w tym badaniu powinny wykazywać ekspresję analizowanego genu oraz spełniać dwa podstawowe wymagania genotypowe. Muszą być heterozygotyczne zarówno pod kątem sekwencji DNA związanych z chorobą, jak i markerów DNA, które pozwalają odróżnić transkrypty na podstawie ich pochodzenia chromosomalnego. W przedstawionej tutaj strategii wyboru linii komórkowych, linie komórkowe A i B, A jest heterozygotyczne pod kątem transkrybowanego markera kodującego reprezentowanego przez trójkąty.

Jednakże linia Omnicell A jest heterozygotyczna dla sekwencji DNA związanej z chorobą, zwanej wariantem DNA ryzyka, reprezentowaną przez koła. Niebieski allel wariantu ryzyka wiąże się z niższym poziomem transkrypcji. Po wyborze hodowli linii komórkowej, komórek w kolbie zgodnie ze specyfikacją dostawcy – w tym pokazie użyjemy fibroblastów. Chociaż badanie to jest w takim samym stopniu możliwe do zastosowania w innych typach komórek, w tym w komórkach pierwotnych, należy przygotować dwie szalki Petriego o średnicy 10 cm, odpowiednio do ekstrakcji DNA i RNA.

Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, można je zebrać w celu ekstrakcji DNA i RNA, stosując standardowe metody, w tym dostępne komercyjnie zestawy odpowiednie dla wybranego typu komórek. Przed przeprowadzeniem tego testu zaprojektowano dwie pary starterów PCR dla każdego markera DNA: jedną parę do amplifikacji DNA genomowego, a drugą do amplifikacji cDNA. Startery forward i reverse do amplifikacji cDNA umieszczono w różnych egzonach, aby uniknąć kontaminacji DNA genomowym. Startery zaprojektowano tak, aby produkt PCR dla każdej linii komórkowej miał długość od 100 do 500 par zasad. Przygotowano osiem reakcji PCR o objętości 8 µL: każdorazowo cztery niezależne reakcje dla amplifikacji DNA genomowego oraz cztery niezależne reakcje dla amplifikacji cDNA.

Mieszanina do reakcji PCR zawiera polimerazę DNA, NTP, startery, chlorek magnezu oraz genomowe DNA lub cDNA. Przeprowadzić reakcje PCR w warunkach zoptymalizowanych dla każdej pary starterów, utrzymując liczbę cykli w liniowej fazie amplifikacji. Po zakończeniu reakcji PCR usunąć startery oraz nadmiar dNTP poprzez dodanie egzonukleazy I oraz krewetkowej fosfatazy alkalicznej (SAP) do każdego produktu PCR i inkubację w temperaturze 37°C przez 20 minut, a następnie przez 15 minut w temperaturze 85°C.

Nanieś każdy produkt PCR dwukrotnie na płytkę 384-dołkową, tak aby dla każdej próbki dostępnych było osiem pomiarów. Łącznie 16 punktów dla podstawowego testu elongacji. Zaprojektuj starter elongacyjny za pomocą oprogramowania do projektowania testów w taki sposób, aby ten sam starter mógł być użyty zarówno dla produktów genomicznych, jak i produktów cDNA PCR.

Określ długość startera w zakresie od 14 do 18 par zasad. Przeprowadź pierwotną reakcję elongacji z odpowiednią mieszaniną trzech terminatorów dNTP i jednego dNTP. Typowa pierwotna reakcja elongacji obejmuje etap początkowy w temperaturze 94 °C przez dwie minuty, a następnie 40 cykli: 94 °C przez pięć sekund, 52 °C przez pięć sekund i 72 °C przez pięć sekund.

Na koniec wydłużone oligonukleotydy poddaje się ilościowej analizie metodą spektrometrii mas czasu przelotu z desorpcją i jonizacją laserową wspomaganą macierzą, wykorzystując spektrometr mas z czytnikiem widm. Kluczowym punktem tego protokołu jest zastosowanie kilku strategii kontroli szumów eksperymentalnych w celu wyeliminowania artefaktów. Bardzo ważne jest powtórzenie eksperymentu co najmniej trzykrotnie.

Najlepszą kontrolą dla eksperymentu jest użycie linii komórkowej heterozygotycznej pod kątem testu snip powłoki do pierwotnej elongacji, która nie niesie allela związanego z chorobą. Dodatkowo należy zaprojektować testy dla alternatywnych kodujących markerów transkrybowanych z DNA. Jeśli nie są one dostępne, dodatkową kontrolę można zapewnić za pomocą alternatywnych par starterów do PCR, celujących w inne eksony w teście pierwotnej elongacji.

Kontrolę wewnętrzną można zapewnić poprzez zaprojektowanie starterów do elongacji wiążących się zarówno z nicią prawą, jak i lewą. Poniżej przedstawiono przykład analizy ekspresji specyficznej dla allelu wraz z przykładami śladów spektrometrii mas. Rysunek ten przedstawia wyniki analizy czterech produktów pierwotnej elongacji specyficznych dla alleli, przeprowadzonej na czterech różnych matrycach.

Dwa górne wykresy przedstawiają wyniki uzyskane z analizy genomowego DNA dwóch różnych linii komórkowych, z których obie są heterozygoticzne pod względem transkrybowanego polimorfizmu kodującego. Jednak tylko linia komórkowa A jest heterozygoticzna pod względem wariantu DNA ryzyka. Te dwa dolne wykresy przedstawiają wyniki uzyskane z analizy cDNA wygenerowanego z tych samych linii komórkowych w wyniku artefaktu eksperymentalnego.

Pierwszy pik jest zawsze wyższy od drugiego, nawet w analizie genomicznej. Dlatego wyniki analizy genomicznej są wykorzystywane do normalizacji danych cDNA. Analizę statystyczną przeprowadza się poprzez wygenerowanie pełnego raportu typowania ELO w oprogramowaniu typu mass array.

Niniejszy raport przedstawia dane dotyczące pola piku; prezentujemy tutaj przykład w odniesieniu do dwóch linii komórkowych, komórki A i komórki B, heterozygotycznych pod kątem kodującego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP), przy czym tylko komórka A jest heterozygotyczna pod kątem markera związanego z chorobą. Kolumny wyróżnione na szaro są generowane bezpośrednio przez oprogramowanie, natomiast kolumny wyróżnione na zielono zostały opracowane ręcznie dla każdej komórki. Dla cDNA oraz genomowego DNA wykonano po osiem pomiarów.

Oprogramowanie obliczy pole powierzchni pod każdym pikiem widma, co reprezentuje liczebność każdego z dwóch alleli. Stosunek alleli oblicza się poprzez podzielenie pola powierzchni pierwszego allela przez pole powierzchni drugiego allela dla każdej próbki cDNA i genomowej. Następnie oblicza się średnią oraz błąd standardowy dla ośmiu pomiarów.

Wysoki błąd standardowy przekraczający 0.1 wskazuje, że pomiary nie są spójne i należy je pominąć. Na koniec, średni stosunek CDNA jest normalizowany przy użyciu średniego stosunku genomowego DNA, aby oszacować odchylenie od stosunku równego jeden, którego oczekuje się w przypadku braku różnic w ekspresji specyficznej dla allelu. Ponieważ znormalizowany stosunek w komórce A różni się od jedności, natomiast w komórce B jest mu bliski, dane sugerują, że linia komórkowa A posiada wariant DNA sprzężony z allelem mierzoną przez drugi pik, co obniża ekspresję analizowanego genu.

Linia komórkowa B stanowi bardzo wygodną kontrolę negatywną. Choć przeprowadzenie tej procedury jest niezwykle istotne dla zidentyfikowania informacyjnych wariantów genetycznych oraz określenia odpowiednich kontroli eksperymentalnych, po jej wykonaniu można zastosować inne metody, takie jak haplotypowa, specyficzna immunoprecypitacja chromatyny. Pomagają one odpowiedzieć na pytania dotyczące wariantów genetycznych, dla których brakuje transkrybowanych markerów umożliwiających analizę specyficznej dla allelu ekspresji genu.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak analizować RNA w sposób specyficzny dla allelu oraz jak wykorzystać tę metodę do zrozumienia istotnych genetycznie wariantów funkcjonalnych.