Name: Test ekspresji genów specyficzny dla alleli w celu zbadania funkcjonalnych podstaw asocjacji genetycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Poznaj metodę analizy ekspresji allelowo-specyficznej w komórkach heterozygotycznych przy użyciu spektrometrii masowej MALDI-TOF. Technika ta pozwala precyzyjnie mierzyć endogenne poziomy ekspresji genów i badać molekularne mechanizmy asocjacji genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana przez Wellcome Trust w ramach grantów przyznanych A.P.M [076566/Z/05/Z], J.C.K. [074318] oraz podstawowej dotacji dla Wellcome Trust Centre for Human Genetics [075491/Z/04].

1) Hodowla komórek
<ol>
<li>Wybrać typy komórek wykazujące ekspresję badanego genu.</li>
<li>Wybrać linie komórkowe heterozygotyczne zarówno pod kątem wariantów ryzyka DNA, jak i polimorfizmu kodującego w transkrypcie badanego genu (Rysunek 1).</li>
<li>Hodować wybrane linie komórkowe zgodnie ze specyfikacją dostawcy i przygotować odpowiednio 2 szalki Petriego o średnicy 10 cm do ekstrakcji DNA i RNA.</li>
<li>Po osiągnięciu przez komórki 80% konfluencji rozpocząć procedurę zbioru komórek oraz izolacji DNA i RNA, stosując procedurę opisaną poniżej lub korzystając z dostępnych komercyjnie zestawów.</li>
</ol>
2) Ekstrakcja DNA
<ol>
<li>Usunąć pożywkę z naczynia, przemyć PBS i dodać do naczynia 500 μL roztworu lizującego (0,6% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA oraz 50 μg/mL RNaza A).</li>
<li>Delikatnie kołysz płytką przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przenieś lizat komórkowy do probówki do mikrocentryfugi i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
<li>Dodać proteinazę K do stężenia końcowego wynoszącego 100 μg/mL i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
<li>Wyekstrahować DNA równą objętością fenolu z chloroformem o pH 8, powtórzyć czynność, a następnie wyekstrahować równą objętością chloroformu z alkoholem izoamylowym.</li>
<li>Wytrącić DNA przy użyciu 1/10th objętość 3 M NaCl oraz 2,5 objętości 100% etanolu.</li>
<li>Pozostawić na lodzie przez 5 min, a następnie wirować z prędkością 13 000 obr./min przez 30 min w temperaturze 4 °C.</li>
<li>Przemyć DNA 70% etanolem, pozostawić do wyschnięcia na powietrzu i resuspender w 200 μL TE.</li>
<li>Inkubować w 65 °C przez 10 min, a następnie pozostawić na 2 dni w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C lub długoterminowo w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3) Izolacja RNA
<ol>
<li>Usunąć medium z naczynia, przemyć PBS, dodać 1 mL TRIzol i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Zeskrobać komórki, kilka razy pipetować, przenieść do probówki do mikrocentryfugi i inkubować przez 5 min.</li>
<li>Wirować przez 10 min przy 10 000 rpm w temperaturze 4°C.</li>
<li>Przenieść nadsącz do nowej probówki i dodać 200 μL chloroformu.</li>
<li>Wstrząsnąć i wirować przez 10 min przy 10 000 rpm w temperaturze 4°C.</li>
<li>Przenieść fazę wodną do nowej probówki i dodać równą objętość 70% etanolu.</li>
<li>Nanieść roztwór na 1 lub 2 (w zależności od objętości) kolumny RNeasy i wirować przez 30 sec z maksymalną prędkością.</li>
<li>Następnie postępować zgodnie z instrukcją zestawu RNeasy (Qiagen).</li>
</ol>
4) Przygotowanie próbki kwasów nukleinowych
<ol>
<li>Oznacz stężenie DNA i RNA przy użyciu spektrofotometru NanoDrop (Thermo Scientific).</li>
<li>Przygotuj cDNA z 500-1000 ng RNA, wykorzystując random decamers oraz odwrotną transkryptazę SuperScript III (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
5) PCR i test wydłużania starterów
<ol>
<li>Zaprojektuj dwie pary starterów PCR dla każdego markera DNA: jedną parę do amplifikacji DNA genomowego i drugą parę do amplifikacji cDNA (Rys. 2). W przypadku amplifikacji cDNA umieść startery forward i reverse w różnych egzonach, aby uniknąć kontaminacji DNA genomowym. Zaprojektuj startery tak, aby produkt PCR miał długość w zakresie 100-500 bp.</li>
<li>Przygotuj 10 μL reakcji PCR zawierającej 0.5 U Immolase Taq (Bioline), 0.8 mM dNTPs, 2 mM MgCl2, po 0.2 M każdego startera oraz 20 ng cDNA lub DNA. Amplifikuj każdą próbkę w czterech niezależnych reakcjach.</li>
<li>Przeprowadź reakcję PCR w warunkach zoptymalizowanych dla każdej pary starterów, utrzymując liczbę cykli w liniowej fazie amplifikacji.</li>
<li>Usuń nadmiar starterów PCR i dNTPs poprzez inkubację produktu PCR z egzonukleazą I i fosfatazą alkaliczną krewetkową (SAP) w temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
<li>Nanieś każdy produkt PCR dwukrotnie na płytkę 384-dołkową, tak aby dla każdej próbki dostępne było 8 pomiarów.</li>
<li>Zaprojektuj starter wydłużający za pomocą oprogramowania Assay Design (Sequenom) w taki sposób, aby ten sam starter mógł być użyty zarówno dla produktów PCR z DNA genomowego, jak i z cDNA. Określ długość startera w zakresie 14-18 bp oraz mieszaninę wydłużającą zawierającą kombinacje 3ddNTPs (Rys. 2).</li>
<li>Przeprowadź reakcję wydłużania starterów oraz analizę MALDI-TOF/MS przy użyciu systemu MassARRAY (Sequenom) zgodnie z instrukcją producenta.</li>
<li>Typowa reakcja wydłużania starterów obejmuje etap wstępny w 94 °C przez 2 min, a następnie 40 cykli: 94 °C przez 5 s, 52 °C przez 5 s i 72 °C przez 5 s.</li>
<li>Produkty wydłużania starterów są oczyszczane za pomocą żywicy SpectroCLEAN i przenoszone na matrycę (chip) przy użyciu nanolitrowego dyspensera SpectroPOINT.</li>
<li>Wydłużone oligonukleotydy są kwantyfikowane metodą MALDI-TOF przy użyciu spektrometru mas SpectroREADER.</li>
</ol>
6) Analiza statystyczna
<ol>
<li>Sprawdź wyniki MALDI-TOF/MS w oprogramowaniu MassARRAY Typer, aby ocenić ogólną jakość eksperymentu.</li>
<li>Wyeksportuj raport z allelotypowania, który zawiera dane dotyczące pól powierzchni pików.</li>
<li>Dla każdego pojedynczego widma oblicz stosunek pola powierzchni piku allelu 1 do pola powierzchni piku allelu 2 (stosunek pól powierzchni pików).</li>
<li>Dla każdej próbki cDNA wyznacz średnią i odchylenie standardowe stosunku pól powierzchni pików dla 8 pomiarów, korzystając z odpowiedniej funkcji w programie Excel.</li>
<li>Wyznacz analogiczną średnią stosunku pól powierzchni pików dla 8 pomiarów w przypadku genomowego DNA.</li>
<li>Podziel średni stosunek dla cDNA przez średni stosunek dla DNA genomowego, aby ocenić odchylenie od oczekiwanego stosunku 1:1.</li></ol>
7) Kontrole eksperymentalne
<ol>
<li>Aby wykluczyć artefakty eksperymentalne, powtórz eksperyment co najmniej trzy razy.</li>
<li>W miarę możliwości opracuj testy dla dodatkowych markerów DNA.</li>
<li>Zaprojektuj wiele par starterów PCR oraz starterów do elongacji, które hybrydyzują zarówno z nicią sensowną, jak i antysensowną.</li>
<li>W miarę możliwości w charakterze kontroli negatywnych przetestuj linie komórkowe, które są heterozygotyczne pod kątem markerów DNA, ale nie posiadają wariantów ryzyka DNA związanych z danym fenotypem (Ryc. 1 i Ryc. 3)</li>
</ol>
8) Reprezentatywne wyniki
Przykład analizy ekspresji specyficznej dla alleli przedstawiono na rysunku 3 wraz z przykładami śladów spektrometrii mas. Rysunek obrazuje wyniki analizy 4 produktów przedłużania starterów specyficznych dla alleli, przeprowadzonych na 4 różnych matrycach. Górne wykresy przedstawiają wyniki uzyskane z analizy genomowego DNA dwóch różnych linii komórkowych, które są heterozygotyczne pod kątem transkrybowanego polimorfizmu kodującego. Jednak tylko linia komórkowa A jest heterozygotyczna pod kątem wariantu DNA ryzyka (rysunek 1). Dolne wykresy przedstawiają wyniki uzyskane z analizy cDNA wygenerowanego z tych samych linii komórkowych. W wyniku artefaktu eksperymentalnego pierwszy pik jest zawsze wyższy od drugiego piku, nawet w analizie genomowej. Dlatego wyniki analizy genomowej są wykorzystywane do normalizacji danych cDNA. Po normalizacji stosunek alleli w linii komórkowej A znacząco różni się od 1 (gdzie drugi pik wydaje się niższy w porównaniu z pozostałymi spektrami), podczas gdy w linii komórkowej B jest on bardzo bliski 1. Dane sugerują, że linia komórkowa A posiada wariant DNA, znajdujący się w fazie z allelem mierzonym przez drugi pik, który obniża ekspresję analizowanego genu. Linia komórkowa B stanowi bardzo dogodną kontrolę negatywną.
<img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig1.jpg" alt="Schemat chromosomu; porównanie heterozygotyczności; linie komórkowe A i B; wariant ryzyka; marker kodujący." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Strategia wyboru linii komórkowych. Linie komórkowe A i B są heterozygotyczne w obrębie transkrybowanego markera kodującego (trójkąt), ale tylko linia komórkowa A jest heterozygotyczna w obrębie wariantu ryzyka DNA (koło). Niebieski allel wariantu ryzyka wiąże się (poprzez bezpośredni efekt lub ze względu na ścisłą korelację z rzeczywistym wariantem funkcjonalnym) z niższym poziomem transkrypcji.
<img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig2.jpg" alt="Schemat procesu PCR z przedłużaniem startera do analizy MALDI-TOF/MS w profilowaniu DNA." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Test przedłużania starterów allelospecyficznych. Na rycinie przedstawiono schemat procedury eksperymentalnej przeprowadzonej dla matryc cDNA (po lewej) oraz genomowego DNA (po prawej). Startery PCR (szare prostokąty) zostały zaprojektowane tak, aby amplifikować heterozygotyczny polimorfizm kodujący (trójkąt). Aby uniknąć kontaminacji genomowej, podczas amplifikacji z matrycy cDNA startery PCR przyłączają się do sekwencji znajdujących się w różnych egzonach (jasnoniebieskie paski). Produkt PCR jest następnie wykorzystywany jako matryca w reakcji przedłużania startera, przeprowadzonej z użyciem startera przedłużającego, który przyłącza się w pozycji jednej zasady obok polimorfizmu, oraz odpowiedniej mieszaniny trzech terminatorów dideoksynukleotydowych (ddNTPs) (kwadraty) i jednego deoksynukleotydu (koło), aby przedłużyć starter odpowiednio o jedną lub dwie zasady. Powstałe produkty przedłużania starterów mają różne masy, co umożliwia ich rozdzielenie i ilościowe oznaczenie za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF. Ilość produktu odpowiadająca niebieskiemu allelowi markera DNA jest relatywnie niższa w porównaniu do allela czerwonego.
<img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig3.jpg" alt="Wykres porównawczy stosunków alleli w DNA genomicznym i cDNA w liniach komórkowych; obejmuje analizę statystyczną." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Wyniki analizy ekspresji specyficznej dla allelu. Na rycinie przedstawiono wyniki spektrometrii mas z analizy przeprowadzonej na DNA genomicznym oraz cDNA linii komórkowej A i linii komórkowej B (Rycina 1).

<ol><li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).</li>
<li>Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+quantitative+assay+for+measurement+of+allele-specific+transcripts+differing+by+a+single+nucleotide%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide.</a> PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).</li>
<li>Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+variation+in+human+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Allelic variation in human gene expression.</a> Science. 297, 1143-11 (2002).</li>
<li>Ding, C., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+gene+expression+analysis+technique+using+competitive+PCR+and+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).</li>
<li>Gabriel, S., Ziaugra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+using+Sequenom+MassARRAY+7K+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet+Chapter%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform.</a> Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).</li>
<li>Lo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+variation+in+gene+expression+is+common+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Allelic variation in gene expression is common in the human genome.</a> Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression-based+discovery+of+variation+in+the+human+glutathione+S-transferase+M3+promoter+and+functional+analysis+in+a+glioma+cell+line+using+allele-specific+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation.</a> Cancer Res. 65, 99-104 (2005).</li>
<li>Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+regulatory+polymorphisms+by+allele-specific+quantification+of+RNA+polymerase+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading.</a> Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).</li>
<li>Pastinen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+genetic+and+epigenetic+variation+affecting+human+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression.</a> Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).</li>
<li>Francks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+77-kilobase+region+of+chromosome+6p22.2+is+associated+with+dyslexia+in+families+from+the+United+Kingdom+and+from+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States.</a> Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).</li>
<li>Paracchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromosome+6p22+haplotype+associated+with+dyslexia+reduces+the+expression+of+KIAA0319%2C+a+novel+gene+involved+in+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration.</a> Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Metoda ta umożliwia ocenę wpływu wariantów DNA związanych z chorobą na ekspresję genów poprzez analizę różnic allelicznych w poziomie transkryptu in vivo. W niniejszym protokole względną obfitość transkryptu mierzy się za pomocą MALDI-TOF, jednak można zastosować inne technologie umożliwiające kwantyfikację allelocyficzną, takie jak TaqMan6,7. Głównym ograniczeniem tego podejścia jest dostępność transkrybowanych markerów kodujących. Opisano metody oparte na przedstawionej tutaj zasadzie, lecz wykorzystujące inne klasy polimorfizmów. Test haploChip mierzy ekspresję allelocyficzną przy użyciu markerów zlokalizowanych w odległości 1 kb od miejsca startu lub końca transkrypcji genu, które byłyby obecne w materiale po immunoprecypitacji chromatyny wyizolowanym za pomocą przeciwciał specyficznych dla polimerazy RNA II8. Alternatywnie, gdy matrycą jest heteronuklearne RNA, można wykorzystać SNP intronowe9.
Opisany tutaj konkretny protokół, w połączeniu z analizą haploChip, został z sukcesem wykorzystany do zidentyfikowania genu kandydującego w przypadku dysleksji (lub zaburzeń czytania). Początkowo badanie asocjacji genetycznej zidentyfikowało sekwencję DNA powiązaną z dysleksją, która obejmowała trzy geny10. Analiza allelo-specyficznej ekspresji genów wykazała, że w obecności wariantów DNA powiązanych z dysleksją zmienność ekspresji zaobserwowano tylko dla jednego z trzech genów, a nie dla pozostałych dwóch11.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR international</td><td>27788.366</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR international</td><td>100777C</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Immolase Taq</td><td>Bioline</td><td>BIO-21048</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNTP100A</td><td></td></tr><tr><td>Egzonukleaza 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>Krewetkowa fosfataza alkaliczna</td><td>GE Healthcare</td><td>E70092Z</td><td></td></tr><tr><td>Żywica SpectroCLEAN</td><td>Sequenom</td><td>10053</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina MassEXTEND ddNTP/dNTP</td><td>Sequenom</td><td></td><td>Zmienna w zależności od projektu analizy</td></tr><tr><td>MassEXTEND thermosequenase</td><td>Sequenom</td><td>10052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sprzęt&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chłodzona mikrocentryfuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanolitrowy dozownik SpectroPOINT</td><td>Sequenom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy SpectroREADER</td><td>Sequenom</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza allelo-specyficznej ekspresji genów w celu zbadania funkcjonalnych podstaw powiązań genetycznych

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Liczba istotnych powiązań genetycznych z powszechnymi złożonymi cechami stale rośnie. Jednak większość tych powiązań nie została jeszcze wyjaśniona na poziomie molekularnym. Jednym z mechanizmów pośredniczących w oddziaływaniu wariantów DNA na fenotypy jest ekspresja genów, która – jak wykazano – ma szczególne znaczenie w przypadku cech złożonych1.
Metoda ta pozwala przetestować w kontekście komórkowym wpływ specyficznych sekwencji DNA na ekspresję genów. Zasada polega na pomiarze względnej ilości transkryptów pochodzących z dwóch alleli genu poprzez analizę komórek posiadających jedną kopię sekwencji DNA związanych z chorobą (wariantów ryzyka)2,3. W związku z tym komórki wykorzystywane w tej metodzie powinny spełniać dwa podstawowe wymagania genotypowe: muszą być heterozygotyczne zarówno pod kątem wariantów ryzyka DNA, jak i markerów DNA, zazwyczaj polimorfizmów kodujących, które umożliwiają rozróżnienie transkryptów na podstawie ich pochodzenia chromosomalnego (Rysunek 1). Warianty ryzyka DNA oraz markery DNA nie muszą mieć tej samej częstotliwości alleli, jednak relacja fazowa (haplotypowa) markerów genetycznych musi być znana. Istotny jest również wybór typów komórek, które wykazują ekspresję analizowanego genu. Niniejszy protokół odnosi się konkretnie do procedury przyjętej w celu ekstrakcji kwasów nukleinowych z fibroblastów, jednak metoda ta jest równie zastosowalna do innych typów komórek, w tym do komórek pierwotnych.
Z wybranych linii komórkowych ekstrahuje się DNA i RNA, a następnie syntetyzuje cDNA. DNA i cDNA analizuje się za pomocą testu wydłużania starterów, zaprojektowanego tak, aby celować w kodujące markery DNA4. Test wydłużania starterów przeprowadza się na platformie MassARRAY (Sequenom)5 zgodnie ze specyfikacjami producenta. Produkty wydłużania starterów są następnie analizowane za pomocą spektrometrii mas z detekcją czasu przelotu i jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF/MS). Ponieważ wybrane markery są heterozygotyczne, wygenerują one dwa piki na profilach MS. Pole każdego piku jest proporcjonalne do ilości transkrypcyjnej i może być mierzone za pomocą funkcji oprogramowania MassARRAY Typer w celu obliczenia stosunku allelicznego (allel 1: allel 2). Stosunek alleliczny uzyskany dla cDNA jest normalizowany przy użyciu wartości zmierzonej dla genomowego DNA, gdzie oczekiwany stosunek alleliczny wynosi 1:1, aby skorygować artefakty techniczne. Markery z znormalizowanym stosunkiem allelicznym znacząco różniącym się od 1 wskazują, że ilość transkrypcyjnej generowanej z dwóch chromosomów w tej samej komórce jest różna, co sugeruje, że warianty DNA związane z fenotypem wpływają na ekspresję genów. W celu potwierdzenia wyników należy zastosować kontrole eksperymentalne.

Powiązania genetyczne często pozostają niewyjaśnione na poziomie funkcjonalnym. Niniejsza metoda ma na celu ocenę wpływu markerów genetycznych powiązanych z fenotypem na ekspresję genów poprzez analizę komórek heterozygotycznych w obrębie transkrybowanych SNP. Technologia ta umożliwia precyzyjny pomiar za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF w celu ilościowego oznaczenia produktów specyficznego dla alleli przedłużania starterów.

Analiza allelo-specyficznej ekspresji genów w celu zbadania funkcjonalnych podstaw powiązań genetycznych

Liczba istotnych powiązań genetycznych z powszechnymi cechami złożonymi stale rośnie. Jednak większość tych powiązań nie została...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest sprawdzenie, czy dany wariant DNA, na przykład taki, który jest powiązany z chorobą, wpływa na ekspresję konkretnego genu. Osiąga się to poprzez wybór linii komórkowych heterozygotycznych zarówno pod względem tego wariantu, jak i polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (snip) w kodującej części interesującego genu. W drugim kroku z komórek izoluje się DNA i RNA, które następnie służą jako matryca w reakcji allele-specyficznego przedłużania pierwszej sekwencji.Następnie produkty pierwotnej elongacji są analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu określenia względnej liczności dwóch alleli. Uzyskane wyniki pozwalają stwierdzić, czy pierwotny wariant DNA związany z chorobą wiąże się również z różnicą w ekspresji genu na podstawie ilościowych pomiarów allelo-specyficznych przy użyciu spektrometrii mas. Głównymi zaletami tej techniki są, w przeciwieństwie do testu z genem reporterowym lucyferazy, brak konieczności manipulacji molekularnych oraz możliwość pomiaru endogennych poziomów ekspresji genu.Co więcej, jesteśmy w stanie porównać poziomy ekspresji obu alleli w sposób kontrolowany wewnętrznie, co eliminuje część zmienności eksperymentalnej. Metoda ta pomaga nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie genetyki człowieka, takie jak molekularne mechanizmy leżące u podstaw asocjacji genetycznych. Pomysł zastosowania tej metody pojawił się, gdy zidentyfikowaliśmy asocjację genetyczną obejmującą trzy geny i nie mogliśmy zawęzić sygnału do jednego z nich.Poprzez dalsze mapowanie genetyczne. Komórki wykorzystane do tego testu powinny wykazywać ekspresję badanego genu, a także spełniać dwa podstawowe wymagania genotypowe. Muszą być heterozygotyczne zarówno w odniesieniu do sekwencji DNA związanych z chorobą, jak i markerów DNA, które pozwalają odróżnić transkrypty na podstawie ich pochodzenia chromosomalnego. W przedstawionej tutaj strategii wyboru linii komórkowych, linie A i B, A są heterozygotyczne dla transkrybowanego markera kodującego reprezentowanego przez trójkąty.Linia Omnicell A jest jednak heterozygotyczna w odniesieniu do sekwencji DNA związanej z chorobą, nazywanej wariantem DNA ryzyka i reprezentowanej przez okręgi. Niebieski allel wariantu ryzyka wiąże się z niższym poziomem transkrypcji. Po wybraniu hodowli linii komórkowej w kolbie zgodnie ze specyfikacją dostawcy – w tym pokazie wykorzystamy fibroblasty – przygotuj dwie płytki Petriego o średnicy 10 centymetrów, odpowiednio do ekstrakcji DNA i RNA. Choć badanie to ma tak samo zastosowanie do innych typów komórek, w tym do komórek pierwotnych.Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, można je zebrać w celu ekstrakcji DNA i RNA, stosując standardowe metody, w tym dostępne komercyjnie zestawy odpowiednie dla wybranego typu komórek. Przed przeprowadzeniem tego testu zaprojektowano dwie pary starterów PCR dla każdego markera DNA: jedną parę do amplifikacji genomowego DNA oraz drugą do amplifikacji cDNA. Startery forward i reverse do amplifikacji cDNA należy umieścić w różnych eksonach, aby uniknąć kontaminacji genomowej. Startery powinny być zaprojektowane tak, aby uzyskać produkt PCR o długości od 100 do 500 par zasad dla każdej linii komórkowej. Dla każdej linii przygotowano reakcje PCR o objętości 80 µL: cztery niezależne reakcje dla amplifikacji genomowego DNA oraz cztery niezależne reakcje dla amplifikacji cDNA w każdym przypadku.Mieszanina do reakcji PCR zawiera polimerazę DNA, NTP, primery, chlorek magnezu oraz genomowe DNA lub cDNA. Reakcje PCR należy przeprowadzić w warunkach zoptymalizowanych dla każdej pary primerów, utrzymując liczbę cykli w liniowej fazie amplifikacji. Po zakończeniu reakcji PCR należy usunąć primery PCR i nadmiar dNTP poprzez dodanie egzonukleazy I oraz krewetkowej fosfatazy alkalicznej SAP do każdego produktu PCR i inkubację w temperaturze 37 °C przez 20 minut, a następnie przez 15 minut w temperaturze 85 °C.Nanieś każdy produkt PCR dwukrotnie na płytkę 384-dołkową, aby dla każdej próbki dostępne były osiem pomiarów. Łącznie 16 plamek dla głównego testu elongacji. Zaprojektuj starter elongacyjny za pomocą oprogramowania do projektowania testów w taki sposób, aby ten sam starter mógł być użyty zarówno dla produktów genomowych, jak i cDNA-PCR.Określ długość starterów w zakresie od 14 do 18 par zasad. Przeprowadź pierwotną reakcję elongacji z zastosowaniem odpowiedniej mieszaniny trzech terminalnych deoksynukleotydów i jednego deoksynukleotydu. Typowa pierwotna reakcja elongacji obejmuje etap wstępny w temperaturze 94 °C przez dwie minuty, a następnie 40 cykli: 94 °C przez pięć sekund, 52 °C przez pięć sekund i 72 °C przez pięć sekund.Na koniec wydłużone oligonukleotydy poddaje się kwantyfikacji za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą macierzą z pomiarem czasu przelotu, wykorzystując spektrometr mas ze spektroczytaniem. Kluczowym punktem niniejszego protokołu jest zastosowanie kilku strategii kontroli szumu eksperymentalnego w celu wyeliminowania artefaktów. Niezwykle ważne jest powtórzenie eksperymentu co najmniej trzykrotnie.Najlepszą kontrolą dla eksperymentu jest wykorzystanie linii komórkowej heterozygotycznej pod kątem analizy snip dla pierwszej ekstensji, która nie posiada jednak allelu związanego z chorobą. Dodatkowo należy opracować analizy dla alternatywnych markerów kodujących transkrybowane DNA. Jeśli nie są one dostępne, dodatkową kontrolę można zapewnić poprzez zastosowanie alternatywnych par starterów PCR celujących w różne eksony w analizie pierwszej ekstensji.Kontrolę wewnętrzną można zapewnić poprzez zaprojektowanie starterów do elongacji i przyłączenie ich zarówno do nici forward, jak i reverse. Przedstawiono tutaj przykład analizy ekspresji specyficznej dla allelu wraz z przykładami śladów spektrometrii mas. Rysunek ten pokazuje wyniki analizy czterech produktów pierwotnej elongacji specyficznej dla allelu, przeprowadzonej na czterech różnych matrycach.Dwa górne wykresy przedstawiają wyniki uzyskane z analizy genomowego DNA dwóch różnych linii komórkowych, z których obie są heterozygami pod względem transkrybowanego polimorfizmu kodującego. Jednak tylko linia komórkowa A jest heterozygota pod względem wariantu DNA zwiększającego ryzyko. Dwa dolne wykresy przedstawiają wyniki uzyskane z analizy cDNA wygenerowanego z tych samych linii komórkowych w wyniku artefaktu eksperymentalnego.Pierwszy piki jest zawsze wyższy od drugiego, nawet w analizie genomicznej. Dlatego wyniki analizy genomicznej są wykorzystywane do normalizacji danych cDNA. Analiza statystyczna jest przeprowadzana poprzez wyodrębnienie pełnego raportu typowania ELO w oprogramowaniu typu mass array.Niniejszy raport przedstawia dane dotyczące pola piku; pokazujemy tutaj przykład odnoszący się do dwóch linii komórkowych, komórki A i komórki B, heterozygotycznych pod kątem kodującego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP), przy czym tylko komórka A jest heterozygotyczna pod kątem markera powiązanego z chorobą. Kolumny zaznaczone na szaro są generowane bezpośrednio przez oprogramowanie, natomiast kolumny zaznaczone na zielono są wyliczane ręcznie dla każdej komórki. Dla cDNA oraz genomowego DNA wykonano po osiem pomiarów.Oprogramowanie obliczy pole pod każdym pikiem widma, co odpowiada liczebności każdego z dwóch alleli. Stosunek alleli jest obliczany poprzez podzielenie pola pierwszego allela przez pole drugiego allela dla każdej próbki cDNA i genomowej. Następnie obliczana jest średnia oraz błąd standardowy dla ośmiu pomiarów.Wysoki błąd standardowy przekraczający 0.1 wskazuje na brak spójności pomiarów, które w takim przypadku należy odrzucić. Na koniec, średni stosunek cDNA jest normalizowany względem średniego stosunku genomowego DNA w celu oszacowania odchylenia od stosunku równego jedności, którego oczekuje się w sytuacji braku różnic w ekspresji specyficznej dla allelu. Ponieważ znormalizowany stosunek w komórce A różni się od jedności, natomiast w komórce B jest bliski jedności, dane sugerują, że linia komórkowa A posiada wariant DNA sprzężony z allelem mierzonym przez drugi piki, co obniża ekspresję analizowanego genu.Linia komórkowa B stanowi bardzo wygodną kontrolę negatywną. Chociaż przeprowadzenie tej procedury jest niezwykle istotne dla zdefiniowania informatywnych wariantów genetycznych oraz odpowiednich kontroli eksperymentalnych, po zastosowaniu tej metody można wykorzystać inne podejścia, takie jak haplotypowa immunoprecypitacja chromatyny. Pomaga ona odpowiedzieć na pytania dotyczące wariantów genetycznych, dla których nie istnieją transkrybowane markery umożliwiające analizę allelowej specyficzności ekspresji genów.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak analizować RNA w sposób specyficzny dla allelu oraz jak wykorzystać tę metodę do zrozumienia funkcjonalnych wariantów o znaczeniu genetycznym.

an-allele-specific-gene-expression-assay-to-test-functional-basis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie ekspresji genów specyficznych dla alleli w celu przetestowania funkcjonalnej podstawy skojarzeń genetycznych

Opracowaliśmy ilościowy test wiążący DNA, oparty na ELISA, do pomiaru interakcji czynników transkrypcyjnych z DNA.  Wysoką swoistość białka RUNX2 osiągnięto dzięki oligonukleotydowi rozpoznającemu DNA i swoistemu przeciwciału monoklonalnemu. Detekcja kolorymetryczna z reakcją substratową przeciwciał sprzężoną z enzymem była monitorowana w czasie rzeczywistym.

Test ilościowy do badania interakcji białko-DNA, odkrywania transkrypcyjnych regulatorów ekspresji genów i identyfikowania nowych środków przeciwnowotworowych

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Dostarczamy ustandaryzowany protokół do analizy wzbogacenia zestawu genów danych transkryptomicznych w celu zidentyfikowania idealnego modelu myszy do badań translacyjnych. Protokół ten może być używany z danymi z mikromacierzy DNA i sekwencjonowania RNA, a następnie może być rozszerzony na inne dane omiczne, jeśli dane są dostępne.

Protokół wykorzystania analizy wzbogacenia zestawu genów w celu zidentyfikowania odpowiedniego modelu zwierzęcego do badań translacyjnych

Identyfikacja wariantów genetycznych przyczyniających się do złożonych chorób ludzkich pozwala nam zidentyfikować nowe mechanizmy. W tym miejscu demonstrujemy podejście do genotypowania multipleksowego genów kandydujących lub analizy szlaków genowych, które maksymalizuje pokrycie przy niskich kosztach i jest podatne na badania kohortowe.

Testowanie genów kandydujących w klinicznych badaniach kohortowych z genotypowaniem multipleksowym i spektrometrią mas

Analiza sygnału do szumu na poziomie aminokwasów określa rozpowszechnienie zmienności genetycznej na danej pozycji aminokwasu, znormalizowanej do zmienności genetycznej tła danej populacji. Pozwala to na identyfikację wariantowych "gorących punktów" w sekwencji białka (sygnału), która wzrasta powyżej częstości występowania rzadkich wariantów występujących w populacji (szum).

Określanie prawdopodobieństwa patogenności wariantów za pomocą analizy zmienności genetycznej na poziomie aminokwasów

Ten protokół opisuje nowatorski test przejściowy oparty na rAAV z funkcją wzmacniania i opisywania. Ten test może być wykorzystany do wywołania ekspresji in vivo w mózgu myszy.

Wdrożenie AAV konstruktów ekspresyjnych opartych na wzmacniaczu in vivo w mózgu myszy

Światło / ciemność testu transformacji jest jednym z najczęściej stosowanych testów do pomiaru lęku zachowań w myszy. Poniżej prezentujemy film, który pokazuje szczegółowe procedury, w jaki sposób przeprowadzenia testu.

Światło / ciemność test przejścia dla Myszy

Niniejsza procedura opisuje sposób tworzenia pierwotnych kultur komórek krwiotwórczych z szpiku kostnego myszy, po których następuje transfekcja przy użyciu systemu elektroporacji Gene Pulser MXCell.

Przygotowanie pierwotnych kultur komórek hematopoetycznych z szpiku kostnego myszy do elektroporacji

Demonstracja izolacji rdzenia kręgowego noworodka myszy do badań elektrofizjologicznych.

Elektrofizjologia rdzenia kręgowego

Niniejsza procedura przedstawia sposób wykorzystania systemu do elektroporacji Gene Pulser MXcell w celu szybkiego i łatwego zidentyfikowania optymalnych warunków elektroporacji dla embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) lub innych komórek pierwotnych. W towarzyszącym filmie omówiono również kwestie związane z rozwiązywaniem problemów.

Wykorzystanie systemu elektroporacji Gene Pulser MXcell do wysokowydajnej transfekcji komórek pierwotnych

Poznaj metodę analizy ekspresji allelowo-specyficznej w komórkach heterozygotycznych przy użyciu spektrometrii masowej MALDI-TOF. Technika ta pozwala precyzyjnie mierzyć endogenne poziomy ekspresji genów i badać molekularne mechanizmy asocjacji genetycznych.

Analiza allelo-specyficznej ekspresji genów w celu zbadania funkcjonalnych podstaw powiązań genetycznych

Przeglądaj więcej filmów