Farmakologia behawioralna w klasycznym warunkowaniu odpowiedzi przedłużenia trąbki u pszczół miodnych (Apis mellifera)
24 stycznia 2011
Pokazujemy, jak wdrożyć metodę farmakologii behawioralnej w paradygmacie pożądawczego warunkowania węchowego u pszczół miodnych (Apis mellifera) poprzez systemowe stosowanie leków. Metoda ta pozwala w prosty i wiarygodny sposób badać mechanizmy leżące u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci.
Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci. U pszczół miodnych pierwszym krokiem jest zebranie swobodnie latających pszczół z ula. Następnie pszczoły są zaprzęgane do plastikowych rurek.
Trzecim krokiem zabiegu jest wykonanie klasycznego kondycjonowania. Leki mogą być wstrzykiwane w określonych punktach czasowych związanych z warunkowaniem w celu zbadania ich wpływu na uczenie się i tworzenie pamięci. Ostatnim krokiem procedury jest przetestowanie retencji pamięci.
Ostatecznie, zmiany w zachowaniu po leczeniu farmakologicznym mogą ujawnić mechanizmy molekularne leżące u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci. U pszczół miodnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie doskonalenia i zapamiętywania poprzez odkrycie molekularnych mechanizmów powstawania pamięci.
Ogólnie rzecz biorąc, badacze nowi w tej metodzie będą mieli trudności, ponieważ czas prezentacji bodźców podczas warunkowania i odzyskiwania pamięci musi być dokładny. Kluczowe znaczenie ma również reżim karmienia. Procedura zostanie zademonstrowana przez przekładnię tnącą i Johannesa Faberga dla absolwentów mojego laboratorium W dniu poprzedzającym eksperyment zbieraj pszczoły między godziną 16:00 a 16:00 za pomocą piramidy z pleksi przepuszczającej światło UV.
Po powrocie do laboratorium umieść piramidę na jej podstawie i przyciemnij ściany ręcznikiem, pozostawiając wierzchołek odkryty. Otwórz wierzchołek i przytrzymaj szklaną fiolkę nad otworem, pozwalając pojedynczej pszczole przedostać się do fiolki przed ponownym zamknięciem. Kontynuuj tę procedurę, aż wszystkie pszczoły zostaną przeniesione do szklanej fiolki jesienią i zimą.
Kiedy pszczoły nie latają na zewnątrz, ul jest trzymany w szklarni w sieci, pojedyncze pszczoły są łapane bezpośrednio z sieci. Używając jednej szklanej fiolki na b, unieruchamić pszczołę, schładzając fiolkę na lodzie przez dwie i pół do trzech i pół minuty. Uważnie monitoruj pszczołę i usuń ją z lodu, gdy tylko przestanie się poruszać.
Zaprzęgnij unieruchomioną pszczołę do małej plastikowej rurki z taśmą klejącą. Upewnij się, że pszczoła jest w stanie swobodnie poruszać swoją osis, ale nie głową, klatką piersiową lub nogami. Ważne jest również, aby nie uciskać szyi.
Po przygotowaniu pszczoły. Umieść rurkę w ponumerowanym otworze wiertniczym na stojaku. Dla lepszej obsługi i identyfikacji.
Rury są zawsze zwracane do tego samego odwiertu. Po obróbce nakarm pszczoły między godziną 18:00 a 18:00 w miejscu innym niż miejsce kondycjonowania. Wywołaj reakcję przedłużenia Probos lub PER, dotykając pszczół i czułków.
Z roztworem sacharozy pozwól pszczole spożyć jedną kroplę około czterech mikrolitrów roztworu. Upewnij się, że nie rozmazujesz czułków pszczoły, pro bois ani plastikowej rurki. Nakarm każdą pszczołę, aż przestaną istnieć.
Pokaż szybki i niezawodny PER, gdy ich anteny dotknęły roztworu. W kolejne wieczory eksperymentu nakarm każdą pszczołę cztery razy jedną kroplą roztworu sacharozy. Napełnij plastikową miskę o wysokości około 0,5 do jednego centymetra wodą z kranu.
Umieść stojak z zaprzężonymi pszczołami w misce, używając talerzy lysa jako platformy. Przykryj miskę kartonem i przechowuj w temperaturze pokojowej. Noc. Pszczoły poddawane są kondycjonowaniu węchowemu około godziny 10:00 rano po pobraniu.
30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu. Umieść stojak pszczół uprzęży w pobliżu miejsca kondycjonowania, ale z dala od otworu rury wydechowej, w której pszczoły będą trenowane. Następnie przygotuj bodziec kondycyjny działający w kapturze.
Użyj końcówki filtra, aby odpipetować cztery mikrolitry olejku goździkowego na okrągłą bibułę filtracyjną. Umieść pachnącą bibułę filtracyjną w 20-mililitrowej strzykawce i włóż tłok. Ustaw odtwarzacz audio, który będzie dostarczał sygnał dźwiękowy do eksperymentatora.
Zapewnia to precyzyjny czas bodźca, bodźca początkowego, bodźca offsetowego, czasu trwania i umiejscowienia. Przygotuj się do rejestrowania zachowania pszczoły podczas kondycjonowania. Wynik dodatni jest przyznawany, jeśli pszczoła przedłuża swój SSIS między wystąpieniem bodźca warunkowego a prezentacją bodźca bezwarunkowego.
Przekroczenie wirtualnej linii między otwartymi żuchwami Aby rozpocząć próbę akwizycji, wybierz pszczołę, która ma zostać wyszkolona i umieść ją przed wydechem na 10 sekund. Na krótko przed końcem tego dziesięciosekundowego interwału umieść strzykawkę zawierającą zapach w odległości trzech centymetrów od pszczół i czułków. Przedstaw zapach przez pięć sekund, przepychając 20 mililitrów powietrza przez strzykawkę.
Po trzech sekundach wprowadź bodziec bezwarunkowy, dotykając brzusznej części dystalnej wici obu czułków roztworem sacharozy, wilgotnym i wykałaczką. Uważając, aby nie osadzić roztworu na pszczołach i czułkach, pszczoła może następnie polizać wykałaczkę. Ten złożony bodziec trwa cztery sekundy, po czym pszczoły są usuwane z kontekstu treningowego i umieszczane z powrotem w stojaku.
13 sekund po prezentacji bodźca warunkowego jedna próba treningowa trwa 28 sekund. Zwróć pszczołę na miejsce treningu po 10-minutowej przerwie między próbami. Przeprowadź drugą z trzech prób, jak pokazano wcześniej, i odczekaj dodatkowe 10 minut przed wykonaniem ostatniego parowania.
Po zakończeniu treningu na cały dzień umieść stojaki z powrotem w misce. Pamiętaj, aby karmić każdą pszczołę cztery razy jedną czterolitrową kroplą roztworu sacharozy między godziną czwartą a 18:00 Jak wykazano wcześniej, testy retencji można wykonywać w dowolnym odstępie czasu od minut do kilku dni po treningu. Przygotuj się do testu pamięci, umieszczając stojak z pszczołami w pobliżu miejsca kondycjonowania na 30 minut.
Rozpocznij testowanie, umieszczając pszczołę przed wydechem na 10 sekund. Przedstaw bodziec warunkowy przez pięć sekund i zwróć uwagę na wystąpienie PER. Po zakończeniu testów na dany dzień umieść ruszty z powrotem w misce.
Pamiętaj, aby nakarmić każdą pszczołę cztery razy jedną czterolitrową kroplą roztworu sacharozy między czwartą a 18:00, jak wykazano wcześniej na końcu całego eksperymentu, sprawdź, czy pszczoła nadal jest w stanie przedłużyć swoje trąby, dotykając czułki z roztworem, aby zostać uwzględnionym w analizie, pszczoły muszą przetrwać cały eksperyment i mieć nienaruszony PER. W niektórych badaniach zastrzyki ogólnoustrojowe są stosowane do badania wpływu interwencji farmakologicznych na pamięć węchową. Zastrzyki te mogą być podawane w różnym czasie, w zależności od projektu eksperymentu.
Na początek wykonaj mały otwór w kutykule tylnej części skutera S w pobliżu szczeliny S scootle nad mięśniem lotu, używając jednorazowej igły podskórnej. Następnie napełnij szklaną rurkę kapilarną jednym mikrolitrem testowanego roztworu. Włóż kapilatę do otworu w kutykularzu i wstrzyknij roztwór do mięśnia lotu.
Wyszkoleni eksperymentatorzy są w stanie wstrzykiwać jedną dawkę B co 30 sekund, co pozwala na precyzyjne wyczucie czasu wstrzyknięcia i kondycjonowania. Przedstawiono tutaj dwa eksperymenty. W pierwszym eksperymencie zbadano wpływ ogólnoustrojowego wstrzyknięcia soli fizjologicznej dostarczonego przed treningiem na uczenie się pamięci.
W tym badaniu są trzy grupy: grupa nieotrzymująca leczenia, jednomikrolitrowe ogólnoustrojowe wstrzyknięcie soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub grupa pozorowana. Zabiegi te były wykonywane 30 minut przed treningiem pokazanym tutaj po lewej stronie. Odsetek zwierząt wykazujących reakcję warunkową podczas nabywania wzrósł we wszystkich trzech badaniach treningowych, bez różnic między grupami.
Wykresy słupkowe po prawej stronie pokazują, że ani wstrzyknięcie PBS, ani zmiana pozorowana nie wpłynęły na zachowanie pamięci. 24 godziny po treningu w drugim eksperymencie zastrzyki podawano 40 minut po treningu pszczoły podzielono na jedną grupę otrzymującą sól fizjologiczną, a drugą otrzymującą jeden mikrolitr inhibitora syntezy białek i mycyny ESO, wykresy słupkowe po prawej stronie pokazują wyraźny spadek retencji pamięci u pszczół otrzymujących Anisa mycynę. Wyniki te podkreślają znaczenie syntezy białek w tworzeniu pamięci węchowej.
Po tej procedurze można wykonać zapisy elektrofizjologiczne i elektrofizjologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jaka jest neurofizjologiczna podstawa uczenia się i tworzenia pamięci po jej rozwoju? Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad uczeniem się i pamięcią do zbadania molekularnego i neurofizjologicznego mechanizmu tworzenia pamięci u pszczół miodnych.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę farmakologii behawioralnej u pszczół miodnych (Apis mellifera), służącą do badania uczenia się oraz tworzenia pamięci poprzez podawanie leków. Metoda ta umożliwia rzetelne badanie mechanizmów leżących u podstaw tych procesów poznawczych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Farmakologia behawioralna
- Uczenie się i pamięć
- Warunkowanie węchowe
Wstęp
- Pszczoły miodne służą jako organizm modelowy do badania procesów poznawczych.
- Metoda ta wykorzystuje warunkowanie klasyczne do oceny retencji pamięci.
- Systemiczne podawanie leków może ujawnić molekularne mechanizmy uczenia się.
- Precyzyjny czas podawania bodźców jest kluczowy dla skutecznego warunkowania.
Cel badania
- Zbadanie wpływu środków farmakologicznych na uczenie się i pamięć pszczół miodnych.
- Zapewnienie niezawodnej metodologii dla badaczy w dziedzinie neuronauki behawioralnej.
- Ujawnienie molekularnych mechanizmów uczestniczących w tworzeniu pamięci.
Zastosowane metody
- Zbieranie i ujarzmienie latających pszczół miodnych.
- Warunkowanie klasyczne z wykorzystaniem bodźców zapachowych oraz sacharozy jako bodźca bezwarunkowego.
- Systemiczne podawanie leku w określonych punktach czasowych.
- Testy retencji pamięci przeprowadzone po warunkowaniu.
Główne wyniki
- Wykazano skuteczne warunkowanie i zapamiętywanie u pszczół miodowych.
- Zidentyfikowano wpływ zastosowania leków na zachowania uczenia się.
- Przedstawiono wnioski dotyczące harmonogramu i protokołów karmienia niezbędnych do efektywnego warunkowania.
- Ujawniono potencjalne mechanizmy molekularne leżące u podstaw tworzenia pamięci.
Wnioski
- Metoda ta jest skuteczna w badaniu uczenia się i pamięci u pszczół miodnych.
- Interwencje farmakologiczne mogą pomóc w wyjaśnieniu procesów poznawczych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodologii w celu zgłębienia dalszych zagadnień z zakresu neuronauki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Farmakologia behawioralna z wykorzystaniem klasycznego warunkowania odruchu wyciągania trąbki (PER) u pszczół miodnych umożliwia precyzyjne badanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw uczenia się i pamięci. Podejście to zapewnia solidny, ilościowy system oceny wpływu interwencji farmakologicznych na procesy poznawcze, wspierając wczesną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach i rozwoju (R&D) skoncentrowanych na neurobiologii. Niezawodność i skalowalność tej metody czynią ją wartościową dla translacyjnych potoków badawczych dążących do uzyskania pewności prognostycznej w odniesieniu do celów molekularnych wpływających na formowanie się pamięci.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią weryfikację hipotez molekularnych związanych z uczeniem się i formowaniem pamięci.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez powiązanie interwencji farmakologicznej z wynikami behawioralnymi.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki kontrolowanym, ilościowym testom behawioralnym.
Przesiew i opracowanie analizy
- Zapewnia standaryzowany, powtarzalny test behawioralny do oceny wpływu związków na pamięć.
- Generuje ilościowe wyniki odpowiednie do analizy porównawczej między grupami eksperymentalnymi.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów neurofarmakologicznych procesów przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki behawioralne z interwencjami molekularnymi, wspierając rozwój translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od mechanistycznych badań na etapie odkryć po przedkliniczną walidację celów poznawczych.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne poprzez dostarczanie danych prognostycznych dotyczących molekularnych szlaków związanych z pamięcią.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących interwencji molekularnych w kontrolowanym systemie behawioralnym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków dla celów związanych z pamięcią.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe odczyty behawioralne do oceny związków.
- Analityka: Zapewnia mierzalne punkty końcowe do statystycznego porównania efektów leczenia.
- Badania translacyjne: Łączy studia nad mechanizmami molekularnymi z przedkliniczną walidacją behawioralną.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do różnorodnych badań neurofarmakologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celu oraz zrozumienie mechanistyczne.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i przepustowość w badaniach z zakresu farmakologii behawioralnej.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez powiązanie interwencji molekularnych z wynikami funkcjonalnymi.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów poznawczych i neurofarmakologicznych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie warunkowania behawioralnego oraz precyzyjnego określania czasu podawania bodźców.
- Wymaga specjalistycznego sprzętu do unieruchamiania, podawania leków i oceny behawioralnej.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji protokołów i analizy danych pomiędzy poszczególnymi zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych czynników farmakologicznych i projektów eksperymentalnych w ramach modelu PER.
- Poprawność włączenia danych zależy od przeżycia zwierzęcia oraz zachowania nienaruszonej odpowiedzi behawioralnej.
