Name: Farmakologia behawioralna w klasycznym warunkowaniu odpowiedzi przedłużenia trąbki u pszczół miodnych (Apis mellifera) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Poznaj metodę farmakologii behawioralnej w klasycznym warunkowaniu pszczół miodnych Apis mellifera. Technika ta umożliwia badanie molekularnych mechanizmów uczenia się i formowania pamięci u owadów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została wsparta grantem z niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań (BMBF) w ramach Bernstein Focus: Neuronal Basis of Learning (BFNL) przyznanym D.E. Dziękujemy Randolfowi Menzelowi za cenne uwagi do wcześniejszej wersji manuskryptu.

1. Odławianie pszczół z ula
<ol>
<li>Na jeden dzień przed rozpoczęciem eksperymentu, między godziną 14:00 a 16:00, odławia się pszczoły opuszczające ul. W tym celu przed wylotkiem ula, w odległości 20-30 cm, trzyma się piramidę z pleksiglasu przepuszczającego światło UV (wysokość = 30 cm, wierzchołek 3,5 x 3,5 cm, podstawa 18 x 18 cm), która jest zamykana na górze i na dole, z otwartą podstawą i zamkniętym wierzchołkiem, tak aby pszczoły opuszczające ul wpadały do podstawy piramidy. Następnie zamyka się podstawę, a odłowione pszczoły przenosi do laboratorium w celu dalszych czynności.</li>
</ol>
2. Przenoszenie pszczół z piramidy do szklanych fiolek
<ol>
<li>W laboratorium piramidę ustawia się na podstawie. Ściany piramidy zostają zaciemnione (np. za pomocą ręcznika), natomiast wierzchołek pozostaje odsłonięty. Ze względu na pozytywny fototaksyz pszczoły opuszczą piramidę przez wierzchołek po jego otwarciu. Pszczoły są przenoszone jedna po drugiej z piramidy do szklanych fiolek poprzez trzymanie fiolek nad otwartym wierzchołkiem. Do każdej pszczoły używa się jednej fiolki. Wierzchołek jest zamykany w momencie, gdy jedna pszczoła dostanie się do fiolki.</li>
</ol>
3.	Unieruchamianie pszczół w probówkach
<ol>
<li>Pszczoły unieruchamia się poprzez chłodzenie ich w szklanych fiolkach na lodzie przez 2,5–3,5 min. Zaleca się obserwowanie pszczoły i wyjęcie jej z lodu natychmiast po zaprzestaniu ruchu.</li>
<li>Pojedynczą unieruchomioną pszczołę mocuje się w małej plastikowej rurce za pomocą taśmy klejącej w taki sposób, aby mogła ona swobodnie poruszać trąbką, ale nie głową, tułowiem ani odnóżami. Ważne jest, aby nie uciskać szyi.</li>
<li>Każdą pszczołę utrwaloną w plastikowej rurce umieszcza się w ponumerowanym otworze na stojaku, co ułatwia obsługę i identyfikację. Po wyjęciu rurki w celu kondycjonowania lub odzyskiwania pamięci, należy ją zawsze zwrócić do tego samego otworu.</li>
</ol>
4. Karmienie pszczół
<ol>
<li>Pierwszego wieczoru (godz. 16:00–18:00), po odłowieniu, pszczoły są karmione do sytości roztworem sacharozy (0,88 M, biały rafinowany cukier spożywczy rozpuszczony w wodzie z kranu). Aby nakarmić pszczołę, wywołuje się jej PER poprzez dotknięcie czułków roztworem sacharozy, a zwierzęciu pozwala się spożyć jedną kroplę (4 μL) roztworu sacharozy. Pszczoły są karmione jedna po drugiej wielokrotnie, aż przestaną wykazywać szybką i niezawodną reakcję PER po dotknięciu czułków roztworem sacharozy.</li>
<li>Każdego kolejnego wieczoru (godz. 16:00–18:00) trwania eksperymentu pszczoły są karmione jedna po drugiej czterokrotnie jedną kroplą roztworu sacharozy (4 μL, 0,88 M, biały rafinowany cukier rozpuszczony w wodzie z kranu). Ważne jest, aby podczas karmienia roztwór sacharozy nie został rozmazany na czułkach lub trąbce pszczoły oraz aby probówki nie zostały zanieczyszczone roztworem sacharozy. Pszczół nie należy karmić w miejscu warunkowania ani w jego pobliżu, aby wykluczyć możliwość powiązania kontekstu treningowego ze bodźcem w postaci sacharozy.</li>
</ol>
5. Przechowywanie uprzężonych pszczół przez noc
<ol>
<li>Pszczoły przechowuje się przez noc w plastikowej misce w temperaturze pokojowej. Miska jest napełniona wodą z kranu (na wysokość około 0,5-1 cm). Statywy z przymocowanymi pszczołami umieszcza się w misce ponad poziomem wody, wykorzystując płytki ELISA jako platformę. Na koniec miskę przykrywa się tekturą.</li>
</ol>
6. Warunkowanie węchowe
Pierwszego dnia eksperymentu rano (o godzinie 10:00) przeprowadza się warunkowanie węchowe. Bodźcem warunkowym (CS) jest zapach, a bodźcem bezwarunkowym (US) roztwór sacharozy.
<ol>
<li>4 μL zapachu (np. olejku goździkowego) pipetuje się na okrągły papier filtracyjny (średnica 1,3 cm), który następnie wkłada się do strzykawki 20 mL. Zapach pipetuje się pod dygestorium, używając końcówek z filtrem, aby zapobiec zanieczyszczeniu pipety.</li>
<li>Kasetę z unieruchomionymi pszczołami umieszcza się w pobliżu miejsca warunkowania 30 min przed rozpoczęciem procedury, lecz w odległości od miejsca przed rurą wydechową, gdzie warunkowane są poszczególne pszczoły.</li>
<li>Warunkowanie polega na trzech parach zapachu (bodziec warunkowy, CS) i roztworu sacharozy (bodziec bezwarunkowy, US, 1,25 M) z odstępem między próbami (ITI) wynoszącym 10 min. Sygnał akustyczny przekazywany eksperymentatorowi za pomocą odtwarzacza audio zapewnia precyzyjny czas rozpoczęcia bodźca, zakończenia bodźca, czasu trwania bodźca oraz umieszczania zwierzęcia. Próba nabywania rozpoczyna się od 10 s umieszczenia zwierzęcia przed wylotem. Krótko przed końcem tych 10 s strzykawkę zawierającą zapach umieszcza się 3 cm przed pszczołą, kierując ją w stronę czułków. Następnie zapach prezentuje się przez 5 s, przepychając przez strzykawkę 20 mL powietrza. Po pierwszych 3 s dystalne człony biczikawa obu czułków są dotykane wykałaczką zwilżoną roztworem sacharozy, a zwierzętom pozwala się lizać zwilżoną wykałaczkę przez 4 s. 13 s po zakończeniu stymulacji CS pszczoły są wyjmowane z kontekstu treningowego i umieszczane z powrotem w kasecie. Łącznie jedna próba treningowa trwa 28 s. 
Ważne jest, aby po warunkowaniu ani czułki, ani aparat gębowy pszczoły nie były pokryte sacharozą. Należy zatem upewnić się, że wykałaczka jest jedynie zwilżona roztworem sacharozy i że na wykałaczce nie tworzą się krople roztworu sacharozy.</li>
<li>Po warunkowaniu kasety umieszcza się z powrotem w pojemniku.</li>
<li>Zachowanie zwierząt podczas eksperymentu, tj. wystąpienie PER podczas umieszczania oraz prezentacji CS i US, jest monitorowane i odnotowywane przez eksperymentatora.</li>
</ol>
7.	Utrwalenie pamięci
<ol>
<li>Testy retencji można przeprowadzać w dowolnych odstępach czasu (od minut do dni). Kasetę z pszczołami umieszcza się w pobliżu miejsca warunkowania na 30 min przed rozpoczęciem testu pamięci.</li>
<li>Test pamięci polega na 5-sekundowej prezentacji CS bez prezentacji US. Test rozpoczyna się od 10-sekundowego umieszczenia zwierzęcia przed wylotem. Następnie, zgodnie z powyższym opisem, zapach jest prezentowany przez 5 s. Podczas eksperymentu odnotowuje się zachowanie zwierzęcia, tzn. wystąpienie PER podczas umieszczania oraz prezentacji CS.</li>
<li>Na koniec eksperymentu ponownie wywołuje się odruch wysunięcia trąbki (proboscis extension response) poprzez dotknięcie czułków roztworem sacharozy, aby upewnić się, że zwierzę nadal jest zdolne do wysunięcia trąbki.</li>
</ol>
8. Iniekcja systemiczna
Moment wykonania iniekcji systemowej zależy od projektu eksperymentalnego.
<ol>
<li>Za pomocą jednorazowej igły podskórnej (21 G) wykonuje się mały otwór w kutykuli tylnej części scutum, obok szczeliny scutalnej, powyżej mięśnia lotnego17.</li>
<li>Przy użyciu szklanej kapilary wstrzykuje się 1 μL roztworu przez otwór w kutykuli do mięśnia lotnego. Doświadczeni eksperymentatorzy są w stanie wstrzyknąć preparat jednej pszczoły co 30 sec, co pozwala na precyzyjne określenie czasu iniekcji i warunkowania.</li>
</ol>
9. Karmienie pszczół podczas eksperymentu
<ol>
<li>Wieczorem (między 16:00 a 18:00) po kondycjonowaniu pszczoły są karmione czterokrotnie, jedna po drugiej, 1 kroplą roztworu sacharozy (4 μL, 0,88 M, biały rafinowany cukier rozpuszczony w wodzie z kranu). Ważne jest, aby podczas karmienia roztwór sacharozy nie dostał się na czułki lub aparat gębowy pszczoły oraz aby probówki nie zostały zanieczyszczone roztworem sacharozy. Pszczół nie należy karmić w miejscu kondycjonowania ani w jego pobliżu, aby wykluczyć możliwość powiązania kontekstu treningowego ze bodźcem w postaci sacharozy.</li>
</ol>
10.	Gromadzenie i analiza danych
<ol>
<li>Monitorowane jest wystąpienie reakcji wysunięcia trąbki podczas eksperymentu. Pszczoła jest oceniana jako dodatnia, jeśli wysunie trąbkę między rozpoczęciem CS a prezentacją US (podczas treningu) lub podczas prezentacji CS (podczas fazy testowej), przekraczając wirtualną linię między otwartymi żuwaczkami.</li>
<li>Aby zwierzęta zostały uwzględnione w analizie, muszą spełnić dwa kryteria: muszą przeżyć cały eksperyment oraz wykazać bezwarunkową reakcję wysunięcia trąbki (PER) na roztwór sacharozy na koniec eksperymentu. Procent pszczół wykazujących PER podczas testów nabywania i retencji jest naniesiony na wykres dla każdej prezentacji CS.</li>
</ol>
11. Reprezentatywne wyniki:
W niniejszym opracowaniu przedstawiono dwa eksperymenty.
W pierwszym eksperymencie zbadaliśmy wpływ systemowej iniekcji soli fosforanowo-buforowanej (PBS; w mM: 137 NaCl, 2,7 KCl, 10,1 Na2HPO4, 1,8 KH2PO4, pH 7,2) na uczenie się i formowanie pamięci długotrwałej. Trzy grupy pszczół zostały poddane treningowi składającemu się z trzech parowań CS-US z 10 min odstępem między próbami: grupę niepoddaną działaniu preparatów, grupę, której 30 min przed treningiem wstrzyknięto 1 μL PBS, oraz grupę z iniekcją pozorowaną (sham), traktowaną analogicznie jak grupa z PBS, lecz bez podania roztworu. 24 h po treningu przetestowano pamięć we wszystkich trzech grupach za pomocą jednej prezentacji CS. Procent zwierząt wykazujących reakcję warunkową podczas warunkowania wzrastał istotnie w trakcie trzech prób treningowych (Ryc.1, ANOVA z powtarzanymi pomiarami dla czynnika czasu F2,378=340,456, p &lt; 0,05). Podczas warunkowania nie zaobserwowano różnic w PER pomiędzy trzema grupami (ANOVA z powtarzanymi pomiarami dla czynnika grup F2, 189 = 1,299, p &gt; 0,05). Wynik ten utrzymał się w teście retencji po 24 h (F2, 187 = 0,752, p&gt;0,05) przy porównaniu zwierząt niepoddanych działaniu preparatów ze zwierzętami po iniekcji PBS oraz iniekcji pozorowanej.
W drugim eksperymencie wykazaliśmy hamowanie utrwalania pamięci trzy i cztery dni po treningu, gdy inhibitor syntezy białek anisomycyna (10 mM) została wstrzyknięta systemowo 30 min po trzech sparowaniach CS-US. Porównanie grupy po iniekcji anisomycyny z grupą po iniekcji PBS ujawniło istotną różnicę między grupami podczas testu retencji (Ryc. 2, ANOVA dla pomiarów powtarzanych dla czynnika grupa F1, 94=8,86, p &lt; 0,05). Znaczącą różnicę można zaobserwować podczas testu pamięci w dniu 3. i 4. Wyniki te są zbliżone do rezultatów Wüstenberga et al.18, którzy również warunkowali pszczoły przy użyciu trzech sparowań CS-US, choć z zastosowaniem innego protokołu.
<img src="/files/ftp_upload/2282/2282fig1.jpg" alt="wykres liniowy przedstawiający nabywanie i utrzymywanie pamięci; %PER w funkcji czasu dla różnych grup traktowanych" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Uszkodzenie kutykuli lub wstrzyknięcie PBS nie zmienia procesu nabywania i utrzymywania pamięci. Zwierzęta trenowano za pomocą trzech par CS-US (nabywanie). Po 24 h przetestowano pamięć (utrzymywanie pamięci). Na trzydzieści minut przed treningiem w kutykuli dwóch grup wykonano otwór (lesion, PBS), a jednej z tych grup wstrzyknięto 1 μL PBS (PBS). Trzecią grupę pozostawiono nienaruszoną (brak traktowania). Przedstawiono procent zwierząt w każdej grupie reagujących na prezentację zapachu za pomocą PER. Analiza ANOVA nie wykazała istotnych różnic między grupami w fazie nabywania (F2, 189 = 1,299, p &gt; 0,05) ani w utrzymywaniu pamięci (F2, 187 = 0,752, p &gt; 0,05).
<img src="/files/ftp_upload/2282/2282fig2.jpg" alt="Wykres przedstawiający % PER w fazach nabywania i retencji pamięci, w warunkach PBS i Aniso." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Iniekcja anisomycyny 40 min po ostatnim sparowaniu CS-US zmniejsza retencję pamięci trzy i cztery dni po treningu. Zwierzęta zostały poddane treningowi z trzema sparowaniami CS-US (nabywanie), a następnie otrzymały iniekcję 1 μL 10 mM anisomycyny (Aniso) lub 1 μL PBS 1 h po pierwszej próbie treningowej. Pamięć była testowana (Retencja Pamięci) odpowiednio 24 h, 48 h, 72 h i 96 h później. Przedstawiono procent zwierząt w grupie reagujących na prezentację zapachu odruchem PER. Iniekcja anisomycyny prowadzi do istotnego zmniejszenia retencji pamięci 72 h i 96 h po treningu (F1, 94=8.86, p &lt; 0.05), co wykazano za pomocą analizy ANOVA.

<ol><li>Menzel, R., Giurfa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+architecture+of+a+mini-brain%3A+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cogn+Sci%22%5BJournal%5D)">Cognitive architecture of a mini-brain: the honeybee.</a> Trends Cogn Sci. 5, 62-71 (2001).</li>
<li>Menzel, R., Leboulle, G., Eisenhardt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+brains%2C+bright+minds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Small brains, bright minds.</a> Cell. 124, 237-239 (2006).</li>
<li>Menzel, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMenzel%2C+R+%22Neurobiology+of+comparative+cognition%22">Neurobiology of comparative cognition</a>. Kesner, R. P., Olton, D. S. , Lawrence Erlbaum Associates Publishers. Hillsday, New Jersey, Hove, London. (1990).</li>
<li>Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical-Conditioning+of+Proboscis+Extension+in+Honeybees+%28Apis-Mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Psyc%22%5BJournal%5D)">Classical-Conditioning of Proboscis Extension in Honeybees (Apis-Mellifera).</a> J. Comp. Psyc. 97, 107-119 (1983).</li>
<li>Menzel, R., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+in+honeybees%3A+from+behavior+to+neural+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning and memory in honeybees: from behavior to neural substrates.</a> Annu. Rev. Neurosci. 19, 379-404 (1996).</li>
<li>Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+dynamics+in+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A-Neuroethology+Sensory+Neural+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Memory dynamics in the honeybee.</a> Journal of Comparative Physiology A-Neuroethology Sensory Neural and Behavioral Physiology. 185, 323-340 (1999).</li>
<li>Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Searching+for+the+memory+trace+in+a+mini-brain%2C+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Searching for the memory trace in a mini-brain, the honeybee.</a> Learn. Mem. 8, 53-62 (2001).</li>
<li>Eisenhardt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+formation+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera%29+and+its+dependency+on+the+cAMP-protein+kinase+A+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Biology%22%5BJournal%5D)">Learning and memory formation in the honeybee (Apis mellifera) and its dependency on the cAMP-protein kinase A pathway.</a> Animal Biology. 56, 259-278 (2006).</li>
<li>Hourcade, B., Muenz, T. S., Sandoz, J. C., Rossler, W., Devaud, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+memory+leads+to+synaptic+reorganization+in+the+mushroom+bodies%3A+a+memory+trace+in+the+insect+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-term memory leads to synaptic reorganization in the mushroom bodies: a memory trace in the insect brain.</a> J. Neurosci. 30, 6461-6465 (2010).</li>
<li>Denker, M., Finke, R., Schaupp, F., Grun, S., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+correlates+of+odor+learning+in+the+honeybee+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural correlates of odor learning in the honeybee antennal lobe.</a> Eur. J. Neurosci. 31, 119-133 (2010).</li>
<li>Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+and+non-associative+plasticity+in+kenyon+cells+of+the+honeybee+mushroom+body%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Associative and non-associative plasticity in kenyon cells of the honeybee mushroom body.</a> Front Syst. Neurosci. 2, 3-3 (2008).</li>
<li>Okada, R., Rybak, J., Manz, G., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning-related+plasticity+in+PE1+and+other+mushroom+body-extrinsic+neurons+in+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning-related plasticity in PE1 and other mushroom body-extrinsic neurons in the honeybee brain.</a> J. Neurosci. 27, 11736-11747 (2007).</li>
<li>Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+activation+of+cAMP-dependent+protein+kinase+during+conditioning+induces+long-term+memory+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Prolonged activation of cAMP-dependent protein kinase during conditioning induces long-term memory in honeybees.</a> Neuron. 27, 159-168 (2000).</li>
<li>Locatelli, F., Bundrock, G., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+and+temporal+release+of+glutamate+in+the+mushroom+bodies+improves+olfactory+memory+in+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Focal and temporal release of glutamate in the mushroom bodies improves olfactory memory in Apis mellifera.</a> J. Neurosci. 25, 11614-11618 (2005).</li>
<li>Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+recovery+from+extinction+depends+on+the+reconsolidation+of+the+acquisition+memory+in+an+appetitive+learning+paradigm+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera.</a> J. Neurosci. 25, 4485-4492 (2005).</li>
<li>Stollhoff, N., Eisenhardt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consolidation+of+an+extinction+memory+depends+on+the+unconditioned+stimulus+magnitude+previously+experienced+during+training%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Consolidation of an extinction memory depends on the unconditioned stimulus magnitude previously experienced during training.</a> J. Neurosci. 29, 9644-9650 (2009).</li>
<li>Snodgrass, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSnodgrass%2C+RE+%22Anatomy+of+the+honeybee%22">Anatomy of the honeybee</a>. , Comstock Publishing Associates. New York. (1956).</li>
<li>Wustenberg, D., Gerber, B., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+communication%3A+long-+but+not+medium-term+retention+of+olfactory+memories+in+honeybees+is+impaired+by+actinomycin+D+and+anisomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Short communication: long- but not medium-term retention of olfactory memories in honeybees is impaired by actinomycin D and anisomycin.</a> Eur. J. Neurosci. 10, 2742-2745 (1998).</li>
<li>Vollbehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zur+Orientierung+junger+Honigbienen+bei+ihrem+1%5BTitle%5D)+AND+%22Orientierungsflug.+Zool.+Jb.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Zur Orientierung junger Honigbienen bei ihrem 1.</a> Orientierungsflug. Zool. Jb. Physiol. 79, 33-69 (1975).</li>
<li>Scheiner, R., Erber, J., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactile+learning+and+the+individual+evaluation+of+the+reward+in+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp+Physiol+%5BA%5D%22%5BJournal%5D)">Tactile learning and the individual evaluation of the reward in honey bees (Apis mellifera L.).</a> J. Comp Physiol [A]. 185, 1-10 (1999).</li>
<li>Sanchez, B. rito, G, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+studies+on+tarsal+gustation+in+honeybees%3A+sucrose+responsiveness+and+sucrose-mediated+olfactory+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp+Physiol+A+Neuroethol.+Sens.+Neural+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Behavioral studies on tarsal gustation in honeybees: sucrose responsiveness and sucrose-mediated olfactory conditioning.</a> J. Comp Physiol A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 194, 861-869 (2008).</li>
<li>Menzel, R., Manz, G., Menzel, R., Greggers, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massed+and+spaced+learning+in+honeybees%3A+the+role+of+CS%2C+US%2C+the+intertrial+interval%2C+and+the+test+interval%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Massed and spaced learning in honeybees: the role of CS, US, the intertrial interval, and the test interval.</a> Learn. Mem. , 198-208 (2001).</li>
<li>Friedrich, A., Thomas, U., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+at+different+satiation+levels+reveals+parallel+functions+for+the+cAMP-protein+kinase+A+cascade+in+formation+of+long-term+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning at different satiation levels reveals parallel functions for the cAMP-protein kinase A cascade in formation of long-term memory.</a> J. Neurosci. 24, 4460-4468 (2004).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

<ol>
<li>Odławianie pszczół: Aby zebrać doświadczone pszczoły zbieraczki, odławia się je rano lub po południu, unikając pory, w której młode pszczoły odbywają loty orientacyjne19. Zbieraczki gromadzą albo pyłek, albo nektar. Zaobserwowano różnice między zbieraczkami pyłku a nektaru w zakresie ich reaktywności na cukier oraz zdolności uczenia się20. Aby odłowić wyłącznie zbieraczki nektaru, w pobliżu ula można ustawić sztuczne źródło pokarmu wypełnione roztworem sacharozy i tam zbierać owady. Zbieraczki pyłku powracające do ula można zidentyfikować po koszyczkach pyłkowych na odnóżach tylnych20.</li>
<li>Unieruchamianie i obchodzenie się z pszczołami: Należy unikać przedłużonego chłodzenia pszczół na lodzie, ponieważ może to wpłynąć na ich zdolność uczenia się i przeżywalność do końca eksperymentu. Tarsy należy ostrożnie unieruchomić w probówce, aby uniknąć przypadkowej stymulacji roztworem sacharozy. Jest to istotne, ponieważ wykazano, że pszczoły uczą się poprzez stymulację tarsów roztworem sacharozy3,21.</li>
<li>Warunkowanie węchowe: Liczbę prób warunkowania, odstęp między próbami oraz punkt czasowy testu można zmieniać w zależności od celu badania3,22.</li>
<li>Karmienie: Znane jest, że poziom nasycenia pszczół wpływa na ich efektywność uczenia się i retencję pamięci3,23. Należy to uwzględnić podczas planowania eksperymentów.</li>
<li>Iniekcja: W klatce piersiowej pszczoły miodnej znajdują się worki powietrzne17. Te kluczowe elementy układu oddechowego są niezbędne do przeżycia. Dlatego podczas iniekcji należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić worków powietrznych. Wydostanie się pęcherzyków powietrza świadczy o uszkodzeniu worków powietrznych.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Strzykawka Omnifix 20 ml</td><td>B. Braun Medical</td><td>4616200 V</td><td></td></tr><tr><td>Biały rafinowany cukier spożywczy</td><td>Kaisers Supermarket, Berlin, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olejek goździkowy</td><td>Bombastus, Freital, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multipette plus</td><td>Eppendorf</td><td>4981 000.019</td><td></td></tr><tr><td>Statyw na 30 probówek dla pszczół</td><td>Własny wyrób</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki plastikowe</td><td>Własny wyrób</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piramida z pleksiglasu przepuszczającego światło UV</td><td>Własny wyrób</td><td></td><td>wysokość = 30cm, wierzchołek 3,5 x 3,5cm, podstawa 18x18cm</td></tr><tr><td>Taśma klejąca</td><td>Tesa, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapilary 1-5&amp;mu;l</td><td>Selzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koniec kapilarne 1-5&amp;mu;l</td><td>Selzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny o grubości 0,16-0,2 mm</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 616 lub MN615</td><td>Przycięty do okrągłych fragmentów o średnicy 1,3 cm</td></tr><tr><td>Jednorazowa igła podskórna</td><td>B. Braun Medical</td><td>4657683</td><td>średnica 0,45 mm</td></tr></tbody></table>

farmakologia behawioralna w klasycznym warunkowaniu odruchu wyciągania trąbka u pszczoły miodowej (apis mellifera)

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Pszczoły miodne (Apis mellifera) są znane ze swoich umiejętności komunikacyjnych i orientacyjnych oraz z imponującej zdolności uczenia się1,2. Ponieważ przetrwanie kolonii pszczół zależy od eksploatacji źródeł pożywienia, pszczoły zbieraczki uczą się i zapamiętują zmienne lokalizacje kwiatów, a także ich opłacalność. Pszczoły zbieraczki można łatwo trenować w warunkach naturalnych, gdzie żerują w miejscu karmienia i uczą się powiązanych z nim sygnałów, takich jak zapach lub kolor. Apetytywne uczenie się asocjacyjne można badać również w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych poprzez warunkowanie odruchu wysuwania trąbki (PER) u indywidualnie unieruchomionych pszczół miodnych3,4. Ten paradygmat uczenia się umożliwia badanie mechanizmów neuronalnych i molekularnych leżących u podstaw uczenia się i formowania pamięci w sposób prosty i wysoce niezawodny5-12. Do badania mechanizmów molekularnych stosuje się podejście farmakologii behawioralnej. Leki są wstrzykiwane systemowo, aby zakłócić funkcję konkretnych cząsteczek w trakcie lub po procesie uczenia się i formowania pamięci13-16.
W niniejszym materiale demonstrujemy, jak trenować przywiązane pszczoły miodne w warunkowaniu PER oraz jak podawać leki systemowo poprzez wstrzykiwanie ich do mięśnia latającego pszczoły.

Prezentujemy sposób wdrożenia metody farmakologii behawioralnej w paradygmacie apetycyjnego warunkowania węchowego u pszczół miodnych (Apis mellifera) poprzez systemiczne podawanie leków. Metoda ta pozwala w prosty i niezawodny sposób badać mechanizmy leżące u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci.

Farmakologia behawioralna w klasycznym warunkowaniu odruchu wyciągania trąbka u pszczoły miodowej (Apis mellifera)

Pszczoły miodne (Apis mellifera) są znane ze swoich zdolności komunikacyjnych i orientacyjnych oraz z imponującej zdolności uczenia się1,2. Ponieważ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci. W przypadku pszczół miodnych pierwszym krokiem jest odłowienie latających pszczół z ula. Następnie pszczoły są przymocowywane do plastikowych rurek.Trzecim krokiem procedury jest przeprowadzenie warunkowania klasycznego. Leki mogą być wstrzykiwane w określonych punktach czasowych wokół warunkowania w celu zbadania ich wpływu na proces uczenia się i formowania pamięci. Ostatnim krokiem procedury jest test retencji pamięci.Ostatecznie zmiany w zachowaniu po podaniu leku mogą ujawnić molekularne mechanizmy leżące u podstaw uczenia się i formowania pamięci u pszczół miodnych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie uczenia się i pamięci poprzez odkrycie molekularnych mechanizmów tworzenia pamięci.Generalnie badacze rozpoczynający pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ czas prezentacji bodźców podczas warunkowania orazB przywoływania pamięci musi być precyzyjny. Kluczowy jest również reżim żywieniowy. Procedura zostanie zademonstrowana przez cutting gearing i Johannes faberg studentom studiów magisterskich i doktoranckim z mojego laboratorium. W dniu poprzedzającym eksperyment należy zebrać pszczoły między godziną 14:00 a 16:00, używając pleksiglasowej piramidy przepuszczającej światło UV.Po powrocie do laboratorium ustaw piramidę na podstawie i przesłoń ściany ręcznikiem, pozostawiając wierzchołek odsłonięty. Otwórz wierzchołek i przytrzymaj szklaną fiolkę nad otworem, pozwalając pojedynczej pszczole wlecieć do fiolki, a następnie ponownie ją zamknij. Powtarzaj tę procedurę, aż wszystkie pszczoły zostaną przeniesione do szklanej fiolki jesienią i zimą.Gdy pszczoły nie latają na zewnątrz, ul jest przechowywany w szklarni w siatce; pojedyncze pszczoły są wyłapywane bezpośrednio z siatki. Używając jednej fiolki szklanej na pszczołę, unieruchom pszczołę, chłodząc fiolkę na lodzie przez dwie i pół do trzech i pół minut. Uważnie monitoruj pszczołę i wyjmij ją z lodu natychmiast po zaprzestaniu ruchu.Unieruchom pszczołę w małej plastikowej probówce za pomocą taśmy klejącej. Upewnij się, że pszczoła może swobodnie poruszać odwłokiem, ale nie głową, tułowiem ani odnóżami. Ważne jest również, aby nie uciskać szyi.Po przygotowaniu pszczoły umieść probówkę w ponumerowanym otworze w statywie, aby ułatwić obsługę i identyfikację.Probówki są zawsze zwracane do tego samego otworu w ziemi. Po manipulacji należy karmić pszczoły między godziną 16:00 a 18:00 w miejscu innym niż miejsce kondycjonowania. Wywołaj odruch wysuwania aparatury gębowej (PER), dotykając pszczół i ich czułków.Przy użyciu roztworu sacharozy pozwól pszczole spożyć jedną kroplę roztworu SRA o objętości około 4 µL. Upewnij się, że nie zanieczyścisz czułków, proboscis lub plastikowej rurki pszczoły. Karm każdą pszczołę do momentu, aż przestanie przyjmować pokarm.Wykaż szybki i wiarygodny odruch prostowania proboscis (PER), gdy ich czułki zostaną dotknięte roztworem. W kolejnych wieczorach eksperymentu karm każdą pszczołę cztery razy jedną kroplą roztworu sacharozy. Napełnij plastikową miseczkę o wysokości około 0,5 do 1 cm wodą z kranu.Umieść kasetę z przymocowanymi pszczołami w misce, wykorzystując płytki lysa jako platformę. Przykryj miskę tekturą i przechowuj w temperaturze pokojowej przez noc. Warunkowanie węchowe pszczół odbywa się około godziny 10:00 rano dnia następnego po ich zebraniu.30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu. Umieść statyw z pszczołami w uprzężach w pobliżu miejsca warunkowania, ale z dala od otworu rury wylotowej, w której będą szkolone pszczoły. Następnie, pracując w dygestorium, przygotuj bodziec warunkujący.Za pomocą końcówki z filtrem nanieś 4 µL olejku goździkowego na okrągły papier filtracyjny. Umieść nasączony papier filtracyjny w strzykawce o pojemności 20 mL i włóż tłok. Ustaw odtwarzacz audio, który będzie emitował sygnał akustyczny dla eksperymentatora.Zapewnia to precyzyjny czas podaży bodźca, moment rozpoczęcia bodźca, moment zakończenia bodźca, czas trwania oraz miejsce aplikacji. Przygotuj się do rejestracji zachowania pszczoły podczas całego procesu warunkowania. Wynik pozytywny przyznaje się, jeśli pszczoła wysunie SSIS pomiędzy momentem rozpoczęcia bodźca warunkowego a prezentacją bodźca bezwarunkowego.Przecięcie wirtualnej linii między otwartymi żuwaczkami. Aby rozpocząć próbę nabywania, należy wybrać pszczołę do treningu i umieścić ją przed wylotem przez 10 sekund. Krótko przed końcem tego dziesięciosekundowego odstępu należy umieścić strzykawkę zawierającą zapach w odległości trzech centymetrów od pszczoły i jej czułków. Zapach należy podawać przez pięć sekund, przepychając 20 milliliters powietrza przez strzykawkę.Po trzech sekundach wprowadź bodziec bezwarunkowy, dotykając wilgotnym wykałaczką nasączoną roztworem sacharozy brzusznej części dystalnych flagell obu czułków. Uważając, aby nie nanieść roztworu na pszczoły i ich czułki, należy pozwolić pszczole polizać wykałaczkę. Ten złożony bodziec trwa cztery sekundy, po czym pszczoły są usuwane z kontekstu treningowego i umieszczane z powrotem w stojaku.Jedna próba treningowa trwa 28 sekund, przy czym bodziec warunkowy jest prezentowany w 13 sekundzie. Po odstępie między próbami wynoszącym 10 minut należy zwrócić pszczołę do miejsca treningu. Przeprowadzić drugą z trzech prób w sposób opisany wcześniej, a następnie odczekać kolejne 10 minut przed wykonaniem ostatniego parowania.Po zakończeniu treningu w danym dniu, umieść statywy z powrotem w misce. Pamiętaj, aby karmić każdą pszczołę cztery razy, podając jedną kroplę 4 µL roztworu sacharozy między godziną 16:00 a 18:00. Jak pokazano wcześniej, testy retencji można przeprowadzać w dowolnym odstępie czasu od kilku minut do kilku dni po treningu. Przygotuj test pamięci, umieszczając statyw z pszczołami w pobliżu miejsca warunkowania na 30 minut.Rozpocznij testowanie, umieszczając pszczolę przed wylotem na 10 sekund. Przedstaw bodziec warunkujący przez pięć sekund i odnotuj wystąpienie PER. Po zakończeniu testów w danym dniu umieść statywy z powrotem w misce.Należy pamiętać, aby każdą pszczołę karmić cztery razy, podając jedną kroplę 4 µL roztworu sacharozy między godziną 16:00 a 18:00, zgodnie z wcześniejszą demonstracją; na koniec całego eksperymentu należy zweryfikować, czy pszczoła nadal potrafi wysunąć proboscis, dotykając czułka roztworem SRA, aby mogła zostać uwzględniona w analizie. Pszczoły muszą przeżyć cały eksperyment i posiadać nienaruszoną PER. W niektórych badaniach w celu analizy wpływu interwencji farmakologicznych na pamięć węchową stosuje się iniekcje systemiczne. Iniekcje te mogą być podawane w różnych odstępach czasu, w zależności od projektu eksperymentu.Na początek, za pomocą jednorazowej igły hipodermicznej, wykonaj niewielki otwór w kutykuli tylnej części S scootin w pobliżu szczeliny S scootle powyżej mięśnia lotnego. Następnie napełnij szklaną kapilarę jednym mikrolitrem roztworu do badania. Wprowadź kapilarę do otworu w kutykuli i wstrzyknij roztwór do mięśnia lotnego.Przeszkoleni eksperymentatorzy są w stanie wstrzyknąć jedną dawkę B co 30 sekund, co pozwala na precyzyjne zsynchronizowanie czasu wstrzyknięcia i warunkowania. Przedstawiono tutaj dwa eksperymenty. Pierwszy eksperyment bada wpływ systemicznego wstrzyknięcia soli fizjologicznej przed treningiem na proces uczenia się pamięciowego.W niniejszym badaniu wyodrębniono trzy grupy: grupę A, która nie otrzymała żadnego leczenia, grupę otrzymującą systemową iniekcję 1 µL soli fizjologicznej (PBS) oraz grupę pozorowaną (sham). Preparaty te podano na 30 minut przed treningiem przedstawionym tutaj po lewej stronie. Odsetek zwierząt wykazujących reakcję uwarunkowaną podczas nabywania wzorca wzrastał w ciągu trzech prób treningowych, przy czym nie stwierdzono różnic między grupami.Wykresy słupkowe po prawej stronie pokazują, że ani wtryskiwanie PBS, ani pozorna lekcja nie wpłynęły na zapamiętywanie. W drugim eksperymencie, 24 godziny po treningu, iniekcje podano 40 minut po zakończeniu szkolenia; pszczoły podzielono na grupę otrzymującą sól fizjologiczną oraz grupę otrzymującą 1 µL inhibitora syntezy białek, anisomycyny. Wykresy słupkowe po prawej stronie wykazują wyraźny spadek zapamiętywania u pszczół otrzymujących anisomycynę. Wyniki te podkreślają znaczenie syntezy białek w tworzeniu pamięci węchowej.Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać pomiary elektrofizjologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jakie są neurofizjologiczne podstawy uczenia się i formowania pamięci po ich rozwoju? Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie uczenia się i pamięci do zbadania molekularnych i neurofizjologicznych mechanizmów formowania pamięci u pszczoły miodnej.

behavioural-pharmacology-classical-conditioning-proboscis-extension

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Farmakologia behawioralna w klasycznym uwarunkowaniu reakcji wydłużania trąbki u pszczół miodnych (Apis mellifera)

Pszczoły można poddać warunkowaniu w paradygmacie apetytywnego uczenia się węchowego (warunkowanie PER). Wykorzystując zapachy jako bodźce, opracowaliśmy metodę, w której rejestrowane jest zachowanie, przy jednoczesnym zastosowaniu obrazowania wapniowego w celu pomiaru aktywności wywołanej zapachem w neuronach ciała grzybowatego in vivo.

In vivo obrazowanie Ca2+ neuronów ciał grzybowych podczas uczenia się zapachów u pszczoły miodnej

W tym protokole pokazujemy, jak kondycjonować zaprzęgnięte pszczoły miodne do bodźców dotykowych i wprowadzamy technikę przechwytywania ruchu 2D do analizy kinematyki wzorca próbkowania anteny na małą skalę.

Kondycjonowanie dotykowe i analiza ruchu w strategiach pobierania próbek czułków u pszczół miodnych (Apis mellifera L.)

Protokół warunkowania Proboscis Extension Response (PER), opracowany dla pszczół miodnych (Apis mellifera), dostarcza ekologicznie istotnych i łatwo mierzalnych środków do badania kilku różnych mechanizmów uczenia się u wielu gatunków owadów.

Protokół odpowiedzi na wydłużenie trąby do badania plastyczności behawioralnej u owadów: zastosowanie do badań podstawowych, biomedycznych i rolniczych

Opisano nowy test behawioralny do badania krótkoterminowych reakcji smakowych swobodnie poruszających się trzmieli (Bombus terrestris) na składniki odżywcze i toksyny w roztworze.

Nowatorski test behawioralny do badania reakcji smakowych osobników, swobodnie poruszających się trzmieli (Bombus terrestris)

Ten manuskrypt opisuje kilka protokołów podawania środków farmakologicznych pszczołom miodnym, w tym proste nieinwazyjne metody dla pszczół swobodnie latających, a także bardziej inwazyjne warianty, które pozwalają na precyzyjne, miejscowe leczenie krępowanych pszczół.

Neurofarmakologiczna manipulacja skrępowanych i swobodnie latających pszczół miodnych, Apis mellifera

Ten protokół opisuje kroki korzystania z nowatorskiego oprogramowania, SwarmSight, do śledzenia klatka po klatce pozycji anteny owada i trąbki z konwencjonalnych kamer internetowych przy użyciu konwencjonalnych komputerów. Darmowe oprogramowanie typu open source przetwarza klatki około 120 razy szybciej niż ludzie i działa z dokładnością lepszą niż ludzka.

SwarmSight: Śledzenie w czasie rzeczywistym ruchów anteny owadów i odruchu wysuwania trąbki przy użyciu zwykłego preparatu i konwencjonalnego sprzętu

Prezentujemy protokół klasycznego warunkowania mrówek w okiełznaniu, który pozwala badaczom badać wizualne uczenie się i tworzenie pamięci na poziomie analizy niemożliwym dla swobodnie poruszających się osób.

Wizualne warunkowanie klasyczne u mrówek leśnych

Opisane zostaną zewnątrzkomórkowe rejestracje aktywności neuronalnej z wykorzystaniem sond krzemowych u znieczulonego szczura. Technika ta pozwala na pozyskiwanie informacji z wielu obszarów mózgu od ponad 100 neuronów jednocześnie. Dostarcza ona informacji z rozdzielczością pojedynczych komórek na temat dynamiki zespołów neuronalnych w wielu obwodach lokalnych.

Rejestracja wielkoskalowych zespołów neuronalnych za pomocą sond krzemowych u znieczulonego szczura

Opisano zastosowanie klasycznego behawioralnego paradygmatu warunkowania lękowego w badaniach nad protezami słuchowymi u szczurów. Paradygmat ten umożliwia identyfikację zarówno detekcji, jak i rozróżniania między odmiennymi bodźcami akustycznymi i elektrycznymi, wykorzystując tętno jako miernik wyniku.

Behawioralne określenie dyskryminacji par bodźców słuchowych, akustycznych i elektrycznych z zastosowaniem warunkowania klasycznego i analizy tętna

Test wymuszonego pływania jest uznaną metodą eksperymentalną służącą do oceny potencjalnej skuteczności leków przeciwdepresyjnych u gryzoni. Zwierzęta doświadczalne umieszcza się w zbiorniku z wodą, a następnie kwantyfikuje zachowania ruchowe związane z próbą ucieczki. Opisano powszechnie stosowane procedury dla wersji tego testu wykonywanej na myszach.

Test wymuszonego pływania u myszy

Poznaj metodę farmakologii behawioralnej w klasycznym warunkowaniu pszczół miodnych Apis mellifera. Technika ta umożliwia badanie molekularnych mechanizmów uczenia się i formowania pamięci u owadów.

Farmakologia behawioralna w klasycznym warunkowaniu odruchu wyciągania trąbka u pszczoły miodowej (Apis mellifera)

Przeglądaj więcej filmów