Farmakologia behawioralna w klasycznym warunkowaniu odruchu wyciągania trąbka u pszczoły miodowej (Apis mellifera)
24 stycznia 2011
Prezentujemy sposób wdrożenia metody farmakologii behawioralnej w paradygmacie apetycyjnego warunkowania węchowego u pszczół miodnych (Apis mellifera) poprzez systemiczne podawanie leków. Metoda ta pozwala w prosty i niezawodny sposób badać mechanizmy leżące u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw uczenia się i formowania pamięci. W przypadku pszczół miodnych pierwszym krokiem jest odłowienie latających pszczół z ula. Następnie pszczoły są mocowane do plastikowych rurek.
Trzecim krokiem procedury jest przeprowadzenie warunkowania klasycznego. Leki mogą być wstrzykiwane w określonych punktach czasowych wokół warunkowania, aby zbadać ich wpływ na uczenie się i formowanie pamięci. Ostatnim krokiem procedury jest przetestowanie retencji pamięci.
W ostateczności zmiany w zachowaniu po podaniu leku mogą ujawnić mechanizmy molekularne leżące u podłoża uczenia się i tworzenia pamięci u pszczół miodnych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie uczenia się i pamięci poprzez odkrycie molekularnych mechanizmów formowania pamięci.
Zasadniczo badacze rozpoczynający pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ czas prezentacji bodźców podczas warunkowania i odzyskiwania pamięci musi być precyzyjny. Krytyczny jest również reżim żywieniowy. Procedura zostanie zaprezentowana przez cutting gearing i Johannes faberg studentom studiów doktoranckich z mojego laboratorium. W dniu poprzedzającym eksperyment, pomiędzy godziną 14:00 a 16:00, należy odłowić pszczoły, używając pleksiglasowej piramidy przepuszczającej światło UV.
Po powrocie do laboratorium ustaw piramidę na podstawie i zasłoń ściany ręcznikiem, pozostawiając wierzchołek odsłoniętym. Otwórz wierzchołek i przytrzymaj nad otworem szklaną fiolkę, pozwalając pojedynczej pszczole wlecieć do fiolki przed ponownym zamknięciem. Powtarzaj tę procedurę, aż wszystkie pszczoły zostaną przeniesione do szklanej fiolki jesienią i zimą.
Gdy pszczoły nie latają na zewnątrz, ul utrzymuje się w szklarni w sieci, a poszczególne pszczoły wyłapuje się bezpośrednio z sieci. Używając jednej probówki szklanej na pszczołę, unieruchom pszczołę poprzez chłodzenie probówki na lodzie przez od dwóch i pół do trzech i pół minut. Uważnie monitoruj pszczołę i wyjmij ją z lodu natychmiast po zaprzestaniu ruchów.
Unieruchom pszczołę w małej plastikowej probówce za pomocą taśmy klejącej. Upewnij się, że pszczoła może swobodnie poruszać odwłokiem, ale nie może poruszać głową, tułowiem ani odnóżami. Ważne jest również, aby nie uciskać obszaru szyi.
Po przygotowaniu pszczoły umieść probówkę w ponumerowanym otworze w statywie, aby ułatwić obsługę i identyfikację.
Probówki zawsze umieszcza się w tym samym otworze wiertniczym. Po zakończeniu manipulacji należy karmić pszczoły między godziną 16:00 a 18:00 w miejscu oddzielonym od miejsca kondycjonowania. Reakcję wysunięcia aparatu gębowego (Proboscis extension response, PER) wywołuje się poprzez dotknięcie pszczół oraz ich czułków.
Za pomocą roztworu sacharozy należy podać pszczole jedną kroplę roztworu SRA o objętości około 4 µL. Należy uważać, aby nie pobrudzić czułków, proboscis lub plastikowej rurki pszczoły. Karmić każdą pszczołę do momentu, aż przestaną przyjmować pokarm.
Wykaż szybki i niezawodny PER, gdy antena psa dotknie roztworu. W kolejnych wieczorach eksperymentu karm każdą pszczołę cztery razy jedną kroplą roztworu sacharozy. Napełnij plastikową miseczkę o wysokości około 0,5 do 1 cm wodą z kranu.
Umieść statyw z unieruchomionymi pszczołami w misce, używając płytek Lisa jako platformy. Przykryj miskę tekturą i przechowuj w temperaturze pokojowej przez noc. Pszczoły przechodzą warunkowanie węchowe około godziny 10:00 rano w dniu następującym po ich zebraniu.
30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu. Umieść stojak z pszczołami w uprzężach w pobliżu miejsca warunkowania, ale z dala od wylotu rury wydechowej, w której będą trenowane pszczoły. Następnie, pracując w dygestorium, przygotuj bodziec warunkujący.
Używając końcówki z filtrem, nanieś cztery µL olejku goździkowego na okrągły papier filtracyjny. Umieść nasączony papier filtracyjny w strzykawce o pojemności 20 mL i włóż tłok. Nastaw odtwarzacz audio, który będzie emitował sygnał akustyczny dla eksperymentatora.
Zapewnia to precyzyjny czas podania bodźca, rozpoczęcia bodźca, zakończenia bodźca, czas trwania oraz rozmieszczenie. Należy przygotować się do rejestracji zachowania pszczoły w trakcie warunkowania. Wynik dodatni przyznaje się, jeśli pszczoła wysunie SSIS pomiędzy rozpoczęciem bodźca warunkowego a podaniem bodźca bezwarunkowego.
Przecięcie wirtualnej linii między otwartymi żuwaczkami. Aby rozpocząć próbę pozyskiwania, należy wybrać pszczołę do treningu i umieścić ją przed wyciągiem na 10 sekund. Krótko przed końcem tego dziesięciosekundowego odstępu, należy umieścić strzykawkę z inhibitorem zapachu w odległości trzech centymetrów od pszczoły i jej czułków. Zapach należy prezentować przez pięć sekund, przepychając 20 milliliters powietrza przez strzykawkę.
Po trzech sekundach wprowadź bodziec bezwarunkowy, dotykając wilgotnym wykałaczką z roztworem sacharozy brzusznej części dystalnych flagell obu czułków. Uważając, aby nie nanieść roztworu na ciało pszczoły i jej czułki, należy następnie pozwolić pszczole polizać wykałaczkę. Ten złożony bodziec trwa cztery sekundy, po czym pszczoły są usuwane z kontekstu treningowego i umieszczane z powrotem w statywie.
Po 13 sekundach od prezentacji bodźca warunkowego jedna próba treningowa trwa 28 sekund. Zwróć pszczołę do miejsca treningu po 10-minutowym odstępie między próbami. Przeprowadź drugą z trzech prób w sposób opisany wcześniej i odczekaj kolejne 10 minut przed wykonaniem ostatniego parowania.
Po zakończeniu codziennego treningu należy umieścić statywy z powrotem w misce. Należy pamiętać o karmieniu każdej pszczoły cztery razy, podając jedną kroplę 4 µL roztworu sacharozy między godziną 16:00 a 18:00. Jak pokazano wcześniej, testy retencji można przeprowadzać w dowolnych odstępach czasu, od kilku minut do kilku dni po treningu. W celu przygotowania do testu pamięci należy umieścić statyw z pszczołami w pobliżu miejsca warunkowania na 30 minut.
Rozpocznij testowanie, umieszczając pszczołę przed wylotem przez 10 sekund. Przedstaw bodziec warunkujący przez pięć sekund i odnotuj wystąpienie PER. Po zakończeniu testów w danym dniu umieść stativy z powrotem w misce.
Należy pamiętać o czterokrotnym karmieniu każdej pszczoły jedną kroplą 4 µL roztworu sacharozy między godziną 16:00 a 18:00, zgodnie z wcześniejszą instrukcją; na koniec całego eksperymentu należy sprawdzić, czy pszczoła nadal potrafi wysunąć proboscis, dotykając czułka roztworem SRA, aby uwzględnić ją w analizie. Pszczoły muszą przeżyć cały eksperyment i mieć nienaruszoną PER. W niektórych badaniach stosuje się iniekcje systemiczne w celu zbadania wpływu interwencji farmakologicznych na pamięć węchową. Iniekcje te mogą być podawane w różnych odstępach czasu, w zależności od projektu eksperymentu.
Na początek, za pomocą jednorazowej igły hipodermicznej, wykonaj mały otwór w kutykuli tylnej części S scootin w pobliżu szczeliny S scootle powyżej mięśnia lotnego. Następnie napełnij szklaną kapilarę jednym mikrolitrem roztworu do badania. Wprowadź kapilarę do otworu w kutykuli i wstrzyknij roztwór do mięśnia lotnego.
Przeszkoleni eksperymentatorzy są w stanie wykonać jeden zastrzyk co 30 s, co pozwala na precyzyjne zsynchronizowanie momentu iniekcji i warunkowania. Przedstawiono tutaj dwa eksperymenty. Pierwszy eksperyment bada wpływ systemowej iniekcji soli fizjologicznej podanej przed treningiem na proces zapamiętywania.
W badaniu ujęto trzy grupy: grupę A, która nie otrzymała żadnego leczenia, grupę otrzymującą systemową iniekcję 1 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym oraz grupę pozorowaną. Zabiegi te przeprowadzono na 30 minut przed treningiem, przedstawionym tutaj po lewej stronie. Procent zwierząt wykazujących reakcję warunkową podczas nabywania wzorca wzrastał w ciągu trzech prób treningowych, przy czym nie odnotowano różnic między grupami.
Wykresy słupkowe po prawej stronie pokazują, że ani wstrzyknięcie PBS, ani pozorowana lekcja nie wpłynęły na utrzymanie pamięci. W drugim eksperymencie, 24 godziny po treningu, iniekcje podano 40 minut po treningu; pszczoły podzielono na jedną grupę otrzymującą sól fizjologiczną oraz drugą otrzymującą 1 µL inhibitora syntezy białek, anisomycyny. Wykresy słupkowe po prawej stronie pokazują wyraźny spadek utrzymania pamięci u pszczół otrzymujących anisomycynę. Wyniki te podkreślają znaczenie syntezy białek w tworzeniu pamięci węchowej.
Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać zapisy elektrofizjologiczne w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak: jaka jest neurofizjologiczna podstawa uczenia się i formowania pamięci po ich rozwoju? Technika ta utorowała badaczom z zakresu uczenia się i pamięci drogę do zgłębienia molekularnych i neurofizjologicznych mechanizmów formowania pamięci u pszczoły miodnej.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę farmakologii behawioralnej u pszczół miodnych (Apis mellifera), służącą do badania uczenia się oraz tworzenia pamięci poprzez podawanie leków. Metoda ta umożliwia rzetelne badanie mechanizmów leżących u podstaw tych procesów poznawczych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Farmakologia behawioralna
- Uczenie się i pamięć
- Warunkowanie węchowe
Wstęp
- Pszczoły miodne służą jako organizm modelowy do badania procesów poznawczych.
- Metoda ta wykorzystuje warunkowanie klasyczne do oceny retencji pamięci.
- Systemiczne podawanie leków może ujawnić molekularne mechanizmy uczenia się.
- Precyzyjny czas podawania bodźców jest kluczowy dla skutecznego warunkowania.
Cel badania
- Zbadanie wpływu środków farmakologicznych na uczenie się i pamięć pszczół miodnych.
- Zapewnienie niezawodnej metodologii dla badaczy w dziedzinie neuronauki behawioralnej.
- Ujawnienie molekularnych mechanizmów uczestniczących w tworzeniu pamięci.
Zastosowane metody
- Zbieranie i ujarzmienie latających pszczół miodnych.
- Warunkowanie klasyczne z wykorzystaniem bodźców zapachowych oraz sacharozy jako bodźca bezwarunkowego.
- Systemiczne podawanie leku w określonych punktach czasowych.
- Testy retencji pamięci przeprowadzone po warunkowaniu.
Główne wyniki
- Wykazano skuteczne warunkowanie i zapamiętywanie u pszczół miodowych.
- Zidentyfikowano wpływ zastosowania leków na zachowania uczenia się.
- Przedstawiono wnioski dotyczące harmonogramu i protokołów karmienia niezbędnych do efektywnego warunkowania.
- Ujawniono potencjalne mechanizmy molekularne leżące u podstaw tworzenia pamięci.
Wnioski
- Metoda ta jest skuteczna w badaniu uczenia się i pamięci u pszczół miodnych.
- Interwencje farmakologiczne mogą pomóc w wyjaśnieniu procesów poznawczych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodologii w celu zgłębienia dalszych zagadnień z zakresu neuronauki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Farmakologia behawioralna z wykorzystaniem klasycznego warunkowania odruchu wyciągania trąbki (PER) u pszczół miodnych umożliwia precyzyjne badanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw uczenia się i pamięci. Podejście to zapewnia solidny, ilościowy system oceny wpływu interwencji farmakologicznych na procesy poznawcze, wspierając wczesną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach i rozwoju (R&D) skoncentrowanych na neurobiologii. Niezawodność i skalowalność tej metody czynią ją wartościową dla translacyjnych potoków badawczych dążących do uzyskania pewności prognostycznej w odniesieniu do celów molekularnych wpływających na formowanie się pamięci.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią weryfikację hipotez molekularnych związanych z uczeniem się i formowaniem pamięci.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez powiązanie interwencji farmakologicznej z wynikami behawioralnymi.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki kontrolowanym, ilościowym testom behawioralnym.
Przesiew i opracowanie analizy
- Zapewnia standaryzowany, powtarzalny test behawioralny do oceny wpływu związków na pamięć.
- Generuje ilościowe wyniki odpowiednie do analizy porównawczej między grupami eksperymentalnymi.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów neurofarmakologicznych procesów przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki behawioralne z interwencjami molekularnymi, wspierając rozwój translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od mechanistycznych badań na etapie odkryć po przedkliniczną walidację celów poznawczych.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne poprzez dostarczanie danych prognostycznych dotyczących molekularnych szlaków związanych z pamięcią.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących interwencji molekularnych w kontrolowanym systemie behawioralnym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków dla celów związanych z pamięcią.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe odczyty behawioralne do oceny związków.
- Analityka: Zapewnia mierzalne punkty końcowe do statystycznego porównania efektów leczenia.
- Badania translacyjne: Łączy studia nad mechanizmami molekularnymi z przedkliniczną walidacją behawioralną.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do różnorodnych badań neurofarmakologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celu oraz zrozumienie mechanistyczne.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i przepustowość w badaniach z zakresu farmakologii behawioralnej.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez powiązanie interwencji molekularnych z wynikami funkcjonalnymi.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów poznawczych i neurofarmakologicznych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie warunkowania behawioralnego oraz precyzyjnego określania czasu podawania bodźców.
- Wymaga specjalistycznego sprzętu do unieruchamiania, podawania leków i oceny behawioralnej.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji protokołów i analizy danych pomiędzy poszczególnymi zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych czynników farmakologicznych i projektów eksperymentalnych w ramach modelu PER.
- Poprawność włączenia danych zależy od przeżycia zwierzęcia oraz zachowania nienaruszonej odpowiedzi behawioralnej.
