Krystalizacja białek w krystalografii rentgenowskiej

Ogólnym celem tej procedury jest wyprodukowanie kryształów białkowych do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej. Zademonstrowano trzy różne techniki przesiewania kryształów: metody krystalizacji dyfuzyjnej, w tym kropla wisząca i kropla siedząca, a także metody krystalizacji mikropartii opisano krystalizacji dyfuzyjnej z parą. Studnie są wypełnione środkiem strącającym.

Następnie wysokie stężenie oczyszczonej próbki białka miesza się ze środkiem strącającym. Wymieszaną kroplę zamyka się następnie w studzience zawierającej roztwór strącający. Krystalizacja mikropartii rozpoczyna się od napełnienia studni olejem parafinowym.

Białko jest następnie ładowane do studzienek, a następnie roztwór strącający. Ostatnim krokiem wszystkich metod jest pozostawienie systemu do równowagi i śledzenie wyglądu i wzrostu kryształów w kroplach. Ostatecznie za pomocą tej techniki można uzyskać kryształy, a wzór dyfrakcji białek można określić za pomocą źródła promieniowania rentgenowskiego z odpowiednim detektorem.

Cześć, jestem Sal z laboratorium profesora Yoga Motis na Wydziale Biofizyki Molekularnej i Biochemii na Uniwersytecie Yale. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę krystalizacji oczyszczonego białka. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania strukturalnych podstaw infekcji wirusowej.

Więc zacznijmy i wyhodujmy kilka kryształów. Aby zidentyfikować metodę krystalizacji dla wybranej makrocząsteczki, można przeprowadzić wstępne badania przesiewowe przy użyciu dostępnych na rynku roztworów krystalizacji, które zostały wybrane tak, aby wykorzystać metodę niekompletnej matrycy czynnikowej w warunkach próbnych. Warunki te są wybierane na podstawie znanych i powszechnie udanych warunków krystalizacji makrocząsteczek.

Gdy warunki krystalizacji są znane, można zmontować wąskie sito, które zmienia stężenie strącającego się pH wokół pierwotnego uderzenia. Zwykle warunki krystalizacji stosowane w tych sitach składają się z ataku czynnika strącającego i buforu do ustawiania pH, wszystkie roztwory podstawowe muszą być przefiltrowane przez filtr 0,22 mikrona w celu przeprowadzenia tej demonstracji. Wcześniej zidentyfikowane warunki krystalizacji lizosomu kurczaka stosuje się z chlorkiem sodu jako środkiem strącającym, rozpoczynając procedurę od przygotowania jednomililitrowych roztworów chlorku sodu o różnych stężeniach w 0,1-molowym octanie sodu o różnych pH.

Następnie rozmrażanie próbka białka jest przechowywana w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i trzymana na lodzie. Typowe stężenia białka mieszczą się w zakresie od pięciu do 50 miligramów na mililitr przy wyższych stężeniach, zwykle dając lepsze wyniki. Tutaj stosuje się 50 miligramów na mililitr roztworu lizosomu jaj kurzych w 0,02 molowym octanie sodu o pH 4,9.

Wirować próbkę przez 15 minut w temperaturze 18 000 g i czterech stopniach Celsjusza w celu usunięcia wszelkich częściowo zagregowanych białek lub wytrącić się z etapu rozmrażania. Agregaty te mogą zakłócać wzrost kryształów i sprzyjać dalszej agregacji. Po odwirowaniu.

Określ stężenie białka na podstawie jego absorbancji przy 280 nanometrach za pomocą fotometru widm UV. Stężenie białka można obliczyć na podstawie odczytu absorbancji i współczynnika ekstynkcji białka. Gdy próbka białka jest gotowa, napełnij 24-dołkową tacę do krystalizacji w pozycji siedzącej 500 mikrolitrami roztworu strącającego zgodnie z mapą tacy.

Utwórz silikonowy pierścień smarowy wokół krawędzi każdej studzienki bez idealnego zamykania pierścienia, aby powietrze mogło uciec do studni. Sufit. Wyczyść szkiełko pokrywy sprayem skondensowanego powietrza lub profesjonalną chusteczką, aby uniknąć kurzu, co ułatwi interpretację kropli krystalizacji i wyeliminuje zanieczyszczenia. Następnym krokiem jest odpipetowanie równych objętości próbki białka i roztworu zbiornika na szkiełko podstawowe.

Jednak w ramach procesu optymalizacji można wypróbować różne objętości białka i strącacza przy użyciu większej ilości białka niż wynosi strącacz, co skutkuje stężeniem netto białka w zrównoważonej kropli, co może być pożądane w przypadku próbek białek dute lub w celu spowolnienia zarodkowania lub wzrostu kryształów. Do tej demonstracji dwa mikrolitry po 50 miligramów na mililitr lizozymu w 0,02 molowym octanie sodu. pH cztery jest ładowane na środek szkiełka przykrywkowego, a następnie dwa mikrolitry roztworu krystalizacyjnego.

Podczas pipetowania białka i roztworu ze zbiornika na szkiełko przykrywkowe należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, które często występują, gdy powietrze jest wydmuchiwane z pipety. Delikatnie wymieszaj kroplę, aby zapobiec przedwczesnemu wytrącaniu się białka z powodu lokalnie wysokich stężeń strącających w kropli. Mieszanie jest szczególnie ważne w przypadku lepkich środków strącających, takich jak glikol polietylenowy, za pomocą pęsety. Delikatnie odchyl suwak pokrywy i połóż go na pierścieniu smarowym na górze, dobrze wykonaj to w sposób kierunkowy, aby powietrze mogło uciec ze studni.

W przeciwnym razie powietrze może podnieść suwak pokrywy, zagrażając uszczelnieniu studni. Przejdź do następnej studzienki, aż taca będzie gotowa. Po ustawieniu tacki należy ją sprawdzić wzrokowo, eliminując cząsteczki kurzu i inne zanieczyszczenia, które mogą zmniejszyć fałszywie dodatnią identyfikację kryształów białka.

Użyj arkusza wyników, aby udokumentować eksperyment. Następnie umieść tacę w żądanej temperaturze inkubacji, zwykle między czterema stopniami Celsjusza a temperaturą pokojową. Najbardziej udana temperatura to 20 stopni Celsjusza.

Uważaj, aby obchodzić się z tacą delikatnie i unikać wstrząsów, wibracji lub zmian temperatury podczas przenoszenia lub inkubacji, które mogą zapobiec wzrostowi kryształów lub negatywnie wpłynąć na jakość kryształów. Sprawdzaj tacę pod kątem kryształów następnego dnia, a następnie co kilka dni, zawsze ostrożnie obchodząc się z tacami. Udokumentuj wszelkie wyniki i morfologie upuść w arkuszu punktacji specyficznym dla tacy.

Kryształy zwykle pojawiają się po dwóch do pięciu dniach, chociaż czasami pojawiają się prawie natychmiast lub do kilku miesięcy później. Po zidentyfikowaniu warunków krystalizacji i poznaniu tempa wzrostu kryształów, najlepiej pozostawić tace w spokoju, dopóki kryształy się nie pojawią i nie osiągną co najmniej połowy swojego ostatecznego rozmiaru. Pozostawienie tac w spokoju może zmniejszyć liczbę zdarzeń zarodkowania kryształów, co skutkuje mniejszą liczbą większych kryształów do krystalizacji w pozycji siedzącej, postępuj zgodnie z tą samą procedurą, co w przypadku wiszącej kropli, z wyjątkiem tego, że użyjemy tacki z 24 dołkami, w której nie są wymagane szkiełka pokrywowe.

Zamiast tego studzienka zawiera półkę, na której białko i środek strącający są mieszane pipetą, dwa mikrolitry po 50 miligramów na mililitr roztworu lizozymu na środek półki, unikając wytwarzania pęcherzyków powietrza. Następnie dodaj dwa mikrolitry roztworu strącającego do próbki po ustawieniu tacy. Uszczelnij studnie taśmą optyczną z opadającym spadkiem.

Nie są konieczne żadne prowadnice pokrywy. Kontynuuj inkubację i nacinanie kryształów zgodnie z opisem dla wiszącej kropli. Aby wykonać procedurę mikrowsadową.

Przygotować roztwór krystalizacyjny i białko zgodnie z opisem dla procedury zawieszania kropli. Zaopatrz się w nową tacę na mikrowsad i natrysk powietrzny, aby uniknąć kurzu i innych dużych cząstek w tacy na mikrowsady. Dodaj olej parafinowy do każdej studzienki na głębokość trzech milimetrów.

Następnie usuń nadmiar oleju. Następnie załaduj jeden mikrolitr roztworu białka do wstępnie napełnionej studzienki, upewniając się, że kropla opada na dno studzienki. Następnie załaduj jeden mikrolitr roztworu strącającego do studni.

Upewnij się, że kropla opada na dno studzienki i łączy się z kroplą białka. Przejdź do następnego dołka, aż taca będzie kompletna i kontynuuj inkubację i analizę kryształów, jak opisano tutaj. Typowe wyniki krystalizacji białek.

Pokazane są eksperymenty. Wytrącanie amorficzne występuje, gdy białko i/lub środek strącający są w wysokim stężeniu. I odwrotnie, krople, które są nienasycone, zwykle pozostają czyste.

Separacja faz może wystąpić, jeśli białko lub detergent rozdziela się na inną fazę po zmieszaniu z niektórymi środkami strącającymi w wysokim stężeniu. W optymalnych warunkach kryształy białka powinny tworzyć Arabidopsis csn. Siedem kryształów białka, które uzyskano w glikolu polietylenowym 8 000 i octanie magnezu, ma kształt pręcika.

Pokazane kryształy to również kryształy białka lizosomów, które uzyskano w jednym zębie trzonowym, chlorku sodu i octanu sodu. pH 4,9. Ten film poklatkowy pokazuje, że kryształy lizosomów rosną w duże pryzmaty w ciągu kilku godzin od ustawienia przy użyciu metody wiszącej kropli.

Właśnie pokazaliśmy Ci, jak skonfigurować eksperyment z białkami podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest, aby pracować w środowisku, w którym panuje stała kontrola temperatury i wilgotności, ponieważ wysoka wilgotność pomaga zminimalizować parowanie kropli, spróbuj zastosować technikę, która minimalizuje narażenie kropli na świeże powietrze. Z tego powodu ważne jest, aby działać w dobrze zorganizowanym środowisku pracy.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.