Name: Krystalizacja białek w krystalografii rentgenowskiej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-16T16:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Poznaj metody krystalizacji białek do dyfrakcji rentgenowskiej, w tym dyfuzję par i mikro partię. Techniki te umożliwiają uzyskanie wysokiej jakości kryształów białkowych niezbędnych do badań strukturalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant Burroughs Wellcome Investigator Award przyznany YM oraz stypendium podoktorskie Brown-Coxe Postdoctoral Fellowship przyznane MD przez Uniwersytet Yale.

Materiały:
<ul>
<li>Próbka białka – lyzozym (50 mg/ mL)</li>
<li>Płytka 24-dołkowa do metody wiszącej kropli</li>
<li>Płytka 24-dołkowa do metody siedzącej kropli</li>
<li>Płytka 96-dołkowa do krystalizacji metodą microbatch</li>
<li>Roztwory krystalizacyjne (dostępne komercyjnie lub przygotowane samodzielnie)</li>
<li>Smar silikonowy</li>
<li>Strzykawka 5 mL bez końcówki Luer-lock</li>
<li>Silikonizowane szkiełka nakrywkowe</li>
<li>Optyczna taśma uszczelniająca</li>
<li>Parafina</li>
<li>Mikropipeta 0,1-2 μL z końcówkami o niskiej retencji</li>
<li>Pęseta</li>
<li>Chusteczki specjalistyczne</li>
</ul>
1. Procedura kropli wiszącej/siedzącej:
<ol>
<li>Do wstępnego przesiewu można wykorzystać dostępne komercyjnie zestawy przesiewowe oparte na metodzie rzadkiej macierzy niepełnego planu czynnikowego dla warunków próbnych. Metoda rzadkiej macierzy niepełnego planu czynnikowego jest oparta na znanych warunkach krystalizacji makrocząsteczek i jest z nich wybierana (Carter and Carter, 1979; Cudney et al., 1994; Jancarik and Kim, 1991; Jancarik et al., 1991). Jeśli warunki krystalizacji są już znane, można przygotować wąski zestaw przesiewowy, zmieniając stężenie czynnika wytrącającego i pH wokół pierwotnie uzyskanego wyniku. Najskuteczniejszym i najczęściej stosowanym czynnikiem wytrącającym jest glikol polietylenowy (PEG), a następnie siarczan amonu. Te dwa czynniki odpowiadają za około 60% wszystkich zarejestrowanych czynników wytrącających makrocząsteczek stosowanych w krystalizacji (Gilliland et al., 1994; Kimber et al., 2003; Page et al., 2003).</li>
<li>Przygotować roztwory do krystalizacji. Zazwyczaj warunki te stanowią kombinację czynnika wytrącającego, odpowiedniej soli oraz buforu ustalającego pH. W niektórych przypadkach do konkretnego białka mogą zostać dodane specjalne dodatki. Wszystkie roztwory stokowe należy przefiltrować przez filtr 0,22 μm. Niektóre roztwory stokowe mogą być bardzo lepkie (np. 50% PEGs, glicerol, PEG-MME).
<ul>
<li>Przygotować po 1,5 mL roztworów NaCl o stężeniach 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6 M, każdy w 0,1 M NaOAc o pH 4,0, 4,3, 4,6 oraz 4,9 (łącznie 24 roztwory)</li>
</ul></li>
<li>Odmrozić próbkę białka i przechowywać na lodzie. Stokowe roztwory białek należy przechowywać w temperaturze -80°C, chyba że badane białko jest wrażliwe na cykle zamrażania i rozmrażania (w takim przypadku przechowywać w 4°C). Typowe stężenia białek mieszczą się w zakresie 5-50 mg/ mL, przy czym wyższe stężenia zazwyczaj dają lepsze wyniki.</li>
<li>Wirować próbkę przez 15 min przy 18 000×g w 4°C – niektóre białka mają tendencję do częściowej agregacji i wytrącania się po rozmrożeniu. Agregaty te mogą promować amorficzne wytrącanie pozostałych cząsteczek białka, dlatego dokładne wirowanie zapewni obecność w próbce wyłącznie cząsteczek rozpuszczalnych. Białko przechowywać na lodzie do momentu przygotowania płytki.</li>
<li>Wyznaczyć stężenie białka na podstawie jego absorbancji przy 280 nm za pomocą spektrofotometru UV. Stężenie białka można obliczyć z odczytu absorbancji i współczynnika ekstynkcji białka. Współczynnik ekstynkcji można obliczyć za pomocą narzędzia ProtParam na stronie internetowej Expasy: <a href="http://ca.expasy.org/tools/protparam.html">http://ca.expasy.org/tools/protparam.html</a></li>
<li>Napełnić dołki 24-dołkowej płytki do metody kropli wiszącej/siedzącej 500 μL roztworu czynnika wytrącającego zgodnie ze schematem ustawienia płytki (Rysunek 2B). Utworzyć pierścień z smaru silikonowego wokół krawędzi dołka. Pierścień powinien mieć małą przerwę, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia powietrza podczas uszczelniania dołka. W metodzie kropli siedzącej smar nie jest potrzebny, ponieważ dołek uszczelnia się taśmą (Rysunek 2A).</li>
<li>Wziąć szkiełko nakrywkowe i oczyścić je sprężonym powietrzem lub profesjonalną chusteczką – unikanie kurzu ułatwi interpretację kropli krystalizacyjnej i wyeliminuje zanieczyszczenia. W metodzie kropli siedzącej szkiełka nakrywkowe nie są stosowane. Zamiast tego dołek zawiera półkę, na której miesza się białko z czynnikiem wytrącającym.</li>
<li>Nanieść równe objętości próbki białka i roztworu z rezerwuaru na szkiełko nakrywkowe. W ramach procesu optymalizacji można wypróbować różne objętości białka i czynnika wytrącającego. Zastosowanie większej ilości białka niż czynnika wytrącającego prowadzi do zwiększenia stężenia białka w kropli po osiągnięciu stanu równowagi, co może być pożądane w przypadku rozcieńczonych próbek białek oraz w celu spowolnienia nukleacji lub wzrostu kryształów. Każda inna substancja nieletna w roztworze kropli zostanie również skoncentrowana przez ten sam czynnik. Podczas pipetowania białka i roztworów z rezerwuaru na szkiełko nakrywkowe należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza. Dzieje się to często, gdy powietrze jest wydmuchiwane z pipety.
<ul>
<li>Kropla wisząca: Nanieść 2 μL lizozymu o stężeniu 50 mg/ mL w 0,02 M NaOAc pH 4,9 na środek szkiełka nakrywkowego i dodać do niego 2 μL roztworu z rezerwuaru.</li>
<li>Kropla siedząca: Nanieść 2 μL roztworu lizozymu o stężeniu 50 mg/ mL na środek półki i dodać do niego 2 μL roztworu z rezerwuaru.</li>
</ul></li>
<li>Ostrożnie obrócić szkiełko nakrywkowe i położyć je na pierścieniu ze smaru na górze dołka. Delikatnie docisnąć, aby powietrze mogło uciec z dołka przez wycięcie w smarze, co zapobiegnie wzrostowi ciśnienia powietrza w dołku i zapewni szczelność. Wzrost ciśnienia powietrza w dołku może unieść szkiełko nakrywkowe, naruszając uszczelnienie. W metodzie kropli siedzącej do uszczelnienia dołków stosuje się optycznie przejrzystą taśmę przezroczystą. Zatem w tej metodzie uszczelnianie odbywa się dla każdego rzędu/kolumny.</li>
<li>Przejść do następnego dołka, aż cała płytka zostanie przygotowana.</li>
<li>Sprawdzić płytkę po przygotowaniu – wyeliminowanie cząsteczek kurzu i innych zanieczyszczeń może zmniejszyć liczbę wyników fałszywie dodatnich przy identyfikacji kryształów białka.</li>
<li>Użyć arkusza ocen do dokumentowania eksperymentu.</li>
<li>Umieścić płytkę w pożądanej temperaturze inkubacji, zazwyczaj między 4°C a temperaturą pokojową. Najczęściej skuteczną temperaturą jest 20°C. Należy obchodzić się z płytką delikatnie i unikać wszelkich wstrząsów. Zachować ostrożność podczas otwierania i zamykania drzwi inkubatora. Wibracje lub zmiany temperatury podczas przenoszenia lub inkubacji mogą zapobiec wzrostowi kryształów lub negatywnie wpłynąć na ich jakość. Jako wyściółkę pod płytkami do kryształów można zastosować materiał amortyzujący (np. piankę opakowaniową).</li>
<li>Sprawdzić obecność kryształów na płytce następnego dnia, a następnie co kilka dni, zawsze obchodząc się z płytkami ostrożnie. Dokumentować wszelkie znaleziska i morfologię kropli w arkuszu ocen dedykowanym dla danej płytki. Kryształy zazwyczaj pojawiają się w ciągu 2-5 dni, choć sporadycznie mogą pojawić się znacznie szybciej (niemal natychmiast) lub później (nawet po kilku miesiącach!). Po zidentyfikowaniu warunków krystalizacji i poznaniu szybkości wzrostu kryształów najlepiej pozostawić płytki w spokoju, aż kryształy pojawią się i urosną do co najmniej połowy ich końcowej wielkości. Pozostawienie płytek w spokoju może zmniejszyć liczbę zdarzeń nukleacji kryształów, co prowadzi do powstania mniejszej liczby większych kryształów.</li>
</ol>
2. Procedura mikrobatchowa:
<ol>
<li>Przygotowanie próbki białka i czynnika wytrącającego odbywa się zgodnie z powyższym opisem.</li>
<li>Nową tackę do metody mikrobatch należy oczyścić za pomocą sprężonego powietrza, aby uniknąć zanieczyszczenia kurzem i innymi dużymi cząstkami.</li>
<li>Wypełnić tackę do metody mikrobatch olejem parafinowym do wysokości 3 mm (tyle, aby zakryć dołki). Usunąć nadmiar oleju.</li>
<li>Do dołka wypełnionego olejem nanieść 1 μL roztworu białka (lizozym 50 mg/ mL) – należy pipetować roztwór bezpośrednio na dno dołka (Rycina 2A).</li>
<li>Do dołka nanieść 1 μL roztworu czynnika wytrącającego zgodnie ze schematem rozmieszczenia na tacce (Rycina 2B) – należy upewnić się, że kropla opadnie na dno dołka i połączy się z kroplą białka.</li>
<li>Powtarzać czynność dla kolejnych dołków, aż cała tacka zostanie wypełniona.</li>
<li>Postępować zgodnie z krokami 11–14 procedury dla kropli wiszącej/siedzącej.</li>
</ol>

<ol><li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergfors%2C+TM+%22Protein+crystallization+%3A+techniques%2C+strategies%2C+and+tips+%3A+a+laboratory+manual%22">Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual</a>. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).</li>
<li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallization+using+incomplete+factorial+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li>
<li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li>
<li>Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification+and+crystallization+of+a+PCI+domain+from+the+COP9+signalosome+subunit+7+%28CSN7%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7).</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).</li>
<li>Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Macromolecule+Crystallization+Database%2C+Version+3.0%3A+new+features%2C+data+and+the+NASA+archive+for+protein+crystal+growth+data%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).</li>
<li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sparse+matrix+sampling%3A+a+screening+method+for+crystallization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Cryst%22%5BJournal%5D)">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).</li>
<li>Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+study+of+the+ligand-binding+domain+of+the+bacterial+chemotaxis-mediating+aspartate+receptor+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium.</a> J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).</li>
<li>Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+mining+crystallization+databases%3A+knowledge-based+approaches+to+optimize+protein+crystal+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens.</a> Proteins. 51, 562-568 (2003).</li>
<li>Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+growth+of+proteins%2C+nucleic+acids%2C+and+viruses+in+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels.</a> Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcPherson%2C+A+%22Crystallization+of+biological+macromolecules%22">Crystallization of biological macromolecules</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li>
<li>Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+crystallization+strategy+for+structural+genomics%3A+an+optimized+two-tiered+crystallization+screen+against+the+Thermotoga+maritima+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym artykule opisujemy i prezentujemy ogólne, aktualne protokoły krystalizacji białek. Ponieważ jest to procedura wieloetapowa, należy wziąć pod uwagę kilka istotnych kwestii. Przy pracy z bardzo małymi objętościami (0.5-2 μL) głównym problemem jest wysychanie kropli na skutek odparowania. Dlatego zaleca się pracę w dobrze kontrolowanym środowisku (przy niskim przepływie powietrza, wysokiej wilgotności i ścisłej kontroli temperatury) oraz stosowanie techniki minimalizującej ekspozycję kropli na otwarte powietrze...

<table><tbody><tr><td>Lizozym</td><td></td><td>Sigma-aldrich</td><td>L6876-1G</td></tr><tr><td>Płytka VDX 24-dołkowa</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-142</td></tr><tr><td>Płytka Cryschem 24-dołkowa</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-158</td></tr><tr><td>Smar próżniowy Dow Corning</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-510</td></tr><tr><td>Sylikonizowane szklane kółka przykrywkowe</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-231</td></tr><tr><td>100% olej parafinowy</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-411</td></tr><tr><td>Przezroczysta taśma uszczelniająca Crystal Clear o szerokości 1,88 cala</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-511</td></tr><tr><td>Płytka Imp@ct 96-dołkowa (płytka do mikrobatchingu)</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-098</td></tr></tbody></table>

krystalizacja białek do krystalografii rentgenowskiej

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Wykorzystanie trójwymiarowej struktury makrocząsteczek biologicznych do wnioskowania o tym, jak one funkcjonują, jest jedną z najważniejszych dziedzin współczesnej biologii. Dostępność struktur o rozdzielczości atomowej zapewnia głębokie i unikalne zrozumienie funkcji białek oraz pomaga odkryć wewnętrzne mechanizmy działania żywej komórki. Do tej pory 86% wpisów w Protein Data Bank (rcsb-PDB) stanowią struktury makrocząsteczkowe, które zostały wyznaczone przy użyciu krystalografii rentgenowskiej.
Aby uzyskać kryształy odpowiednie do badań krystalograficznych, makrocząsteczka (np. białko, kwas nukleinowy, kompleks białko-białko lub kompleks białko-kwas nukleinowy) musi zostać oczyszczona do stanu homogenności lub jak najbliżej stanu homogenności. Homogenność preparatu jest kluczowym czynnikiem w uzyskiwaniu kryształów dyfrakcyjnych o wysokiej rozdzielczości (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Krystalizacja wymaga doprowadzenia makrocząsteczki do stanu nasycenia nadmiernego. Próbka powinna zatem zostać skoncentrowana do najwyższego możliwego stężenia, które nie spowoduje agregacji lub precypitacji makrocząsteczki (zazwyczaj 2-50 mg/mL). Wprowadzenie próbki do czynnika wytrącającego może promować nukleację kryształów białka w roztworze, co może prowadzić do wzrostu dużych kryształów trójwymiarowych z roztworu. Istnieją dwie główne techniki pozyskiwania kryształów: dyfuzja par oraz krystalizacja okresowa (metoda batch). W dyfuzji par kropla zawierająca mieszaninę roztworów czynnika wytrącającego i białka jest zamknięta w komorze z czystym czynnikiem wytrącającym. Para wodna dyfunduje następnie z kropli, aż osmolarity kropli i czynnika wytrącającego się wyrównają (Rysunek 1A). Dehydratacja kropli powoduje powolną koncentrację zarówno białka, jak i czynnika wytrącającego, aż do osiągnięcia stanu równowagi, idealnie w strefie nukleacji kryształów na diagramie fazowym. Metoda batch polega na bezpośrednim wprowadzeniu białka do strefy nukleacji poprzez zmieszanie białka z odpowiednią ilością czynnika wytrącającego (Rysunek 1B). Metodę tę wykonuje się zazwyczaj pod mieszaniną parafiny i oleju mineralnego, aby zapobiec dyfuzji wody z kropli.
W niniejszym materiale zaprezentujemy dwa rodzaje układów eksperymentalnych do dyfuzji pary – metodę wiszącej kropli oraz metodę siedzącej kropli, a także krystalizację metodą wsadową pod warstwą oleju.

Krystalizacja jest zazwyczaj określana jako wąskie gardło krystalografii rentgenowskiej. Przesiewowy screening warunków wytrącania w układzie macierzy rzadkiej z niepełnym schematem czynnikowym zazwyczaj prowadzi do powstania wielu różnych rodzajów agregacji i wytrącania białek, spośród których powstają duże monokryształy. Jeśli stężenie białka lub czynnika wytrącającego jest zbyt wysokie, można zaobserwować brunatną materię o nieokreślonym kształcie i rozmiarze (wytrącanie amorficzne). Gdy roztwór jest niedonasycony, kr...

Struktura trójwymiarowa cząsteczki pozwala na unikalne zrozumienie sposobu jej funkcjonowania. Główną metodą wyznaczania struktury w rozdzielczości bliskiej atomowej jest krystalografia rentgenowska. W niniejszym materiale prezentujemy aktualne metody otrzymywania kryształów trójwymiarowych dowolnej makrocząsteczki, które nadają się do wyznaczenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja białek do krystalografii rentgenowskiej

Wykorzystanie trójwymiarowej struktury makrocząsteczek biologicznych do wnioskowania o ich funkcjach jest jedną z najważniejszych dziedzin współczesnej biologii. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie kryształów białek do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej. Przedstawiono trzy różne techniki przesiewania kryształów; opisano metody krystalizacji przez dyfuzję par, w tym metodę wiszącej kropli i siedzącej kropli, a także metody krystalizacji mikroprzepływowej (micro batch) dla krystalizacji przez dyfuzję par. Do studni wprowadza się czynnik wytrącający.Następnie próbkę oczyszczonego białka o wysokim stężeniu miesza się z czynnikiem wytrącającym. Pomieszaną kroplę zamyka się w studzience zawierającej roztwór precypitantu. Krystalizacja metodą mikro-batch rozpoczyna się od wypełnienia studzienki olejem parafinowym.Następnie białko jest naniesione do studni, a po nim roztwór wytrącający. Ostatnim etapem wszystkich metod jest doprowadzenie systemu do stanu równowagi oraz obserwacja pojawienia się i wzrostu kryształów wewnątrz kropel. Ostatecznie za pomocą tej techniki można uzyskać kryształy i wyznaczyć dyfraktogram białka, wykorzystując źródło promieni rentgenowskich z odpowiednim detektorem.Cześć, jestem Sal z laboratorium profesora Yogi Motisa z Departamentu Biofizyki Molekularnej i Biochemii na Uniwersytecie Yale. Dzisiaj przedstawimy procedurę krystalizacji oczyszczonego białka. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania strukturalnych podstaw infekcji wirusowych.Zacznijmy zatem od hodowli kryształów. Aby zidentyfikować metodę krystalizacji dla wybranej makrocząsteczki, wstępne badania przesiewowe można przeprowadzić przy użyciu dostępnych komercyjnie roztworów krystalizacyjnych, dobranych tak, aby wykorzystać metodę rzadkiej macierzy niepełnego planu czynnikowego w doborze warunków próbnych. Warunki te są wybierane na podstawie znanych i powszechnie skutecznych parametrów krystalizacji dla makrocząsteczek.Po ustaleniu warunków krystalizacji można przygotować wąski screening, zmieniając stężenie czynnika wytrącającego oraz pH w obrębie pierwotnie otrzymanego wyniku. Zazwyczaj warunki krystalizacji stosowane w takich screeningach składają się z czynnika wytrącającego oraz buforu ustalającego pH; na potrzeby niniejszego pokazu wszystkie roztwory stokowe muszą zostać przefiltrowane przez filtr 0,22 mikrona. W procedurze wykorzystuje się wcześniej zidentyfikowane warunki krystalizacji dla lizosomów kurzych, stosując chlorek sodu jako czynnik wytrącający; należy rozpocząć od przygotowania jednofilarowych roztworów chlorku sodu o różnych stężeniach w 0,1 molarnej octanie sodu o różnych wartościach pH.Następnie rozmrozić próbkę białka przechowywaną w temperaturze -80 °C i trzymać ją w lodzie. Typowe stężenia białek mieszczą się w zakresie od 5 do 50 mg/mL, przy czym wyższe stężenia zazwyczaj dają lepsze wyniki. W niniejszym doświadczeniu zastosowano roztwór lizozymu z jaja kurzego o stężeniu 50 mg/mL w 0,02 M octanie sodu o pH 4,9.Wirować próbkę przez 15 minut przy 18 000 G i temperaturze czterech stopni Celsius, aby usunąć wszelkie częściowo zagregowane białka lub osad powstały podczas etapu rozmrażania. Agregaty te mogą zakłócać wzrost kryształów i sprzyjać dalszej agregacji. Po odwirowaniu.Wyznacz stężenie białka na podstawie jego absorbancji przy 280 nanometrach za pomocą spektrofotometru UV. Stężenie białka można obliczyć z odczytu absorbancji oraz współczynnika ekstynkcji białka. Po przygotowaniu próbki białka, wypełnij 24-dołkową taczkę do krystalizacji metodą wiszącej kropli 500 µL roztworu precypitantu zgodnie z mapą tacek.Wytwórz pierścień z smaru silikonowego wokół krawędzi każdej studni, nie zamykając go całkowicie, aby powietrze mogło uciekać z wnętrza studni. Oczyść szkiełko nakrywki za pomocą sprayu ze sprężonym powietrzem lub profesjonalnej ściereczki przeciwstatycznej, aby uniknąć kurzu, co ułatwi interpretację kropel krystalizacyjnych i wyeliminuje zanieczyszczenia. Kolejnym krokiem jest pipetowanie równych objętości próbki białka oraz roztworu z rezerwuaru na szkiełko nakrywki.Można jednak przetestować różne objętości białka i precypitantu w ramach procesu optymalizacji; zastosowanie większej ilości białka niż precypitantu prowadzi do uzyskania określonego stężenia białka w zrównoważonej kropli, co może być pożądane w przypadku rzadkich próbek białka lub w celu spowolnienia nukleacji bądź wzrostu kryształów. W tej demonstracji na środku szkiełka nakrywkowe nanosi się 2 µL lizozymu o stężeniu 50 mg/mL w 0,02 M octanie sodu o pH 4, a następnie dodaje 2 µL roztworu krystalizacyjnego.Podczas pipetowania białka i roztworu z rezerwuaru na szkiełko nakrywkowe należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, co często zdarza się podczas wydmuchiwania powietrza z pipety. Należy delikatnie wymieszać kroplę, aby zapobiec przedwczesnemu wytrącaniu białka wynikającemu z lokalnie wysokich stężeń czynnika wytrącającego w kropli; mieszanie jest szczególnie istotne w przypadku lepkich czynników wytrcających, takich jak glikol polietylenowy, i powinno być wykonywane za pomocą pęsety. Delikatnie odwróć szkiełko nakrywkowe i połóż je na pierścieniu z smaru na górze dołka; wykonaj tę czynność kierunkowo, aby powietrze mogło wydostać się z dołka.W przeciwnym razie powietrze może unieść szkiełko nakrywkowe, naruszając szczelność dołka. Przejdź do następnego dołka, aż cała tacka zostanie przygotowana. Po ustawieniu tacki przeprowadź jej inspekcję wizualną, usuwając cząsteczki kurzu i inne zanieczyszczenia, które mogą prowadzić do fałszywie dodatniej identyfikacji kryształów białka.Użyj arkusza ocen do dokumentowania eksperymentu. Następnie umieść tacę w pożądanej temperaturze inkubacji, zazwyczaj między 4 °C a temperaturą pokojową. Najskuteczniejszą temperaturą jest 20 °C.Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z tacką i unikać wstrząsów, wibracji lub zmian temperatury podczas przenoszenia bądź inkubacji, ponieważ mogą one zapobiec wzrostowi kryształów lub negatywnie wpłynąć na ich jakość. Należy sprawdzać obecność kryształów w tace następnego dnia, a następnie co kilka dni, zawsze obchodząc się z tackami z należytą starannością. Wszelkie obserwacje oraz morfologię kropel należy odnotować w dedykowanym arkuszu ocen dla danej tacy.Kryształy zazwyczaj pojawiają się od dwóch do pięciu dni, choć sporadycznie mogą pojawić się niemal natychmiast lub nawet po kilku miesiącach. Po zidentyfikowaniu warunków krystalizacji i poznaniu szybkości wzrostu kryształów, najlepiej pozostawić tacki niezakłócone, aż kryształy pojawią się i urosną do przynajmniej połowy ich końcowego rozmiaru. Pozostawienie tacek w spokoju może ograniczyć liczbę zdarzeń nukleacji kryształów, co skutkuje powstaniem mniejszej liczby większych kryształów. W przypadku krystalizacji metodą siedzącej kropli stosuje się tę samą procedurę co w metodzie wiszącej kropli, z wyjątkiem zastosowania tacki do siedzącej kropli z 24 dołkami, w której nie są wymagane szkiełka nakrywki.Zamiast tego, dołka zawiera półkę, na której białko i czynnik wytrącający są mieszane pipetą; nanieś 2 µL roztworu lysozymu o stężeniu 50 mg/mL na środek półki, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Następnie, po przygotowaniu tacki, dodaj 2 µL roztworu czynnika wytracającego do próbki. Zamknij dołki taśmą optyczną w metodzie siedzącej kropli.Szkiełka nakrywowe nie są wymagane. Kontynuuj inkubację i ocenę kryształów zgodnie z opisem dla metody wiszącej kropli. Aby przeprowadzić procedurę mikrobatch.Przygotować roztwór do krystalizacji oraz białko zgodnie z opisem dla procedury wiszącej kropli. Pobrać nową tackę do metody mikrobatch oraz użyć sprężonego powietrza, aby uniknąć zanieczyszczenia tacki kurzem i innymi dużymi cząstkami. Do każdego dołka wlać olej parafinowy do głębokości 3 mm.Następnie należy usunąć nadmiar oleju. Potem do wypełnionej wcześniej studni należy nanieść 1 µL roztworu białka, upewniając się, że kropla opadnie na dno studni. Następnie do studni należy nanieść 1 µL roztworu precypitantu.Należy upewnić się, że kropla opadnie na dno studzienki i połączy się z kropelką białka. Przejdź do następnej studzienki, aż wypełnisz cały wsad, a następnie kontynuuj inkubację i analizę kryształów zgodnie z opisem. Typowe wyniki krystalizacji białek.Przedstawiono wyniki doświadczeń. Wytrącanie amorficzne zachodzi, gdy białko i/lub czynnik wytrącający występują w wysokim stężeniu. Z kolei krople nienasycone zazwyczaj pozostają klarowne.Rozdzielenie faz może wystąpić, jeśli białko lub detergent oddzielą się do innej fazy po zmieszaniu z określonymi precypitantami przy wysokim stężeniu. W optymalnych warunkach powinny powstać kryształy białka Arabidopsis csn. Siedem kryształów białka uzyskanych w glikolu polietylenowym 8, 000 i octanie magnezu ma kształt pręcikowy.Przedstawione kryształy to również kryształy białek lizosomalnych, które otrzymano w roztworze jednego molowego chlorku sodu i octanu sodu o pH 4.9. Ten film poklatkowy demonstruje, że kryształy lizosomalne wyrastają w duże pryzmaty w ciągu kilku godzin od przygotowania próbek z zastosowaniem metody wiszącej kropli.Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować eksperyment z białkami podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest, aby pracować w środowisku ze stabilną kontrolą temperatury i wilgotności, ponieważ wysoka wilgotność pomaga zminimalizować odparowywanie kropli; należy starać się stosować technikę, która ogranicza ekspozycję kropli na powietrze. Z tego powodu niezbędne jest działanie w dobrze zorganizowanym środowisku pracy.To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

protein-crystallization-for-x-ray-crystallography

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Krystalizacja białka do krystalografii rentgenowskiej

Zautomatyzowane systemy i protokoły do rutynowego przygotowania dużej liczby ekranów i nanolitrowych kropelek krystalizacji do eksperymentów dyfuzji par są opisane i omówione.

Zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół wytwarzania mikroprzepływowych chipów opracowanych do krystalizacji białek na chipie metodą dializy i eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Proces mikroprodukcji umożliwia zintegrowanie półprzepuszczalnej membrany do dializy z regenerowanej celulozy z dowolnym odcięciem masy cząsteczkowej między dwiema warstwami chipa.

Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

Badania strukturalne biomakromolekuł za pomocą krystalografii wymagają kryształów wysokiej jakości. W tym miejscu demonstrujemy protokół, który może być używany przez OptiCrys (w pełni zautomatyzowane urządzenie opracowane w naszym laboratorium) i/lub przyciski do mikrodializy do hodowli dużych, wysokiej jakości kryształów w oparciu o znajomość schematu faz krystalizacji.

Optymalizacja wzrostu kryształów w ultramolekularnej krystalografii neutronów

Ten wkład opisuje, jak skonfigurować krystalizację białek na urządzeniach typu kryształ na krysztale oraz jak przeprowadzić automatyczne szeregowe zbieranie danych w temperaturze pokojowej za pomocą platformy krystalizacji na chipie.

Krystalizacja na chipie i dyfrakcja szeregowa na dużą skalę w temperaturze pokojowej

Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

Ten protokół szczegółowo opisuje wysokoprzepustowe badanie przesiewowe krystalizacji, począwszy od przygotowania 1 536 mikropróbek do końca 6-tygodniowego okna eksperymentalnego. Znajdują się tam szczegółowe informacje na temat konfiguracji próbki, uzyskanego obrazowania oraz sposobu, w jaki użytkownicy mogą wykonywać analizy za pomocą graficznego interfejsu użytkownika opartego na sztucznej inteligencji, aby szybko i skutecznie zidentyfikować warunki krystalizacji makromolekularnej.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w celu uzyskania trafień kryształów do krystalografii białek

Ten protokół opisuje konfigurację do krystalizacji transportera steroli ABCG5/G8. ABCG5/G8 jest odtwarzany w postaci wodoroceli w celu krystalizacji w kropli wiszącej. Protokół nie wymaga specjalistycznych materiałów ani podłoży, dzięki czemu jest dostępny i łatwy do adaptacji w każdym laboratorium w celu określenia struktury białka za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja ABCG5/G8 w lipidowym środowisku bicelle do krystalografii rentgenowskiej

Prezentujemy protokół krystalizacji białek za pomocą urządzenia do krystalizacji w Kompleksie Badawczym w Harwell i późniejsze zbieranie danych krystalograficznych in situ w promieniowaniu rentgenowskim in situ z kryształów wewnątrz płytek na linii badawczej Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi). Opisujemy wymagania dotyczące próbek, protokoły krystalizacji i wytyczne dotyczące zbierania danych.

Gromadzenie danych o krystalizacji i temperaturze pokojowej in situ przy użyciu urządzenia do krystalizacji w Harwell i linii badawczej VMXi, diamentowego źródła światła

Wykorzystaliśmy synchrotronową tomografię rentgenowską w Europejskiej Instalacji Promieniowania Synchrotronowego (ESRF), aby nieinwazyjnie uzyskać trójwymiarowe zbiory danych tomograficznych o rozdzielczości piksela 0.7µm. Dzięki zastosowaniu oprogramowania do renderowania objętościowego możliwe jest zrekonstruowanie struktur wewnętrznych w ich stanie naturalnym, bez artefaktów powstających podczas sekcjonowania histologicznego.

Nieinwazyjna wizualizacja 3D z rozdzielczością submikronową z wykorzystaniem synchrotronowej tomografii rentgenowskiej

Poznaj metody krystalizacji białek do dyfrakcji rentgenowskiej, w tym dyfuzję par i mikro partię. Techniki te umożliwiają uzyskanie wysokiej jakości kryształów białkowych niezbędnych do badań strukturalnych.

Krystalizacja białek do krystalografii rentgenowskiej

Przeglądaj więcej filmów