Name: 96-dołkowa metoda mikromiareczkowa oparta na płytkach do monitorowania powstawania i badania wrażliwości przeciwgrzybiczej biofilmów Candida albicans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Naucz się formowania biofilmów Candida albicans w płytkach 96-dołkowych i oceny wrażliwości przeciwgrzybiczej metodą kolorymetryczną. Ta technika jest prosta, tania i wysoko powtarzalna.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace laboratoryjne związane z biofilmem są finansowane z grantów o numerach R21DE017294 oraz R21AI080930 przyznanych przez National Institute of Dental &amp; Craniofacial Research oraz National Institute for Allergy and Infectious Diseases (dla J.L.L.-R.). Treść publikacji jest wyłącznie odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie odzwierciedla oficjalne stanowisko NIDCR, NIAID lub NIH.

1. Przygotowanie C. albicans
C. albicans jest mikroorganizmem z grupy ryzyka 1/BSL1. Pamiętaj o zawsze stosowaniu właściwych technik aseptyki i sterylności podczas pracy z tym mikroorganizmem oraz o przestrzeganiu procedur instytucjonalnych dotyczących prawidłowej utylizacji materiałów biologicznie niebezpiecznych.
<ol>
	<li>Przygotuj nocną hodowlę C. albicans w płynnej pożywce YPD (drożdżowej peptone-dekstrozie) poprzez zaszczepienie pojedynczej kolonii C. albicans do 25 ml pożywki YPD.</li>
	<li>Inkubować hodowlę w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną (ok. 180 obr./min) w temperaturze 30 °C przez noc. Większość C. albicans szczepy będą rosły jako komórki drożdżowe w tych warunkach.</li>
	<li>Odwiruj hodowle nocne (ok. 3000 obr./min, 5–10 minut), przemyj komórki dwukrotnie sterylnym PBS i resuspenduj końcowy osad w około 20–25 ml pożywki RPMI 1640 buforowanej kwasem morfolinopropanosulfonowym w stężeniu 165 mM do pH 7,0 i uprzednio ogrzanej do 37 °C (od tej pory pożywka ta określana jest po prostu jako „RPMI 1640”). </li>
	<li>Policz komórki przy użyciu hemacytometru. Po policzeniu przygotuj zawiesinę komórek o końcowym zagęszczeniu 1,0 x 106 komórek/ml w pośrodku RPMI 1640. Uwaga: Ze względu na tendencję komórek do agregacji, ważne jest intensywne mieszanie w wirówce (vortexowanie) pomiędzy kolejnymi etapami płukania oraz przed pipetowaniem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej do formowania biofilmu
<ol>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 μL zawiesiny C. albicans do wybranych dołków płytki mikrotytrującej 96-dołkowej. Nie dodawaj komórek do dołków w kolumnie 12, ponieważ będą one służyć jako kontrole negatywne.</li>
	<li>Przykryj całą płytkę mikrotytrującą oryginalną pokrywką, uszczelnij parafilmem, umieść w inkubatorze i inkubuj przez 24 h w temperaturze 37 °C. Czas inkubacji można dostosować do konkretnego planu eksperymentalnego. Na przykład możliwe jest badanie kinetyki tworzenia biofilmu w okresie od 24 do 48 godzin poprzez zaszczepienie wielu płytek i przetwarzanie każdej z nich w różnych punktach czasowych (np. 2, 4, 8, 12, 24 i 48 h).</li>
	<li>Po uformowaniu biofilmu, za pomocą pipety wielokanałowej ostrożnie odessij medium, aby nie dotknąć i nie naruszyć biofilmów, które utworzyły się w każdym z dołków.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej przemyj płytki trzy razy w sterylnym PBS (200 μL na dołek). Alternatywnie można użyć automatycznej myjki do płytek mikrotytrujących. Pomiędzy myciami, a zwłaszcza po ostatnim płukaniu, osusz płytki w pozycji odwróconej, przykładając ręczniki papierowe, aby usunąć resztki PBS. Na tym etapie biofilmy uformowane na dnie dołków powinny być wyraźnie widoczne nawet gołym okiem i mogą być również wizualizowane za pomocą mikroskopu odwróconego (Rysunek 1). Biofilmy są teraz gotowe do analizy w testach wrażliwości na środki przeciwgrzybicze. (Jeśli głównym celem eksperymentu jest ocena stopnia tworzenia biofilmu, płytki są gotowe do przetworzenia metodą kolorymetryczną. W tym celu można dodać odczynnik XTT/menadion (patrz Krok 3 poniżej) i odczytać powstałe zabarwienie za pomocą czytnika płytek mikrotytrujących).</li>
</ol>
3. Badanie wrażliwości biofilmów na środki przeciwgrzybicze
<ol>
	<li> Z roztworów zapasowych lub proszku przygotować roztwór roboczy każdego badanego leku przeciwgrzybiczego w podłożu RPMI 1640. Typowe wysokie stężenia to 1,024 μg/ mL dla flukonazolu oraz 16 μg/ mL dla amfoterycyny B i kaspofunginy. W przypadku innych czynników można zastosować inne stężenia.</li>
	<li> Używając pipety wielokanałowej, dodać 200 μL wysokiego stężenia roboczego leku przeciwgrzybiczego do odpowiednich studzienek w kolumnie 1 każdej płytki mikrotytrowej zawierającej biofilmy grzybów. </li>
	<li> Dodać 100 μL RPMI 1640 do każdej studzienki w kolumnach od 2 do 10. </li>
	<li> Dodać 100 μL RPMI 1640 do studzienek w kolumnie 11. </li>
	<li> Pobrać 100 μL leku przeciwgrzybiczego ze studzienek w kolumnie 1 i przenieść do sąsiednich studzienek w kolumnie 2 (zawierających już 100 μL podłoża). </li>
	<li> Dobrze wymieszać zawartość poprzez pipetowanie w górę i w dół w celu wykonania seryjnego rozcieńczenia dwukrotnego, a następnie zdjąć końcówki. </li>
	<li> Powtarzać czynność, przesuwając się w prawo aż do studzienek w kolumnie 10, po czym odrzucić końcowe 100 μL objętości ze studzienek w kolumnie 10 po wymieszaniu. W ten sposób stworzono serię rozcieńczeń dwukrotnych badanych czynników; od najwyższego stężenia w studzienkach kolumny 1 do najniższego w studzienkach kolumny 10. Biofilmy niepoddane działaniu leków w kolumnie 11 będą służyć jako kontrole dodatnie, a puste studzienki w kolumnie 12 jako kontrole ujemne. </li>
	<li> Przykryć płytki pokrywkami, uszczelnić parafilmem i inkubować przez 24 -48 h w temperaturze 37 °C.</li>
	<li> Po okresie inkubacji przemyć płytki zgodnie z Krokiem 2.4 (3 x PBS).</li>
	<li> Używając pipety wielokanałowej, dodać 100 μL roztworu XTT/menadion do każdej studzienki zawierającej uprzednio przemyty biofilm, a także do studzienek kontroli ujemnej w celu pomiaru tła kolorymetrycznego XTT.
	<ol>
		<li> XTT przygotowuje się jako roztwór nasycony o stężeniu 0,5 g/L w sterylnym mleczanie Ringera, PBS lub soli fizjologicznej, który należy wysterylizować przez filtr o rozmiarze oczek 0,22 μm. Roztwór XTT jest światłoczuły, dlatego podczas przygotowania powinien być osłonięty folią aluminiową. Po przygotowaniu i sterylizacji filtracyjnej rozdzielić na alikwoty o objętości roboczej 10 mL i przechowywać w temperaturze -70 °C. Probówki chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej. Odmrażać tylko tyle probówek, ile jest potrzebnych do konkretnego eksperymentu, bezpośrednio przed użyciem.</li>
		<li> Menadion przygotowuje się jako roztwór zapasowy 10 mM w 100% acetonie, rozdzielony na mniejsze objętości (około 50 μL) i przechowywany w temperaturze -70 °C. Roztwór XTT/menadion przygotować bezpośrednio przed użyciem, dodając 1 μL roztworu zapasowego menadionu do probówki zawierającej 10 mL odmrożonego roztworu XTT.</li>
	</ol>
 </li>
	<li> Przykryć płytki folią aluminiową i inkubować w ciemności przez 2 h w temperaturze 37 °C. </li>
	<li> Odkryć płytki. Używając pipety wielokanałowej, pobrać 80 μL powstałego barwnego supernatantu z każdej studzienki i przenieść do odpowiednich studzienek nowej płytki mikrotytrowej. </li>
	<li> Odczytać wartości z płytki(ek) w czytniku płytek mikrotytrowych przy 490 nm. </li>
	<li> Obliczyć osiadłe minimalne stężenia hamujące SMIC50 i SMIC80, czyli stężenia leków przeciwgrzybiczych, przy których odnotowano spadek odczytów kolorymetrycznych o 50% lub 80% w porównaniu do biofilmów kontrolnych utworzonych bez leku przeciwgrzybiczego (w tym przypadku wartości dla kolumny 11, pamiętając o odjęciu wartości z kontroli ujemnych ze studzienek w kolumnie 12 zawierających tylko XTT). Wyniki SMIC można przedstawić w formie tabeli (np. wiele izolatów przeciwko wielu lekom przeciwgrzybiczym) lub alternatywnie wyniki dla każdego pojedynczego izolatu grzyba przeciwko każdemu lekowi przeciwgrzybiczemu można przedstawić na wykresie, naniesionym jako procent inhibicji w funkcji stężenia leku przeciwgrzybiczego.</li>
</ol>
Przykład: Po odjęciu wartości z kontroli negatywnej, średnia gęstość optyczna (O.D.) biofilmu kontrolnego utworzonego w kolumnie 11 wynosi 1,32. SMIC50 to najniższe stężenie środka przeciwgrzybiczego prowadzące do &gt; 50% redukcji odczytów kolorymetrycznych, w tym przypadku wartość poniżej 1,32 x 50/100 = 0,66. Analogicznie, SMIC80 to najniższe stężenie środka przeciwgrzybiczego prowadzące do &gt; 80% redukcji odczytów kolorymetrycznych, w tym przypadku wartość poniżej 1,32 x 20/100 = 0,264.
4. Reprezentatywne wyniki
Rycina 1 przedstawia mikrofotografię biofilmu C. albicans uformowanego na dnie studzienki w 96-dołkowej płytce mikrotiterowej, wykonaną przy użyciu mikroskopu odwróconego. Rycina 2 przedstawia odczyty kolorymetryczne XTT (wartości OD490) dla każdego z 11 biofilmów szczepu dzikiego C. albicans, uformowanych w każdym z 8 różnych rzędów tej samej 96-dołkowej płytki mikrotiterowej. Rycina 3 przedstawia aktywność amfoterycyny B w różnych stężeniach przeciwko biofilmom C. albicans; strzałki wskazują wartości SMIC50 i SMIC80.
<img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig1.jpg" alt="Porównanie wzrostu bakterii; obrazy z mikroskopu i SEM; badanie morfologii komórek; widoczne paski skali." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1.(A) Panel A przedstawia mikrofotografię wykonaną za pomocą kamery przymocowanej do mikroskopu odwróconego, obrazującą biofilm C. albicans utworzony na dnie studzienki po aspiracji podłoża RPMI i następnych płukaniach za pomocą PBS. (B) Mikrografia typowego biofilmu C. albicans wizualizowana za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Paski skali dla paneli A i B wynoszą odpowiednio 100 μm i 10 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig2.jpg" alt="Wyniki testu XTT; wykres analizy kolorymetrycznej przedstawiający odczyty próbek, dane porównawcze." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Formowanie wielu równoważnych biofilmu C. albicans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych. Odczyty kolorymetryczne (wartości OD490) z testów redukcji XTT biofilmu utworzonego przez szczep dziki C. albicans w dołkach płytek mikrotitracyjnych. Wartości dotyczą 11 niezależnych biofilmu utworzonych w każdym z 8 różnych rzędów tej samej 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej. Wyniki dla różnych rzędów porównano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji, stosując test Bartletta dla jednorodności wariancji oraz post-hoc test wielokrotnych porównań Bonferroniego. Nie odnotowano statystycznie istotnych różnic przy porównywaniu wszystkich par rzędów między sobą (P &gt; 0,05).
<img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig3.jpg" alt="Wykres podatności przeciwgrzybiczej, test XTT, odpowiedź na dawkę amfoterycyny B, wartości SMIC50/80." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Typowe wyniki testów podatności przeciwgrzybiczej względem biofilmów C. albicans. Wykres przedstawiający typowe wyniki skuteczności różnych stężeń amfoterycyny B przeciwko biofilmom szczepu dzikiego C. albicans. Wartości wyrażono jako średni procent odczytów kolorymetrycznych dla testów redukcji XTT w porównaniu do dołków kontrolnych. Wartości SMIC50 i SMIC80 zostały zaznaczone strzałkami.

<ol><li>Bachmann, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activity+of+caspofungin+against+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).</li>
<li>Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+2%2C3-bis%282-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl%29-5-%5B%28phenylamino%29carbonyl%5D-2H-t+etrazolium+hydroxide+%28XTT%29+colorimetric+method+with+the+standardized+National+Committee+for+Clinical+Laboratory+Standards+method+of+testing+clinical+yeast+isolates+for+susceptibility+to+antifungal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents.</a> J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).</li>
<li>Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uses+and+limitations+of+the+XTT+assay+in+studies+of+Candida+growth+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism.</a> J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).</li>
<li>Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+susceptibility+of+Candida+biofilms%3A+Unique+efficacy+of+amphotericin+B+lipid+formulations+and+echinocandins%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).</li>
<li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p%3A+a+regulator+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biol%22%5BJournal%5D)">C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation.</a> Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).</li>
<li>Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+biofilms%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Candida biofilms: an update.</a> Eukaryot Cell. 4, 633-638 (2005).</li>
<li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li>
<li>Bachmann, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+combinations+against+Candida+albicans+biofilms+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).</li>
<li>Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pharmacodynamic+properties+of+three+antifungal+agents+against+preformed+Candida+albicans+biofilms+determined+by+time-kill+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).</li>
<li>Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Iberoam.+Micol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li>
<li>Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+endpoint+determination+system+for+antifungal+susceptibility+testing+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).</li>
<li>Nett, J., Andes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilm+development%2C+modeling+a+host-pathogen+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction.</a> Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).</li>
</ol>

JLL-R posiada udziały w MicrobeHTS Technologies, Inc., która opracowuje środki przeciwgrzybicze. Firma MicrobeHTS Technologies, Inc. nie zapewniła wsparcia finansowego dla tych badań.

W niniejszej pracy opisujemy prosty, szybki, ekonomiczny i wysoce powtarzalny model z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki mikrotytrycyjnej do hodowli biofilmu Candida, połączony z metodą kolorymetryczną XTT służącą do pomiaru aktywności metabolicznej komórek wewnątrz biofilmu. Ten model 96-dołkowej płytki mikrotytrycyjnej do tworzenia biofilmu został pierwotnie opracowany dla C. albicans, lecz może być stosowany w przypadku innych gatunków Candida spp. oraz łatwo adaptowany do innych organizmów g...

<table><tbody><tr><td>Agar Sabouraud-dekstrozowy</td><td>BD Biosciences</td><td>211584</td><td>Przygotowanie płytek do świeżych pasażowań izolatów grzybów</td></tr><tr><td>YPD: Pożywka drożdżowa peptonowo-dekstrozowa</td><td>US Biological</td><td>Y2076</td><td>Pożywka do namnażania nocnych kultur w cieczy</td></tr><tr><td>RPMI-1640 bez wodorowęglanu sodu z dodatkiem L-glutaminy</td><td>Cellgro</td><td>50-020-PB</td><td>Pożywka płynna do formowania biofilmu</td></tr><tr><td>Kwas morfolinopropanosulfonowy (MOPS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td>Buforowanie medium RPMI 1640</td></tr><tr><td>bufor fosforanowo-solny, PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Bufor do płukania</td></tr><tr><td>sól sodowa XTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4251</td><td>Instrukcje przygotowania znajdują się powyżej</td></tr><tr><td>roztwór Ringera&amp;rsquo;mleczan w surowicy</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC0409-7953-09</td><td>Do przygotowania roztworu XTT</td></tr><tr><td>Menadion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5625</td><td>Ostrzeżenie: substancja niebezpieczna w przypadku kontaktu ze skórą, inhalacji lub połknięcia</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>stożkowe probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>probówki do wirowania o pojemności 50 ml z dnem stożkowym</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki mikrotitracyjne: Polistyrenowe, z płaskim dnem, traktowane do hodowli tkankowych</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa i końcówki</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek mikrotitracyjnych</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metoda z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki mikrotytrującej do monitorowania tworzenia się i badania wrażliwości przeciwgrzybiczej biofilmów candida albicans

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans pozostaje najczęstszą przyczyną infekcji grzybiczych w rosnącej populacji pacjentów z obniżoną odpornością, a kandydoza jest obecnie trzecią najczęstszą infekcją w szpitalach w USA. Różne postaci kandydozy są związane z tworzeniem biofilmu, zarówno na tkankach gospodarza, jak i/lub na urządzeniach medycznych (np. cewnikach). Tworzenie biofilmu niesie ze sobą negatywne skutki kliniczne, ponieważ komórki wewnątrz biofilmu są chronione przed odpowiedzią immunologiczną gospodarza oraz przed działaniem leków przeciwgrzybiczych. Opracowaliśmy prosty, szybki i niezawodny model in vitro tworzenia biofilmów C. albicans z wykorzystaniem mikropłytek 96-dołkowych, który może być również stosowany do testowania wrażliwości biofilmów na leki przeciwgrzybicze. Odczyt tego testu jest kolorymetryczny i opiera się na redukcji XTT (soli tetrazoliowej) przez metabolicznie czynne komórki grzybów w biofilmie. Typowy eksperyment trwa około 24 h w fazie tworzenia biofilmu, z dodatkowymi 24 h na badanie wrażliwości na leki przeciwgrzybicze. Ze względu na prostotę oraz wykorzystanie powszechnie dostępnych materiałów i sprzętu laboratoryjnego, technika ta upowszechnia badania nad biofilmami i stanowi ważny krok w stronę standaryzacji testów wrażliwości biofilmów grzybiczych na leki przeciwgrzybicze.

Opisujemy prostą, szybką i niezawodną metodę tworzenia biofilmów Candida albicans z wykorzystaniem 96-dołkowych płytek mikrotytacyjnych oraz jej przydatność w badaniu wrażliwości komórek wewnątrz biofilmów na środki przeciwgrzybicze.

Metoda z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki mikrotytrującej do monitorowania tworzenia się i badania wrażliwości przeciwgrzybiczej biofilmów Candida albicans

Candida albicans pozostaje najczęstszą przyczyną grzybic w rosnącej populacji pacjentów z niedoborami odporności, a kandydoza jest obecnie trzecią...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest utworzenie biofilmów candida albicans oraz zbadanie ich podatności na środki przeciwgrzybicze. Cel ten osiąga się poprzez uprzednie wytworzenie grzybiczych biofilmów w dołkach 96-dołkowych płytek mikrotitracyjnych, a następnie dodanie środków przeciwgrzybiczych do uformowanych biofilmów i inkubację przez 24 do 48 godzin po tym etapie.W celu ustalenia minimalnego stężenia hamującego (MIC) środków przeciwgrzybiczych wobec biofilmu stosowana jest kolorymetryczna metoda pomiaru aktywności metabolicznej komórek w obrębie biofilmu. W rezultacie, dzięki zastosowaniu prostej i łatwej metody opartej na 96-dołkowej płytce mikrotitracyjnej połączonej z odczytem kolorymetrycznym, można uzyskać wyniki obrazujące zdolność do tworzenia biofilmu oraz przeprowadzić testy wrażliwości na środki przeciwgrzybicze. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota, relatywnie niski koszt, wysoka powtarzalność oraz możliwość wytworzenia wielu równoważnych biofilmów.Ponadto metoda ta jest kompatybilna z technologią platformy 96-dołkowej, powszechnie dostępną w większości laboratoriów badawczych i klinicznych. Zastosowania tej techniki obejmują terapię psowatych, ponieważ infekcje te bardzo często wiążą się z tworzeniem biofilmu.Stosując odpowiednie techniki mikrobiologiczne, pobierz pętlą pełną ilość komórek ze świeżej subkultury albicans na płytce z agarem SAU dextrose copper i zaszczep je do kolby Erlenmeyera o pojemności 125 ml zawierającej 25 ml pożywki yeast pepane dextrose broth. Umieść kulturę w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną ustawioną na 180 RPM i 30 °C, a następnie inkubuj przez noc. Po nocnej inkubacji przelej kultury drożdży do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i wiruj w wirówce przy 3000 RPM przez 5 do 10 minut. Odlej nadsącz i wymieszaj na wirówce vortex.Osad należy energicznie zawiesić, aby rozdzielić komórki. Następnie dodać sterylny PBS w celu przemycia, przed ponownym odwirowaniem kultur. Krok płukania powtórzyć jeszcze raz, a następnie ponownie zawiesić komórki.W około 20 mililitrach pożywki RPMI 1640, buforowanej do pH 7.0. Używając roztworu 165 milimolowego mops, uprzednio ogrzanego do 37 °C, przygotować z tej zawiesiny rozcieńczenie 1:100, wykorzystując standardowy hemocytometr i mikroskop w świetle przechodzącym. Policzyć komórki.Następnie należy przygotować końcową zawiesinę komórek o stężeniu 1×10⁶/ml w ciepłym buforowanym medium RPMI 1640. Za pomocą pipety wielokanałowej należy przenieść 100 µL zawiesiny komórek do wybranych dołków sterylnej płytki mikrotitracyjnej z płaskim dnem o 96 dołkach. Dołki w kolumnie 12 należy pozostawić puste, ponieważ będą one służyć jako kontrole negatywne.Po przykryciu i uszczelnieniu płytki parafilmem, inkubuj ją w temperaturze 37 °C przez 24 godziny, aby umożliwić utworzenie się biofilmów. Po inkubacji delikatnie odessij i usuń pożywkę z każdego dołka, uważając, aby nie naruszyć biofilmów utworzonych na dnie.Wypłucz każdą studzienkę, dodając 200 µL PBS, a następnie usuń płyn, ostrożnie odwracając płytkę i osuszając ją na stosie ręczników papierowych. Powtórz ten etap płukania trzy razy. Na tym etapie biofilmy są widoczne gołym okiem i można je obrazować za pomocą mikroskopu odwróconego oraz SEM.Można zauważyć, że biofilmy składają się z przeplatającej się mieszaniny filamentów i komórek drożdżaków. Po potwierdzeniu utworzenia biofilmu można rozpocząć testowanie środków przeciwgrzybiczych z użyciem buforowanego podłoża RPMI 1640, przygotowując roztwory robocze o wysokim stężeniu badanych środków przeciwgrzybiczych. Typowe wysokie stężenia to 1024 µg/mL dla flukonazolu oraz 16 µg/mL dla amfoterycyny B i kaspofunginu.Następnie do dołków w pierwszej kolumnie należy dodać 200 µL roztworów przeciwgrzybiczych, a do dołków w kolumnach od drugiej do jedenastej 100 µL buforowanego medium RPMI 1640. Wykonać serię dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych, przenosząc 100 µL roztworów przeciwgrzybiczych o wysokim stężeniu z dołków pierwszej kolumny do dołków drugiej kolumny.Po delikatnym pipetowaniu w górę i w dół w celu wymieszania, przenieś 100 µL z dołków kolumny drugiej do dołków kolumny trzeciej i tak dalej, aż do kolumny 10. Do kolumny 11 nie dodawaj żadnego roztworu przeciwgrzybiczego, ponieważ będzie ona służyć jako kontrola dodatnia, a ostatnie 100 µL z dołków kolumny 10 należy odrzucić. Wszystkie dołki, z wyjątkiem tych w kolumnie 12.Końcowa objętość powinna teraz wynosić 100 µL. Przykryć płytkę, uszczelnić ją parafinią i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 do 48 godzin, aby umożliwić działanie środków przeciwgrzybiczych. Po inkubacji i trzykrotnym przemyciu płytki w PBS zgodnie z wcześniejszym opisem, dodać 100 µL roztworu XTT do każdego dołka, w tym do dołków kontroli negatywnej.W kolumnie 12. Przykryć płytkę, owinąć ją folią aluminiową w celu ochrony przed światłem i inkubować w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Po zakończeniu inkubacji rozwinąć płytkę, aby umożliwić rozwój barwy.Początkowo bezbarwny roztwór XTT zmieni kolor na pomarańczowy po przetworzeniu przez metabolicznie aktywne komórki. Przenieś 80 µL zabarwionych nadsączów do nowej płytki mikrotitracyjnej z płaskim dnem. Użyj kolorymetrycznego czytnika płytek mikrotitracyjnych ustawionego na długość fali 490 nm, aby odczytać wartości z płytki, jak pokazano tutaj. W przypadku braku środków przeciwgrzybiczych odczyty kolorymetryczne dotyczyły próbek nieleczonych.Biofilmy aplikowane przez SEA w różnych rzędach są równoważne. Aby ocenić efekt testowanych związków przeciwgrzybiczych, należy najpierw od wszystkich pozostałych wartości odjąć średnią wartość tła uzyskaną z dołków kontroli negatywnej w kolumnie 12. Następnie należy obliczyć procent hamowania, wykorzystując kontrole pozytywne w rzędzie 11.Wartości maksymalne, czyli stężenia przeciwgrzybicze, przy których stwierdza się 50% lub 80% spadek odczytów kolorymetrycznych, określa się jako minimalne stężenia hamujące według metody Cecila. Wartości te są zazwyczaj wykorzystywane jako referencyjna miara potencji związku. Dzięki zastosowaniu tej prostej metody wysokoprzepustowej, biofilmy grzybicze mogą zostać uformowane in vitro w ciągu 24 godzin, a po jej wstępnym opracowaniu można przeprowadzić przesiew wybranych związków pod kątem aktywności przeciwgrzybiczej.Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny mykologii medycznej do zgłębiania procesu tworzenia biofilmu oraz badania aktywności środków przeciwgrzybiczych. Ponownie, komórki w biofilmach.

a-96-well-microtiter-plate-based-method-for-monitoring-formation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metoda oparta na 96-dołkowej płytce mikrotitrometrycznej do monitorowania tworzenia i testowania wrażliwości przeciwgrzybicznej Candida albicans biofilmów

Analiza opisuje szybką metodę pomiaru wczesnego tworzenia się biofilmu przez bakterie i grzyby. Metoda ta wykorzystuje płytkę mikrotitracyjną jako podłoże do tworzenia biofilmu mikrobiologicznego, a sam biofilm jest wizualizowany przy użyciu fioletu krystalicznego. Analiza ta pozwala na jakościowe lub ilościowe oznaczenie wczesnego etapu tworzenia biofilmu.

Analiza tworzenia biofilmu w płytkach mikrotitrowych

Opracowaliśmy platformę wysokiej gęstości do mikromacierzy, składającą się z 3D nano-biofilmów C. albicans, nazwaną CaBChip. Profil wrażliwości leków testowanych na CaBChip jest porównywalny z konwencjonalnym modelem płytki 96-dołkowej, co sugeruje, że chip grzybiczy jest idealnie dostosowany do prawdziwie wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwgrzybiczych.

Chip do hodowli biofilmu Candida albicans (CaBChip) do wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwgrzybiczych

Ten film demonstruje test in vitro do badania związków przeciwgrzybiczych za pomocą testu mikrorozcieńczenia bulionu. Badane związki rozcieńcza się seryjnie na płytce do mikromiareczkowania i inkubuje z inokulum grzybów. Po inkubacji płytkę bada się pod kątem studzienek, w których nie stwierdzono wzrostu grzybów, w celu oceny potencjału przeciwgrzybiczego badanych związków i ich minimalnego stężenia hamującego (MIC).

Test mikrorozcieńczenia bulionu in vitro do badań przesiewowych związków przeciwgrzybiczych

Ten film demonstruje technikę in vitro do badania wpływu przeciwciał na biofilmy grzybów. Chorobotwórczy grzyb Candida tropicalis wydziela czynnik wirulencji wydzielający proteinazę aspartylową 2 (Sap2), ułatwiając tworzenie biofilmu. Po wprowadzeniu inaktywowanej termicznie surowicy zawierającej przeciwciała specyficzne dla Sap2, które hamują dojrzewanie biofilmu, ocenia się żywotność komórek grzyba za pomocą testu chromogennego.

Test in vitro w celu oceny wpływu przeciwciał na biofilm Candida tropicalis

Przedstawiamy eksperymentalną procedurę rozwoju biofilmu Candida albicans w mysim modelu podskórnym. Biofilmy grzybów określono ilościowo, określając liczbę jednostek tworzących kolonie oraz nieinwazyjne obrazowanie bioluminescencyjne, w którym ilość wytwarzanego światła odpowiada liczbie żywotnych komórek.

Candida albicans (Candida albicans) Rozwój biofilmu na istotnych z medycznego punktu widzenia ciałach obcych w mysim modelu podskórnym, a następnie obrazowanie bioluminescencyjne

Ten protokół opisuje użycie konfigurowalnego zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego do wizualizacji tworzenia biofilmu u Candida albicans w warunkach fizjologicznych gospodarza.

Wizualizacja tworzenia się biofilmu u Candida albicans za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego

Łatwa i elastyczna metoda mikrorozcieńczania bulionu do badania związków przeciwgrzybiczych i ekstraktów.

Mikrorozcieńczenie bulionu Badania przesiewowe in vitro: łatwa i szybka metoda wykrywania nowych związków przeciwgrzybiczych

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół badania oddychania mitochondrialnego i funkcji glikolitycznej u Candida Albicans za pomocą dodatkowego analizatora strumienia.

Badanie bioenergetyczne Candida albicans przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Aby zobaczyć i określić ilościowo wewnętrzne cechy biofilmów Candida albicans, przygotowujemy nienaruszone próbki stałe, które są klarowane przez dopasowanie współczynnika załamania. Następnie można wykorzystać optyczną mikroskopię przekrojową do uzyskania trójwymiarowych danych obrazowych na całej grubości biofilmu.

Oczyszczanie i obrazowanie biofilmów Candida albicans

Ten protokół opisuje metodę uzyskiwania danych ilościowych na temat przeciwgrzybiczej aktywności peptydów i innych związków, takich jak małocząsteczkowe środki przeciwgrzybicze, przeciwko Candida albicans. Wykorzystanie gęstości optycznej zamiast liczenia jednostek tworzących kolonie w celu ilościowego określenia zahamowania wzrostu oszczędza czas i zasoby.

Kwantyfikacja aktywności przeciwgrzybiczej peptydów przeciwko Candida albicans

Protokół oparty na 96-dołkowej płytce mikromiareczkowej przy użyciu testu redukcji 2,3-bis(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-5-karboksyanilid-2H-tetrazolium (XTT) jest opisany tutaj, w celu zbadania wpływu przeciwciał na biofilmy utworzone przez C. tropicalis. Ten protokół in vitro może być wykorzystany do sprawdzenia wpływu potencjalnych nowych związków przeciwgrzybiczych na aktywność metaboliczną komórek gatunku Candida w biofilmach.

Rozpuszczalny test redukcyjny na bazie tetrazoliu do oceny wpływu przeciwciał na biofilmy Candida tropicalis

Naucz się formowania biofilmów Candida albicans w płytkach 96-dołkowych i oceny wrażliwości przeciwgrzybiczej metodą kolorymetryczną. Ta technika jest prosta, tania i wysoko powtarzalna.

96-dołkowa metoda mikromiareczkowa oparta na płytkach do monitorowania powstawania i badania wrażliwości przeciwgrzybiczej biofilmów Candida albicans (Wideo) | JoVE Journal

Metoda z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki mikrotytrującej do monitorowania tworzenia się i badania wrażliwości przeciwgrzybiczej biofilmów Candida albicans

Przeglądaj więcej filmów