Name: Wprowadzenie do Worm Lab: od hodowli robaków do mutagenezy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Poznaj metody mutagenezy EMS i TMP/UV u nicieni Pristionchus pacificus w celu generowania mutantów i identyfikacji genów. Techniki te umożliwiają badanie funkcji genów w neurobiologii i biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana z grantu NSF IOB#0615996.

Część 1: Przygotowanie szalek Petri z pożywką do wzrostu nicieni (NGM)
Nematody eksperymentalne, takie jak C. elegans i P. pacificus, są zazwyczaj hodowane w laboratorium na płytkach Petriego o średnicy 6 cm zawierających pożywkę NGM (Nematode Growth Medium) 1. Nicienie są utrzymywane w temperaturze 20°C, ale mogą być inkubowane w różnych zakresach temperatur (od 4°C do 25°C), w zależności od gatunku nematody i projektu eksperymentalnego. Do przygotowania płytek z NGM należy zastosować standardowe techniki sterylizacji, aby zapobiec kontaminacji grzybiczej i bakteryjnej. Poniżej przedstawiono protokół przygotowania płytek NGM:
<ol>
	<li>Odważ 15 g agaru, 2,4 g NaCl, 2 g tryptonu oraz 2,72 g KH2PO42PO4 w kolbie stożkowej o pojemności 2 L dopełnić objętość do 1 L wodą, wysterylizować w autoklawie i pozwolić ostygnąć do 60° C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Dodać po 0,8 ml 1 M CaCl22, cholesterol (5 mg/ml w etanolu) oraz 1 M MgSO44Aby zapobiec kontaminacji grzybiczej i bakteryjnej, do każdego litra pożywki można dodać 1 ml streptomycyny (100 mg/ml) oraz 1 ml nystatyny (10 mg/ml).</li>
	<li>Przy użyciu urządzenia Unispense i z zachowaniem warunków sterylnych, rozlej pożywkę do odpowiednich płytek. Płytki należy wypełnić do około 2/3 objętości.rd pełne. Standardowa płytka o średnicy 60 mm wymaga około 10 ml pożywki. Nie należy przesuwać płytek do czasu całkowitego zżelowania agaru; w przeciwnym razie powierzchnia agaru będzie nierówna, co utrudni ustawienie ostrości na nicieniach w stereomikroskopie.</li>
	<li>Po wyschnięciu płytki można zasiewać natychmiast lub przechowywać w 4° C do momentu zaszczepienia bakteriami.</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie bakterii OP50 i wysiewanie szalek Petriego z pożywką NGM
P. pacificus jest hodowany w laboratorium poprzez karmienie szczepem E.coli OP50. OP50 wykazuje ograniczony wzrost na płytkach NGM, tworząc tym samym cienki trawnik, co ułatwia wizualizację nicieni1. Aby wyhodować kulturę OP50, należy użyć pożywki LB-broth:
<ol>
	<li>Do butelki z zakrętką o pojemności 500 ml dodać 5 g baktotryptonu, 2,5 g ekstraktu drożdżowego oraz 2,5 g NaCl, uzupełnić objętość do 500 ml wodą destylowaną i wysterylizować w autoklawie.</li>
	<li>W warunkach sterylnych zaszczepić pożywkę pojedynczą kolonią OP50 z płytki hodowlanej i inkubować przez noc w temperaturze 37° C.</li>
	<li>LB-OP50 jest gotowy do użycia i może być przechowywany w temperaturze 4° C przez kilka miesięcy, pod warunkiem zachowania sterylności. W celu zaszczepienia płytek należy przelać niewielką ilość pożywki do małego sterylnego zlewka, co zapobiegnie zanieczyszczeniu kultury wyjściowej.</li>
	<li>Aby zaszczepić płytki, nanieść 100-120 μl OP50 na płytkę Petri z podłożem NGM o średnicy 60 mm i zamieszać okrężnymi ruchami w celu rozprowadzenia zawiesiny.</li>
	<li>Inkubować zaszczepione płytki przez noc w temperaturze pokojowej do czasu wyrośnięcia trawnika bakterii. Tak przygotowane płytki można przechowywać w temperaturze 4° C do 3 tygodni. Przechowywanie ich w pozycji odwróconej zapobiega szybkiemu wysychaniu.</li>
</ol>
Część 3: Wybór kolonii
W tej sekcji opisujemy, jak przygotować igłę do przenoszenia nicieni. Igła służy do przenoszenia nicieni z jednego miejsca w drugie. Jest ona wykonana z drutu 30 gauge składającego się z 90% platyny i 10% irydu, choć niektórzy badacze mogą preferować nieco inne składy metali:
<ol>
	<li>Odciąć około 3-4 cm drutu, wprowadzić 0,5 cm drutu do końcówki pipety Pasteura (której końcówkę wcześniej skrócono), a następnie stopić szkło nad palnikiem Bunsena, aby utrwalić drut. Długość drutu wystającego ze szkła powinna wynosić około 3-3,5 cm, jednak może być dostosowana do indywidualnych preferencji.</li>
	<li>Spłaszczyć wystający koniec drutu za pomocą młotka lub szczypiec. Następnie zagiąć spłaszczoną część ku górze, tworząc czerpak.</li>
	<li>Wygładzić ostre krawędzie narzędzia papierem ściernym, aby zapobiec uszkodzeniu nicieni lub agaru.</li>
</ol>
Część 4: Wybieranie nicieni
<ol>
	<li>Aby pobrać nicienie, wysterylizować drucik platynowy w płomieniu, a następnie przesunąć spłaszczoną końcówkę pęsety wzdłuż trawnika bakteryjnego, aby pokryć ją grubą warstwą lepkich bakterii, uważając, by nie przebić ani nie uszkodzić powierzchni agaru.</li>
	<li>Korzystając ze stereomikroskopu, bardzo delikatnie dotknąć lepki końcówką nicnia lub nicieni przeznaczonych do pobrania, aż przykleją się oni do bakterii na pęsecie.</li>
	<li>Gdy nicień znajdzie się na końcówce pęsety, należy go bezzwłocznie przenieść na nową płytkę, dotykając lub przesuwając końcówkę pęsety po trawniku bakteryjnym nowej płytki, co powinno spowodować zejście nicienia z narzędzia. Należy uważać, aby nie uszkodzić powierzchni agaru na płytce, w przeciwnym razie nicienie mogą wpełznąć w otwory, co utrudni ich późniejsze odzyskanie. Jeśli nicień pozostanie na pęsecie zbyt długo, może ulec wysuszeniu.</li>
</ol>
Część 5: Mutageneza za pomocą EMS
Metanosulfonian etylu (EMS) indukuje szerokie spektrum mutacji w genomie 2. Mutanty można zidentyfikować na podstawie takich defektów jak zaburzenia składania jaj, wady mięśniowe, nieprawidłowości w determinacji płci, tworzenie postaci dauer, zmiany w zachowaniu oraz wady formowania gonad. Protokół mutagenezy EMS jest podobny do opisanego dla C. elegans 1.
<ol>
	<li>Przygotować 500 ml (lub więcej) 1N NaOH.</li>
	<li>Pobrać 4-5 szalek Petri o średnicy 6 cm wypełnionych nicieniami, zawierających kilkaset osobników w trzecim stadium larwalnym (J3), i zmyć nicienie, używając 2-3 ml sterylnego M9 na szalkę.</li>
	<li>Zebrać wszystkie nicienie do sterylnej, jednorazowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 1500 x g przez 5-7 minut lub do momentu utworzenia osadu z nicieni.</li>
	<li>Odssać ciecz i użyć 2 ml M9 do ponownego zawieszenia nicieni. Dodać 20 μl EMS do probówki zawierającej 2 ml M9 i wstrząsnąć, aby rozpuścić substancję. Następnie dodać ten roztwór EMS do 2 ml zawiesiny nicieni i delikatnie wymieszać ruchem okrężnym. Końcowe stężenie EMS wyniesie 47 mM. Uwaga: EMS jest bardzo silnym mutagenem i należy z nim pracować w dygestorium. Wszystkie materiały (rękawiczki, pipety, końcówki), które miały kontakt z tym mutagenem, należy potraktować 1N NaOH w celu inaktywacji EMS. Przez cały czas trwania procedury mutagenezy EMS należy nosić podwójne rękawiczki. Odpady niebezpieczne należy utylizować zgodnie z wytycznymi danej instytucji.</li>
	<li>Umieścić probówkę wirówkową i zabezpieczyć zakrętkę parafimem; położyć probówkę poziomo w dygestorium i inkubować nicienie przez 3,5 godziny. Probówkę można również umieścić na wstrząsarce o niskiej prędkości.</li>
	<li>Obrócić probówkę i zabezpieczyć zakrętkę parafimem; ustawić w pozycji pionowej i inkubować do czasu opadnięcia nicieni na dno.</li>
	<li>Odssać nadosad i wylać go do zlewki/kolby zawierającej 1N NaOH. Pozwoli to na inaktywację EMS.</li>
	<li>Dodać do nicieni 5 ml M9, odwrócić probówkę 25-30 razy w celu przemycia nicieni, a następnie wirować przy 1500 x g przez 5-7 minut lub do momentu utworzenia osadu. Odssać nadosad i wylać do zlewki z 1N NaOH.</li>
	<li>Powtórzyć etap przemywania co najmniej 3 razy.</li>
	<li>Po ostatnim przemyciu ponowie zawiesić osad z nicieni w minimalnej ilości (~500 μl) M9 i przenieść je pipetą na płytki NGM zawierające trawnik bakterii OP50. Na tym etapie nie ma już konieczności pracy w dygestorium.</li>
	<li>Pozostawić ciecz do wyschnięcia przez kilka minut, a następnie wybrać i przenieść zdrowe larwy J4 na świeżo zaszczepione płytki. Oryginalną płytkę należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi odpadów niebezpiecznych.</li>
	<li>Pozostawić zmutagenizowane nicienie do samodyzapłodnienia. Używając stereomikroskopu, przesiewać fenotypy pokolenia F2 w celu znalezienia interesujących mutantów recesywnych.</li>
</ol>
Część 6: Mutageneza psoralenowa
W tej sekcji opisujemy procedurę mutagenezy z użyciem TMP w połączeniu z długofalowym promieniowaniem ultrafioletowym (UV). Metoda mutagenezy TMP/UV jest szeroko stosowana do indukowania mutacji delecyjnych w genomie 3.
<ol>
	<li>Zebrać nicienie z szalek Petri o średnicy 6 cm (4-5 szalek) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, zgodnie z opisem w poprzedniej procedurze.</li>
	<li>Dodać 10 ml buforu M9, odwrócić probówkę 20 razy w celu przemycia nicieni, a następnie wirować przy 1500 x g przez 5 minut. Odlać nadsącz i powtórzyć przemywanie łącznie 3 razy. Odessać ciecz i zawiesić nicienie ponownie w objętości buforu M9 około 10-krotnie przekraczającej ich objętość, zawierającej 30 μg/ml TMP. Do 2 ml buforu M9 pipetować 20 μl TMP (3 mg/ml). Podobnie jak EMS, TMP jest silnym kancerogenem i musi być obsługiwany z zachowaniem odpowiednich środków bezpieczeństwa. Aby zapobiec potencjalnemu ryzyku związanemu z promieniowaniem UV, należy stosować odpowiednie okulary ochronne. Materiały jednorazowe należy utylizować w odpowiednich workach na odpady biologiczne.</li>
	<li>Inkubować probówkę w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej na wolnoobrotowym wytrząsarce (40 UPM). Postawić zakrytą probówkę pionowo na 10 minut, aby wszystkie nicienie opadły na dno.</li>
	<li>Zebrać nicienie z dna probówki za pomocą pipety Pasteura i przenieść je na nieobsianą płytkę NGM. Nadsącz należy zutylizować zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi niebezpiecznych substancji chemicznych.</li>
	<li>Przechowywać płytkę w ciemności do czasu wchłonięcia nadmiaru TMP przez podłoże.</li>
	<li>Używając miernika natężenia UV, ustawić odległość między źródłem długofalowego promieniowania UV a płytką tak, aby natężenie na płytce wynosiło 500 μW/cm2 4. Zdjąć osłonę aluminiową oraz pokrywkę i naświetlać płytkę z nicieniami traktowanymi TMP długofalowym promieniowaniem UV przez 50 sekund.</li>
	<li>Przykryć i pozostawić nicienie w ciemności na 5 godzin w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wybrać i przenieść zdrowe larwy J4 na świeżo obsiane płytki. Oryginalną płytkę należy zutylizować zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi niebezpiecznych substancji chemicznych.</li>
	<li>Używając stereomikroskopu, przesiewać fenotypy pokolenia F2 w celu znalezienia poszukiwanej mutacji.</li>
</ol>
Część 7: Reprezentatywne wyniki
Niektóre fenotypy mutantów P. pacificus powstałe w wyniku mutagenezy (zarówno przy użyciu EMS, jak i TMP/UV) przedstawiono na rysunku 1. Każdy mutant posiada charakterystyczny fenotyp, który jest łatwo odróżnialny od zwierzęcia typu dzikiego. Z nicieni poddanych działaniu mutagenu wybrano 30 larw J3/J4 z pokolenia rodzicielskiego (P0), które umieszczono na oddzielnych szalkach i pozostawiono do zniesienia jaj, stanowiących pokolenie F1. Z szalek, na których pojawiło się zdrowe potomstwo F1, łącznie 1000 osobników F1 przeniesiono na indywidualne szalki, a następnie przesiewano potomstwo F2 pod kątem fenotypów. Znaleziono zwierzęta o fenotypach Dumpy 5,6, Uncoordinated6 oraz Transformer7.
<img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="Zdjęcia mikroskopowe nicieni przedstawiające różne pozycje do badań behawioralnych; pasek skali 500 μm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rycina 1. Pristionchus pacificus zwierzęta typu dzikiego i mutanty. A. hermafrodyta typu dzikiego B. samiec typu dzikiego C. dpy mutant D. unc mutant E. tra mutanta. Dwa górne panele przedstawiają zwierzęta typu dzikiego: hermafrodytę (po lewej) i samca (po prawej), w celu porównania z różnymi mutantami na pozostałych panelach.

<ol><li>Brenner, S. Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li>
<li>Anderson, P. Methods Cell Biol. 48, 31-31 (1995).</li>
<li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1381-1381 (1994).</li>
<li>Pires-daSilva, A. WormBook. , 1-1 (2005).</li>
<li>Kenning, C., Kipping, I., Sommer, R. J. Genesis. 40 (3), 176-176 (2004).</li>
<li>Sommer, R. J., Carta, L. K., Kim, S. Y. Fundamental and Applied Nematology. 19 (6), 511-511 (1996).</li>
<li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. Genes & development. 18 (10), 1198-1198 (2004).</li>
<li>Wei, A., Yuan, A., Fawcett, G. Nucleic acids research. 30 (20), 110-110 (2002).</li>
<li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-356 (2002).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Mutageneza jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach genetycznych u różnych organizmów modelowych. Eksperymenty z mutagenezą są często wykorzystywane do identyfikacji funkcji genu2. Opisane tutaj procedury mutagenezy mogą być stosowane nie tylko w przypadku P. pacificus, ale także dla C. elegans i innych pokrewnych gatunków nicieni. W niniejszym opracowaniu opisujemy dwie metody: mutagenezę EMS oraz TMP/UV.
EMS jest związkiem chemicznym, który indukuje mutac...

wprowadzenie do laboratorium nicieni: od hodowli nicieni do mutagenezy

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

Niniejszy protokół opisuje procedury utrzymywania nicieni w laboratorium oraz sposób ich mutagenizacji przy użyciu dwóch alternatywnych metod: siarczanu etylometanosulfonianu (EMS) oraz 4, 5', 8-trimetylopsoralenu w połączeniu ze światłem ultrafioletowym (TMP/UV). Nicienie stanowią potężne systemy biologiczne do badań genetycznych ze względu na prostą budowę ciała i system rozrodu, składający się z samopłodnych hermafrodytów oraz samców, którzy mogą generować setki potomstwa na jedną osobnik. Nicienie są utrzymywane na płytkach agarowych zawierających trawnik bakterii i mogą być łatwo przenoszone z jednej płytki na drugą za pomocą igły do przenoszenia. EMS jest czynnikiem alkilującym powszechnie stosowanym do indukowania mutacji punktowych i małych delecji, podczas gdy TMP/UV indukuje głównie delecje. W zależności od stosowanego gatunku nicienia, stężenia EMS i TMP będą wymagały optymalizacji. W celu wyizolowania mutacji recesywnych u nicienia Pristionchus pacificus, osobniki generacji F2 poddano wizualnej ocenie fenotypowej. Aby zilustrować te metody, przeprowadzono mutagenizację nicieni i wyszukano mutanty Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) oraz Transformer (Tra).

Przesiewowe poszukiwanie mutantów z defektami fenotypowymi jest prostą metodą identyfikacji genów funkcjonujących w danym procesie biologicznym. W niniejszym artykule opisujemy sposób hodowli wolnożyjących nicieni (np. Pristionchus pacificus) w warunkach laboratoryjnych i przedstawiamy dwie różne metody mutagenezy: EMS oraz TMP/UV.

Wprowadzenie do laboratorium nicieni: od hodowli nicieni do mutagenezy

Niniejszy protokół opisuje procedury utrzymywania nicieni w warunkach laboratoryjnych oraz sposób ich mutagenizacji z wykorzystaniem dwóch alternatywnych metod: siarczanu etylometanu...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie dwóch różnych protokołów mutagenezy, które są powszechnie stosowane do generowania mutantów u nicieni, takich jak ceno, hepatitis elegance i prisca. Mutageneza Pacificus jest potężnym narzędziem służącym do odkrywania funkcji genów. Osiąga się to poprzez wcześniejsze przygotowanie kultur z dużą liczbą osobników w ostatnim stadium larwalnym przed osiągnięciem dojrzałości, na których zostanie przeprowadzona mutageneza.Kolejnym krokiem jest mutagenizacja nicieni przy użyciu dwóch alternatywnych procedur: traktowania sulfonianem etylometanu lub mutagenozy w połączeniu z promieniowaniem ultrafioletowym. Trzecim krokiem procedury jest przeniesienie zdrowo wyglądających nicieni na płytki agarowe, świeżo zasiające bakterie, które stanowią źródło pożywienia. Ostatnim krokiem procedury jest przesiewanie w celu wyłonienia interesujących fenotypów mutantów w pierwszym, drugim lub trzecim pokoleniu.Witajcie, jestem Jore z laboratorium dr. Andre Pereza Silvy w Departamencie Biologii na Uniwersytecie Teksańskim w Arlington. Procedury T-M-P-U-V oraz mutagenezy EMS pomagają odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań genetycznych, takie jak to, które geny są zaangażowane w procesy biologiczne odgrywające istotną rolę podczas rozwoju. Cześć, nazywam się Manish Phar. Choć zaprezentowane metody mutagenezy będą dotyczyć gatunku Pristi Onca S Pacificus, mogą one być bardzo powszechnie stosowane w innych modelach eksperymentalnych, takich jak nicienie Caenorhabditis elegans, a nawet u kręgowców, na przykład u danio przebrzuchłego.Zacznijmy zatem. Nasza zgłębnik do przenoszenia nicieni z jednego miejsca w drugie został wykonany z drutu o średnicy 30 gauge, składającego się w 90% z platyny i w 10% z irydu. Chociaż niektóre osoby prowadzące badania mogą preferować nieco inne składy metali do wykonania zgłębników, do trzymania narzędzia używana jest również pipeta pasterska.Zacznij od odłamania wydłużonej końcówki pipety Pasteura do wymaganej długości. Odetnij około trzech do czterech centymetrów drutu i wprowadź 0,5 centymetra drutu do wnętrza końcówki pipety Pasteura, a następnie zlutuj drut ze szkłem nad palnikiem Bunsena.Długość drutu wystającego ze szkła wynosi około trzech do trzech i pół centymetrów, jednak może być ona dostosowana do indywidualnych preferencji. Spłaszczyć koniec wystającego drutu za pomocą szczypiec. Następnie zgiąć spłaszczoną część ku górze, aby utworzyć kształt czerpaka.Na koniec wygładzić ostre krawędzie wykałaczki papierem ściernym, aby zapobiec uszkodzeniu nicieni lub agaru. Aby pobrać nicienie, wysterylizować drut wykałaczki w płomieniu, a następnie przeciągnąć spłaszczoną końcówkę wzdłuż lawnu bakteryjnego na płytce NGMP, aby pokryć końcówkę gęstą, lepką warstwą bakterii. Używając stereomikroskopu, bardzo delikatnie przeciągnąć końcówkę, uważając, aby nie przebić ani nie uszkodzić powierzchni agarowej.Przesuwaj lepki koniec igły po robaku, aż ten przywrze do bakterii znajdujących się na igle. Gdy robak znajdzie się na końcu igły, natychmiast przenieś go na nową płytkę, dotykając lub przesuwając końcem igły po trawniku bakteryjnym nowej płytki. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić powierzchni agarowej płytki, ponieważ robaki mogą wpełznąć w powstałe otwory, co utrudni ich odzyskanie.Nematoda powinna zsunąć się z wykałaczki w momencie, gdy dotkniesz lub przesuniesz końcówką wykałaczki po powierzchni trawnika bakteryjnego. Organizm nie może pozostać na wykałaczce zbyt długo, aby nie uległ wysuszeniu. Przeprowadzimy mutogenezę EMS na czterech do pięciu szalkach Petriego o średnicy sześciu centymetrów z nicieniami *Prisca pacificus* w trzecim stadium larwalnym (L3).Zmyć nicienie z każdej płytki, używając od dwóch do trzech mililitrów sterylnego medium M9 na płytkę. Powinno być kilkaset nicieni. Zbierz nicienie do sterylnej jednorazowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów.Wiruj próbkę przy 1500 Gs przez pięć do siedmiu minut lub do czasu utworzenia osadu z nicieni. Odessań ciecz i użyj dwóch mililitrów M9 do resuspensji nicieni, pracując w wyciągu i nosząc podwójne rękawiczki; dodaj 20 µL EMS do probówki zawierającej dwa mililitry M9 i wstrząśnij, aby rozpuścić substancję. Następnie dodaj to do dwóch mililitrów zawiesiny nicieni i delikatnie wymieszaj przez obracanie.Końcowe stężenie EMS wyniesie 47 millimolar. Umieść probówkę do wirowania z paraformem na niskobiegowym wytrząsarce w dygestorium i inkubuj nicienie przez trzy i pół godziny. Po zakończeniu inkubacji trwającej trzy i pół godziny, ustaw probówkę w pozycji pionowej i inkubuj do czasu opadnięcia nicieni na dno, następnie odessij nadnadstCiecz i wlej ją do zlewki zawierającej roztwór wodorotlenku sodu w celu inaktywacji EMS obecnego w nadnadstCieczy.Za każdym razem przed wyjęciem rąk z dygestorium należy je opłukać w 1 N wodorotlenku sodu. Aby inaktywować EMS, dodaj do nicieni pięć mililitrów M9. Odwróć probówkę od 25 do 30 razy, aby wypłukać nicienie, a następnie wiruj przy 1500 G przez pięć do siedmiu minut lub do czasu, aż nicienie utworzą osad; po wirowaniu odessaj naddestylat i wylej go do zlewka z 1 N wodorotlenkiem sodu.Powtórz ten etap płukania, dodając M9 i wirując, a następnie usuwając nadsącz, co najmniej trzy razy. Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś osad z nicieniami w minimalnej ilości M9, a następnie nanieś zawiesinę nicieni pipetą na płytki NGM zawierające trawnik bakterii OP50. Po odczekaniu kilku minut do wyschnięcia cieczy, wybierz i przenieś zdrowe larwy J4 na świeżo zasiałe płytki.Pozostawcie poddane mutagenezie nicienie do samozapłodnienia; około 8–10 dni później, przy użyciu stereomikroskopu, przeprowadźcie przesiew fenotypów pokolenia F2 w celu wyłonienia nadmiernej liczby interesujących mutantów. Niniejsza procedura mutagenezy zostanie zaprezentowana na nicieniach *P. pacificus* z szalek Petriego o średnicy 4–6 cm, zebranych do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Do osadu z nicieniami dodajcie 10 ml pożywki M9.Odwróć probówkę 20 razy, aby wyprać nicienie, a następnie odwiruj przy 1500 Gs przez pięć minut. Po wirowaniu odlej nadsącz. Powtórz przemywanie nicieni w medium M nine łącznie trzy razy; po ostatnim przemywaniu odessaj ciecz i zawieś nicienie ponownie w objętości medium M nine około 10-krotnie przekraczającej ich objętość.Następnie dodać 4,5,8-trimetylosorenin lub TMP z roztworu stokowego o stężeniu 3 mg/mL, aby uzyskać stężenie końcowe 30 µg/mL. Probówkę z TMP inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej na kołysce z niską prędkością przez 15 minut. Po inkubacji ustawić probówkę pionowo na 10 minut, aby wszystkie nicienie opadły na dno; w tym filmie probówka jest pokazana bez zakrętki, jednak roztwór TMP nie powinien być wystawiony na działanie światła.Ponieważ ten odczynnik jest światłoczuły, należy użyć pasteryzowanej pipety, aby usunąć nicienie z dna probówki i przenieść je na nieposianą płytkę NGM. Płytkę należy przechowywać w ciemności do czasu wchłonięcia nadmiaru TMP przez podłoże. Po wchłonięciu TMP przez płytkę nicienie mogą zostać poddane działaniu światła ultrafioletowego.Jednym z najbardziej krytycznych etapów procedury neurogenezy TMP UV jest zachowanie odpowiedniego dystansu między źródłem długofalowego promieniowania UV a płytką. Należy zatem kilkukrotnie skorygować tę odległość, aby uzyskać właściwą intensywność światła UV padającego na płytkę. Intensywność powinna zostać zmierzona miernikiem i powinna wynosić 500 µW/cm².Podczas tego etapu należy stosować odpowiednią ochronę oczu ze względu na potencjalne ryzyko związane z promieniowaniem UV. Korzystając z miernika natężenia promieniowania UV, należy wyznaczyć odległość od źródła długofalowego promieniowania UV, która zapewni natężenie wynoszące 500 µW/cm².Następnie należy zdjąć folię aluminiową oraz pokrywkę i umieścić płytkę z niciami traktowanymi TMP w takiej odległości od lampy, aby natężenie promieniowania na płytce wynosiło 500 µW/cm². Płytkę należy naświetlać długofalowym promieniowaniem UV przez 50 s, a następnie przykryć i pozostawić nicie w ciemności przez pięć godzin w temperaturze pokojowej. Po pięciu godzinach należy wybrać i przenieść zdrowe larwy w stadium J4 na świeżo zaszczepione płytki.Na koniec, za pomocą mikroskopu stereoskopowego, przesiewaj pokolenia F1, F2 lub F3 w poszukiwaniu interesujących fenotypów. Przedstawiono tutaj niektóre fenotypy mutantów ppac pacificus zidentyfikowane w pokoleniu F2 po mutagenzie za pomocą EMS lub T-M-P-U-V. Dwa górne panele na tych obrazach to przykłady hermafrodyty typu dzikiego oraz samca typu dzikiego.Każdy mutant wykazuje charakterystyczny fenotyp, który jest łatwo odróżnialny od zwierzęcia typu dzikiego. Panel C przedstawia przykład mutanta dumpy. Panel D pokazuje mutanta uncoordinated, a panel E mutanta transformer. Po opanowaniu techniki, mutagenezę EMS można przeprowadzić w cztery i pół godziny, a mutagenezę TMP uuv w pięć i pół godziny, jeśli zostanie ona wykonana prawidłowo.Ten okres obejmuje również czas inkubacji. Należy pamiętać, że EMS i TMP są niezwykle niebezpieczne i podczas pracy z nimi zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego, stosowanie podwójnych rękawiczek, korzystanie z wyciągu i okularów ochronnych. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

an-introduction-to-worm-lab-from-culturing-worms-to-mutagenesis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wprowadzenie do laboratorium dżdżyc: od hodowli dżdżyc po mutagenezę

Opisano procedurę hodowli w środowisku ciekłym oraz rozdziału szczepów C. elegans wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych, która nie wymaga użycia kosztownego sprzętu do sortowania. Podejście to można zastosować w przypadku licznych indukowalnych genów C. elegans w celu odkrywania leków lub biosensingu zanieczyszczeń.

Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

Ten film opisuje technikę szybkiego badania pojedynczego nicienia pod kątem markera genetycznego za pomocą badania przesiewowego PCR. W przykładowym protokole przeprowadzamy badania przesiewowe pod kątem edycji genomu opartej na CRISPR.

PCR z pojedynczym robakiem: metoda ekstrakcji i amplifikacji genomowego DNA

C. elegans jest zwykle uprawiany na solidnych płytkach agarowych lub w płynnych kulturach z wysiewem E. coli. Aby zapobiec zakłóceniom w badaniach toksykologicznych i żywieniowych bakteryjnych produktów ubocznych, wykorzystaliśmy płynne podłoże akseniczne, CeHR, do hodowli i synchronizacji dużej liczby robaków do szeregu dalszych zastosowań.

Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Worm-align/Worm_CP to prosty proces pracy FIJI/CellProfiler, który może być używany do prostowania i wyrównywania próbek Caenorhabditis elegans oraz do oceny testów opartych na obrazach całych robaków bez konieczności wcześniejszego szkolenia. Zastosowaliśmy Worm-align/Worm_CP do ilościowego oznaczania ekspresji wywołanej szokiem cieplnym u żywych zwierząt lub kropelek lipidów w ustalonych próbkach.

Worm-align i Worm_CP, dwa potoki typu open source do prostowania i kwantyfikacji danych obrazu fluorescencji uzyskanych z Caenorhabditis elegans

Genetycznie podatny na uszkodzenia nicień Caenorhabditis elegans może być używany jako prosty i tani model do odkrywania leków. Opisano tutaj protokół identyfikacji leków przeciwnowotworowych, które hamują dalszą sygnalizację białek RAS i EGFR.

Identyfikacja inhibitorów EGFR i RAS za pomocą Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje 96-dołkowe zakłócenie pojedynczych bakteriologicznie skolonizowanych Caenorhabditis elegans po zimnym paraliżu i bieleniu powierzchni w celu usunięcia zewnętrznych bakterii. Otrzymaną zawiesinę umieszcza się na płytkach agarowych, aby umożliwić dokładne, średnioprzepustowe określenie ilościowe obciążenia bakteryjnego w dużej liczbie pojedynczych robaków.

Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności w interakcjach Caenorhabditis elegans z bakteriami

Mikrokosmosy kompostu wprowadzają do laboratorium różnorodność mikrobiologiczną występującą w naturze, aby ułatwić badania mikrobiomu u Caenorhabditis elegans. Poniżej znajdują się protokoły do przeprowadzania eksperymentów mikrokosmicznych, przy czym eksperymenty wykazują zdolność do modulowania różnorodności mikrobiologicznej środowiska w celu zbadania związków między różnorodnością mikrobiologiczną środowiska a składem mikrobiomu jelitowego robaków.

Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w mikrofabrykowanych urządzeniach wielodołkowych. Takie podejście pozwala na monitorowanie poszczególnych zwierząt przez całe życie pod kątem różnych fenotypów związanych ze starzeniem się i zdrowiem, w tym aktywności, wielkości i kształtu ciała, geometrii ruchu i przeżycia.

Długotrwała hodowla i monitorowanie izolowanych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych w urządzeniach wielodołkowych

Mutageneza celowana całych plazmidów to prosty sposób na stworzenie nieco odmiennych wariantów oryginalnego plazmidu. W niniejszej pracy demonstrujemy łatwą i kosztowo efektywną metodę wprowadzania substytucji zasad w plazmidzie przy użyciu standardowych odczynników.

Własna metoda mutagenezy celowanej całych plazmidów

Poznaj metody mutagenezy EMS i TMP/UV u nicieni Pristionchus pacificus w celu generowania mutantów i identyfikacji genów. Techniki te umożliwiają badanie funkcji genów w neurobiologii i biologii rozwoju.

Wprowadzenie do laboratorium nicieni: od hodowli nicieni do mutagenezy

Przeglądaj więcej filmów