Name: Protokół oznaczania RNAi u dorosłych komarów (A. gambiae) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Poznaj metodę wyciszania genów RNAi u komarów Anopheles gambiae poprzez wstrzyknięcie dsRNA do tułowia. Technika ta umożliwia badanie funkcji genów związanych z odpornością na patogeny malarii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wyciszanie genów za pomocą RNAi u komarów wymaga wcześniejszego przygotowania i oczyszczania specyficznych dsRNA celujących w wybrany gen. Do syntezy dsRNA zalecamy zestaw Ambion Megascript, który wykorzystuje reakcję transkrypcji in vitro z udziałem polimerazy RNA T7. Do oczyszczania dsRNA zalecamy zestaw Qiagen RNeasy. Próbki dsRNA należy skwantyfikować i dostosować do stężenia 3 μg/μL w wodzie. Pozostałe niezbędne materiały to: pęseta z cienkimi końcami, szkiełko przedmiotowe, szklane igły mikrokapilarne, mikroiniekcyjnik (używamy Drummond's Nanoject II), mikroskop świetlny zamontowany nad blokiem chłodzącym, przykryta szklana szalka Petriego, ręczniki papierowe oraz wiadro z lodem. Konieczne będzie również zapewnienie sposobu odłowu komarów i odpowiedniego dla nich pojemnika wraz ze źródłem pokarmu, takim jak bawełniana kulka nasączona 10% sacharozą.
<ol>
<li>Zabierz komary. Używając aspiratora zasilanego bateryjnie, zbierz komary, które chcesz poddać iniekcji. Zatkaj dyszę ręcznikiem papierowym lub watą, aby komary nie mogły uciec, a następnie zdejmij zbiornik. Ponieważ niskie temperatury działają na komary znieczulająco, zanurz zbiornik w wiadrze z lodem i odczekaj 5-10 minut, aż komary przestaną się poruszać. Znieczulenie można również osiągnąć umieszczając zbiornik w chłodni, lodówce lub stosując CO2. W ciągu tych 5-10 minut przejdź do następnego kroku. </li>
<li>Przygotuj obszar pracy. Ustaw płaski blok chłodzący na 2°C i połóż na nim szkiełko przedmiotowe. To tutaj komary będą spoczywać podczas iniekcji. Zamocuj szklaną igłę w mikroinjektorze i za pomocą pęsety odłam końcówkę igły do pożądanej szerokości. Ważne jest, aby szerokość była wystarczająca, by umożliwić przepływ cieczy z odpowiednią prędkością, ale jednocześnie na tyle wąska, by zadać minimalną ranę podczas iniekcji. Dobra końcówka igły powinna być na tyle cienka, by lekko się wygiąć, ale nie złamać. Ustaw urządzenie do iniekcji na pożądaną objętość podawaną (w przypadku RNAi używamy 69 nL). Zanurz końcówkę igły w próbce i pobierz ciecz do igły zgodnie z instrukcją producenta. Próbką cieczy może być roztwór dsRNA, zawiesina bakteryjna lub inny preparat; proces iniekcji jest taki sam dla wszystkich. Umieść szklaną płytkę Petriego w wiadrze z lodem tak, aby dno płytki w pełni stykało się z lodem. To tutaj będziesz trzymać komary do momentu ich iniekcji. </li>
<li>Przygotuj komary. Przenieś 50-100 komarów ze zbiornika na szklaną płytkę Petriego. Za pomocą pęsety rozdziel je do jednej warstwy, dbając o to, aby większość z nich stykała się z zimnym dnem płytki, by pozostały znieczulone. Przykrywaj komary pokrywką płytki, gdy ich nie używasz. Wróć zbiornikiem do wiadra z lodem, aby utrzymać pozostałe komary w stanie znieczulenia. </li>
<li>Umieść komary na bloku chłodzącym. Za pomocą pęsety z cienkimi końcami przenoś komary pojedynczo z płytki na szkiełko przedmiotowe zamontowane na bloku chłodzącym pod mikroskopem świetlnym. Chwytaj komary delikatnie, najlepiej za odnóża. Ułóż do 30 komarów obok siebie na szkiełku, upewniając się, że masz dostęp do każdego z nich mikroinjektorem i że każdy z nich styka się z zimnym szkiełkiem. Ułóż komary uporządkowanie, abyś w trakcie pracy wiedziała, które z nich zostały już poddane iniekcji, a które nie. Pozostałe komary pozostaw pod przykryciem w schłodzonej płytce Petriego. </li>
<li>Wykonaj iniekcje w pierwszej grupie komarów. Trzymaj pęsetę z cienkimi końcami w jednej ręce, a mikroinjektor w drugiej, niczym ołówek. Używaj pęsety do przesuwania komara w razie potrzeby (chwytaj go za odnóża, aby uniknąć obrażeń) oraz do stabilizacji komara podczas iniekcji. Najlepiej sprawdza się podpieranie jedną stroną komara pęsetą podczas wstrzykiwania z drugiej strony. Ostrożnie wprowadź samą końcówkę igły w przedplecze komara. Najlepiej wstrzykiwać w napiętą, ale cienką część kutykuli, aby zminimalizować urazy. Unikaj również zbyt głębokiego wprowadzania igły; w klatce piersiowej powinna znajdować się tylko końcówka; głębsze iniekcje powodują większe rany, co pogorsza przeżywalność. Gdy końcówka igły znajdzie się na miejscu, naciśnij i zwolnij pedał mikroinjektora, co poda ustawioną objętość dsRNA. Odczekaj sekundę lub dwie i wyjmij igłę z komara. Jeśli na zewnątrz miejsca ukłucia pojawi się kropla cieczy, odczekaj kilka sekund, aż zostanie wchłonięta w ranę. Jeśli nie zostanie wchłonięta w ciągu kilku sekund, odrzuć tego komara i spróbuj ponownie. Kontynuuj proces iniekcji dla wszystkich komarów na szkiełku. </li>
<li>Przechowuj komary. Po zakończeniu umieść zainfekowane komary w oznakowanych pojemnikach (preferujemy kartonowe kubki o pojemności 1 pinta z woskową wyściółką, przykryte siatką i zabezpieczone gumkami oraz kartonową pokrywką). </li>
<li>Kontynuuj iniekcje do momentu zakończenia. Kontynuuj układanie komarów na szkiełku, wykonywanie iniekcji i przenoszenie ich do kubków, aż uzyskasz pożądaną wielkość próby. Uwzględnij pewną liczbę zgonów – osoby początkujące mogą doświadczyć dużej śmiertelności komarów z powodu urazu podczas iniekcji. Sytuacja ta poprawi się wraz z praktyką, aż prawie 100% komarów będzie przeżywać zabieg. </li>
<li>Po zakończeniu połóż na kubku złożony, mokry ręcznik papierowy wraz ze źródłem pożywienia i przykryj kubki czymś, co zatrzyma wilgoć, np. folią spożywczą lub plastikową pokrywką od płytki Petriego. Komary po iniekcji są podatne na wysychanie, dlatego wilgoć dostarczana przez mokry ręcznik i zatrzymywana przez plastik pomoże temu zapobiec. </li>
<li>Umieść komary w komorze z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi do inkubacji. </li>
</ol>
Uwaga: Efektywność wyciszania genów jest bardzo zmienna i zależy od szeregu czynników, w tym od tempa obrotu transkryptów i białek oraz od wydajności pobierania dsRNA przez komórki i organy. Stwierdziliśmy, że wyciszanie rozpoczyna się już 1 dzień po wstrzyknięciu i może trwać do 6 dni po wstrzyknięciu. W celu walidacji wyciszania należy zastosować metody detekcji transkryptów i białek, takie jak ilościowy PCR oraz Western blotting.
Uwaga: Istnieje kilka wariantów wielu etapów techniki wstrzykiwania u komarów oraz wyciszania genów za pomocą RNAi. Niektóre z tych wariantów zostały opisane przez: Boisson, et al. (2006) oraz Blandin, et al.(2002).

<ol><li>Boisson,, et al. , (2006).</li>
<li>Blandin,, et al. , (2002).</li>
</ol>

Wydajność wyciszania genów jest bardzo zmienna i zależy od wielu czynników, w tym od tempa obrotu transkryptów i białek oraz wydajności pobierania dsRNA przez komórki i organy. Stwierdziliśmy, że wyciszanie rozpoczyna się już 1 dzień po iniekcji i może trwać do 6 dni po iniekcji. W celu walidacji wyciszania należy zastosować metody detekcji transkryptów i białek, takie jak ilościowa PCR oraz Western blotting.

<table><tbody><tr><td>Megascript</td><td>zestaw</td><td>Ambion</td><td></td><td>do syntezy dsRNA; reakcja transkrypcji in vitro za pośrednictwem polimerazy RNA T7</td></tr><tr><td>RNeasy</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td>Do oczyszczania dsRNA</td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td></td><td>należy określić ilość i dostosować stężenie do 3 &amp;#x03BC;g/ &amp;#x03BC;L w wodzie</td></tr><tr><td>pęseta z cienkimi końcówkami</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szkiełko przedmiotowe</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szklane igły mikrokapilarne</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroinjektor</td><td></td><td>Drummond Scientific</td><td>Nanoject II</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop świetlny</td><td></td><td></td><td></td><td>zamontowany nad blokiem chłodzącym</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td></td><td></td><td></td><td>szklana, z przykrywką</td></tr><tr><td>ręczniki papierowe</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% sacharoza</td><td>pokarmowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A. gambiae</td><td>Zwierzę</td><td></td><td></td><td>komary</td></tr></tbody></table>

protokół analiz rnai u dorosłych komarów (a. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Metody genetyki odwrotnej okazały się niezwykle przydatne w określaniu, które geny odpowiadają za oporność komarów na patogeny przenoszone przez wektory. Niniejszy protokół wideo przedstawia metodę stosowaną w laboratorium Dimopoulosa do wstrzykiwania dsRNA komarom Anopheles gambiae, będącym żywicielami pasożyta malarii. Przedstawiono technikę przygotowania zestawu do iniekcji oraz proces wstrzykiwania dsRNA do klatki piersiowej owada.

Metody genetyki odwrotnej okazały się niezwykle użyteczne w określaniu, które geny odpowiadają za odporność komarów na patogeny przenoszone przez wektory. Niniejszy protokół wideo przedstawia metodę stosowaną w laboratorium Dimopoulosa do wstrzykiwania dsRNA komarom Anopheles gambiae, będącym nosicielami pasożyta malarii. Przedstawiono technikę przygotowania zestawu do iniekcji oraz proces wstrzykiwania dsRNA do klatki piersiowej owada.

Protokół analiz RNAi u dorosłych komarów (A. gambiae)

Podejścia genetyki odwrotnej okazały się niezwykle użyteczne w określaniu, które geny odpowiadają za oporność komarów na patogeny przenoszone przez wektory. To wideo...

Nazywam się Lindsay Garver i jestem doktorantką w laboratorium dr. George'a Dimopoulosa w Johns Hopkins School of Public Health. Przedstawię Państwu sposób uciszania genów za pomocą RNAi z wykorzystaniem techniki wstrzykiwania. Pierwszym krokiem jest zebranie komarów, których będziemy poddawać tej procedurze.Są to po prostu okazy laboratoryjne gatunku Gabi. Jest to mieszanka osobników płci męskiej i żeńskiej. A to jest nasz aspirator zasilany bateryjnie.Wewnątrz znajduje się wentylator, który wytwarza ssanie, wciągając komary przez tę dyszę do zbiornika. Odłączamy urządzenie. Mamy małe drzwiczki dostępowe, które zazwyczaj są zaklejone taśmą, aby zapobiec ucieczce komarów, ale otwieramy je, wkładamy dyszę, włączamy urządzenie i przystępujemy do odłowu.Gdy komary znajdą się wewnątrz, zatykamy górną część dyszy, obserwując owady w zbiorniku. Następnie należy znieczulić komary. W tym celu umieszczamy zbiornik w wiaderku z lodem, przykrywamy go warstwą lodu i czekamy, aż komary stracą aktywność.Kolejnym krokiem jest iniekcja komarów. W tym celu użyjemy urządzenia NanoJet II. Składa się ono z części w postaci ręcznego aplikatora, który będę trzymać, oraz igły, za pomocą której podamy pły

protocol-for-rnai-assays-in-adult-mosquitoes-a-gambiae

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokół badań RNAi u dorosłych komarów (A. gambiae)

Niniejszy film przedstawia ogólne techniki stosowane w hodowli Anopheles gambiae w warunkach laboratoryjnych. Metody opieki nad komarami laboratoryjnymi są zaprezentowane na wszystkich etapach cyklu życiowego organizmu: od larw i poczwarek po dorosłe osobniki pobierające krew.

Protokół hodowli komarów (A. gambiae)

W niniejszym protokole łączymy wyciszanie genów za pomocą RNAi z testem diurezy in vivo, aby zbadać wpływ wyciszenia wybranych genów na wydalanie płynów przez komary.

Wyciszenie genów za pomocą RNAi oraz test diurezy in vivo u dorosłych samic komarów Aedes aegypti

Analizy RNA-Seq stają się coraz ważniejsze dla identyfikacji molekularnych podstaw cech adaptacyjnych w organizmach niemodelowych. W tym miejscu opisano protokół identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji między komarami Aedes albopictus z diapauzą i bez diapauzy, od hodowli komarów po sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne danych RNA-Seq.

Eksperymentalny i bioinformatyczny protokół do analiz sekwencyjnych RNA diapauzy fotoperiodycznej u azjatyckiego komara tygrysiego, Aedes albopictus

Komary przenoszące malarię mają wiele ważnych epidemiologicznie cech, które można wykryć tylko za pomocą technik molekularnych. Wykorzystując platformę genotypowania SNP opartą na MALDI-TOF, opracowaliśmy test do jednoczesnego wykrywania wielu kluczowych cech (gatunek, odporność na insektycydy, zakażenie pasożytami i wybór żywiciela) wektorów malarii.

Test z wieloma wykrywaniami komarów przenoszących malarię

Tutaj opisujemy procedurę hamowania funkcji genów u komarów wektorów chorób za pomocą chitozanu/interferujących nanocząsteczek RNA, które są połykane przez larwy.

Wyciszanie genów za pośrednictwem chitozanu/interferujących nanocząstek RNA w larwach komarów wektorów chorób

Interferencja RNA (RNAi) jest niezwykle cennym narzędziem do odkrywania funkcji genów. Jednak zdolność do celowania w geny za pomocą RNAi w stadiach przeddorosłych jest ograniczona w przypadku głównego wektora malarii u ludzi Anopheles gambiae. Opisujemy protokół RNAi w celu zmniejszenia funkcji genu poprzez bezpośrednią iniekcję podczas rozwoju poczwarki.

Dostarczanie RNAi do poczwarek Anopheles gambiae

Ten protokół opisuje metodologię mikroiniekcji, którą ustandaryzowaliśmy i stosowaliśmy przez kilka lat, aby dostarczyć określone ilości kwasów nukleinowych bezpośrednio do hemolimfy komarów i much domowych. Protokół ten skutkuje minimalną śmiertelnością po wstrzyknięciach i umożliwia pomiary płodności skorelowane z dawką.

Powtarzalny test biologiczny mikroiniekcji dsRNA i składania jaj u komarów i much domowych

Dwuczęściowy system GAL4-UAS jest wszechstronnym narzędziem do modyfikacji ekspresji genów w kontrolowany sposób czasoprzestrzenny, co pozwala na funkcjonalną analizę genetyczną w Anopheles gambiae. Opisane procedury korzystania z tego systemu to częściowo ustandaryzowana strategia klonowania, określanie płci i badanie przesiewowe poczwarek pod kątem fluorescencyjnych markerów białkowych i utrwalanie zarodków.

Wykorzystanie systemu GAL4-UAS do genetyki funkcjonalnej u Anopheles gambiae

Ten protokół zapewnia kroki od ekstrakcji DNA do eksperymentalnego przygotowania do cyfrowego PCR kropelkowego (ddPCR), w tym analizę do identyfikacji i kwantyfikacji zdarzeń niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) w miejscach docelowych po indukowanym przez gRNA rozszczepieniu Cas9 i naprawie DNA. Inne zastosowania tej metody obejmują takie zastosowania, jak wykrywanie polimorfizmu i weryfikacja wariantów edycji genów.

Cyfrowa kropelkowa reakcja PCR w celu wykrycia mutacji indeli w genetycznie zmodyfikowanych populacjach komarów Anopheline

Ten artykuł opisuje protokół szybkiej identyfikacji indeli indukowanych przez CRISPR/Cas9 i selekcji linii mutantów u komara Aedes aegypti za pomocą analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Wykrywanie indel po mutagenezie CRISPR/Cas9 przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości u komara Aedes aegypti

Doustne podawanie dsRNA wytwarzanego przez bakterie, metoda dostarczania interferencji RNA (RNAi), która jest rutynowo stosowana u Caenorhabditis elegans, została tutaj z powodzeniem zastosowana u dorosłych komarów. Nasza metoda pozwala na rzetelne badania genetyki odwrotnej i badania wektorów blokujących transmisję bez użycia iniekcji.

Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae

Poznaj metodę wyciszania genów RNAi u komarów Anopheles gambiae poprzez wstrzyknięcie dsRNA do tułowia. Technika ta umożliwia badanie funkcji genów związanych z odpornością na patogeny malarii.

Protokół analiz RNAi u dorosłych komarów (A. gambiae)

Przeglądaj więcej filmów