Protokół oznaczania RNAi u dorosłych komarów (A. gambiae)

Nazywam się Lindsay Garver i jestem doktorantką w laboratorium dr George'a Dimopoulosa w Johns Hopkins School of Public Health. Pokażę wam, jak wyciszać geny za pośrednictwem RNAi za pomocą techniki iniekcji. Pierwszym krokiem jest więc zebranie komarów, które zamierzamy wstrzyknąć.

To są po prostu strasznie Gabi. To mieszanka samców i kobiet. A to jest nasz aspirator zasilany bateryjnie.

Ma wewnątrz wentylator, który wytworzy ssanie, wciągając komary przez tę dyszę do tego zbiornika. Więc odłączamy się. Mamy małe drzwiczki dostępowe, które zwykle są zaklejone taśmą, aby utrzymać komary w środku, ale otwieramy je i wkładamy dyszę, włączamy ją i używamy do zbierania.

Gdy mamy już komary w środku, zatykamy górną część dyszy, widzimy komary w zbiorniku. Następnie chcemy znieczulić te komary. Zakopujemy więc ten zbiornik w wiaderku z lodem, przykrywamy lodem i czekamy, aż komary opadną.

Okej, następnym krokiem jest wstrzyknięcie komarów i aby tego użyć, będziemy używać tego, co jest nano jet dwa. Składa się z porcji różdżki, którą będę trzymał w ręku. A to będzie zawierało igłę, która dozuje płyn do komara.

Panel sterowania, na którym znajdują się nasze przyciski napełniania i opróżniania oraz odpowiada za wciąganie i wyjmowanie płynu z igły. A to jest nóżka. To zostanie umieszczone na podłodze.

A popychanie tego stopą spowoduje dozowanie jednej kropli odpowiedniej objętości do komara. Tak więc, gdy komary są na lodzie, przygotowujemy stanowisko pracy, ustawiając zimny blok na zero stopni do dwóch stopni Celsjusza. Ten zimny blok ma płaską nasadkę, na której następnie zamontowano szklaną prowadnicę.

A to sprawi, że komary nie będą się poruszać, gdy będziemy próbować nimi manipulować. Wezmę też jedną z tych szklanych igieł kapilarnych. Jest to po prostu zwykła szklana rurka kapilarna, która została podgrzana i wciągnięta w środek, aby utworzyć igłę.

I to jest to, co utrzyma nasz płyn. A potem to jest to, czego użyjemy do wstrzyknięcia komara i dozowania płynu. Następną rzeczą, którą musimy zrobić, to umieścić igłę kapilarną na naszej różdżce do wstrzykiwania.

Usuwamy końcówkę do nosa. Upewnij się, że pierścienie wewnętrzne są umieszczone zgodnie z instrukcjami producenta. Wsuń szklaną igłę w dół do końcówki nosowej, uważając na końcówkę, aby jej nie złamać.

Gdy to się upewni, wsuń igłę różdżki do igły kapilarnej i mocno przykręć końcówkę nosową. Następną rzeczą jest upewnienie się, że igła rurki kapilarnej ma odpowiednią szerokość do wstrzykiwań. Jest to bardzo ważny punkt, ponieważ zbyt cienka igła nie dozuje odpowiedniej ilości płynu, a zbyt gruba końcówka igły zrani komara i może spowodować śmierć.

Jest to coś, co wymaga dużo praktyki, ale dobra szerokość jest w rzeczywistości kluczowa dla prawidłowego wstrzyknięcia i przetrwania komarów. To, co robię, to używanie kleszczyków z cienką końcówką, aby złamać końcówkę igły, tak aby igła była nadal elastyczna, ale stabilna. Potrzebujemy naszej dwuniciowej próbki RNA.

Próbka ta została przygotowana przy użyciu zestawu. Na rynku dostępnych jest wiele zestawów, które mogą generować specyficzne RNA o podwójnym standardzie dla interesującego genu. Używamy naszych RNA w stężeniu trzech mikrogramów na mikrolitr i mamy nasz zestaw do wstrzykiwania nano tak, że jedno wstrzyknięcie dozuje 69 nanolitrów.

Rurka wkłada igłę do płynu i używa przycisku napełniania na wysuwaniu n, aby pobrać płyn do igły. Ilość płynu, która będzie potrzebna w igle, jest wprost proporcjonalna do liczby komarów, które będziesz wstrzykiwać. Porządku? A teraz musimy przygotować komary.

Bierzemy więc nasze plastikowe naczynie P two i umieszczamy je w naszym wiadrze z lodem. Sprawdzamy, czy nasze komary się nie poruszają i rozkładamy je cienko na zimnej szalce Petriego. Gwarantuje to, że podczas pracy komary się nie poruszają i nie latają.

Następnie umieszczamy komary na naszym szklanym szkiełku, które ma teraz temperaturę zero stopni Celsjusza. A ułożenie komarów ma kluczowe znaczenie dla tego, jak je wstrzykujemy. Więc chcesz, aby twoje komary były ustawione w porządku, abyś wiedział, które zostały wstrzyknięte, a które nie.

Zależy Ci również na tym, aby między komarami było wystarczająco dużo miejsca, abyś mógł do nich dotrzeć za pomocą wtryskiwacza. Przenosimy więc pojedyncze komary z naczynia do siusiania na zjeżdżalnię, uważając, uważając, aby dotykać ich za nogi. Pozwala to uniknąć zgniecania ciał i skutkuje większą przeżywalnością.

Więc teraz jesteśmy gotowi do wstrzyknięcia. Używamy kleszczyków z cienką końcówką, aby podeprzeć komara z jednej strony, jestem praworęczny, więc używam tego w lewej ręce. A następnie wstrzykujemy z drugiej strony, wkładając końcówkę igły w bok klatki piersiowej, tak aby klatka piersiowa komara była wciśnięta między końcówki kleszczy a punkt igły, a punkt igły wchodzi.

Gdy końcówka igły znajdzie się w klatce piersiowej, naciśnij pedał nożny, usłyszysz sygnał dźwiękowy i płyn zostanie dozowany do klatki piersiowej komara. Następnie przechodzisz do następnego i powtarzasz. Raz na jakiś czas, po wyjęciu igły, zobaczysz kroplę płynu, która opuściła miejsce wejścia.

A jeśli tak się stanie, możesz poczekać, aż płyn zostanie ponownie wchłonięty w miejsce wejścia. Jeśli tak się stanie, to w porządku. Jeśli kropla nie zostanie ponownie wchłonięta, jeśli kropla pozostanie na zewnątrz klatki piersiowej, to ten komar musi zostać wyrzucony, a ty wstrzykujesz inny w jego miejsce.

Ważne jest również, aby upewnić się, że igła wchodzi tylko tak głęboko w klatkę piersiową, jak to konieczne. Nie chcesz przebić się na drugą stronę ani pozwolić, aby igła przeszła przez nią o zbyt dużej szerokości. Przeżywalność klatki piersiowej lub komara będzie zagrożona.

Więc kontynuujemy tę procedurę dla wszystkich komarów w razie potrzeby. Tak więc do przechowywania wstrzykniętych komarów użyliśmy jednolitrowego kartonowego kubka wyłożonego woskiem, który został pokryty cienką siatkową siatką i zabezpieczony gumką i tekturową pokrywką. Otworzyliśmy drzwi wejściowe, które są pokryte taśmą i ostrożnie dodajemy nasze komary, aby pomóc Twoim komarom przetrwać.

Powinieneś dodać wacik, który został połączony z 10% roztworem sacharozy, który działa jako źródło pożywienia dla komarów, gdy są tutaj. I wilgotny złożony ręcznik papierowy. Ponieważ zranione komary mają tendencję do wysychania, pomoże to zachować wilgotność i pomoże przetrwać komary, którym wstrzyknięto

Uzupełniamy to pokrywką Petriego, aby zatrzymać wilgoć, dzięki czemu nasz ręcznik papierowy i waciki pozostaną mokre. A następnie inkubujemy je w normalnych warunkach kontrolowanych przez środowisko. Tak więc kinetyka molekularna wyciszania genów za pośrednictwem RNAi różni się znacznie w zależności od genu.

Tak więc w przypadku niektórych genów wyciszenie może nastąpić w ciągu jednego dnia, a w przypadku innych genów skuteczne wyciszenie nie nastąpi przez kilka dni. Różnice między każdym genem można zmierzyć za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, który będzie monitorował poziomy transkryptu w komarach i poinformuje Cię, kiedy osiągnąłeś skuteczne wyciszenie. Dlatego zalecałbym odłożenie na bok kilku komarów, którym wstrzyknięto w tym celu.

Pomoże Ci to również określić, jak wydajne są Twoje dwuniciowe RNA w ogóle, czy Ty, Twoje konkretne dwuniciowe RNA możesz osiągnąć skuteczne wyciszenie. A jeśli faktycznie ingerujesz w poziomy transkryptów, właśnie pokazałem ci procedurę wyciszania genów za pośrednictwem RNAi u anomalnych komarów z Gambii. Procedura ta polega na mikrowstrzyknięciu dwuniciowych RNA do klatki piersiowej komarów Anole Gabi.

Ta procedura jest ważna, ponieważ jest to jedno z najłatwiejszych i najskuteczniejszych odpadów do manipulowania pojedynczymi genami u komarów.