Name: Mysi model przeszczepu in utero (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj metodę przeszczepu in utero w mysich płodach do badań nad terapią komórkową i genową. Technika umożliwia ocenę wszczepienia komórek oraz ekspresji genów w środowisku płodowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować naszym sponsorom: California Institute for Regenerative Medicine Clinical Fellow Training Grant (AN), National Science Foundation (MW), Irene Perstein Award (TCM), American College of Surgeons (TCM), American Pediatric Surgical Association (TCM) oraz March of Dimes (TCM).

1. Przygotowanie pipet do iniekcji
<ol>
<li>Skalibruj wyciągacz pipet w taki sposób, aby oddzielenie szklanej pipety następowało w ciągu 15 sekund (patrz instrukcje producenta dotyczące kalibracji). Pipeta będzie miała zwężenie w miejscu oddzielenia.</li>
<li>Odetnij koniec pipety tak, aby odległość od początku zwężenia do końca pipety wynosiła od 1,04 cm do 1,05 cm. Długość pipety jest odwrotnie proporcjonalna do kalibru otworu pipety. Należy pamiętać, że wykonanie dłuższej pipety skutkuje również słabszą końcówką, która jest bardziej podatna na złamanie podczas wstrzykiwania.</li>
<li>Kolejnym krokiem w przygotowaniu pipety jest stworzenie gładkiego ścięcia poprzez ostrzenie końcówki na diamentowej tarczy szlifującej. W momencie przycinania pipety do odpowiedniego rozmiaru często pęka ona, tworząc naturalne ścięcie na końcówce, które należy wykorzystać podczas przykładania pipety do tarczy. Podczas tego procesu ważne jest, aby delikatnie opierać pipetę o tarczę szlifującą i okresowo sprawdzać, czy pipeta nadal z nią styka), ponieważ w miarę wygładzania ścięcia będzie ona tracić kontakt z tarczą szlifującą.</li>
<li>Gdy ścięcie będzie gładkie, należy zaostrzyć końcówkę pipety (Rycina 1). Unieś pipetę tak, aby nie dotykała już tarczy szlifującej, obróć ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 10-50 stopni i ponownie umieść pipetę na obracającej się tarczy szlifującej przez około 10 sekund. Wyjmij pipetę z tarczy szlifującej i sprawdź krawędź. Ten krok zazwyczaj musi być powtórzony z kilkoma niewielkimi korektami, aby uzyskać ostrą krawędź. Jeśli pipeta będzie opierać się o krawędź zbyt długo, istnieje większe prawdopodobieństwo powstania nierównej powierzchni (Rycina 1). Po ukończeniu jednej strony można przejść do ostrzenia przeciwległej krawędzi, powtarzając powyższe kroki.</li>
<li>Użyj permanentnego markera, aby narysować linię okrężną co 4 mm, zaczynając od miejsca, w którym zaczyna się zwężenie pipety. Oznaczenia te odpowiadają objętości 5 µL.</li>
</ol>
2. Transplantacja in utero
<ol>
<li>Po przygotowaniu materiału do wstrzyknięcia (np. komórek, wirusa itp.) można przystąpić do przygotowania mikroiniekcji. Używamy mikroinjektora podłączonego do sprężonego powietrza z następującymi ustawieniami: (Ustawienia ciśnienia: wejście 60-80 psi, napełnianie 40 psi, wtrysk 8-12 psi, balans 0 psi, podtrzymanie 0 psi; czas wtrysku 100 milisekund).</li>
<li>Aby wysterylizować pipetę do iniekcji, należy ją dwukrotnie przemyć 70% EtOH, a następnie dwukrotnie sterylnym 1X PBS. Ze względu na to, że końcówka pipety jest bardzo krucha, nie zaleca się autoklawowania pipet do iniekcji.</li>
<li>Iniekcje można wykonywać przy użyciu lup o powiększeniu 2,5X-3,5X lub mikroskopu sekcyjnego. Przygotuj obszar zabiegowy, zapewniając podgrzewacz, oświetlenie i niezbędne instrumenty chirurgiczne.</li>
<li>Zpodaj znieczulenie ciężarnej myszy (stosujemy izofluran i tlen dostarczane przez jednostkę do ciągłego przepływu gazów anestezjologicznych). Umieść mysz na macie grzewczej w pozycji na plecach i przymocuj każdą kończynę taśmą, aby unieruchomić zwierzę.</li>
<li>Ogol futro. Następnie, w sterylnych rękawiczkach chirurgicznych, przygotuj brzuch, przemywając go 10% powidon-jodem, a następnie alkoholem, i podaj lek przeciwbólowy, taki jak buprenorfina.</li>
<li>Wykonaj cięcie o długości 1 cm w dolnej części brzucha (dolna krawędź cięcia powinna znajdować się około 1 cm powyżej introitus). Przetnij skórę i powięź. Należy uważać, aby nie uszkodzić narządów brzusznych (jelit i pęcherza), które znajdują się bezpośrednio pod cienką warstwą powięzi.</li>
<li>Używając patyczków waty, delikatnie rozszerz powięź i wysuń ciążową macicę przez nacięcie. Policz całkowitą liczbę płodów, identyfikując najpierw prawy i lewy jajnik, aby upewnić się, że cała macica jest widoczna. Przed przejściem do dalszych kroków umieść macicę z powrotem w jamie brzusznej, aby płody pozostały ciepłe podczas przygotowań do iniekcji.</li>
<li>Pobierz odpowiednią objętość materiału dla liczby płodów, którym planujesz wykonać iniekcje. Podczas napełniania igły próbką ważne jest, aby końcówka pipety pozostała zanurzona, co zapobiegnie zassaniu próbki do przewodów mikroinjektora. Ponieważ komórki zazwyczaj znajdują się w małej objętości, zazwyczaj umieszczamy je w małej probówce do wirówki (np. 0,5 mL) lub bezpośrednio na kawałku Parafilmu, aby móc napełnić igłę bez złamania końcówki pipety.</li>
<li>Delikatnie chwyć każdego płoda i zidentyfikuj część ciała, w którą planujesz wstrzyknąć materiał (np. wątrobę, jamę otrzewną, nogę itp.). Kciukiem i palcem wskazującym należy ustabilizować płód w jamie owodniowej, aby nie obracał się podczas wykonywania iniekcji. Ważne jest, aby trzymać płoda wystarczająco mocno, by go ustabilizować, ale jednocześnie delikatnie, aby go nie uszkodzić.</li>
<li>Ostrożnie wprowadź pipetę przez macicę, owodnię i skórę płoda, aż do organu docelowego. Jeśli pipeta jest ostra, powinna łatwo przejść przez te tkanki. Jeśli końcówka pipety jest tępa, zauważysz napinanie się macicy i błon owodniowych. Wstrzyknij pożądaną objętość do każdego płoda. Niezbędne jest, aby ruchy podczas wprowadzania, wtryskiwania i wycofywania pipety były stabilne.</li>
<li>Po wstrzyknięciu pożądanej objętości ostrożnie wycofaj pipetę. Jeśli zabieg wykonano prawidłowo, materiał nie powinien wyciekać z jamy owodniowej ani macicy. Jeśli w owodni powstanie duży otwór, co można rozpoznać po wycieku płynu owodniowego, przeżycie płoda jest zagrożone. W przypadku badań obejmujących pobieranie materiału po narodzinach, wszystkie płody muszą otrzymać technicznie idealne iniekcje, ponieważ po urodzeniu nie ma możliwości odróżnienia płodów wstrzykniętych od niewstrzykniętych.</li>
<li>Jeśli wykonujesz iniekcje do wątroby płodowej, po wycofaniu pipety możesz czasami zauważyć krew w jej końcówce – potwierdza to prawidłowe umiejscowienie i nie powinno wpłynąć na przeżywalność. W przypadku iniekcji dosytrawnowych celuj nieco poniżej wątroby płoda. W przypadku iniekcji domięśniowych możesz ułożyć płoda tak, aby zidentyfikować biodro i kość udową, a następnie wstrzyknąć materiał w mięsień pośladkowy. W przypadku iniekcji domózgową do komór bocznych, łatwo jest zlokalizować szwy wieńcowe, aby skierować pipetę do odpowiedniego celu. Do tych iniekcji wymagane są pipety o nieco większym przekroju, aby przebić czaszkę bez złamania narzędzia.</li>
<li>Następnie ostrożnie umieść macicę z powrotem w jamie brzusznej. Upewnij się, że nie jest ona skręcona ani nie uciska swoich naczyń krwionośnych. Podaj 1 mL sterylnego 1X PBS do jamy otrzewnej matki, aby uzupełnić płyny utracone podczas procedury. Zamknij nacięcie w dwóch warstwach za pomocą plecionej wchłanialnej nici 5-0 (np. Vicryl). Najpierw zamknij powięź, nie uszkadzając leżących poniżej jelit ani pęcherza, a następnie zamknij skórę.</li>
<li>W tym momencie można podać leki przeciwbólowe po zabiegu. Przenieś każdą wstrzykniętą samicę do osobnej klatki i ustaw klatkę na podgrzewaczu. Monitoruj mysz, aż odzyska pełną sprawność i stanie się aktywna. Włóż ściółkę do klatki i umieść mysz w spokojnej części pomieszczenia dla zwierząt, gdzie nie będzie ona niepokojona (np. poprzez sprzątanie klatki) przez kilka dni po porodzie. Minimalizowanie dodatkowego stresu zwierzęcia zmniejszy ryzyko przedwczesnego porodu.</li>
<li>Po zakończeniu iniekcji przemyj pipetę dwukrotnie sterylnym 1X PBS i raz 70% EtOH.</li>
<li>Samicami po zabiegu należy opiekować się codziennie, aby upewnić się, że powracają do zdrowia bez trudności. Nacięcie powinno być monitorowane pod kątem obrzęku, stanu zapalnego, rozejścia się rany oraz innych oznak infekcji. W razie potrzeby można podawać przeciwbólowe leki pooperacyjne.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki:
Przeżywalność wstrzykniętych płodów do terminu porodu jest głównym czynnikiem ograniczającym sukces tej techniki. W zależności od wstrzykniętego materiału i użytej szczepu myszy, wskaźniki przeżywalności mogą się różnić. Ogólnie wstrzyknięcie komórek krwiotwórczych do myszy typu dzikiego w dniu E14 powinno skutkować narodzinami co najmniej 50% żywych szczeniąt. Wyższe wskaźniki przeżywalności są możliwe w zależności zarówno od aspektów technicznych wstrzyknięcia, jak i od charakterystyki wstrzykiwanych myszy.
Minimalizacja urazów macicy i błon płodowych jest najważniejszym aspektem technicznym niniejszego protokołu. Zastosowanie ostrych pipet o małej średnicy pozwoli ograniczyć urazy macicy podczas wstrzykiwania. Nie zalecamy stosowania standardowych igieł do iniekcji, ponieważ ich średnica jest zbyt duża, co doprowadziłoby do powstania dużego otworu w macicy. Ręcznie wykonane szklane pipety do iniekcji są jedynymi igłami o małej średnicy, które można wykorzystać do iniekcji in utero. Dla uzyskania optymalnych wyników kluczowa jest również uważna i precyzyjna technika chirurgiczna, obejmująca delikatne obchodzenie się z macicą oraz krótkotrwałe znieczulenie.
Na przeżywalność mogą wpływać również specyficzne cechy myszy biorców, takie jak tło genetyczne, wiek ciążowy oraz wielkość miotu. Pewne szczepy myszy są bardziej podatne na przedwczesny poród i utratę ciąży w zależności od ich tła genetycznego.15 Zwierzęta transgeniczne z wadami mięśniowymi lub neurodegeneracyjnymi mogą mieć upośledzoną zdolność do rodzenia płodów drogą pochwową po wykonaniu laparotomii w linii pośrodkowej.8 U tych ciężarnych samic może być konieczne zastosowanie cięcia cesarskiego. Stwierdziliśmy również, że wiek ciążowy w momencie iniekcji może wpływać na żywotność. Płody młodsze niż w 12. dniu embrionalnym wykazują niższą przeżywalność niż płody starsze. Wreszcie zauważyliśmy, że w przypadku dużych miotów (&gt;10 płodów) występuje tendencja do wyższej śmiertelności płodów po iniekcji. Dbałość zarówno o aspekty techniczne tej metody, jak i o specyficzne cechy iniekcyjnych myszy, może zmaksymalizować przeżywalność wstrzykniętych płodów.
Przy prawidłowym wykonaniu tych metod można oczekiwać, że wszystkie płody zostaną poddane działaniu wstrzykniętego materiału. Jednak podobnie jak w warunkach pozłodowych, skuteczne dostarczenie komórek lub wirusów in utero nie zawsze skutkuje odpowiednio przyjęciem komórek donora lub ekspresją genów. Przyjmowanie komórek macierzystych zależy na przykład od kilku czynników, takich jak dawka i źródło przeszczepianych komórek. Podobnie sukces transdukcji wirusowej jest częściowo określany przez rodzaj zastosowanego wektora wirusowego. Aby osiągnąć sukces w realizacji tego protokołu, należy zrozumieć liczne czynniki wpływające na przeżywalność młodych, przyjęcie komórek oraz transdukcję wirusową.

<img src="/files/ftp_upload/2303/2303fig1.jpg" alt="Schemat procesu ostrzenia igieł; zawiera widoki boczne i dolne tworzenia skosu i krawędzi." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat przedstawiający prawidłowe ostrzenie pipet wstrzykujących (Krok 1.4)

<ol><li>Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+in+utero+transplantation+of+paternal+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of X-linked severe combined immunodeficiency by in utero transplantation of paternal bone marrow.</a> N Engl J Med. 335, 1806-1810 (1996).</li>
<li>Wengler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-utero+transplantation+of+parental+CD34+haematopoietic+progenitor+cells+in+a+patient+with+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+%28SCIDXI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">In-utero transplantation of parental CD34 haematopoietic progenitor cells in a patient with X-linked severe combined immunodeficiency (SCIDXI).</a> Lancet. 348, 1484-1487 (1996).</li>
<li>Flake, A. W., Zanjani, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+utero+hematopoietic+stem+cell+transplantation%3A+ontogenic+opportunities+and+biologic+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">in utero hematopoietic stem cell transplantation: ontogenic opportunities and biologic barriers.</a> Blood. 94, 2179-2191 (1999).</li>
<li>Merianos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119, 2590-2600 (2009).</li>
<li>Peranteau, W. H., Endo, M., Adibe, O. O., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+an+immune+barrier+after+in+utero+hematopoietic-cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for an immune barrier after in utero hematopoietic-cell transplantation.</a> Blood. 109, 1331-1333 (2007).</li>
<li>Kim, H. B., Shaaban, A. F., Yang, E. Y., Liechty, K. W., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microchimerism+and+tolerance+after+in+utero+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Microchimerism and tolerance after in utero bone marrow transplantation in mice.</a> J Surg Res. 77, 1-5 (1998).</li>
<li>Durkin, E. T., Jones, K. A., Rajesh, D., Shaaban, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+chimerism+threshold+predicts+sustained+engraftment+and+NK-cell+tolerance+in+prenatal+allogeneic+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Early chimerism threshold predicts sustained engraftment and NK-cell tolerance in prenatal allogeneic chimeras.</a> Blood. 112, 5245-5253 (2008).</li>
<li>Mackenzie, T. C., Shaaban, A. F., Radu, A., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+bone+marrow+and+fetal+liver+cells+after+in+utero+transplantation+in+MDX+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Engraftment of bone marrow and fetal liver cells after in utero transplantation in MDX mice.</a> J Pediatr Surg. 37, 1058-1064 (2002).</li>
<li>Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+chimerism+following+in+utero+hematopoietic+stem+cell+transplantation+in+murine+models+of+hemoglobinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mixed chimerism following in utero hematopoietic stem cell transplantation in murine models of hemoglobinopathy.</a> Exp Hematol. 31, 176-184 (2003).</li>
<li>Bouchard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+transgene+expression+in+cardiac+and+skeletal+muscle+following+fetal+administration+of+adenoviral+or+adeno-associated+viral+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Long-term transgene expression in cardiac and skeletal muscle following fetal administration of adenoviral or adeno-associated viral vectors in mice.</a> J Gene Med. 5, 941-950 (2003).</li>
<li>Meza, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+pyruvate+kinase+deficiency+in+mice+by+gene+therapy+using+the+human+isoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Rescue of pyruvate kinase deficiency in mice by gene therapy using the human isoenzyme.</a> Mol Ther. 17, 2000-2009 (2009).</li>
<li>MacKenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+liver+and+muscle+after+in+utero+injection+of+lentiviral+vectors+with+different+pseudotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of liver and muscle after in utero injection of lentiviral vectors with different pseudotypes.</a> Mol Ther. 6, 349-358 (2002).</li>
<li>MacKenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+satellite+cells+after+prenatal+intramuscular+administration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Transduction of satellite cells after prenatal intramuscular administration of lentiviral vectors.</a> J Gene Med. 7, 50-58 (2005).</li>
<li>Sabatino, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+expression+of+hF.IX+After+tolerance+induction+by+in+utero+or+neonatal+administration+of+AAV-1-F.IX+in+hemophilia+B+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Persistent expression of hF.IX After tolerance induction by in utero or neonatal administration of AAV-1-F.IX in hemophilia B mice.</a> Mol Ther. 15, 1677-1685 (2007).</li>
<li>Mellor, A. L., Munn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+at+the+maternal-fetal+interface%3A+lessons+for+T+cell+tolerance+and+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology at the maternal-fetal interface: lessons for T cell tolerance and suppression.</a> Annu Rev Immunol. 18, 367-391 (2000).</li>
<li>Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actively+acquired+tolerance+of+foreign+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Actively acquired tolerance of foreign cells.</a> Nature. 172, 603-606 (1953).</li>
<li>Endo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+ocular+stem+cells+by+early+gestational+intraamniotic+injection+of+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to ocular stem cells by early gestational intraamniotic injection of lentiviral vector.</a> Mol Ther. 15, 579-587 (2007).</li>
<li>Waddington, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+transgene+expression+by+administration+of+a+lentivirus-based+vector+to+the+fetal+circulation+of+immuno-competent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice.</a> Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).</li>
<li>Schachtner, S., Buck, C., Bergelson, J., Baldwin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+regulated+expression+patterns+following+in+utero+adenovirus-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Temporally regulated expression patterns following in utero adenovirus-mediated gene transfer.</a> Gene Ther. 6, 1249-1257 (1999).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Ponad 50 lat temu Billingham, Brent i Medawar wykorzystali transplantację in utero u myszy w celu wywołania tolerancji immunologicznej na obce białka.16 Od tamtego czasu kilka wariantów tej techniki było stosowanych do rozwiązywania problemów w immunologii i biologii komórek macierzystych.
Opisany tutaj protokół jest jedną z najłatwiej dostępnych metod IUT. Wątroba płodu stanowi łatwo widoczny cel i zapewnia dostęp do krążenia systemowego poprzez żyłę wrotną i żyły wątrobo...

<table><tbody><tr><td>Pipety</td><td>Kimble Chase</td><td>71900-100</td><td></td></tr><tr><td>Wytwarzarka pipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-30</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>Narishige International</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>Ostrzałka do pipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model BV-10</td><td></td></tr></tbody></table>

model mysi transplantacji in utero

A Mouse Model of in Utero Transplantation

Transplantacja komórek macierzystych i wirusów in utero ma ogromny potencjał w leczeniu wad wrodzonych u ludzkiego płodu. Na przykład transplantacja in utero (IUT) hematopoetycznych komórek macierzystych została z sukcesem zastosowana w leczeniu pacjentów z ciężkim złożonym niedoborem odporności.1,2 Jednak w przypadku kilku innych schorzeń próby IUT nie przyniosły sukcesu.3 Biorąc pod uwagę te niejednoznaczne wyniki, dostępność wydajnego modelu pozaludzkiego do badania biologicznych następstw transplantacji komórek macierzystych i terapii genowej jest kluczowa dla rozwoju tej dziedziny. My oraz inni badacze wykorzystaliśmy mysi model IUT do badania czynników wpływających na pomyślny rozwój graftu z hematopoetycznych komórek macierzystych transplantowanych in utero zarówno u myszy typu dzikiego4-7, jak i u myszy z chorobami genetycznymi.8,9 Środowisko płodowe oferuje również znaczne korzyści dla powodzenia terapii genowej in utero. Na przykład dostarczenie do płodu wektorów adenowirusowych10, wirusów adeno-zależnych10, retrowirusowych11 oraz lentiwirusowych12,13 doprowadziło do transdukcji wielu narządów oddalonych od miejsca wstrzyknięcia z długotrwałą ekspresją genu. Terapia genowa in utero może zatem być rozważana jako możliwa strategia leczenia schorzeń monogenowych, takich jak dystrofia mięśniowa czy mukowiscydoza. Inną potencjalną zaletą IUT jest zdolność do indukowania tolerancji immunologicznej na konkretny antygen. Jak zaobserwowano u myszy z hemofilią, wprowadzenie czynnika IX we wczesnej fazie rozwoju skutkuje tolerancją na to białko.14 
Oprócz zastosowania w badaniach nad potencjalnymi terapiami dla ludzi, mysi model IUT może być potężnym narzędziem do badania podstawowych zagadnień z zakresu biologii rozwoju i biologii komórek macierzystych. Na przykład można dostarczać różne małe cząsteczki, aby indukować lub hamować ekspresję konkretnych genów na określonych etapach rozwoju płodowego i manipulować szlakami rozwojowymi. Wpływ tych zmian można oceniać w różnych punktach czasowych po wstępnej transplantacji. Co więcej, do środowiska płodowego można przeszczepiać pluripotencjalne lub liniowo specyficzne komórki progenitorowe, aby badać różnicowanie komórek macierzystych w nienaświetlonym i niezakłóconym środowisku gospodarza.
Myszie modele IUT dostarczyły już licznych informacji w dziedzinie immunologii oraz biologii rozwojowej i komórek macierzystych. W tym protokole wideo opisujemy krok po kroku sposób przeprowadzania IUT u płodów myszy oraz przedstawiamy kluczowe etapy i potencjalne trudności związane z tą techniką.

Myszowy model transplantacji in utero jest wszechstronnym narzędziem, które może być wykorzystywane do badania potencjalnych zastosowań klinicznych transplantacji komórek macierzystych oraz terapii genowej u płodu. W niniejszym protokole przedstawiamy ogólne podejście do wykonania tej techniki

Model mysi transplantacji in utero

Transplantacja komórek macierzystych i wirusów wewnątrzmacicznie posiada ogromny potencjał w leczeniu wad wrodzonych u ludzkiego płodu. Na przykład w...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest transplantacja komórek lub wirusów do płodów myszy. W pierwszej kolejności należy wykonać nacięcie na stronie brzusznej myszy. Następnie należy wyeksponować macicę wraz z płodami, a następnie przeprowadzić iniekcje in utero.Na koniec ostrożnie wprowadź macicę z powrotem do jamy otrzewnej, a następnie zaszyj powięź brzusną i skórę. Ostatecznie, w przypadku transplantacji komórek macierzystych do macicy oraz terapii genowej, można uzyskać wyniki wykazujące przeżycie komórek lub ekspresję genów za pomocą PCR, cytometrii przepływowej lub immunohistochemii. Dzięki naszym innowacyjnym strategiom leczenia wad wrodzonych przed narodzinami, możemy wykorzystać niedojrzały układ odpornościowy płodu, aby indukować tolerancję na komórki allogeniczne lub białka obce.Myszowy model transplantacji in utero pozwala nam badać czynniki biologiczne specyficzne dla płodu, które prowadzą do skutecznego przyjęcia przeszczepu i indukcji tolerancji. Technikę tę zaprezentuje teraz Amer Nial, chirurg i stażysta podoktorski w moim laboratorium. Przygotowanie pipet do iniekcji rozpoczyna się od dociągania pipet szklanych przy użyciu dociągacza do pipet, który został skalibrowany w celu uzyskania odpowiedniego rozdzielenia pipety.W ciągu 15 sekund umieść pipetę w wyciągarze do pipet i zabezpiecz ją za pomocą zacisków górnego i dolnego. Następnie naciśnij przycisk wyciągania. Filament rozgrzeje się, a pipeta zostanie rozdzielona.Pipeta będzie posiadać zwężenie w miejscu oddzielenia; należy odciąć końcówkę pipety w taki sposób, aby odległość od początku zwężenia do końca pipety wynosiła 1,04 do 1,05 centymetrów. Dzieje się tak, ponieważ długość pipety jest odwrotnie proporcjonalna do kalibru otworu pipety. Wykonanie dłuższej pipety spowoduje uzyskanie słabszej końcówki, która jest bardziej podatna na złamanie podczas wstrzykiwania, co może wpłynąć na przeżywalność wstrzykiwanego płodu myszy.Aby uzyskać gładką fazę, końcówkę pipety należy zaostrzyć na diamentowej tarczy szlifującej. Włącz urządzenie, a następnie delikatnie opuść pipetę na obracającą się tarczę szlifującą. Podczas początkowego cięcia końcówka pipety często łamie się, tworząc naturalną fazę.Należy okresowo kontrolować końcówkę pipety za pomocą dołączonego mikroskopu, aby upewnić się, że pipeta nadal styka się z kołem. W miarę jak krawędź staje się gładka, utraci ona kontakt z kołem ostrzącym. Gdy krawędź będzie już gładka, końcówka pipety musi zostać zaostrzona.Unieś pipetę tak, aby nie dotykała już koła ostrzącego. Obróć ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 10 do 50 stopni i ponownie umieść pipetę na obracającym się kole ostrzącym na około 10 sekund. Należy uważać, aby nie trzymać pipety na krawędzi zbyt długo, ponieważ może to doprowadzić do powstania nierównej powierzchni.Wyjmij pipetę z koła szlifującego i sprawdź krawędź. Krok ten zazwyczaj wymaga powtórzenia z kilkoma niewielkimi korektami, aby uzyskać ostrą krawędź. Po ukończeniu jednej strony, naostrz przeciwległą krawędź w ten sam sposób, który został właśnie zaprezentowany.Schemat ten przedstawia prawidłowe ostrzenie pipet do iniekcji, widok od dołu prawidłowo ostrzonego ścięcia igły oraz widok z boku pipety z nierówną krawędzią, pokazaną tutaj. Na koniec należy użyć niezmywalnego markera, aby narysować linię okrężną. Co cztery milimetry, zaczynając od miejsca, w którym zaczyna się zwężenie pipety, oznaczenia te odpowiadają objętości 5 µL.Po przygotowaniu wstrzyknięcia, pipet oraz materiału do wstrzyknięcia, można przystąpić do przygotowania procedury iniekcji. Najpierw dwukrotnie przemyj pipetę iniekcyjną przy użyciu XPBS, zanurz pipetę w PBS i naciskaj przycisk napełniania, aż zostanie zassana ilość płynu wystarczająca do wypełnienia pipety. Następnie sprawdź zawartość PBS.Następnie przygotuj obszar zabiegowy, zapewniając koc grzewczy, oświetlenie oraz niezbędne instrumenty chirurgiczne. Iniekcje zostaną wykonane przy użyciu okularów powiększających 2.5 x. W tej demonstracji, mimo że można również użyć mikroskopu stereoskopowego, umieść znieczuczoną mysz w pozycji grzbietnej na podkładce grzewczej i przymocuj każdą kończynę taśmą, aby unieruchomić zwierzę.Po wystrzyżeniu futra przygotuj brzuch, stosując 10% povidone iodine, a następnie alkohol; upewnij się za pomocą ucisku palca u nogi, że zwierzę jest całkowicie znieczulone. Następnie wykonaj jednocentymetrowe nacięcie w dolnej części brzucha. Najniższy punkt nacięcia powinien znajdować się około jednego centymetra powyżej us incise nacinając skórę oraz powięź.Należy uważać, aby nie uszkodzić jelit i pęcherza moczowego, które znajdują się bezpośrednio pod cienką warstwą powięzi. Za pomocą patyczków higienicznych delikatnie rozciągnij powięź i wydobądź macicę przez nacięcie. Zlokalizuj prawy i lewy jajnik, aby upewnić się, że cała macica jest widoczna, a następnie policz całkowitą liczbę płodów.Przed przejściem do kolejnych kroków umieść macicę z powrotem w jamie brzusznej, aby płody pozostały rozgrzane podczas przygotowywania wstrzykiwanych substancji. Ponieważ objętości wstrzykiwanych materiałów są zazwyczaj niewielkie, zazwyczaj umieszczamy je w małej probówce do wirowania, aby móc napełnić igłę bez uszkodzenia końcówki pipety. Ponieważ iniekcje są najtrudniejszym elementem tej procedury, kluczowe dla sukcesu tej techniki jest zastosowanie właściwej metody, która zminimalizuje urazy macicy.Płody należy trzymać pewnie, ale jednocześnie wystarczająco delikatnie, aby uniknąć ich uszkodzenia. Niezbędne jest również, aby ruchy podczas wprowadzania i wycofywania pipety były stabilne. Pobierz odpowiednią objętość materiału dla liczby płodów, które planujesz zainiekować.Ważne jest, aby trzymać końcówki pipet z dala od mikroinkjektora, aby uniknąć zassania próbki do cewki urządzenia. Delikatnie przytrzymaj płód i zidentyfikuj miejsce, w które planujesz wykonać wtryskiwanie. W tej demonstracji w każdym płodzie wykonamy wtryskiwanie w inną część ciała; w pierwszym przypadku będzie to wątroba płodu.Kciukiem i palcem wskazującym ustabilizuj płód w jamie owodniowej, aby nie obracał się podczas wykonywania iniekcji. Aby wstrzyknąć substancję do wątroby, ostrożnie wprowadź pipetę przez macicę, owodnię i skórę płodu, aż do wątroby płodu. Ostra pipeta powinna z łatwością przejść przez te tkanki.Wstrzyknij pożądaną objętość do płodu i ostrożnie wycofaj pipetę. W przypadku wstrzyknięć doprzewnowych kluczowe jest, aby ruchy podczas wprowadzania pipety, iniekcji i wycofywania były stabilne. Pipetę wprowadza się przez macicę, błonę owodniową i skórę płodu, celując nieco poniżej wątroby płodu.Wstrzyknij pożądaną objętość w przypadku iniekcji domięśniowych. Ustaw płód tak, aby zidentyfikować biodro i kość udową, a następnie wykonaj wstrzyknięcie w mięsień pośladkowy. W przypadku iniekcji dokomorowych szwy wieńcowe są łatwo widoczne, co pozwala na skierowanie pipety do odpowiedniego miejsca docelowego dla tych wstrzyknięć.Do penetracji czaszki bez uszkodzenia pipety wymagane są pipety o nieco większym kalibrze. W przypadku badań obejmujących pobieranie materiału po narodzinach wszystkie płody muszą zostać poddane technicznie poprawnym iniekcjom, ponieważ po urodzeniu nie ma możliwości odróżnienia płodów poddanych iniekcji od tych, które jej nie otrzymały. Jeśli iniekcje zostaną wykonane prawidłowo, materiał nie powinien wyciekać z jamniowej jamy ani z macicy.Po wstrzyknięciu płodów ostrożnie umieść macicę z powrotem w jamie brzusznej, upewniając się, że nie jest skręcona ani nie owija się wokół naczyń krwionośnych. Podaj jeden mililitr 1xPBS do jamy otrzewnej matki, aby uzupełnić płyny utracone podczas procedury. Zamknij nacięcie w dwóch warstwach, używając plecionej nici wchłanialnej o rozmiarze 5-0.Najpierw zamknij powięź, uważając, aby nie uszkodzić znajdujących się pod nią jelit lub pęcherza moczowego, a następnie zamknij skórę. Na koniec przenieś wstrzykniętą samicę do jej indywidualnej klatki. Umieść klatkę na podgrzewającym kocu i wsyp do niej ściółkę.Umieść mysz w cichym miejscu w pomieszczeniu dla zwierząt, gdzie nie będzie ona niepokojona przez kilka dni po dostawie. Minimalizacja dodatkowego stresu zwierzęcia zmniejszy ryzyko przedwczesnego porodu; tutaj przedstawiono reprezentatywne wyniki przyjęcia przeszczepu od dawcy po dokonaniu wewnątrzmacicznego przeszczepu komórek. Płody w 14. dniu embrionalnym otrzymały przeszczep komórek macierzystych krwi obwodowej wykazujących ekspresję GFP.Następnie pobrano krew obwodową z szczenięcia chimerycznego w celu wykrycia ekspresji GFP w komórkach donora za pomocą cytometrii przepływowej, co potwierdziło obecność komórek donora. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania pipet do iniekcji oraz wykonywania iniekcji wewnątrzmacicznych. Po opanowaniu tych podstawowych technik.Metodę tę można zmodyfikować, aby przeprowadzać iniekcje u płodów w różnych okresach rozwojowych w celu badania podstaw biologii rozwoju oraz biologii komórek macierzystych.

a-mouse-model-of-in-utero-transplantation

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Model myszy in Utero Transplantacji

In-utero in-vivo iniekcja i elektroporacja zarodkowego neokortyksu myszy stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi ...

Wewnątrzkomorowe wstrzyknięcie i elektroporacja in utero embrionów myszy w 15. dniu rozwoju (E15)

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Opis chirurgicznego indukowania endometriozy u myszy i szczurów poprzez autotransplantację tkanki macicy do kaskady tętniczej krezki jelitowej.

Myszowy model chirurgicznie wywołanej endometriozy poprzez autotransplantację tkanki macicy

Kontrola ekspansji somatycznych komórek macierzystych jest głównym czynnikiem utrudniającym ich badanie oraz zastosowanie w terapii. W niniejszym opracowaniu opisujemy system czasowej kontroli ekspansji neuronalnych komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym, który może zostać wykorzystany do zwiększenia liczby neuronów generowanych w mózgu myszy.

Ekspansja embrionalnych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego poprzez elektroporację in utero lub stereotaksycyjne wstrzyknięcie wirusowe

Pomimo funkcjonalnego i medycznego znaczenia podwzgórza, rzadko próbowano genetycznej manipulacji jego rozwojem in utero. Przedstawiamy szczegółową procedurę elektroporacji in utero do podwzgórza myszy i pokazujemy reprezentatywne wyniki całkowitej i częściowej (regionalnej) transfekcji podwzgórza.

Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero

Transfer zarodków macicowo-jajowodowych wykorzystuje połączenie macicowo-jajowodowe jako barierę zapobiegającą odpływowi zarodka, który może wystąpić podczas transferu macicy. Mężczyźni poddani wazektomii są zobowiązani do pozyskania biorców pseudociężarnych do transferu zarodków. Omówiono obie techniki.

Transfer zarodka macicowo-jajowodowego i wazektomia w modelu mysim

Opisujemy protokół przeprowadzania przeszczepu in utero (IUT) poprzez dożylne i dożylne drogi iniekcji w modelu mysim. Protokół ten może być stosowany do wprowadzania komórek, wektorów wirusowych i innych substancji do unikalnego środowiska płodu tolerancyjnego na odporność.

Przeszczepienie dożylne i owodniowe w macicy w modelu mysim

Opracowaliśmy model zapalenia błony płodowej, aby symulować narażenie płodu na stan zapalny matki (FEMI) bez komplikacji związanych z żywymi organizmami, aby zbadać wpływ FEMI na rozwój przewodu pokarmowego potomstwa. Pozwala to na badanie mechanistycznych przyczyn rozwoju uszkodzenia jelit po zapaleniu błony płodowej.

Mysi model narażenia płodu na stan zapalny matki w celu zbadania wpływu ostrego zapalenia błony płodowej na rozwój jelit noworodka

Tutaj wprowadzamy metodę wykonywania okrągłych wstrzyknięć spermatyd (ROSI) u myszy, technikę o obiecujących zastosowaniach klinicznych i użyteczność do badania mechanizmów leżących u podstaw rozwoju embrionalnego.

Wstrzyknięcie okrągłego plemnika myszy

Badanie to wprowadza nowy model mysi zaprojektowany specjalnie do symulacji endometriozy, klinicznie istotnego podtypu endometriozy. Wykorzystując myszy C57BL/6J, model ma na celu wyjaśnienie patofizjologicznych mechanizmów leżących u podstaw niepłodności związanej z endometrioma, oferując wyrafinowane narzędzie do wypełnienia obecnej luki w wiedzy w medycynie reprodukcyjnej.

Stworzenie eksperymentalnego mysiego modelu endometrioma w celu zbadania związanej z nim niepłodności

Poznaj metodę przeszczepu in utero w mysich płodach do badań nad terapią komórkową i genową. Technika umożliwia ocenę wszczepienia komórek oraz ekspresji genów w środowisku płodowym.

Model mysi transplantacji in utero

Przeglądaj więcej filmów