Mysi model przeszczepu in utero
January 27th, 2011
Mysi model przeszczepu in utero jest wszechstronnym narzędziem, które może być wykorzystane do badania potencjalnych zastosowań klinicznych przeszczepu komórek macierzystych i terapii genowej u płodu. W niniejszym protokole przedstawiamy ogólne podejście do wykonywania tej techniki
Ogólnym celem tej procedury jest przeszczepienie komórek lub wirusów do płodów myszy. Najpierw wykonaj nacięcie na brzusznej części myszy. Następnie wyegzewnętrzizuj macicę i płody, a następnie wykonaj zastrzyki in utero.
Na koniec delikatnie przywróć macicę z powrotem do jamy otrzewnej i zamknij powięź brzuszną i skórę. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wykazują wszczepienie komórkowe lub ekspresję genów za pomocą cytometrii przepływowej PCR lub immunohistochemii Przeszczep komórek macierzystych w macicy i terapia genowa. Dzięki naszym innowacyjnym strategiom leczenia wad wrodzonych przed urodzeniem możemy wykorzystać niedojrzały układ odpornościowy płodu do wywołania tolerancji na komórki allogeniczne lub wytworzenia białek.
Mysi model przeszczepu in utero pozwala nam badać czynniki biologiczne unikalne dla płodu, które prowadzą do udanej indukcji nietolerancji wszczepienia. Technika ta zostanie teraz zademonstrowana przez Amera Niala, chirurga i doktora habilitowanego w moim laboratorium. Przygotowanie pipet iniekcyjnych rozpoczyna się od wyciągnięcia szklanych pipet za pomocą ściągacza do pipet, który został skalibrowany w celu oddzielenia pipety.
W ciągu 15 sekund umieść pipetę w ściągaczu do pipet i zabezpiecz ją za pomocą górnego i dolnego zacisku. Następnie naciśnij przycisk pociągnięcia. Filament nagrzeje się, a pipeta się oddzieli.
Pipeta będzie miała stożek w miejscu, w którym oddziela koniec pipety, tak aby odległość od początku stożka do końca pipety wynosiła od 1,04 do 1,05 centymetra. Ponieważ długość pipety jest odwrotnie proporcjonalna do kalibru otworu pipety. Wykonanie dłuższej pipety spowoduje osłabienie końcówki, która jest bardziej podatna na złamanie podczas wstrzykiwania i może mieć wpływ na przeżycie płodu myszy, któremu wstrzyknięto.
Aby uzyskać gładki skos, końcówka pipety musi być naostrzona na diamentowej tarczy do ostrzenia. Włącz pokrętło, a następnie delikatnie opuść pipetę na obracającym się kole do ostrzenia. Gdy pipeta jest początkowo cięta, często pęka przy naturalnym skosie.
Na końcówce należy okresowo ponownie oceniać pipetę za pomocą dołączonego mikroskopu, aby upewnić się, że pipeta nadal dotyka koła. Ponieważ gdy skos stanie się gładki, straci kontakt z tarczą ostrzącą. Gdy skos jest gładki, końcówkę pipety należy naostrzyć.
Podnieś pipetę tak, aby nie dotykała tarczy do ostrzenia. Obróć ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 10 do 50 stopni i umieść pipetę z powrotem na obracającej się tarczy do ostrzenia na około 10 sekund. Należy uważać, aby nie kłaść pipety na jej krawędzi zbyt długo, ponieważ może to spowodować powstanie nierównej powierzchni.
Wyjmij pipetę z tarczy do ostrzenia i sprawdź krawędź. Ten krok zwykle należy powtórzyć z kilkoma niewielkimi korektami, aby uzyskać ostrą krawędź. Po uzupełnieniu jednej strony naostrz przeciwległą krawędź w taki sam sposób, jak to właśnie pokazano.
Ten schemat przedstawia prawidłowe ostrzenie pipet iniekcyjnych, widok z dołu prawidłowo naostrzonego skosu igły oraz widok z boku pipety z nierówną krawędzią, pokazany tutaj. Na koniec użyj markera permanentnego, aby narysować linię obwodową. Co cztery milimetry, począwszy od miejsca, w którym zaczyna się stożek pipety, rozgraniczenia te odpowiadają pięciu mikrolitrom objętości.
Po przygotowaniu iniekcji, pipet i materiału do wstrzykiwań, można przygotować się do iniekcji. Najpierw wyczyść pipetę iniekcyjną dwukrotnie za pomocą jednego XPBS, zanurz pipetę w PBS i naciśnij przycisk napełniania, aż zostanie zassana wystarczająca ilość płynu do napełnienia pipety. Następnie każdy z nich sprawdza PBS.
Następnie przygotuj obszar zabiegowy za pomocą koca rozgrzewającego, oświetlenia i niezbędnych narzędzi chirurgicznych. Iniekcje będą wykonywane przy użyciu pętli z powiększeniem chirurgicznym 2,5x. W tej demonstracji, chociaż można również użyć mikroskopu preparacyjnego, umieść znieczuloną mysz na poduszce grzewczej w pozycji leżącej i przymocuj każdą kończynę taśmą, aby zabezpieczyć zwierzę na miejscu.
Po strzyżeniu sierści przygotuj brzuch z 10% jodowidonu, a następnie alkoholem, potwierdzonym uszczypnięciem palca u nogi, że zwierzę jest całkowicie znieczulone. Następnie wykonaj jednocentymetrowe nacięcie w dolnej części brzucha. Najgorszy aspekt nacięcia powinien znajdować się około jednego centymetra wyżej od nacięcia skóry i powięzi.
Uważaj, aby nie uszkodzić jelit i pęcherza, które znajdują się bezpośrednio pod cienką warstwą powięzi. Za pomocą bawełnianych wacików delikatnie rozciągnij powięź i przeprowadź macicę przez nacięcie. Zidentyfikuj prawe i lewe jajniki, aby upewnić się, że wizualizujesz całą macicę, a następnie policz całkowitą liczbę płodów.
Przed przystąpieniem do dalszych czynności należy umieścić macicę z powrotem w jamie brzusznej, aby płód pozostał ciepły podczas przygotowywania się do wstrzyknięć. Ponieważ materiały do wstrzykiwań mają zazwyczaj małą objętość, zwykle umieszczamy je w małej mikrorurki fuge, aby móc napełnić igłę bez łamania końcówki pipety. Ponieważ zastrzyki są najtrudniejszym aspektem tej procedury, dobra technika, która powoduje minimalny uraz macicy, ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tej techniki.
Płód musi być trzymany mocno, ale na tyle delikatnie, aby uniknąć uszkodzenia. Konieczne jest również, aby ruchy były stabilne podczas wkładania i wyjmowania pipety z iniekcji. Należy sporządzić odpowiednią objętość materiału dla liczby płodów, które planuje się wstrzyknąć.
Ważne jest, aby zachować końcówki pipet merów, aby uniknąć zasysania próbki do rurki mikrowtryskiwacza. Delikatnie przytrzymaj płód i zidentyfikuj część płodu, którą planujesz wstrzyknąć. W tej demonstracji wstrzykniemy każdemu płodowi inną część ciała, z których pierwszą jest wątroba płodu.
Kciukiem i palcem wskazującym należy ustabilizować płód w jamie owodniowej, tak aby nie obracał się podczas wykonywania wstrzyknięcia. Aby wstrzyknąć wątrobę, ostrożnie włóż pipetę przez macicę, owodnię i skórę płodu, a następnie do wątroby płodu. Ostra pipeta powinna łatwo przejść przez te tkanki.
Wstrzyknąć żądaną objętość do płodu i delikatnie wyjąć pipetę. Konieczne jest, aby ruchy były stabilne w czasie wkładania, wstrzykiwania i wyjmowania pipety w przypadku wstrzyknięć dootrzewnowych. Pipeta jest również wprowadzana przez macicę, owodnię i skórę płodu, ale jest skierowana nieco poniżej wątroby płodu.
Wstrzyknąć żądaną objętość do wstrzyknięć domięśniowych. Ustaw płód tak, aby zidentyfikował biodro i kość udową i wstrzyknij mięsień pośladkowy. W przypadku wstrzyknięć dokomorowych łatwo jest dostrzec szwy koronalne, aby skierować pipetę do odpowiedniego miejsca dla tych wstrzyknięć.
Do penetracji czaszki bez łamania pipety potrzebne są pipety o nieco większym kalibrze. W przypadku badań, które obejmują pobieranie od dzieci po urodzeniu, wszystkie płody muszą otrzymać technicznie doskonałe zastrzyki, ponieważ nie ma możliwości odróżnienia, wstrzykniętych i odizolowanych płodów po urodzeniu. Jeśli wstrzyknięcia są wykonywane prawidłowo, materiał nie powinien wyciekać z jamy owodniowej lub macicy.
Po wstrzyknięciu płodu ostrożnie umieść macicę z powrotem w jamie brzusznej, upewniając się, że nie jest skręcona na sobie lub wokół jej dopływu naczyniowego. Dostarczyć jeden mililitr jednego XPBS do jamy otrzewnowej matki, aby zastąpić płyn, który został utracony podczas zabiegu. Zamknij nacięcie w dwóch warstwach za pomocą wchłanialnego szwu z pięcioma opleciami.
Najpierw zamknij powięź bez uszkadzania leżącego poniżej jelita lub pęcherza, a następnie zamknij skórę. Na koniec należy umieścić samicę z wstrzyknięciem w jej własnej, indywidualnej klatce. Umieść klatkę na kocu rozgrzewającym i wbij do niej ściółkę.
Umieść mysz w cichym miejscu w pomieszczeniu dla myszy, gdzie nie należy jej przeszkadzać przez kilka dni po dostawie. Zminimalizowanie dodatkowego stresu dla zwierzęcia zmniejszy szanse na przedwczesny poród reprezentatywne wyniki przeszczepu dawcy po przeszczepieniu komórek w macicy są pokazane tutaj. Zarodkowych. Płodom w 14. dniu przeszczepiono hematopoetyczne komórki macierzyste GFP.
Następnie pobrano próbki krwi obwodowej u chimerycznego szczeniaka w celu wykrycia ekspresji GFP w komórce dawcy za pomocą cytometrii przepływowej, która potwierdziła obecność komórek dawcy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak robić pipety iniekcyjne i wykonywać zastrzyki in utero. Po opanowaniu tych podstawowych technik.
Metodę tę można zmodyfikować w celu wstrzyknięcia płodów w różnym wieku ciążowym w celu zbadania podstawowej biologii rozwoju i komórek macierzystych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę przeszczepu in utero u płodów myszy, mającą na celu zbadanie zastosowań przeszczepów komórek macierzystych i terapii genowej. Technika ta pozwala na badanie wkradania się komórek i ekspresji genów w środowisku płodowym.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Badania nad komórkami macierzystymi
- Terapia genowa
Tło
- Przewlekanie in utero daje wgląd w rozwój płodu.
- Wykorzystuje niedojrzały układ odpornościowy płodu do indukcji tolerancji.
- To podejście może potencjalnie leczyć wrodzone zaburzenia przed urodzeniem.
- Wkradanie się komórek i ekspresja genów może być oceniana za pomocą różnych technik.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody przeszczepu komórek lub wirusów in utero.
- Zbadanie wykonalności terapii komórkami macierzystymi w modelach płodowych.
- Zbadanie zastosowań terapii genowej w kontekście prenatalnym.
Zastosowane metody
- Nadciecie na brzusznej stronie myszy, aby uzyskać dostęp do macicy.
- Wydobycie macicy i płodów na zewnątrz do wstrzyknięcia.
- Wstrzyknięcia komórek lub wirusów in utero.
- Ocena po zabiegu za pomocą PCR, cytometrii przepływowej lub immunohistochemii.
Główne wyniki
- Skuteczne wkradanie się przeszczepowanych komórek w środowisko płodowe.
- Wykazanie ekspresji genów za pomocą różnych metod analitycznych.
- Dowód na poparcie stosowania tej techniki w terapiach prenatalnych.
- Możliwość leczenia wrodzonych zaburzeń przed urodzeniem.
Wnioski
- Przewlekanie in utero jest obiecującą metodą badania terapii komórkami macierzystymi i genowych.
- Ta metoda może ułatwić badania nad prenatalnymi leczeniami wrodzonych chorób.
- Potrzebne są dalsze badania, aby zoptymalizować techniki i ocenić długoterminowe wyniki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
In utero transplantation in mouse models enables preclinical evaluation of stem cell and gene therapy strategies for congenital disorders, leveraging the fetal immune system's tolerance-inducing capacity. This approach supports target validation and mechanistic de-risking by assessing engraftment, transgene expression, and immune tolerance in a disease-relevant developmental system. Insights from this model inform go/no-go decisions in early discovery by predicting translational potential and reducing biological risk in prenatal therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of hematopoietic stem cell engraftment and functional validation in wild-type and disease-model fetuses.
- Operational Value: Provides a reproducible system to assess biological factors influencing successful transplantation and tolerance induction.
- Scientific Value: Supports evaluation of viral vector transduction efficiency and long-term gene expression across multiple fetal organs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable engraftment and transgene expression data via flow cytometry, PCR, and immunohistochemistry for assay standardization.
- Operational Value: Establishes standardized surgical and injection protocols to ensure reproducibility across litters and experimental conditions.
- Scientific Value: Enables dose-response and timing studies by controlling injection volume, gestational age, and fetal target site.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models immune tolerance induction to therapeutic proteins, such as Factor IX in hemophilia, supporting biologic safety assessment.
- Operational Value: Facilitates longitudinal tracking of engraftment and gene expression from fetal to postnatal stages.
- Scientific Value: Enables mechanistic studies of stem cell differentiation and developmental pathway modulation in a non-irradiated host.
Pipeline & Workflow Integration
The mouse IUT model fits within the discovery continuum from target validation through preclinical development, providing a platform to de-risk stem cell and gene therapy candidates before large-animal or clinical testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on engraftment efficiency, immune tolerance, and transgene persistence in utero.
- Screening: Enables standardized preparation and validation of cellular or viral injectables for consistent fetal delivery.
- Analytics: Delivers quantitative readouts including donor chimerism via flow cytometry, transgene detection via PCR, and protein expression via immunohistochemistry.
- Translational Research: Bridges fetal proof-of-concept to postnatal functional outcomes, informing advancement to preclinical efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable surgical and injection platform adaptable to diverse cell types, vectors, and gestational timelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in stem cell engraftment, gene therapy efficacy, and immune tolerance mechanisms.
- Operational Value: Standardized microsurgical technique reduces variability and enhances inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Enables early identification of biological barriers to fetal therapy, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of prenatal therapeutic candidates based on engraftment and tolerance data.
Implementation Considerations
- Expertise in microsurgery and fetal handling is required to minimize trauma and ensure embryo viability.
- Instrumentation includes pipette pullers, diamond sharpening wheels, surgical microscopes, and warming platforms for embryo survival.
- Standardization of injection volume, needle calibration, and fetal positioning is critical for reproducible engraftment outcomes.
- Adaptation across models requires adjustment for gestational timing, fetal size, and target organ accessibility.
- Practical limitations include technical difficulty of injections, fetal loss due to procedural stress, and challenges in detecting low-level engraftment.
