Name: Fizjologiczne zapisy NMJ o wysokiej i niskiej wydajności na mięśniu prostownika nogi raków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj metodę elektrofizjologicznych zapisów synaptycznych na mięśniu prostownika nogi raków. Technika ta pozwala odróżnić terminale toniczne i fazowe oraz wizualizować struktury nerwowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy panu Craigowi D. Slavenowi (Department of English, University of Kentucky) za pomoc redakcyjną. Wspierane przez University of Kentucky, Department of Biology, Office of Undergraduate Studies oraz College of Arts &amp; Sciences.

1) Wstęp
Neurony ruchowe komunikują się z włóknem mięśniowym w synapsach, które zbiorczo określa się jako złącze nerwowo-mięśniowe (NMJ). Do NMJ można łatwo uzyskać dostęp w większości preparatów mięśniowych skorupiaka z rodzaju crayfish. Wiele NMJ u tych skorupiaków wykazuje niewybuchowe wzbudzające potencjały postsynaptyczne (EPSP), podobne do stopniowanych sygnałów elektrycznych generowanych w dendrytach postsynaptycznych w OUN ssaków lub odpowiedzi podprogowych odnotowanych w NMJ kręgowców (Wiersma &amp; Van Harreveld, 1938; Katz &amp; Kuffler, 1946). NMJ skorupiaków mogą służyć jako fundamentalne modele synaptyczne, dostarczając ogólnej wiedzy na temat przekazywania synaptycznego oraz różnicowania synaptycznego.
Zasadniczo jednostki motoryczne regulują aspekty zachowania zwierząt poprzez rodzaj komunikacji synaptycznej w złączach nerwowo-mięśniowych (NMJ) oraz właściwości mięśni. Od czasu pierwszej obserwacji „szybkich” i „wolnych” skurczów mięśni w mięśniu przyzęblistym kraba i raków (Lucas, 1907, 1917), podobne różnicowanie kurczliwości mięśni opisano w innych typach mięśni raków, takich jak zginacze brzuszne (Kennedy &amp; Takeda, 1965a, b) oraz prostowniki kończyn (Van Harreveld &amp; Wiersma, 1936). Skurcze „szybkie” inicjują błyskawiczne reakcje; przykładem takiego zachowania jest szybki ruch odwłoka raka. Skurcze „wolne” odpowiadają za powolne ruchy i pomagają w utrzymaniu postawy ciała (Bradacs et al., 1997). Odpowiadająco do „szybkich” i „wolnych” skurczów mięśni, określenia „fazowe/wysoka aktywność” oraz „toniczne/niska aktywność” są szeroko stosowane w odniesieniu do neuronów ruchowych. Różnice w tempie i czasie skurczu mięśnia są częściowo związane z presynaptycznymi różnicami w strukturze i sile synaptycznej (King et al., 196). Ekspresja izoform białek miofibrylarnych jest również istotna dla różnic w kurczliwości, jednak w preparatach takich jak mięsień prostownik kończyny, w którym dane włókno jest unerwione przez oba typy neuronów ruchowych, główną uwagę poświęca się różnicom synaptycznym zakończeń, ponieważ zakończenia te współdzielą tę samą komórkę docelową (Mykles et al., 202). Wcześniejsze badanie analizowało dwa pobudzające aksony ruchowe prostownika kończyny i opisało fenotypy fazowe oraz toniczne (Bradacs et al., 197). W niniejszym raporcie demonstrujemy, jak przeprowadzić sekcję i uzyskać zapisy, aby umożliwić innym dalsze badanie właściwości różnicowania synaptycznego tych zakończeń nerwowych.
Analiza za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej różnych serii przekrojów uzyskanych z terminali tonicznych i fazycznych mięśnia prostownika nogi raków wykazała, że terminale toniczne zawierają więcej pęcherzyków RRP niż terminale fazyczne; w neuronach tonicznych częściej występują mitochondria, a synapsy w terminalach fazycznych są bardziej złożone niż w synapsach o niskiej wydajności, ponieważ zawierają one liczne strefy aktywne o zróżnicowanych odstępach (Miller et al, 2002; Johnstone et al., 2008; King et al., 196; Bradacs et al., 197). Terminale toniczne o niskiej wydajności są również bardziej podatne na wzmocnienie transmisji synaptycznej za pomocą neuromodulatora serotoniny (5-HT) niż terminale fazyczne (Cooper et al., 203).
Fakt, że toniczne i fazowe NMJ występują na tym samym włóknie mięśniowym, ułatwia ocenę różnic presynaptycznych w obrębie danego włókna oraz analizę kwestii zmęczenia mięśni, depresji synaptycznej i interferencji synaptycznej (synaptic cross talk). W tym preparacie wciąż pozostają nierozwiązane kwestie, takie jak to, czy istnieją różnice w gęstości receptorów postsynaptycznych i podtypach receptorów glutaminianu w obszarach postsynaptycznych dla zakończeń tonicznych i fazowych, jednak lepsze zrozumienie fundamentalnych różnic w anatomii i fizjologii tych dwóch jednostek motorycznych pomoże w zbudowaniu głębszej bazy wiedzy. Nadzieją jest, że zasady podstawowe poznane w tym preparacie synaptycznym znajdą zastosowanie w innych synapsach w różnych preparatach i usprawnią przyszłe badania w tym synaptycznym modelu raka rzecznego.
2) Metody
<ol>
<li> Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na pierwszej lub drugiej parze odnóży krocznych średniej wielkości raków (Procambarus clarkii). Zwierzęta są przetrzymywane indywidualnie w plastikowych pojemnikach z natlenioną wodą. Temperatura w pomieszczeniu hodowlanym mieści się w zakresie 13°C-16°CZwierzęta są karmione suchym pokarmem dla ryb, a woda jest wymieniana raz w tygodniu. 
<img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig1.jpg" alt="Schemat anatomii odnóża skorupiaka z oznakowanymi segmentami: bazypodyt, meropodyt, daktylopodyt." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Schemat nogi krocznej raków oraz sześciu segmentów dystalnych.</li>
<li> Dystalna część nogi krocznej u raka jest anatomicznie podzielona na sześć segmentów (Rysunek 1). Prostownik nogi znajduje się w meropodzie, a pęczek nerwów przeznaczony do izolacji położony jest blisko stawu meropodopodite-ischiopodite. Po odsłonięciu aksony toniczne lub fazowe mogą być stymulowane selektywnie, zgodnie z potrzebami fizjologicznymi. </li>
<li> Cooper i Cooper (209) opisali niektóre aspekty wstępnej sekcji, w tym metody odsłaniania ekscytora otwierającego neuronu ruchowego w obszarze meropoditu, jednak ich opis nie uwzględnia środków niezbędnych do ochrony mięśnia prostownika przed uszkodzeniem, ponieważ nie było to wymagane przy przygotowaniu mięśnia otwierającego. W celu ochrony prostownika, u raka o długości ciała 6–10 cm (Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA), usuwa się pierwszą lub drugą odnóżkę chodną poprzez pobudzenie zwierzęcia do autotomii kończyny poprzez silne ściśnięcie w miejscu dystalnym względem płaszczyzny złamania w segmencie ischiopoditu. Odnóżkę umieszcza się na płytce sekcyjnej stroną boczną (zewnętrzną) skierowaną w stronę obserwatora. Odnóżkę obraca się do momentu, aż obserwator zyska pewność, że strona zewnętrzna (boczna) znajduje się uprawo na płytce sekcyjnej, zazwyczaj z wypukłą stroną skierowaną do góry (Rysunek 2). Umieszczenie odnóżki na kawałku ręcznika papierowego ułatwia obracanie preparatu podczas wykonywania tych nacięć.
 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig2.jpg" alt="Anatomia skorupiaków, opisany schemat segmentu egzoszkieletu, widok z boku do celów badawczych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Strona boczna meropodytu, zazwyczaj strona wygięta, powinna być skierowana ku górze na płytce sekcyjnej.</li>
<li> Przy użyciu łamacza i uchwytu ostrzy skalpela, ostrym ostrzem żyletki wykonuje się nacięcie kutykuli, aż do całkowitego przecięcia, zgodnie ze schematem przedstawionym na rysunku 3 dla segmentu meropoditu. Należy uważać, aby podczas cięcia od strony grzbietowej do brzusznej nie przeciąć zbyt daleko w kierunku dystalnym w miejscu stawu meropodito-karpopoditu.
 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig3.jpg" alt="Schemat morfologii czułka owada; zaznaczona struktura segmentowa; badanie entomologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Segment meropoditu z liniami przedstawiającymi sugerowany wzór trawienia otworu w kutykuli. Preparat umieszcza się w soli fizjologicznej. Pojemnik do sekcji powinien mieć na dnie powłokę z Sylgard (Dow Corning) o grubości 1 cm. Sylgard jest stosowany w celu umożliwienia wbijania w niego szpilek entomologicznych do stabilizacji preparatu. Na tym etapie szpilkę wbija się w środek segmentu karpopoditu oraz w stronę grzbietową segmentu ischiopoditu (Rysunek 4). Przeprowadzone sekcje są zanurzone w standardowej soli fizjologicznej dla raków, zmodyfikowanej z roztworu Van Harrevelda (1936), składającej się z 205 NaCl; 5,3 KCl; 13,5 CaCl2.2; 2H2O; 2,45 MgCl22; 6H2O; 5 HEPES i dostrojono do pH 7,4 (w mM). 
<img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig4.jpg" alt="Równowaga statyczna, zestaw higrometru włosowego do pomiaru wilgotności; naprężenie włosa, absorpcja wilgoci." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4: Odczepianie segmentu meropoditu z wyciętym okienkiem. Zwróć uwagę na rozmieszczenie szpilek sekcyjnych.</li>
<li> Kutikulę delikatnie unosi się w części dystalnej, a następnie odcina włókna mięśniowe od kutikuli, wykonując cięcia w kierunku podstawy nogi. Po tym zabiegu kutikulę można zdjąć.</li>
<li> Apodema (ścięgno) zostaje przecięta w stawie meropodytu i karpopodytu. Na wewnętrznej powierzchni ścięgna zginacza umieszcza się szpilkę, aby wskazać miejsce cięcia (Rycina 5). Następnie miejsce przecięcia ścięgna chwyta się pęsetą, a mięsień zginacz odciąga, unosząc go w kierunku kaudalnym (Rycina 6), co odsłania główny nerw nogi oraz mięsień prostownik. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig5.jpg" alt="Procedura sekcji, schemat w zbliżeniu, eksperyment z dymulacji nerwów, badania biomedyczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5: Apodema mięśnia zginacza została uwidoczniona poprzez odsunięcie jej od mięśnia za pomocą szpilki. 
<img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig6.jpg" alt="Morski wieloszczet z widocznymi szczegółami szczecinek do badań z zakresu biologii morskiej; obraz mikroskopowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Apodema mięśnia zginacza zostaje przecięta i usunięta z zachowaniem ostrożności, aby nie uszkodzić głównego nerwu kończyny.</li>
<li> Główny nerw kończyny przecinamy na stawieniu meropoditu z karpopoditem i ostrożnie odsuwamy go w kierunku mięśnia prostownika. W całym badaniu wykorzystywana jest powierzchnia przyśrodkowa mięśnia. Oddzielenie nerwu mięśnia prostownika od głównego nerwu kończyny można ułatwić, delikatnie odsuwając dystalny kikut głównego nerwu kończyny na bok preparatu. Podczas odsuwania głównego nerwu kończyny znad mięśnia prostownika może zajść konieczność przecięcia małych odgałęzień aksonów. Są to odgałęzienia inhibitoryjnego neuronu ruchowego do mięśnia prostownika. Większy pęczek odchodzący od głównego nerwu kończyny w pobliżu proksymalnego końca meropoditu jest poszukiwanym małym pęczkiem nerwowym. 
 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig7.jpg" alt="Przecięta dżdżownica z widocznymi organami wewnętrznymi, edukacyjny schemat biologiczny do badań anatomicznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Główny nerw kończyny zostaje przecięty i odciągnięty w kierunku proksymalnym. Ten pęczek nerwowy można zaobserwować po barwieniu błękitem metylenowym (Rycina 8) lub po barwieniu fluorescencyjnym 4-Di-2-ASP (Rycina 9). 
<img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig8.jpg" alt="Ksylem roślinny obserwowany za pomocą mikroskopii świetlnej; widoczne kanały transportu soku z wyraźnym kierunkiem przepływu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rycina 8: Mięsień prostownik barwiony błękitem metylenowym. Zwróć uwagę na rozgałęzienie aksonów oraz dwa wyraźnie widoczne aksony w obrębie nerwu. Czerwone strzałki wyznaczają przebieg nerwu. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig9.jpg" alt="Obraz mikroskopowy włókna mięśniowego przedstawiający regiony fazowe i toniczne do analizy aktywności mięśniowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9: Aksony nerwu ruchowego barwione 4-Di-2-ASP. Akson toniczny jest widoczny wyraźniej ze względu na zwiększoną zawartość mitochondriów. 
<img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10a.jpg" alt="Struktura neuronu, obraz mikroskopowy, skala 10 mikrometrów, badania biologiczne, analiza morfologii komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 10A">
Rysunek 10A: Poszczególne terminale neuronów fazycznych i tonicznych zabarwione 4-Di-2-ASP. Zwróć uwagę na obecność żlebi na terminalach tonicznych oraz na cienką strukturę terminali fazycznych. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10b.jpg" alt="Obraz mikroskopowy neuronu; skala 10 μm; wizualizacja struktury aksonalnej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 10B"> 
Rycina 10B -Odnotowano napięcie mięśniowe <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10c.jpg" alt="Struktura neuronu fazowego, obraz mikroskopowy, skala 10 µm, z zaznaczonymi szlakami neuronalnymi." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 10C"> 
Rycina 10C -Odnotowano fazowość</li>
</ol>
3) Profile fizjologiczne 
<ol>
<li> Aby zaobserwować pobudzające potencjały postsynaptyczne (EPSP) neuronów tonicznych lub fazycznych, jeden z izolowanych aksonów w pęczku nerwowym jest stymulowany za pomocą elektrody ssącej (Rysunek 11) podłączonej do stymulatora Grass, podczas gdy monitorowane są potencjały wewnątrzkomórkowe w mięśniu (Johnstone i wsp.., 208). Stymulację o częstotliwości 70 Hz przykłada się do aksonu tonicznego w celu wywołania odpowiedzi ułatwionej w złączeniach nerwowo-mięśniowych (NMJ) o niskiej aktywności lub przykłada się pojedynczy impuls (1 Hz) do aksonu fazycznego, aby uzyskać duże potencjały postsynaptyczne pobudzające (EPSP) w NMJ o wysokiej aktywności, zgodnie z rysunkiem 12. EPSP są rejestrowane przez komputer za pomocą interfejsu PowerLab/4s. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig11.jpg" alt="Obraz mikroskopowy włókien mięśniowych z analizą prążkowania w celu badania struktury komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: Elektroda stymulująca umieszczona nad pojedynczym aksonem w pęczku nerwowym. Zielona linia obrysowuje dwa główne aksony. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig12.jpg" alt="Wykres elektrofizjologiczny; przedstawia toniczno-fazową aktywność elektryczną przy częstotliwości 70 Hz i skali 2 mV." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 12"> 
Rysunek 12: Potencjały postsynaptyczne (EPSP) neuronów tonicznych lub fazycznych uzyskane za pomocą rejestracji wewnątrzkomórkowej.</li>
<li> Badania nad naturą ułatwienia synaptycznego i depresji synaptycznej można przeprowadzić za pomocą różnych paradygmatów doświadczalnych z wykorzystaniem połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ) o niskiej i wysokiej wydajności. Ułatwienie w NMJ o niskiej wydajności zależy od częstotliwości, co wykazano dla impulsów o częstotliwości 20, 40 i 60 Hz przy około 20 bodźcach (Rysunek 13). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig13.jpg" alt="Wykres elektrofizjologiczny przedstawiający odpowiedź neuronalną przy 20 Hz, 40 Hz i 60 Hz w funkcji czasu w mV." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 13"> 
Rysunek 13: EPSP w odpowiedzi na pociąg impulsów stymulacyjnych podawanych z trzema różnymi częstotliwościami: 20, 40 i 60 Hz w standardowym roztworze soli fizjologicznej dla raka.</li>
<li> Szybkość depresji synaptycznej w zależności od częstotliwości stymulacji jest również związana z wysoką wydajnością połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ). Rysunek 14 przedstawia ciągłą stymulację z częstotliwością 5 Hz, która prowadzi do depresji NMJ w ciągu 30 min. Przy wyższej częstotliwości stymulacji preparat będzie ulegał depresji szybciej (Bradacs i wsp.., 1997). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig14.jpg" alt="Wykres amplitudy EPSP w funkcji czasu, analiza odpowiedzi synaptycznej, stymulacja z częstotliwością 0,5 Hz, 5 Hz." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 14"> 
Rysunek 14: Amplituda EPSP odpowiedzi fazowej podczas stymulacji o częstotliwości 5 Hz w celu wywołania depresji.</li>
</ol>
4) Reakcje kwantowe
<ol>
<li> W niniejszym preparacie zastosowano procedurę podobną do tej opisanej dla mięśnia otwierającego u raków (Cooper i Cooper, 209). Kwantowe EPSP bezpośrednio nad zidentyfikowanymi obszarami zakończenia nerwowego rejestrowano poprzez umieszczenie światła elektrody do rejestracji makropatch na wzdęgach synaptycznych zwizualizowanych za pomocą barwnika witalnego 4-Di-2-Asp (5 μM, 5-minutowa inkubacja, Cooper i wsp.., 1995; Magrassi i wsp.., 1987). Spontaniczne, jak i wywołane odpowiedzi kwantowe można rejestrować wzdłuż zakończeń nerwowych. Wywołane i spontaniczne potencjały synaptyczne rejestrowane są za pomocą elektrody makro-patch (Dudel, 1981; Wojtowicz i in.., 191; Mallart, 1993). Szkło Kimax (średnica zewnętrzna: 1,5 mm) zostało wyciągnięte i wypolerowane ogniowo w celu wytworzenia końcówek elektrod z wewnętrznymi średnicami w zakresie od 10 do 20 μm (Rysunek 15). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig15.jpg" alt="Schemat techniki mikroiniekcji z użyciem mikropipety do edycji genów w badaniach komórkowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 15"> 
Rycina 15: Średnica wnętrza elektrody do rejestracji makropłata. Światło elektrody wypełnia się medium kąpielowym. Wzmacniacz jest taki sam, jak ten użyty do wspomnianych wyżej rejestracji wewnątrzkomórkowych. Opór elektrody i uszczelnienia można określić poprzez przepuszczenie impulsów prądu testowego przez elektrodę. W naszych eksperymentach opory uszczelnienia mieściły się w zakresie od 0,3 do 1,0 MOhm, a opór elektrody w zakresie od 0,5 do 1,0 MOhm. Opór uszczelnienia może być monitorowany przez cały czas trwania rejestracji.</li>
<li> Bezpośrednie przeliczanie zdarzeń kwantowych jest możliwe przy niskich częstotliwościach stymulacji. Dla każdej odpowiedzi wywołanej liczbę zdarzeń kwantowych można łatwo określić w przypadku terminali o niskim wyjściu (Rysunek 16). Takie bezpośrednie przeliczenia mogą pomóc w oszacowaniu średniej zawartości kwantowej (Del Castillo &amp; Katz, 1954; Cooper i wsp.., 1995). Ponieważ wywołane odpowiedzi w NMJ o wysokiej wydajności generują wielokwantowe zdarzenia wywołane, średnią amplitudę lub pole wychyleń, wraz ze średnią amplitudą szczytową lub polem zdarzeń spontanicznych, można wykorzystać do przybliżenia średniej zawartości kwantowej (Cooper i wsp.., 1995). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig16.jpg" alt="Wykres kształtu fali neuronalnego EPSP pokazujący odpowiedzi fazowe i toniczne, z oznaczeniem mEPSP, czas trwania 10 ms." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 16"> 
Rysunek 16 Ślady ogniskowe zarejestrowane z fazowej i tonicznej złącza neuromięśniowego (NMJ). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig17.jpg" alt="Formuły analizy średniej zawartości kwantowej, równania dla wywołanych i spontanicznych zdarzeń kwantowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 17"> 
Rysunek 17</li>
</ol>

<ol>
	<li>Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+synaptic+physiology+of+crustacean+neuromuscular+systems.">Organization and synaptic physiology of crustacean neuromuscular systems.</a> Prog. Neurobiol. 7, 291-391 (1976).</li><li>Atwood, H. L., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+diversity+and+differentiation:+Crustacean+neuromuscular+junctions.">Synaptic diversity and differentiation: Crustacean neuromuscular junctions.</a> Invertebrate Neuroscience. 1, 291-307 (1996).</li><li>Bradacs, H., Cooper, R. L., Msghina, M., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+physiology+and+morphology+of+phasic+and+tonic+motor+axons+in+a+crayfish+limb+extensor+muscle.">Differential physiology and morphology of phasic and tonic motor axons in a crayfish limb extensor muscle.</a> J. Exp. Biol. 200, 677-691 (1997).</li><li>Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+measurement+and+analysis+methods+compared+for+crayfish+and+Drosophila+neuromuscular+junctions,+and+rat+hippocampus.">Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus.</a> J. Neurosci Methods. 61, 67-78 (1995).</li><li>Cooper, R. L., Donmezer, A., Shearer, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+differences+in+sensitivity+to+5-HT+between+high-+and+low-output+terminals+innervating+the+same+target.">Intrinsic differences in sensitivity to 5-HT between high- and low-output terminals innervating the same target.</a> Neuroscience Research. 45, 163-172 (2003).</li><li>Cooper, A. S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+view+and+demonstration+of+physiology+at+the+NMJ+at+the+crayfish+opener+muscle.">Historical view and demonstration of physiology at the NMJ at the crayfish opener muscle.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> J. Physiol. 124, 560-573 (1954).</li><li>Desai-Shah, M., Viele, K., Sparks, G., Nadolski, J., Hayden, B., Srinivasan, V. K., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+synaptic+function+during+short-term+facilitation+in+motor+nerve+terminals+in+the+crayfish.">Assessment of synaptic function during short-term facilitation in motor nerve terminals in the crayfish.</a> The Open Neuroscience Journal. 2, 24-35 (2008).</li><li>Desai-Shah, M., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+mechanisms+of+Ca2++regulation+that+influence+synaptic+transmission:+Comparison+between+crayfish+and+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Different mechanisms of Ca2+ regulation that influence synaptic transmission: Comparison between crayfish and Drosophila neuromuscular junctions.</a> SYNAPSE. 63, 1100-1121 (2009).</li><li>Dudel, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+reduced+calcium+on+quantal+unit+at+the+crayfish+neuromuscular+junction.">The effect of reduced calcium on quantal unit at the crayfish neuromuscular junction.</a> Pfl gers Arch. 391, 35-40 (1981).</li><li>Griffis, B., Moffett, S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+phenotype+remains+unaltered+after+limb+autotomy+and+unloading.">Muscle phenotype remains unaltered after limb autotomy and unloading.</a> J. Exp. Zool. 289, 10-22 (2001).</li><li>Harata, N., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Mozhayeva, M., Kavalai, E. T., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+numbers+of+recycling+vesicles+in+small+CNS+nerve+terminals:+implications+for+neural+signaling+and+vesicular+cycling.">Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling.</a> Trends in Neurosci. 24, 637-643 (2001).</li><li>Jeromin, A., Shayan, A. J., Msghina, M., Roder, J., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacean+frequenins:+molecular+cloning+and+differential+localization+at+neuromuscular+junctions.">Crustacean frequenins: molecular cloning and differential localization at neuromuscular junctions.</a> J. Neurobiol. 41 (2), 165-175 (1999).</li><li>Johnstone, A. F. M., Kellie, S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+depression+in+phasic+motor+nerve+terminals+and+influence+of+5-HT+on+docked+vesicles.">Presynaptic depression in phasic motor nerve terminals and influence of 5-HT on docked vesicles.</a> The Open Neuroscience Journal. 2, 16-23 (2008).</li><li>Katz, B., Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+of+the+nerve-muscle+system+in+Crustacea.">Excitation of the nerve-muscle system in Crustacea.</a> Proc. Roy. Soc. B. 133, 374-389 (1946).</li><li>Kennedy, D., Takeda, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflex+control+of+abdominal+flexor+muscles+in+crayfish.+I.+The+twitch+system.">Reflex control of abdominal flexor muscles in crayfish. I. The twitch system.</a> J. Exp. Biol. 43, 211-227 (1965).</li><li>Kennedy, D., Takeda, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflex+control+of+abdominal+flexor+muscles+in+crayfish.+II.+The+tonic+system.">Reflex control of abdominal flexor muscles in crayfish. II. The tonic system.</a> J. Exp. Biol. 43, 229-246 (1965).</li><li>King, M. J. R., Atwood, H. L., Govind, C. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+crayfish+phasic+and+tonic+neuromuscular+junctions.">Structural features of crayfish phasic and tonic neuromuscular junctions.</a> J. Comp. Neurol. 372, 618-626 (1996).</li><li>LaFramboise, W., Griffis, B., Bonner, P., Warren, W., Scalise, D., Guthrie, R. D., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+type+specific+myosin+isoforms+in+crustacean+muscles.">Muscle type specific myosin isoforms in crustacean muscles.</a> J. Exp. Zool. 286, 36-48 (2000).</li><li>Logsdon, S., Johnstone, A. F. M., Viele, K., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+synaptic+vesicles+pools+within+motor+nerve+terminals+during+short-term+facilitation+and+neuromodulation.">Regulation of synaptic vesicles pools within motor nerve terminals during short-term facilitation and neuromodulation.</a> J. Applied Physiol. 100, 662-671 (2006).</li><li>Lucas, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+complex+excitable+tissues+by+their+response+to+electric+currents+of+short+duration.">The analysis of complex excitable tissues by their response to electric currents of short duration.</a> J. Physiol. 35, 310-331 (1907).</li><li>Lucas, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+summation+of+propagated+disturbances+in+the+claw+of+Astacus+and+on+the+double+neuromuscular+system+of+the+abductor.">On summation of propagated disturbances in the claw of Astacus and on the double neuromuscular system of the abductor.</a> J. Physiol. 51, 1-35 (1917).</li><li>Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+that+stain+living+nerve+terminals.">Fluorescent probes that stain living nerve terminals.</a> J. Neurosci. 7, 1207-1214 (1987).</li><li>Millar, A. G., Bradacs, H., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+relationship+between+release+probability+and+readily+releasable+vesicles+in+depressing+and+facilitating+synapses.">Inverse relationship between release probability and readily releasable vesicles in depressing and facilitating synapses.</a> J. Neurosci. 22, 9661-9667 (2002).</li><li>Millar, A. G., Zucker, R. S., Ellis-Davies, C. G., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sensitivity+of+neurotransmitter+release+differs+at+phasic+and+tonic+synapses.">Calcium sensitivity of neurotransmitter release differs at phasic and tonic synapses.</a> J. Neurosci. 25, 3113-3125 (2005).</li><li>Msghina, M., Govind, C. K., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+structure+and+transmitter+release+in+crustacean+phasic+and+tonic+motor+neurons.">Synaptic structure and transmitter release in crustacean phasic and tonic motor neurons.</a> J. Neurosci. 18, 1374-1382 (1998).</li><li>Msghina, M., Millar, A. G., Charlton, M. P., Govind, C. K., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+entry+related+to+active+zones+and+differences+in+transmitter+release+at+phasic+and+tonic+synapses.">Calcium entry related to active zones and differences in transmitter release at phasic and tonic synapses.</a> J. Neurosci. 19, 8419-8434 (1999).</li><li>Mykles, D. L., Medler, S. A., Koenders, A., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibrillar+protein+isoform+expression+is+correlated+with+synaptic+efficacy+in+slow+fibres+of+the+claw+and+leg+opener+muscles+of+crayfish+and.">Myofibrillar protein isoform expression is correlated with synaptic efficacy in slow fibres of the claw and leg opener muscles of crayfish and.</a> 205 (4), 513-522 (2002).</li><li>Sparks, G., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-HT+offsets+homeostasis+of+synaptic+transmission+during+short-term+facilitation.">5-HT offsets homeostasis of synaptic transmission during short-term facilitation.</a> J. Applied Physiol. 96, 1681-1690 (2004).</li><li>Sohn, J., Mykles, D. L., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical,+physiological+and+biochemical+characterization+of+muscles+associated+with+the+articulating+membrane+in+the+dorsal+surface+of+the+crayfish+abdomen.">The anatomical, physiological and biochemical characterization of muscles associated with the articulating membrane in the dorsal surface of the crayfish abdomen.</a> J. Exp. Zool. 287, 353-377 (2004).</li><li>Tsien, R. W., Harata, N. C., Choi, S. W. P. y. l. e., Aravanis, A. M., AM, G. C. h. e. n. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles,+quanta+and+synaptic+plasticity.+Molecular+Mechanisms+of+synaptic+function.">Vesicles, quanta and synaptic plasticity. Molecular Mechanisms of synaptic function.</a> , (2001).</li><li>Van Harreveld, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+solution+for+freshwater+crustaceans.">A physiological solution for freshwater crustaceans.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34, 428-432 (1936).</li><li>Van Harreveld, A., Wiersma, C. A. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triple+innervation+of+the+crayfish+muscle.">The triple innervation of the crayfish muscle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 22, 667-667 (1936).</li><li>Wiersma, C. A. G., Van Harreveld, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+frequency+of+stimulation+on+the+slow+and+fast+contraction+in+crustacean+muscle.">The influence of the frequency of stimulation on the slow and fast contraction in crustacean muscle.</a> Physiol. Zool. 11, 75-81 (1938).</li><li>Wojtowicz, J. M., Smith, B. R., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+recruitment+of+silent+synapses.">Activity-dependent recruitment of silent synapses.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 627, 169-179 (1991).</li></ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym raporcie zademonstrowaliśmy, jak przeprowadzić sekcję, rejestrację oraz kwantyfikację odpowiedzi synaptycznych w unikalnym preparacie nerwowo-mięśniowym raka, w którym zarówno terminale o wysokiej, jak i niskiej wydajności unerwiają to samo włókno mięśniowe. Preparaty nerwowo-mięśniowe raka oferują wiele zalet w porównaniu z złączami nerwowo-mięśniowymi kręgowców, ponieważ do unerwienia mięśnia potrzeba tylko kilku pobudzeniowych neuronów ruchowych, a neurony te są identyfikowalne w kolejnych preparatach (Atwood, 1976). Ponadto neurotransmiter pobudzeniowy to glutaminian, a pobudzeniowe potencjały postsynaptyczne (EPSP) są stopniowane; zatem biofizyczne właściwości zdarzeń stopniowanych są analogiczne do właściwości dendrytów neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym kręgowców. Prądy kwantowe mogą być jednak monitorowane bezpośrednio w miejscach postsynaptycznych (Cooper et al., 1995).
Powtarzająca się stymulacja nerwu fazowego z częstotliwością 5 Hz wywołuje duże EPSP, które ulegają znacznemu osłabieniu po kilku minutach. Ten rodzaj depresji jest powszechny w fazowych złączach nerwowo-mięśniowych stawonogów (Atwood and Cooper, 1996). Obecność zakończeń tonicznych obok zakończeń fazowych pozwala ocenić, czy cel postsynaptyczny ulega znacznemu przekształceniu podczas i po depresji fazowego neuronu ruchowego. Dodatkowo, zakończenia o niskiej aktywności stanowią korzystny model do badania mechanizmów leżących u podstaw facylitacji synaptycznej (Desai-Shah et al., 2008; Desai-Shah and Cooper, 2009)
Terminale o wysokiej wydajności stanowią obszar badań nad modulacją tempa depresji synaptycznej oraz procesu regeneracji. Dostępne i żywotne preparaty powinny pomóc w rozszyfrowaniu mechanizmów leżących u podłoża depresji synaptycznej. W tym preparacie prostownika nogi rakiej egzogenna aplikacja serotoniny jest kolejnym narzędziem do badania regeneracji po depresji synaptycznej i potencjalnie sposobem na dalsze badanie mobilizacji pul synaptic vesicle. Preparat ten oferuje kilka zalet eksperymentalnych, ponieważ poszczególne włókna mięśniowe są unerwione zarówno przez fazowe, jak i toniczne neurony ruchowe.
Ponieważ serotonina zwiększa liczbę pęcherzyków uwalnianych podczas stymulacji wywołanej oraz wspomaga regenerację w trakcie depresji synaptycznej, ewidentne jest, że w obecności serotoniny zachodzi pewna modulacja pul pęcherzykowych w celu zwiększenia prawdopodobieństwa fuzji (Johnstone et al., 2008; Logsdon et al., 2006; Sparks et al., 2004). Wśród różnych protokołów eksperymentalnych możliwych do przeprowadzenia z wykorzystaniem tego preparatu należy również rozważyć modele wyjaśniające dynamikę pul pęcherzykowych w obrębie presynaptycznego zakończenia nerwowego podczas stymulacji o niskiej częstotliwości, w przeciwieństwie do stanu depresji synaptycznej. 
W innych systemach zauważono, że około 30% puli pęcherzyków podlega szybkemu recyklingowi, podczas gdy pozostałe pęcherzyki recyklingowane przechodzą przez tradycyjną, wolną ścieżkę recyklingu poprzez siateczkę śródplazmatyczną (Harata et al., 2001; Tsien et al., 2001). Takie podwójne ścieżki mogą występować również w tym systemie. Jeśli w stanie depresji zakończenia presynaptycznego brakuje ATP, dokowanie i oddokowywanie mogą nie zachodzić; w konsekwencji znacznie więcej niezaładowanych pęcherzyków pozostałoby na powierzchni synaptycznej. Ponieważ po wystawieniu zakończeń na działanie 5 HT uwalniane jest więcej pęcherzyków, prawdopodobne jest, że więcej z nich znajduje się w puli łatwo uwalnialnej (RRV). Jednak w stanie depresji, przy zmniejszonej ilości ATP, dokowanie i oddokowywanie mogą być zablokowane nawet w obecności 5 HT, co ponownie pozostawia niezaładowane pęcherzyki na powierzchni synaptycznej. Ponieważ wstępne dane sugerują, że wraz z upływem czasu, przy przedłużonej ekspozycji na 5 HT i stymulacji, uwalniane jest więcej pęcherzyków, rozkład puli pęcherzyków z szybkich i wolnych ścieżek recyklingu może być przesunięty tak, aby zapewnić pęcherzyki zdolne do ponownego uwolnienia (za Johnstone et al., 2008; patrz przeglądy – Desai-Shah et al., 2008; Desai-Shah i Cooper, 2009)
Wykorzystując techniki ogniskowych rejestracji makropłatowych prądów postsynaptycznych oraz pomiary pojedynczych kwantów z określonych obszarów zakończeń nerwów ruchowych, można postawić pytania pozwalające ustalić, czy depresja synaptyczna wynika z uwalniania mniejszej liczby pęcherzyków, czy z zaburzeń funkcji receptorów postsynaptycznych. Wykazano, że przy tej samej ekspozycji na wapń pęcherzyki w fazowych złączach neuromięśniowych (NMJ) w tej preparacji są bardziej podatne na fuzję (Miller et al. 2005), co prawdopodobnie wyjaśnia wyższą średnią zawartość kwantową w zakończeniach fazowych (Msghina et al., 1998, 1999). Ponadto różnice w białku wiążącym wapń — frekweninie (Jeromin et al., 1999) — oraz w ultrastrukturze (King et al., 1996) przyczyniają się do zróżnicowanej skuteczności synaptycznej (Cooper et al., 2003).

Niektóre wcześniejsze badania analizowały fenotyp mięśniowy włókien mięśni prostowników (Bradacs et al., 1997; Cooper et al., 2003). Porównanie regulacji różnicowania mięśni dla włókien o charakterze ściśle tonicznym i fazycznym u raka z włóknami mieszanymi, takimi jak w przypadku podwójnie unerwionego prostownika nogi, może dostarczyć wskazówek dotyczących ekspresji i regulacji fenotypu mięśniowego (LaFramboise et al., 2000; Sohn et al., 2000; Griffis et al., 2001; Mykles et al., 2002).
W neurobiologii wciąż pozostaje wiele fundamentalnych pytań, a niniejsze przygotowanie może pomóc w rozwiązaniu niektórych z nich. Kilka aktualnie interesujących obszarów badawczych, które można analizować z wykorzystaniem mięśnia prostownika nogi, obejmuje: 1) określenie mechanizmów komórkowych leżących u podstaw depresji synaptycznej w terminalach o wysokim wydajności (czy depresja wynika z ograniczenia napływu Ca2+, braku kompetentnej puli pęcherzyków gotowych do uwalniania (RRV) i/lub zmienionej receptywności postsynaptycznej?), 2) określenie mechanicznej roli 5-HT w przypadku jej podania po indukcji depresji synaptycznej w celu przyspieszenia regeneracji oraz 3) ustalenie, czy kształty prądów kwantowych powstających w wyniku stymulacji terminali fazowych ulegają zmianie podczas indukcji depresji, aby zbadać presynaptyczne i postsynaptyczne komponenty depresji synaptycznej.
To NMJ jest istotne dla prowadzeń badań oraz przyszłych badaczy, ponieważ umożliwia uzyskanie odpowiednich informacji dotyczących mechanizmów leżących u podstaw wydajności synaptycznej, mierzonej bezpośrednio w miejscach uwalniania. Obecne badania w tej dziedzinie dostarczają informacji na temat modulacji depresji synaptycznej przez 5-HT oraz dynamiki pul pęcherzykowych. Zagadnienia te odnoszą się do podstawowych zasad przekaźnictwa synaptycznego, które są istotne dla wszystkich układów nerwowych.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;Rak (&lt;em&gt;Procambarus clarkii&lt;/em&gt;). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Standardowy roztwór soli fizjologicznej dla raków: &lt;ul&gt; &lt;li&gt;Zmodyfikowany roztwór Van Harrevelda (1936). (w mM) 205 NaCl; 5,3 KCl; 13,5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; 2,45 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; 5 HEPES, z pH dostosowanym do 7,4&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; &lt;/li&gt; &lt;li&gt;Narzędzia do sekcji: precyzyjne pęsety nr 5, precyzyjne nożyczki, uchwyt do ostrza noża, szpilki entomologiczne nr 26002-20 (wszystkie zakupione w Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Kuweta sekcyjna powlekana Sylgardem, kuweta rejestracyjna wyposażona w elektrodę ssącą lub elektroda ssąca z manipulatorem do jej stabilizacji.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Mikroskop sekcyjny z funkcją zoom do rejestracji wewnątrzkomórkowych. Do rejestracji ogniskowej na wizualizowanych zakończeniach stosuje się mikroskop złożony z obiektywami pionowymi (4x i 20X). Wymagane jest źródło światła Hg.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Standardowy wzmacniacz wewnątrzkomórkowy i karta A/C do rejestracji online na komputerze. Sygnały elektryczne są rejestrowane online za pomocą &lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/pl3504#overview&quot; target=&quot;_blank">interfejsu PowerLab/4s&lt;/a&gt; (ADInstruments, Australia). Używamy standardowego &lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/&quot; target=&quot;_blank">oprogramowania od ADInstruments o nazwie Chart lub Scope&lt;/a&gt;.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Odczynniki chemiczne: &lt;ul&gt; &lt;li&gt;Do wizualizacji wariancji stosujemy żywy barwnik fluorescencyjny, 4 [4 (dietyloamino) styryl] N metylopirydinium jodek (4 Di 2 Asp; Molecular Probes, Eugene, OR) (Marigassi &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 1987; Cooper &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 1995a). Wszystkie odczynniki do roztworów soli fizjologicznej zostały zakupione w firmie chemicznej Sigma (St. Louis, MO).&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; &lt;/li&gt; &lt;li&gt;Do rejestracji wewnątrzkomórkowych używamy szklanych kapilar (katalog nr 30-31-0 z FHC, Brunswick, ME, 04011, USA), a do elektrod macropatch używamy Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0,8-1,1 mm, długość 100 mm. Elektroda wewnątrzkomórkowa powinna mieć rezystancję od 20 do 30 mOhm. Elektrodę macropatch wykonuje się poprzez odłamanie końcówki szklanej po wytworzeniu cienkiego wierzchołka za pomocą wyciągacza elektrod. Odłamana końcówka musi być czystym, prostopadłym przełamaniem o średnicy około 20&amp;mu;M. Następnie końcówka jest polerowana termicznie do średnicy wewnętrznej około 10&amp;mu;M. Trzon elektrody jest następnie przepuszczany przez element grzejny, aby wygiąć go o około 45 stopni w sposób łagodny. Pozwala to na uzyskanie płaskiego lub prostopadłego światła elektrody nad zakończeniem nerwowym, ponieważ kąt mikromanipulatora stworzy kolejne około 45 stopni względem preparatu.&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

rejestracje fizjologiczne złącza nerwowo-mięśniowego o wysokiej i niskiej wydajności w mięśniu prostowniku nogi raka

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

Szczegółowo wyjaśniamy, jak odsłonić i przeprowadzić rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi synaptycznych dla neuronów ruchowych o wysokiej (fazowej) i niskiej (tonicznej) aktywności wyjściowej, unerwiających mięsień prostownik w nodze chodu raków. Wyraźne różnice występują w fizjologii i morfologii zakończeń nerwowych fazowych i tonicznych. Akson toniczny zawiera znacznie więcej mitochondriów, co pozwala mu na intensywniejsze przyjmowanie barwnika witalnego niż w przypadku aksonu fazowego. Zakończenia toniczne posiadają zgrubienia (varicosities), natomiast zakończenie fazowe jest nitkowate. Zakończenia toniczne charakteryzują się niską skutecznością synaptyczną, ale wykazują gwałtowne odpowiedzi ułatwione. W przeciwieństwie do nich, zakończenia fazowe mają wysoką skuteczność kwantową, lecz wykazują depresję synaptyczną przy stymulacji o wysokiej częstotliwości. Wyjście kwantowe jest mierzone za pomocą ogniskowej elektrody macropatch umieszczonej bezpośrednio nad wizualizowanymi zakończeniami nerwowymi. Zarówno zakończenia fazowe, jak i toniczne unerwiają te same włókna mięśniowe, co sugeruje, że za różnicowanie morfologiczne i fizjologiczne odpowiadają immanentne różnice w neuronach, a nie zróżnicowana sprzężenie zwrotne wsteczne z mięśnia.

Niniejszy artykuł demonstruje, jak przeprowadzać rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi synaptycznych w mięśniu prostowniku nogi chodu raka oraz w jaki sposób wizualizować zakończenia nerwowe, aby wykazać ogólne różnice morfologiczne między zakończeniami nerwowymi o wysokiej i niskiej wydajności.

Rejestracje fizjologiczne złącza nerwowo-mięśniowego o wysokiej i niskiej wydajności w mięśniu prostowniku nogi raka

Szczegółowo wyjaśniamy, jak odsłaniać i przeprowadzać rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi synaptycznych dla wysokich (fazowych) i niskich (tonicznych) wyjść motorycznych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie sposobu odsłaniania i rozróżniania fazycznych oraz tonicznych zakończeń ruchowych za pomocą barwienia morfologicznego i rejestracji elektrofizjologicznej w mięśniu prostowniku raka. Osiąga się to poprzez odcięcie pierwszej lub drugiej nogi krocznej raka średniej wielkości, wycięcie kutykuli i usunięcie mięśnia zginacza w segmencie meite. Pozwala to na odsłonięcie mięśnia prostownika oraz pęczka nerwowego.Drugim krokiem procedury jest barwienie preparatu czterema etyloaminosteiramidami i jodkiem metyloperytonianu, lub 4D2ASP, w celu wizualizacji aksonów i zakończeń nerwowych. Trzecim krokiem procedury jest selektywna stymulacja neuronów tonicznych i/lub fazowych przy jednoczesnym rejestrowaniu wewnątrzkomórkowym wywołanych EPSP w włóknie mięśniowym. Ostatnim krokiem procedury jest zastosowanie elektrody ogniskowej do rejestracji spontanicznych i wywołanych zdarzeń kwantowych z zakończeń.W rezultacie można uzyskać wyniki pozwalające na oddzielenie zakończeń tonicznych i fazycznych, zarówno morfologicznie, jak i fizjologicznie, za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej oraz elektrofizjologii. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii synaptycznej w takich obszarach jak zmęczenie mięśni, depresja synaptyczna oraz interferencja synaptyczna. Eksperyment rozpoczyna się od ostrożnego chwycenia rakika, tak aby uniknąć kontaktu z jego szczypcami.Oddziel odnóż od ciała na poziomie segmentu isiopodu. Silny ucisk w obrębie segmentu isiopodu indukuje u raka autotomizację lub naturalne odłamanie pierwszej nogi krocznej. Krwawienie u raka ustanie, po czym zwierzę zostanie umieszczone z powrotem w zbiorniku hodowlanym.Rak nie zostaje uśpiony. Umieść odnóż na kawałku papierowego ręcznika, aby przygotowany materiał można było łatwo obracać podczas wykonywania nacięć. Obracaj odnóż tak, aby strona zewnętrzna, czyli boczna, była skierowana ku górze na płytce sekcyjnej.Zazwyczaj strona łukowata jest skierowana do góry. Używając ostrego ostrza do żyletki przymocowanego do łamacza skalpeli, wykonaj nacięcie kutykuli w obrębie segmentu meite, postępując zgodnie ze wzorem przedstawionym na rysunku. Należy uważać, aby podczas cięcia grzbietowo-brzusznego wzdłuż stawu meite-carpod nie przeciąć tkanki zbyt daleko w kierunku dystalnym.Takie cięcie tworzy okno w meite powyżej leżących pod nim mięśni nóg. Pozostaw kutykulę na miejscu. Umieść preparat w naczyniu sekcyjnym zawierającym sól fizjologiczną dla raków.W tym momencie, za pomocą precyzyjnej pęsety, umieść szpilkę w środku segmentu carpod oraz w części grzbietowej segmentu ischia pod, delikatnie unieś wycięte w kutykuli okienko od strony końca dystalnego i za pomocą żyletki odetnij włókna mięśnia zginacza od kutykuli. Kontynuuj cięcie w kierunku od strony dystalnej do proksymalnej, a na koniec zdejmij okienko kutykuli. Aby odsłonić mięsień prostownik, należy usunąć nadlegający mięsień zginacz.Oddziel ścięgno mięśnia zginacza, odsuwając je od mięśnia za pomocą szpilki. Następnie przetnij ścięgno na poziomie stawu nadgarstkowego. Zgodnie z instrukcją, należy bardzo uważać, aby odsunąć ścięgno od jamistego wnętrza nogi przed wykonaniem cięcia oraz przeciąć wyłącznie ścięgno, a nie główny nerw nogi, który znajduje się po stronie wewnętrznej ścięgna.Ściśnij pęsetą ścięgno w miejscu przecięcia i oddziel mięsień zginacz od nogi, unosząc go w kierunku przyśrodkowym. Aby odsłonić nerw mięśnia prostownika, przetnij główny nerw nogi na wysokości stawu mero-karpiowego i ostrożnie odsuń główny nerw nogi w stronę mięśnia prostownika. Oddzielenie nerwu mięśnia prostownika od głównego nerwu nogi można ułatwić, delikatnie odsuwając dystalny koniec głównego nerwu nogi na bok preparatu. Podczas odsuwania głównego nerwu nogi znad mięśnia prostownika może być konieczne przecięcie małych odgałęzień aksonu hamującego.Wiązkę nerwową można zwizualizować za pomocą barwienia błękitem metylenowym. Jednakże, w przypadku powyższego obrazu, błękitu metylenowego nie zastosowano do rejestracji elektrofizjologicznych. Czerwone strzałki wskazują interesujący nas przebieg nerwu.Wiązką nerwową, która nas interesuje, jest większa wiązka odchodząca od głównego nerwu nogi w pobliżu końca proksymalnego miejsca, w którym znajduje się merepod. Zwróć uwagę na rozgałęzienie aksonów oraz dwa wyraźnie widoczne aksony wewnątrz nerwu. Po odsłonięciu nerwu i mięśnia należy przygotować aparaturę wykorzystywaną w eksperymencie.Rejestracje wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe są przeprowadzane przy użyciu standardowego przedwzmacniacza głowicowego i wzmacniacza. Stosujemy wzmacniacz Axon Clamp 2B oraz głowicę 1XLU. Wymagane są trzy elektrody: jedna wewnątrzkomórkowa i dwie zewnątrzkomórkowe.Dwie elektrody zewnątrzkomórkowe zostaną wykorzystane do stymulacji nerwu oraz do rejestracji wywołanych i spontanicznych zdarzeń synaptycznych. Wypoleruj elektrody punktowe za pomocą palnika i lekko wygnij je nad elementem grzejnym. Po napełnieniu elektrody punktowej solą fizjologiczną, umieść ją w uchwycie elektrody stymulującej i wprowadź drut stymulatora tak, aby stykał się on z solą fizjologiczną.Jest to połączone z jednostką izolacyjną stymulacji grass P 15, która z kolei jest podłączona do stymulatora grass S 88. Podczas rejestracji elektrofizjologicznej, w celu wizualizacji i barwienia aksonów, stosuje się barwnik witalny D two ASP; należy wymienić sól kąpielową na sól zawierającą 5 µM barwnika four D two as per przez pięć minut. Po pięciu minutach ponownie napełnić naczynie fizjologiczną solą dla raka, umieścić preparat pod mikroskopem i użyć obiektywu Forex.Przy powiększeniu okularowym 10x przesuń elektrodę stymulującą do obszaru zainteresowania. Kolejnym krokiem jest umieszczenie światła makropipety elektrody stymulującej na aksonie fazowym lub tonicznym. To zdjęcie preparatu barwionego czterema barwnikami ukazuje, że akson toniczny jest wyraźniej widoczny ze względu na zwiększoną zawartość mitochondriów.W mikroskopii fluorescencyjnej zakończenia toniczne wykazują liczne żeberka, natomiast zakończenia fazowe są cieńsze. Przy użyciu obiektywu 20x umieszczamy elektrodę na aksonie tonicznym lub fazycznym. W tym przypadku elektrodę umieszcza się na aksonie tonicznym.Umieść elektrodę wewnątrzkomórkową w mikromanipulatorze, a następnie wprowadź elektrodę wewnątrzkomórkową do komórki mięśnia prostownika. Służy ona do rejestracji wewnątrzkomórkowych pobudzających potencjałów postsynaptycznych lub EPSP. W celu rejestracji EPSP.Umieść drugą elektrodę ogniskową w mikromanipulatorze. W tym celu należy usunąć poprzednią elektrodę wewnątrzkomórkową wraz z uchwytem i zastąpić je czystym uchwytem na elektrodę. Użyj mikromanipulatora, aby umieścić światło drugiej elektrody ogniskowej bezpośrednio nad wypukłością synaptyczną.Opór elektrody i uszczelnienia wyznacza się poprzez przepuszczanie impulsów prądu testowego przez elektrodę. W naszych eksperymentach opory uszczelnienia mieściły się w zakresie od 0,3 do jednego megaoma, a zakres oporu elektrody od 0,5 do jednego megaoma. Opór uszczelnienia może być monitorowany przez cały czas trwania rejestracji.Po przygotowaniu do rozpoczęcia stymulacji, uruchom oprogramowanie scope 5.0 i rozpocznij stymulację izolowanego aksonu. W pęczku nerwowym akson toniczny jest stymulowany za pomocą elektrody ssącej, a EPSP włókna mięśniowego są rejestrowane za pomocą elektrody wewnątrzkomórkowej lub zewnątrzkomórkowej. EPSP są rejestrowane na komputerze poprzez interfejs power lab forest.Po stymulacji aksonu tonicznego elektrodę stymulującą można przenieść na akson fazyczny i powtórzyć eksperyment po stymulacji nerwu. Elektroda wewnątrzkomórkowa rejestruje EPSP generowane w odpowiedzi na aktywność zarówno tonicznych, jak i fazycznych neuronów ruchowych. Facylitacja synaptyczna tonicznych złącz nerwowo-mięśniowych zależy od częstotliwości stymulacji nerwu, co pokazano tutaj dla następujących po sobie serii około 20 bodźców każda przy częstotliwości 60 hertz.Zwróć uwagę na facylitację, która występuje przy wielu bodźcach. Ten rysunek porównuje amplitudy EPSP generowanych przez stymulację nerwu tonicznego z częstotliwością 20 hertz (kolor niebieski), 40 hertz (kolor zielony) oraz 60 hertz (kolor czerwony). Zauważ wyraźną facylitację widoczną przy wyższych częstotliwościach stymulacji. Terminale toniczne charakteryzują się niską skutecznością synaptyczną, lecz wykazują gwałtowne odpowiedzi facylitowane.Tutaj przedstawiono same toniczne EPSP, a następnie nałożono na nie odpowiedzi fazowe w tej samej skali. W przeciwieństwie do zakończeń tonicznych, zakończenia fazowe charakteryzują się wysoką skutecznością kwantową, ale wykazują depresję synaptyczną przy stymulacji o wysokiej częstotliwości. Depresja synaptyczna w zakończeniach fazowych jest również powiązana z częstotliwością stymulacji, co pokazano tutaj.Ciągła stymulacja o częstotliwości 5 Hz przez 30 minut obniża odpowiedź w złączu nerwowo-mięśniowym. Przy wyższej częstotliwości stymulacji preparat będzie wykazywać szybszą depresję przy odpowiedniej stymulacji. Złącze nerwowo-mięśniowe raka generuje niepikowe EPSP.Te EPSP mogą być wykorzystane do badania właściwości kwantowych, które tworzą stopniowane sygnały elektryczne w tych mięśniach. Przedstawiono tutaj kwantowe odpowiedzi synaptyczne zakończenia tonicznego. Należy zauważyć, że nie wszystkie próby stymulacji kończą się zdarzeniem kwantowym.Bezpośrednie zliczanie zdarzeń kwantowych jest możliwe przy zastosowaniu stymulacji o niskiej częstotliwości dla każdej odpowiedzi wywołanej. Liczbę zdarzeń kwantowych można łatwo określić dla zakończeń tonicznych. Poprzez zliczanie zdarzeń kwantowych, odpowiedzi synaptyczne z fazowego neuronu ruchowego mogą być rejestrowane w ten sam sposób.W odpowiedziach wywołanych występują jednak zdarzenia wielokwantowe. Średnią zawartość kwantową szacuje się, wykorzystując średnią amplitudę lub pole powierzchni odchyleń wraz ze średnią amplitudą szczytową lub polem powierzchni zdarzeń spontanicznych. Na koniec przypominamy, aby zachować ostrożność podczas usuwania mięśnia zginacza, aby nie uszkodzić nerwu podczas odsłaniania mięśnia prostownika.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

physiological-recordings-high-low-output-nmjs-on-crayfish-leg

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestracje fizjologiczne wysokiego i niskiego wyjścia NMJ na mięśniu przedłużaczu nogi raki

W niniejszej pracy opisujemy metody elektrofizjologiczne służące do pomiaru przekaźnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym larwy Drosophila. Uwalnianie wywołane inicjuje się sztucznie poprzez stymulację aksonów neuronów ruchowych, a przekaźnictwo w złączu NMJ można zmierzyć na podstawie odpowiedzi postsynaptycznej wywołanej w mięśniu.

Metody elektrofizjologiczne rejestracji potencjałów synaptycznych z złącza nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Zastosowanie elektrofizjologii w badaniach dostępnych synaps umożliwia ilościowe pomiary aktywności synaptycznej, co jest przydatne w analizie mutantów synaptycznych. Niniejszy artykuł opisuje metodę dysekcji służącą do odsłonięcia złączy neuromięśniowych (NMJ) u Caenorhabditis elegans (C. elegans) i krótko omawia możliwe zastosowania tak przygotowanego preparatu.

Disekcja i rejestracja z połączenia nerwowo-mięśniowego C. elegans

Nieinwazyjne pomiary wzorców aktywności neuronalnej u zwierząt zachowujących swobodną aktywność uzyskuje się poprzez połączenie rejestracji neurofizjologicznych z szybką wideografią.

Rejestracja aktywacji obwodów neuronalnych u zwierząt w warunkach swobodnego zachowania

Mięsień otwierający odnóża raków został zaprezentowany ze względu na jego historyczne znaczenie oraz wszechstronność eksperymentalną w badaniach nad fenotypem mięśni, fizjologią synaptyczną i plastycznością.

Historyczne ujęcie i demonstracja fizjologii złącza neuromięśniowego mięśnia otwieracza raków

Doświadczenia te prezentują prosty sposób, dzięki któremu studenci mogą zdobyć doświadczenie w badaniu struktury mięśni, odpowiedzi synaptycznych oraz wpływu gradientów jonowych i przepuszczalności na potencjały błonowe. Przedstawiono również obwód sensoryczny-OUN-motoryczny-mięśniowy, aby pokazać metodę testowania wpływu związków chemicznych na obwód neuronalny.

Potencjały błonowe, odpowiedzi synaptyczne, obwody neuronalne, neuromodulacja i histologia mięśni z wykorzystaniem raka rzecznego: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Głównym celem niniejszego eksperymentu jest zrozumienie, w jaki sposób pierwotne neurony sensoryczne przekazują informacje o ruchach i pozycjach stawów jako informacje proprioceptywne u zwierzęcia. Dodatkowym celem niniejszego raportu jest przedstawienie anatomii preparatu poprzez sekcję i obserwację neuronów pod mikroskopem stereoskopowym.

Organy receptorowe mięśni w odwłoku raków: ćwiczenie laboratoryjne dla studentów z zakresu propriocepcji

Opisujemy metodę bezpośredniego pomiaru siły mięśniowej, mocy mięśniowej, kinetyki skurczu oraz podatności na zmęczenie izolowanych mięśni szkieletowych w układzie in vitro z wykorzystaniem stymulacji polowej. Dzięki zastosowaniu różnych protokołów stymulacji można uzyskać cenne informacje na temat właściwości gospodarki Ca2+ oraz mechanizmu skurczowego mięśnia.

Ex Vivo ocena kurczliwości, męczliwości i alternansu w izolowanych mięśniach szkieletowych

Techniki fizjologiczne i anatomiczne są demonstrowane w celu rozwiązania funkcji i struktury proprioceptorów stawów oraz receptorów napięcia mięśniowego u kończyn chodzących skorupiaków.

Receptory propriocepcji i napięcia w kończynach kraba: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Neurony czuciowe mięśni są zaangażowane w sygnalizację proprioceptorową, a także informują o stanie metabolicznym i zdarzeniach związanych z urazami. Opisujemy preparat mięśniowo-nerwowy dorosłej myszy in vitro do badań nad mięśniami aferentnymi aktywowanymi rozciąganiem.

Preparat mięśniowo-nerwowy dorosłej myszy in vitro do badania właściwości wypalania aferentów mięśniowych

Ocena funkcjonalna połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) może dostarczyć istotnych informacji na temat komunikacji między mięśniem a nerwem. W tym miejscu opisujemy protokół kompleksowej oceny zarówno NMJ, jak i funkcjonalności mięśni przy użyciu dwóch różnych preparatów mięśniowo-nerwowych, tj. płaszczkowato-kulszowego i przeponowo-przeponowego.

Pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego

Prezentowany jest protokół do wytwarzania różnych typów uszkodzeń nerwu pośrodkowego (MN) i naprawy u szczura. Dodatkowo protokół pokazuje, jak ocenić funkcjonalną regenerację nerwu za pomocą kilku nieinwazyjnych testów behawioralnych i pomiarów fizjologicznych.

Funkcjonalne i fizjologiczne metody oceny regeneracji nerwu pośrodkowego u szczura

Poznaj metodę elektrofizjologicznych zapisów synaptycznych na mięśniu prostownika nogi raków. Technika ta pozwala odróżnić terminale toniczne i fazowe oraz wizualizować struktury nerwowe.

Rejestracje fizjologiczne złącza nerwowo-mięśniowego o wysokiej i niskiej wydajności w mięśniu prostowniku nogi raka

Przeglądaj więcej filmów