Rejestracje fizjologiczne złącza nerwowo-mięśniowego o wysokiej i niskiej wydajności w mięśniu prostowniku nogi raka

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie sposobu odsłaniania i rozróżniania fazycznych oraz tonicznych zakończeń ruchowych za pomocą barwienia morfologicznego i rejestracji elektrofizjologicznej w mięśniu prostowniku raka. Osiąga się to poprzez odcięcie pierwszej lub drugiej nogi krocznej raka średniej wielkości, wycięcie kutykuli i usunięcie mięśnia zginacza w segmencie meite. Pozwala to na odsłonięcie mięśnia prostownika oraz pęczka nerwowego.

Drugim krokiem procedury jest barwienie preparatu czterema etyloaminosteiramidami i jodkiem metyloperytonianu, lub 4D2ASP, w celu wizualizacji aksonów i zakończeń nerwowych. Trzecim krokiem procedury jest selektywna stymulacja neuronów tonicznych i/lub fazowych przy jednoczesnym rejestrowaniu wewnątrzkomórkowym wywołanych EPSP w włóknie mięśniowym. Ostatnim krokiem procedury jest zastosowanie elektrody ogniskowej do rejestracji spontanicznych i wywołanych zdarzeń kwantowych z zakończeń.

W rezultacie można uzyskać wyniki pozwalające na oddzielenie zakończeń tonicznych i fazycznych, zarówno morfologicznie, jak i fizjologicznie, za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej oraz elektrofizjologii. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii synaptycznej w takich obszarach jak zmęczenie mięśni, depresja synaptyczna oraz interferencja synaptyczna. Eksperyment rozpoczyna się od ostrożnego chwycenia rakika, tak aby uniknąć kontaktu z jego szczypcami.

Oddziel odnóż od ciała na poziomie segmentu isiopodu. Silny ucisk w obrębie segmentu isiopodu indukuje u raka autotomizację lub naturalne odłamanie pierwszej nogi krocznej. Krwawienie u raka ustanie, po czym zwierzę zostanie umieszczone z powrotem w zbiorniku hodowlanym.

Rak nie zostaje uśpiony. Umieść odnóż na kawałku papierowego ręcznika, aby przygotowany materiał można było łatwo obracać podczas wykonywania nacięć. Obracaj odnóż tak, aby strona zewnętrzna, czyli boczna, była skierowana ku górze na płytce sekcyjnej.

Zazwyczaj strona łukowata jest skierowana do góry. Używając ostrego ostrza do żyletki przymocowanego do łamacza skalpeli, wykonaj nacięcie kutykuli w obrębie segmentu meite, postępując zgodnie ze wzorem przedstawionym na rysunku. Należy uważać, aby podczas cięcia grzbietowo-brzusznego wzdłuż stawu meite-carpod nie przeciąć tkanki zbyt daleko w kierunku dystalnym.

Takie cięcie tworzy okno w meite powyżej leżących pod nim mięśni nóg. Pozostaw kutykulę na miejscu. Umieść preparat w naczyniu sekcyjnym zawierającym sól fizjologiczną dla raków.

W tym momencie, za pomocą precyzyjnej pęsety, umieść szpilkę w środku segmentu carpod oraz w części grzbietowej segmentu ischia pod, delikatnie unieś wycięte w kutykuli okienko od strony końca dystalnego i za pomocą żyletki odetnij włókna mięśnia zginacza od kutykuli. Kontynuuj cięcie w kierunku od strony dystalnej do proksymalnej, a na koniec zdejmij okienko kutykuli. Aby odsłonić mięsień prostownik, należy usunąć nadlegający mięsień zginacz.

Oddziel ścięgno mięśnia zginacza, odsuwając je od mięśnia za pomocą szpilki. Następnie przetnij ścięgno na poziomie stawu nadgarstkowego. Zgodnie z instrukcją, należy bardzo uważać, aby odsunąć ścięgno od jamistego wnętrza nogi przed wykonaniem cięcia oraz przeciąć wyłącznie ścięgno, a nie główny nerw nogi, który znajduje się po stronie wewnętrznej ścięgna.

Ściśnij pęsetą ścięgno w miejscu przecięcia i oddziel mięsień zginacz od nogi, unosząc go w kierunku przyśrodkowym. Aby odsłonić nerw mięśnia prostownika, przetnij główny nerw nogi na wysokości stawu mero-karpiowego i ostrożnie odsuń główny nerw nogi w stronę mięśnia prostownika. Oddzielenie nerwu mięśnia prostownika od głównego nerwu nogi można ułatwić, delikatnie odsuwając dystalny koniec głównego nerwu nogi na bok preparatu. Podczas odsuwania głównego nerwu nogi znad mięśnia prostownika może być konieczne przecięcie małych odgałęzień aksonu hamującego.

Wiązkę nerwową można zwizualizować za pomocą barwienia błękitem metylenowym. Jednakże, w przypadku powyższego obrazu, błękitu metylenowego nie zastosowano do rejestracji elektrofizjologicznych. Czerwone strzałki wskazują interesujący nas przebieg nerwu.

Wiązką nerwową, która nas interesuje, jest większa wiązka odchodząca od głównego nerwu nogi w pobliżu końca proksymalnego miejsca, w którym znajduje się merepod. Zwróć uwagę na rozgałęzienie aksonów oraz dwa wyraźnie widoczne aksony wewnątrz nerwu. Po odsłonięciu nerwu i mięśnia należy przygotować aparaturę wykorzystywaną w eksperymencie.

Rejestracje wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe są przeprowadzane przy użyciu standardowego przedwzmacniacza głowicowego i wzmacniacza. Stosujemy wzmacniacz Axon Clamp 2B oraz głowicę 1XLU. Wymagane są trzy elektrody: jedna wewnątrzkomórkowa i dwie zewnątrzkomórkowe.

Dwie elektrody zewnątrzkomórkowe zostaną wykorzystane do stymulacji nerwu oraz do rejestracji wywołanych i spontanicznych zdarzeń synaptycznych. Wypoleruj elektrody punktowe za pomocą palnika i lekko wygnij je nad elementem grzejnym. Po napełnieniu elektrody punktowej solą fizjologiczną, umieść ją w uchwycie elektrody stymulującej i wprowadź drut stymulatora tak, aby stykał się on z solą fizjologiczną.

Jest to połączone z jednostką izolacyjną stymulacji grass P 15, która z kolei jest podłączona do stymulatora grass S 88. Podczas rejestracji elektrofizjologicznej, w celu wizualizacji i barwienia aksonów, stosuje się barwnik witalny D two ASP; należy wymienić sól kąpielową na sól zawierającą 5 µM barwnika four D two as per przez pięć minut. Po pięciu minutach ponownie napełnić naczynie fizjologiczną solą dla raka, umieścić preparat pod mikroskopem i użyć obiektywu Forex.

Przy powiększeniu okularowym 10x przesuń elektrodę stymulującą do obszaru zainteresowania. Kolejnym krokiem jest umieszczenie światła makropipety elektrody stymulującej na aksonie fazowym lub tonicznym. To zdjęcie preparatu barwionego czterema barwnikami ukazuje, że akson toniczny jest wyraźniej widoczny ze względu na zwiększoną zawartość mitochondriów.

W mikroskopii fluorescencyjnej zakończenia toniczne wykazują liczne żeberka, natomiast zakończenia fazowe są cieńsze. Przy użyciu obiektywu 20x umieszczamy elektrodę na aksonie tonicznym lub fazycznym. W tym przypadku elektrodę umieszcza się na aksonie tonicznym.

Umieść elektrodę wewnątrzkomórkową w mikromanipulatorze, a następnie wprowadź elektrodę wewnątrzkomórkową do komórki mięśnia prostownika. Służy ona do rejestracji wewnątrzkomórkowych pobudzających potencjałów postsynaptycznych lub EPSP. W celu rejestracji EPSP.

Umieść drugą elektrodę ogniskową w mikromanipulatorze. W tym celu należy usunąć poprzednią elektrodę wewnątrzkomórkową wraz z uchwytem i zastąpić je czystym uchwytem na elektrodę. Użyj mikromanipulatora, aby umieścić światło drugiej elektrody ogniskowej bezpośrednio nad wypukłością synaptyczną.

Opór elektrody i uszczelnienia wyznacza się poprzez przepuszczanie impulsów prądu testowego przez elektrodę. W naszych eksperymentach opory uszczelnienia mieściły się w zakresie od 0,3 do jednego megaoma, a zakres oporu elektrody od 0,5 do jednego megaoma. Opór uszczelnienia może być monitorowany przez cały czas trwania rejestracji.

Po przygotowaniu do rozpoczęcia stymulacji, uruchom oprogramowanie scope 5.0 i rozpocznij stymulację izolowanego aksonu. W pęczku nerwowym akson toniczny jest stymulowany za pomocą elektrody ssącej, a EPSP włókna mięśniowego są rejestrowane za pomocą elektrody wewnątrzkomórkowej lub zewnątrzkomórkowej. EPSP są rejestrowane na komputerze poprzez interfejs power lab forest.

Po stymulacji aksonu tonicznego elektrodę stymulującą można przenieść na akson fazyczny i powtórzyć eksperyment po stymulacji nerwu. Elektroda wewnątrzkomórkowa rejestruje EPSP generowane w odpowiedzi na aktywność zarówno tonicznych, jak i fazycznych neuronów ruchowych. Facylitacja synaptyczna tonicznych złącz nerwowo-mięśniowych zależy od częstotliwości stymulacji nerwu, co pokazano tutaj dla następujących po sobie serii około 20 bodźców każda przy częstotliwości 60 hertz.

Zwróć uwagę na facylitację, która występuje przy wielu bodźcach. Ten rysunek porównuje amplitudy EPSP generowanych przez stymulację nerwu tonicznego z częstotliwością 20 hertz (kolor niebieski), 40 hertz (kolor zielony) oraz 60 hertz (kolor czerwony). Zauważ wyraźną facylitację widoczną przy wyższych częstotliwościach stymulacji. Terminale toniczne charakteryzują się niską skutecznością synaptyczną, lecz wykazują gwałtowne odpowiedzi facylitowane.

Tutaj przedstawiono same toniczne EPSP, a następnie nałożono na nie odpowiedzi fazowe w tej samej skali. W przeciwieństwie do zakończeń tonicznych, zakończenia fazowe charakteryzują się wysoką skutecznością kwantową, ale wykazują depresję synaptyczną przy stymulacji o wysokiej częstotliwości. Depresja synaptyczna w zakończeniach fazowych jest również powiązana z częstotliwością stymulacji, co pokazano tutaj.

Ciągła stymulacja o częstotliwości 5 Hz przez 30 minut obniża odpowiedź w złączu nerwowo-mięśniowym. Przy wyższej częstotliwości stymulacji preparat będzie wykazywać szybszą depresję przy odpowiedniej stymulacji. Złącze nerwowo-mięśniowe raka generuje niepikowe EPSP.

Te EPSP mogą być wykorzystane do badania właściwości kwantowych, które tworzą stopniowane sygnały elektryczne w tych mięśniach. Przedstawiono tutaj kwantowe odpowiedzi synaptyczne zakończenia tonicznego. Należy zauważyć, że nie wszystkie próby stymulacji kończą się zdarzeniem kwantowym.

Bezpośrednie zliczanie zdarzeń kwantowych jest możliwe przy zastosowaniu stymulacji o niskiej częstotliwości dla każdej odpowiedzi wywołanej. Liczbę zdarzeń kwantowych można łatwo określić dla zakończeń tonicznych. Poprzez zliczanie zdarzeń kwantowych, odpowiedzi synaptyczne z fazowego neuronu ruchowego mogą być rejestrowane w ten sam sposób.

W odpowiedziach wywołanych występują jednak zdarzenia wielokwantowe. Średnią zawartość kwantową szacuje się, wykorzystując średnią amplitudę lub pole powierzchni odchyleń wraz ze średnią amplitudą szczytową lub polem powierzchni zdarzeń spontanicznych. Na koniec przypominamy, aby zachować ostrożność podczas usuwania mięśnia zginacza, aby nie uszkodzić nerwu podczas odsłaniania mięśnia prostownika.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.