Name: Eksperymenty fizjologiczne z rakami w jelicie grubym: ćwiczenie laboratoryjne dla studentów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj techniki badania fizjologii jelita grubego u raków, w tym pomiar skurczów perystaltycznych i testy farmakologiczne. Metoda ta pozwala studentom zrozumieć mechanizmy kontroli mięśni gładkich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez University of Kentucky, Wydział Biologii, Biuro Studiów Licencjackich oraz College of Arts &amp; Sciences.

1. Wstęp

Najnowszy kompleksowy przegląd jelita tylnego raków został opracowany w dysertacji dr Barbary E. Musolf (2007, Georgia State University, Atlanta, Georgia, USA), która skupiła się przede wszystkim na modulacji serotonergicznej i unerwieniu (Musolf et al., 2009). Jelita tylne skorupiaków zostały po raz pierwszy zbadane ponad 100 lat temu przez Alexandrowicza, pioniera anatomii porównawczej (Alexandrowicz, 1909), który opisał różne aspekty ich unerwienia. Badania kontynuowano na przestrzeni lat, identyfikując rodzaje i architekturę warstw mięśniowych, analizując ogólną funkcję jelita tylnego w osmoregulacji całego organizmu oraz badając kontrolę modulacyjną kurczliwości jelita tylnego przez różne związki (zob. przegląd Musolf, 2007). Warto zauważyć, że odcinek analny jelita tylnego służy nie tylko do wydalania kału, ale także do pobierania wody ze środowiska w celu osmoregulacji. Region ten jelita może ulegać perystaltyce przedniej lub wstecznej, w zależności od potrzeb zwierzęcia.

Alexandrowicz (1909) zidentyfikował dwa sploty nerwowe unerwiające jelito końcowe skorupiaków – splot wewnętrzny oraz splot zewnętrzny, które w późniejszym czasie okazały się cennym źródłem do identyfikacji i charakterystyki neuroprzekaźników. W latach 50. dr Ernst Florey rozpoczął serię badań farmakologicznych nad jelitem końcowym raka, wykazując, że skurcze są modulowane przez acetylocholinę i jej pochodne, a także przez epinefrynę i norepinefrynę (Florey, 1954). Florey, odkrywca substancji hamującej znanej jako „czynnik-I”, badał działanie tej substancji na różnych preparatach, w tym na układzie pokarmowym raka (Florey, 1961). Później wykazano, że czynnikiem-I jest GABA. W ten sposób jelito końcowe raka odegrało istotną rolę w wczesnych badaniach nad inhibicją synaptyczną.

Po odkryciu GABA wykazano, że inne domniemane neuroprzekaźniki są również związane z splotami jelita tylnego i wywołują odpowiedzi fizjologiczne. Do takich przekaźników należą dopamina (Elekes et al. 1988; Elofsson et al. 1968), proktolina (RYLPG-OH; Mercier et al. 1997), dwa peptydy orkokininy (NFDEIDRSGFGFN i AFDEIDRSGFGFN; Bungart et al. 1994; Dircksen et al. 2000), orkomyotropina (FDAFTTGFamide; Dircksen et al. 2000) oraz peptyd myosupresyny (Mercier et al. 1997; najprawdopodobniej pQDLDHVFLRFamide, por. Stemmler et al. 2007). Każda z tych substancji moduluje spontaniczne skurcze jelita tylnego, a wszystkie poza GABA wydają się być pobudzające. Jelito tylne reaguje również na glutaminian i kwiskwalan (Jones, 1962; Wrong et al. 2003), jednak nie zgłoszono jednoznacznych dowodów na istnienie unerwienia glutaminergicznego. Posłańcy wewnątrzkomórkowi pośredniczący w działaniu poszczególnych przekaźników pozostają w dużej mierze niezbadani, ale istnieją dowody na udział cAMP w zdolności dopaminy do nasilania skurczów (Knotz &amp; Mercier, 1995).
Choć jelito końcowe skorupiaków kurczy się spontanicznie po denerwacji, skurcze te są zazwyczaj słabe i nieskoordynowane (Wales, 1982; Winlow &amp; Laverack, 1972a). Ruchy perystaltyczne wymagają skoordynowanego sygnału motorycznego z ośrodkowego układu nerwowego, który najwyraźniej pochodzi z ostatniego zwoju brzusznego (Winlow &amp; Laverack, 1972a, b, c). U raków sygnał motoryczny jest przekazywany do jelita końcowego poprzez 7th korzeń brzuszny, który zawiera 75 aksonów, których ciała komórkowe znajdują się w ostatnim zwoju brzusznym (Kondoh &amp; Hisada, 1986). Przynajmniej niektóre peptydy wydają się być dostarczane do splotu jelita końcowego z neuronów pochodzących z ostatniego zwoju brzusznego (Dircksen et al. 2000; Mercier et al. 1991b; Siwicki &amp; Bishop, 1986), natomiast dopamina jest dostarczana przez neurony w zwojach położonych bardziej przednio (Mercier et al. 1991a). Ponieważ sygnał motoryczny przekazywany przez 7th korzeń brzuszny jest niezbędny do wystąpienia dużych, skoordynowanych skurczów, prawdopodobne jest, że niektóre lub wszystkie wymienione powyżej domniemane przekaźniki w pewien sposób przyczyniają się do perystaltyki. Ich relatywny udział nie jest jednak znany. Niektóre wnioski można wyciągnąć, badając ich wpływ oddzielnie na mięśnie okrężne i podłużne (Mercier &amp; Lee, 2002).

Oprócz kontrolowania przemieszczania się niestrawionych pokarmów, splot nerwowy związany z jelitem tylnym skorupiaków wydaje się pełnić ważną funkcję endokrynną związaną z linieniem. Jelito tylne kraba, Carcinus maenas, zawiera komórki endokrynne, które podczas ekdyzy uwalniają hormon hiperglikemiczny skorupiaków oraz powiązany z nim peptyd prekursorowy (Webster et al. 2000), co sugeruje ich rolę w pobieraniu wody i pęcznieniu związanym z procesem linienia. Zatem jelito tylne skorupiaków uczestniczy w kilku istotnych procesach fizjologicznych.

Niniejszy raport jest przede wszystkim narzędziem dydaktycznym dla uczniów starszych klas szkół średnich oraz studentów studiów licencjackich na kursach fizjologii, które obejmują część eksperymentalną. Studenci mogą przeanalizować znaczenie oraz potencjalny mechanizm skurczu i funkcjonowania jelita tylnego. Wykorzystane zostaną środki farmakologiczne, neuroprzekaźniki oraz neurohormony, a następnie zostaną sporządzone krzywe dawka-odpowiedź, co pozwoli studentom zapoznać się z metodami pozyskiwania i interpretacji danych fizjologicznych i farmakologicznych. Można również uzyskać ogólne zrozumienie funkcji receptorów w odniesieniu do agonistów i antagonistów. Studenci nauczą się także prezentować dane w formie graficznej w celu przeprowadzenia analizy statystycznej.

Wypreparowanie jelita tylnego homara oraz rejestracja jego skurczów są bardzo proste. W preparacie wypreparowanym jelito jest łatwo dostępne dla substancji egzogennych. Zmiany w aktywności perystaltycznej można monitorować wizualnie lub za pomocą przetwornika siły, który pozwala również na pomiar siły skurczów. Ze względu na prostotę i niezawodność jako preparat do bioanaliz, jelito tylne homara jest nadal bardzo użyteczne w badaniu wielu zagadnień dotyczących mechanizmów perystaltyki, modulacji efektów motorycznych i skurczów mięśni oraz funkcji receptorów. Jelito tylne znajduje również zastosowanie w testowaniu insektycydów, krustacycydów oraz zanieczyszczeń pod kątem specyficznych mechanizmów ich działania.


2. Metody
2.1) Materiały
<ul>
<li>rak</li>
<li>sól fizjologiczna dla raków</li>
<li>zestaw narzędzi do sekcji (nożyczki grube i precyzyjne, pęsety grube i precyzyjne)</li>
<li>szalka Petri z dnem z Sylgardu</li>
<li>stalowe szpilki sekcyjne</li>
<li>zlewki (do przechowywania roztworów chemicznych)</li>
<li>parafilm (do przykrywania i mieszania roztworów)</li>
</ul>
2.2) Disekcja
<ol>
<li>Rakowate (Procambarus clarkii) o długości ciała 6-10 cm należy umieścić na lodzie na 5 do 10 minut w celu znieczulenia zwierzęcia przed rozpoczęciem sekcji.</li>
<li>Znieczulonego raka należy trzymać jedną ręką za obszar za szczypcami. Szybkim ruchem należy przeciąć od oczodołu do środka głowy po obu stronach, a następnie odciąć głowę raka (Uwaga: krew z preparatu staje się lepka po wyschnięciu, dlatego należy umyć narzędzia po zakończeniu pracy). 
<img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig1.jpg" alt="Procedura sekcji homara; badanie anatomii; eksperyment laboratoryjny; nożyczki, badanie egzoszkieletu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Dekapitacja raka</li>
<li>Należy odciąć chelipody i odnóża kroczne.</li>
<li>Należy odciąć lewą i prawą płetwę ogonową, pozostawiając jedynie środkową płetwę ogonową (uropod).</li>
<li>Na stronie grzbietowej raka należy wykonać cięcia brzuszne po lewej i prawej stronie kutykuli grzbietowej. 
<img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig2.jpg" alt="Sekcja anatomiczna skorupiaka, z zaznaczeniem segmentacji ogona; użycie narzędzia chirurgicznego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Usunięcie kutykuli grzbietowej</li>
<li>Należy wykonać cięcie poprzeczne na stronie grzbietowej kutykuli, dbając o to, aby cięcie było płytkie, aby uniknąć uszkodzenia przewodu pokarmowego (G.I.). Następnie należy usunąć dolną sekcję grzbietowej kutykuli odwłoka.</li>
<li>Zasekcjonowanego raka należy umieścić w naczyniu wyłożonym Sylgardem.</li>
<li>Raka należy przymocować szpilkami do naczynia w części końcowej płetwy ogonowej. W razie potrzeby można użyć większej liczby szpilek po obu stronach G.I., aby unieruchomić ciało.</li>
<li>Naczynie należy wypełnić solą fizjologiczną dla raków, zakrywając G.I. Należy stale obmywać G.I. solą fizjologiczną za pomocą pipety. Sól fizjologiczna to zmodyfikowany roztwór Van Harrevelda (1936), składający się z 205 mM NaCl; 5.3 mM KCl; 13.5 mM CaCl2 2H2O; 2.45 mM MgCl2 6H2O; 5 mM HEPES, z pH dostosowanym do 7.4. Zasekcjonowany rak powinien wyglądać tak, jak pokazano na Rysunku 3. 
<img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig3.jpg" alt="Zasekcjonowany odwłok owada, obraz mikroskopowy biologiczny, badanie anatomiczne, analiza preparatu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Zasekcjonowany rak z nienaruszonym G.I.</li>
</ol>
2.3) Eksperymenty

2.3.1) Skurcze w organizmie zwierzęcia
<ol>
<li>Należy przygotować roztwory związku poddawanego badaniu, tak aby miały tę samą temperaturę co sól fizjologiczna używana do kąpieli. Jako substancje startowe do testów można wykorzystać poszczególne roztwory serotoniny (100 nM, 1 $\mu$M), glutaminianu (1 $\mu$M) oraz dopaminy (1 $\mu$M) przygotowane w soli fizjologicznej dla raków.</li>
<li>Pozostawcie wypreparowanego raka w roztworze dla raków przez około dziesięć minut, aby organizm mógł dojść do siebie po szoku wywołanym sekcją i ekspozycją na sól fizjologiczną. Powinny zacząć pojawiać się powolne skurcze perystaltyczne jelita końcowego.</li>
<li>Po rozpoczęciu skurczów należy odnotować liczbę skurczów występujących w ciągu trzydziestu sekund (należy zaznaczyć rodzaj występujących skurczów, np. perystaltyczne lub spastyczne, oraz kierunek ewentualnych fal perystaltycznych). 
Tabela 1: Skurcze w soli fizjologicznej dla raków 
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Liczba skurczów</td>
 <td>Rodzaje skurczów</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table></li>
<li>Za pomocą pipety należy usunąć sól fizjologiczną z jam ciała w odsłoniętym odwłoku raka, a następnie nanieść sól fizjologiczną zawierającą badaną substancję bezpośrednio na jelito końcowe.</li>
<li>Bezpośrednio po dodaniu roztworu należy odnotować liczbę skurczów występujących po trzydziestu sekundach oraz określić ich rodzaj (tj. perystaltyczne lub spastyczne). 
Tabela 2: Skurcze w zależności od ekspozycji na związki 
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Badany związek</td>
 <td>Stężenie</td>
 <td>Liczba skurczów</td>
 <td>Rodzaje skurczów</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table></li>
<li>Bezpośrednio po zarejestrowaniu odpowiedzi na substancję testową kilkukrotnie przepłucz przewód pokarmowy standardowym roztworem soli fizjologicznej dla raków. Pozostaw preparat na 5 minut, przepłukując go roztworem soli fizjologicznej dla raków mniej więcej co 30 sekund.</li>
<li>Za pomocą pipety nanieś bezpośrednio na jelito tylne niewielką ilość soli fizjologicznej zawierającej kolejny związek do zbadania lub zmiżone stężenie ostatnio testowanej substancji. Zaleca się rozpocząć od niższego stężenia i stopniowo zwiększać jego wartość.</li>
<li>Bezpośrednio po dodaniu każdej nowej substancji lub każdego nowego stężenia należy odnotować liczbę skurczów występujących po trzydziestu sekundach oraz określić typ skurczów.</li>
</ol>
2.3.2) Rejestracja sił skurczu w preparatach wyizolowanych
<img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig4.jpg" alt="Układ eksperymentalny do badania równowagi statycznej z przetwornikiem siły, PowerLab 26T i analizą w programie LabChart7." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Układ
<ol>
<li>Podłącz przetwornik do modułu mostka (bridge pod).</li>
<li>Podłącz moduł mostka do urządzenia PowerLab 26T.</li>
<li>Podłącz PowerLab 26T do portu USB w komputerze.</li>
<li>Otwórz program LabChart7, klikając ikonę labchart7 na pulpicie.
<ul>
<li>Pojawi się okno LabChart Welcome Center. Zamknij je.</li>
<li>Kliknij Setup.</li>
<li>Kliknij channel settings. Zmień liczbę kanałów na 1 (lewy dolny róg okna) i zatwierdź przyciskiem OK.</li>
<li>W lewym górnym rogu wykresu ustaw liczbę cykli na sekundę na około 2k. Ustaw napięcie (oś y) na około 500 lub 200 mV.</li>
<li>Kliknij Channel 1 po prawej stronie wykresu. Kliknij Input Amplifier. Upewnij się, że zaznaczone są następujące ustawienia: single-ended, ac coupled, invert (odwraca sygnał w razie potrzeby) oraz anti-alias.</li>
<li>Aby rozpocząć rejestrację, naciśnij start.</li>
</ul></li>
<li>Pobierz preparat i przetnij przewód pokarmowy na styku klatki piersiowej i brzucha. Następnie ostrożnie przetnij część telsonową ogona. Wyjmij przewód pokarmowy z rozsektowanego rak i umieść go w szalce z Sylgardem. Wzdłuż grzbietowej strony przewodu pokarmowego biegnie naczynie krwionośne; ostrożnie oddziel je od przewodu pokarmowego. Zalej preparat świeżym roztworem soli fizjologicznej dla raków.</li>
<li>Umieść przetwornik siły w uchwycie w pobliżu rozsektowanego raka.</li>
<li>Zahacz przetwornik siły o przewód pokarmowy raka, jak pokazano na rysunku 5. 
<img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig5.jpg" alt="Optyczna metoda strefy topnienia dla wzrostu kryształów, ilustrująca technikę kontroli napięcia powierzchniowego stopu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Izolowany końcowy odcinek jelita raka w roztworze soli fizjologicznej przymocowany do haka przetwornika siły</li>
<li>Odczekaj, aż przewód pokarmowy zacznie się kurczyć, a następnie naciśnij start w programie LabChart7.</li>
<li>Pozostaw program włączony przez około 20 sekund. Naciśnij "stop" i dodaj komentarz o treści "Saline only" (tylko sól fizjologiczna). Wypełnij tabelę 4. 
Tabela 4: Skurcze z zastosowaniem badanego związku 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Liczba skurczów</td>
 <td>Amplituda skurczów (mV)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table></li>
<li>Dodaj badane związki i niezwłocznie naciśnij "start" w programie LabChart7.</li>
<li>Pozostaw program włączony przez około 20 sekund. Naciśnij "stop" i dodaj bezpośrednio w pliku z wykresem komentarz określający, jaka substancja została dodana oraz w jakim stężeniu. Wypełnij poniższą tabelę. 
Tabela 5: Skurcze z zastosowaniem związku _________ 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Liczba skurczów</td>
 <td>Amplituda skurczów (mV)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table></li>
<li>Opłucz preparat roztworem soli fizjologicznej dla raków za pomocą pipety.</li>
<li>W podobny sposób dodaj inne substancje lub różne stężenia. Niezwłocznie naciśnij "start" w programie LabChart7.</li>
<li>Pozostaw program włączony przez około 20 sekund. Naciśnij "stop" i dodaj komentarz oraz etykietę bezpośrednio w pliku z wykresem, wskazując użyty związek i jego stężenie.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
<li>Na podstawie etapu 2.3.1 eksperymentu przedstaw na wykresie liczbę skurczów dla każdego z roztworów (soli fizjologicznej, serotoniny, glutaminianu) w funkcji czasu. Wyjaśnij zaobserwowane trendy.</li>
<li>Na podstawie etapu 2.3.2 eksperymentu przedstaw na wykresie liczbę skurczów dla każdego z roztworów (soli fizjologicznej, serotoniny, glutaminianu) w funkcji amplitudy skurczów wyrażonej w mV. Wyjaśnij zaobserwowane trendy.</li>
</ol>
3.1 ) Pomiar częstotliwości i siły skurczów
Aby wyznaczyć częstość skurczów, można zmierzyć czas od początku jednego odchylenia do początku kolejnego lub zliczyć całkowitą liczbę odchyleń w ciągu jednej lub dwóch minut. Wartości te można następnie wyrazić w liczbie skurczów na minutę lub na sekundę, w zależności od częstotliwości ich występowania.
Aby indeksować siłę skurczów, w celu porównania różnych warunków można zastosować miarę względną. W zapisanym pliku należy użyć znacznika „M” i przesunąć go do linii bazowej. Następnie za pomocą kursora należy przejść do szczytu wychylenia i odnotować wartość wyświetlaną w prawym górnym rogu ekranu jako wartość delta (różnica między punktem M a szczytem). Należy pamiętać, że aby zmierzyć zmianę, kursor musi pozostać w bezruchu. Następnie należy przenieść znacznik M do kolejnej interesującej formy fali i powtórzyć pomiar.

<ol><li>Alexandrowicz, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zur+Kenntnis+des+sympathischen+Nervensystems+der+Crustaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Jena+Z.+Naturw%22%5BJournal%5D)">Zur Kenntnis des sympathischen Nervensystems der Crustaceae.</a> Jena Z. Naturw. 45, 395-444 (1909).</li>
<li>Bungart, D., Dircksen, H., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+and+distribution+of+the+myotropic+neuropeptide+orcokinin+in+the+nervous+system+of+astacidean+crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination and distribution of the myotropic neuropeptide orcokinin in the nervous system of astacidean crustaceans.</a> Peptides. 15, 393-400 (1994).</li>
<li>Dircksen, H., Burdzik, S., Sauter, A., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+orcokinins+and+the+novel+octapeptide+orcomyotropin+in+the+hindgut+of+the+crayfish+Orconectes+limosus%3A+identified+myostimulatory+neuropeptides+originating+totether+in+neurons+of+the+terminal+abdominal+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Two orcokinins and the novel octapeptide orcomyotropin in the hindgut of the crayfish Orconectes limosus: identified myostimulatory neuropeptides originating totether in neurons of the terminal abdominal ganglion.</a> J. Exp. Biol. 203, 2807-2818 (2000).</li>
<li>Elekes, K., Florey, E., Cahil, M. A., Hoeger, U., Geffard, M. Morphology, synaptic connections and neurotransmitters of the efferent neurons of the crayfish hindgut. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElekes%2C+K+%22Neurobiology+of+Invertebrates%22">Neurobiology of Invertebrates</a>. Salanki, J., Rosza, K. 36, Akademiai Kiado. Budapest. 129-146 (1988).</li>
<li>Elofsson, R., Kauri, T., Nielsen, S. O., Stroemberg, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catecholamine-containing+nerve+fibres+in+the+hindgut+of+the+crayfish+Astacus+astacus+L%5BTitle%5D)+AND+%22Experentia%22%5BJournal%5D)">Catecholamine-containing nerve fibres in the hindgut of the crayfish Astacus astacus L.</a> Experentia. 24, 1159-1160 (1968).</li>
<li>Florey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uber+die+wirkung+von+acetylcholin%2C+adrenalin%2C+nor-adrenalin%2C+faktor+I+und+anderen+substanzen+auf+den+isolierten+enddarm+des+flusskrebses+Cambarus+clarkii+Girard%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Vergl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Uber die wirkung von acetylcholin, adrenalin, nor-adrenalin, faktor I und anderen substanzen auf den isolierten enddarm des flusskrebses Cambarus clarkii Girard.</a> Z. Vergl. Physiol. 36, 1-8 (1954).</li>
<li>Florey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+test+preparation+for+bio-assay+of+Factor+I+and+gamma-aminobutyric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A new test preparation for bio-assay of Factor I and gamma-aminobutyric acid.</a> J. Physiol. 156, 1-7 (1961).</li>
<li>Jones, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+action+of+L-glutamic+acid+and+of+structurally+related+compounds+on+the+hind+gut+of+the+crayfish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+%28London%29%22%5BJournal%5D)">The action of L-glutamic acid and of structurally related compounds on the hind gut of the crayfish.</a> J. Physiol. (London). 164, 295-300 (1962).</li>
<li>Knotz, S., Mercier, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+mediates+dopamine-evoked+hindgut+contractions+in+the+crayfish%2C+Procambarus+clarkii%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">cAMP mediates dopamine-evoked hindgut contractions in the crayfish, Procambarus clarkii.</a> Comp. Biochem. Physiol. 111A, 59-64 (1995).</li>
<li>Kondoh, Y., Hisada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroanatomy+of+the+terminal+%28sixth+abdominal%29+ganglion+of+the+crayfish%2C+Procambarus+clarkii%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Tiss.+Res%22%5BJournal%5D)">Neuroanatomy of the terminal (sixth abdominal) ganglion of the crayfish, Procambarus clarkii.</a> Cell. Tiss. Res. 243, 273-288 (1986).</li>
<li>Mercier, A. J., Lange, A. B., TeBrugge, V., Orchard, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+proctolin-like+and+FMRFamide-like+neuropeptides+associated+with+the+hindgut+of+the+crayfish%2C+Procambarus+clarkii%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">Evidence for proctolin-like and FMRFamide-like neuropeptides associated with the hindgut of the crayfish, Procambarus clarkii.</a> Can. J. Zool. 75, 1208-1225 (1997).</li>
<li>Mercier, A. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+neuropeptides+on+circular+and+longitudinal+muscles+of+the+crayfish+hindgut%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Differential effects of neuropeptides on circular and longitudinal muscles of the crayfish hindgut.</a> Peptides. 23, 1751-1757 (2002).</li>
<li>Mercier, A. J., Orchard, I., Schmoeckel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catecholaminergic+neurons+supplying+the+hindgut+of+the+crayfish%2C+Procambarus+clarkii%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">Catecholaminergic neurons supplying the hindgut of the crayfish, Procambarus clarkii.</a> Can. J. Zool. 69, 2778-2785 (1991).</li>
<li>Mercier, A. J., Orchard, I., TeBrugge, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRFamide-like+immunoreactivity+in+the+crayfish+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">FMRFamide-like immunoreactivity in the crayfish nervous system.</a> J. exp. Biol. 156, 519-538 (1991).</li>
<li>Mercier, A. J., Orchard, I., TeBrugge, V., Skerrett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+two+FMRFamide-related+peptides+from+crayfish+pericardial+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Isolation of two FMRFamide-related peptides from crayfish pericardial organs.</a> Peptides. 14, 137-143 (1993).</li>
<li>Musolf, B. E. Serotonergic modulation of the crayfish hindgut: Effects on hindgut contractility and regulation of serotonin on hindgut. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biol+Bull%22">Biol Bull</a>. , Georgia State University. (2007).</li>
<li>Musolf, B. E., Spitzer, N., Antonsen, B. L., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonergic+modulation+of+crayfish+hindgut.+Biol+Bull.+217%281%29%2C+50-64+%282009%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Bull%22%5BJournal%5D)">Serotonergic modulation of crayfish hindgut. Biol Bull. 217(1), 50-64 (2009).</a> Biol Bull. 217, 50-64 (2009).</li>
<li>Shuranova, Z. P., Burmistrov, Y. M., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hundred+years+ago+and+now%3A+A+short+essay+on+the+study+of+the+crustacean+hindgut.+%28Vor+hundert+Jahren+und+nun%3A+Eine+kurze+Geschichte+von+die+Forschung+des+Hinterdarmes+der+Crustaceen%5BTitle%5D)+AND+%22Crustaceana%22%5BJournal%5D)">A hundred years ago and now: A short essay on the study of the crustacean hindgut. (Vor hundert Jahren und nun: Eine kurze Geschichte von die Forschung des Hinterdarmes der Crustaceen.</a> Crustaceana. 76, 755-670 (2003).</li>
<li>Shuranova, Z. P., Burmistrov, Y. M., Strawn, J. R., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+an+Autonomic+Nervous+System+in+Decapod+Crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Zoological+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence for an Autonomic Nervous System in Decapod Crustaceans.</a> International Journal of Zoological Research. 2 (3), 242-283 (2006).</li>
<li>Siwicki, K. K., Bishop, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+proctolinlike+immunoreactivity+in+the+nervsou+systems+of+lobster+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Mapping of proctolinlike immunoreactivity in the nervsou systems of lobster and.</a> 243, 435-435 (1986).</li>
<li>Stemmler, E. A., Cashman, C. R., Messinger, D. I., Gardner, N. P., Dickinson, P. S., Christie, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-mass-resolution+direct-tissue+MALDI-FTMS+reveals+broad+conservation+of+three+neuropeptides+%28APSGFLGMRamide%2C+GYRKPPFNGSIFamide+and+pQDLDHVFLRFamide%29+across+members+of+seven+decapod+crustaean+infraorders%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders.</a> Peptides. 28, 2104-2115 (2007).</li>
<li>Sandeman, D. C., Atwood, H. L. Control of mouthparts and gut. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWales%2C+W+%22The+Biology+of+Crustacea%22">The Biology of Crustacea</a>. 4, Academic Press Inc. London. 165-191 (1982).</li>
<li>Webster, S. G., Dircksen, H., Chung, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+cells+in+the+gut+of+the+shore+crab+Carcinus+maenas+immunoreactive+to+crustacean+hyperglycaemic+hormone+and+its+precursor-related+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocrine cells in the gut of the shore crab Carcinus maenas immunoreactive to crustacean hyperglycaemic hormone and its precursor-related peptide.</a> J. Exp. Biol. 300, 193-205 (2000).</li>
<li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+%28L.%29.+1.+Analysis+of+hindgut+movements+and+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 1. Analysis of hindgut movements and receptor activity.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 1-28 (1972).</li>
<li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+%28L.%29.+2.+Motor+output%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 2. Motor output.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 29-47 (1972).</li>
<li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+%28L.%29.+3.+Structure+of+the+sixth+abdominal+ganglion+%286+A.G.%29+and+associated+ablation+and+microelectrode+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 3. Structure of the sixth abdominal ganglion (6 A.G.) and associated ablation and microelectrode studies.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 93-121 (1972).</li>
<li>Wrong, A. D., Sammahin, M., Richardson, R., Mercier, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+properties+of+glutamate+receptors+associated+with+the+crayfish+hindgut%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological properties of glutamate receptors associated with the crayfish hindgut.</a> J. Comp. Physiol. 189, 371-378 (2003).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Szczegóły przedstawione w powiązanym filmie i tekście opisują kluczowe kroki niezbędne do rejestracji aktywności jelita tylnego rakówa in situ oraz in vitro. Jednym z celów naszego raportu jest zwiększenie świadomości na temat potencjału tego preparatu w studenckich laboratoriach badawczych, w których nauczane są podstawowe koncepcje z zakresu fizjologii i farmakologii.

Przygotowania te mogą być wykorzystane do zbadania szeregu pytań eksperymentalnych, które pozwolą na lepsze zrozumienie funkcji fizjologicznych jelita tylnego. Mechanizmy leżące u podstaw regulacji fal perystaltycznych oraz ich odwrócenia nie są jeszcze znane. Mechanizmy wyższej kontroli całego przewodu pokarmowego również nie są w pełni zrozumiane. Kwestia tego, w jaki sposób ośrodki wyższe integrują swoją aktywność z sygnałami autonomicznymi, które bezpośrednio sterują układem pokarmowym, pozostaje otwartym obszarem badań (Shuranova et al., 2006). Ponadto nie zostały w pełni wyjaśnione możliwości osmoregulacyjne jelita tylnego skorupiaków oraz funkcje osmoregulacji podczas linienia i stresu środowiskowego. W przypadku tej preparatyki wciąż wiele pytań oczekuje na odpowiedzi.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;Rak (&lt;em&gt;Procambarus clarkii&lt;/em&gt;). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA.&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Standardowy roztwór soli dla raków: zmodyfikowany roztwór Van Harrevelda (1936). (w mM) 205 NaCl; 5,3 KCl; 13,5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; 2,45 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; 5 HEPES i dostosowane do pH 7,4. Serotoninę, glutaminian i dopaminę przygotowuje się w roztworze soli dla raków. Wszystkie odczynniki chemiczne pochodzą z firmy Sigma chemical company (St. Louis, MO).&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Narzędzia do sekcji: precyzyjne pęsety nr 5, precyzyjne nożyczki, uchwyt do ostrza noża, szpilki entomologiczne nr 26002-20 (wszystkie zakupione w Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139)&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Szalka Petriego z dnem z Sylgardu&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Zlewki (do roztworów chemicznych)&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Sygnały elektryczne są rejestrowane w czasie rzeczywistym za pomocą interfejsu &lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML856/&quot; target=&quot;_blank">PowerLab 26T&lt;/a&gt; podłączonego do komputera (&lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com&quot; target=&quot;_blank">ADInstruments&lt;/a&gt;, Colorado Springs, CO, USA). Używamy standardowego oprogramowania firmy ADInstruments o nazwie Chart lub Scope.&lt;/li&gt; &lt;li&gt; &lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/Signal_Conditioners/Blood_Pressure,_Force,_Displacement/&quot; target=&quot;_blank">Bridge pod&lt;/a&gt; dla przetwornika siły (różne modele Bridge pod są wymagane dla różnych typów przetworników siły).&lt;/li&gt; &lt;li&gt; &lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0402/&quot; target=&quot;_blank">Przetwornik siły MLT0402 (2 g)&lt;/a&gt; jest urządzeniem klasy badawczej, pokazanym w filmie. &lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/mlt0210d#overview&quot; target=&quot;_blank">MLT 0210/D (10 mg–25 g)&lt;/a&gt; oraz &lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/MLTF500ST#overview&quot; target=&quot;_blank">MLT 500/A (0–500 g)&lt;/a&gt; to przetworniki klasy edukacyjnej (&lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/&quot; target=&quot;_blank">ADInstruments&lt;/a&gt;).&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

eksperymenty fizjologiczne z jelitem tylnym raków: ćwiczenie laboratoryjne dla studentów

Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

Celem niniejszego raportu jest opis technik sekcji służących do przygotowania jelita tylnego raków oraz zademonstrowanie sposobu wykonywania pomiarów fizjologicznych za pomocą przetwornika siły w celu monitorowania siły skurczu. Ponadto pokazujemy, jak wizualnie monitorować aktywność perystaltyczną, która może służyć jako bioassay dla różnych peptydów, amin biogennych i neurotransmiterów. Przygotowanie to nadaje się do laboratoriów studenckich z fizjologii oraz do prezentowania studentom koncepcji farmakologicznych. Preparat ten jest stosowany od ponad 100 lat i nadal stanowi cenny model do badania generowania i regulacji rytmów perystaltycznych oraz opisywania mechanizmów leżących u podstaw ich modulacji. Badania farmakologiczne i typowanie podtypów receptorów, rozpoczęte ponad 50 lat temu na jelicie tylnym, wciąż wnoszą wkład w dzisiejsze badania. Ten wytrzymały preparat jest odpowiedni do szkolenia studentów w zakresie fizjologii i farmakologii.

W niniejszym raporcie prezentujemy techniki, które mogą być wykorzystane do badania biologii jelita tylnego raków. Pokazujemy, jak przeprowadzić sekcję odwłoka raka oraz jak badać powiązaną z nim anatomię, fizjologię i modulację aktywności. Aktywność perystaltyczną oraz siłę skurczów mierzy się przy użyciu przetwornika siły.

Eksperymenty fizjologiczne z jelitem tylnym raków: ćwiczenie laboratoryjne dla studentów

Celem niniejszego opracowania jest opis technik sekcji służących do przygotowania jelita tylnego rakowiego oraz zaprezentowanie sposobu wykonywania pomiarów fizjologicznych ...

Ogólnym celem niniejszego opracowania jest posłużenie jako narzędzie dydaktyczne dla uczniów szkół średnich na poziomie zaawansowanym oraz studentów studiów licencjackich na kursach fizjologii uczestniczących w eksperymentach fizjologicznych. Studenci uczą się odsłaniać i rejestrować skurcze jelita tylnego raka rzecznego. Kolejnym krokiem jest wycięcie jelita tylnego z organizmu zwierzęcia, co umożliwia bezpośrednią aplikację związków.Następnie monitoruje się siłę i rytm skurczów mięśni gładkich jelita tylnego podczas stosowania różnych czynników farmakologicznych, aby zbadać mechanizmy zmieniające siłę skurczu. Na podstawie testów farmakologicznych i subtypów receptorów uzyskuje się wyniki wykazujące działanie modulatorów na unerwienie lub bezpośrednio na mięśnie. Witam, jestem dr J. Mercier z Katedry Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Brocka.Wykorzystuję jelito tylne raka jako preparat do prowadzenia badań nad neurotransmiterami sterującymi mięśniami trzewnymi. Używam go również jako narzędzia dydaktycznego i w ramach współpracy z laboratorium dr. Robina Coopera z University of Kentucky dopracowujemy szereg eksperymentów prowadzonych przez studentów w celach nauczania. Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat funkcji jelita tylnego raka.Metoda ta może być również stosowana w badaniach nad schorzeniami, takimi jak choroby obejmujące rytmy perystaltyczne. Może być także wykorzystywana do opisu mechanizmów leżących u podstaw modulacji unerwienia mięśniowego i neuronalnego. Studenci nauczą się interpretować dane fizjologiczne i farmakologiczne przy użyciu środków farmakologicznych, neuroprzekaźników oraz neurohormonów, a także zdobędą ogólną wiedzę na temat funkcji receptorów.W odniesieniu do agonistów i antagonistów studenci sporządzą krzywe dawka-odpowiedź oraz przedstawią dane w formie graficznej do analizy statystycznej. Aby znieczulić zwierzę, należy umieścić rak o długości ciała od 6 do 10 cm na lodzie na 5 do 10 minut. Znieczulonego raka należy utrzymać jedną ręką za szczypcami. Szybko naciąć od oczodołu do środka głowy po obu stronach, a następnie odciąć głowę raka.Krew z preparatu po wyschnięciu stanie się lepka, dlatego należy umyć narzędzia po zakończeniu pracy. Następnie odetnij płetwy brzuszne i promienie płetwowe. Potem odetnij lewą i prawą płetwę ogonową, pozostawiając środkową płetwę ogonową, przecinając wzdłuż strony grzbietowej brzucha aż do ostatniego segmentu.Następnie przetnij wzdłuż ostatniego segmentu i w dół po drugiej stronie. Usuń pancerz grzbietowy. Umieść rozsektowanego raka w wyłożonej watą płytce Petriego.Uboga solanka dla raka. Aby zabezpieczyć preparat, należy użyć pinezek sekcyjnych, aby przymocować go do szalki Petriego. Jelito końcowe jest zazwyczaj otoczone masą naczyń krwionośnych i tkanki łącznej.Usuń je pęsetą, uważając, aby nie uszkodzić jelita. Odcinek tylny jelita jest teraz widoczny wzdłuż odwłoka.Pozostaw preparat z przekrojonego raka w roztworze soli fizjologicznej przez około 10 minut, aby mógł on dojść do siebie po szoku wywołanym sekcją i ekspozycją na sól fizjologiczną. Obserwuj powolne skurcze perystaltyczne jelita tylnego. W tym momencie można obliczyć częstotliwość skurczów.Policz liczbę skurczów występujących w ciągu 30 sekund i zapisz wynik w dzienniku. Odnotuj również rodzaj występujących skurczów oraz to, czy mają one charakter perystaltyczny, czy spastyczny. Zapisz kierunek wszelkich fal perystaltycznych.Policz częstotliwość skurczów w pobliżu odbytu oraz w połowie długości brzucha i sprawdź, czy istnieją różnice w częstotliwości między tymi dwoma obszarami. Przygotuj zestaw roztworów testowych o temperaturze takiej samej jak temperatura soli fizjologicznej do kąpieli. Pierwszym testowanym tutaj roztworem będzie 1 µM serotoniny przygotowany w soli fizjologicznej dla raków.Za pomocą pipety usuń sól fizjologiczną z jam ciała odsłoniętego odwłoka rakowa i nanieś roztwór serotoniny o stężeniu 1 µM bezpośrednio na jelito tylne. Bezpośrednio po dodaniu nowego roztworu odczekaj 30 s, a następnie policz skurcze w okolicy odbytu przez kolejne 30 s, a potem policz skurcze w połowie długości odwłoka przez następne 30 s. Zapisz te wartości w tabeli oraz odnotuj rodzaj występujących skurczów.Dalej.Wylać roztwór testowy z naczynia pomiarowego i kilkakrotnie wypłukać jelito tylne standardową solą fizjologiczną dla raków. Następnie płukać preparat co 30 sekund przez pięć minut. W tym momencie można dodać kolejny roztwór testowy, którym w tej demonstracji jest 1 µM dopaminy.Zapisz obserwacje w taki sam sposób jak wcześniej i powtórz ten proces dla pozostałych badanych związków. W przypadku stosowania wielu stężeń tej samej substancji należy pamiętać, aby zacząć od najniższego stężenia i przechodzić do stężeń wyższych. Układ do pomiaru siły skurczów przewodu pokarmowego obejmuje laptop z oprogramowaniem LabChart 7, Bridge Pod, PowerLab 26T oraz przetwornik siły.Przed pomiarem siły skurczów mięśni przewodu pokarmowego należy wyizolować układ pokarmowy. Aby to osiągnąć, odetnij mięśnie w ostatnim segmencie odwłoka, umieść dwa lub więcej szpilek przez miękką kutykulę brzuszną po obu stronach odbytu, a następnie odetnij resztę odwłoka, pozostawiając jelito tylne i odbyt przymocowane do niewielkiego fragmentu kutykuli. Jelito należy odciąć blisko miejsca połączenia klatki piersiowej z odwłokiem.Teraz przenieś przewód pokarmowy do płytkiej szalki z dnem pokrytym agarozą. Wzdłuż grzbietowej części przewodu pokarmowego biegnie naczynie krwionośne. Ostrożnie oddziel je od przewodu pokarmowego.Wlej świeżą solankę dla raka na preparat. Przesuń przetwornik siły nad preparat. Przyjrzyj się uważnie bolcowi przyklejonemu do spodu przetwornika siły.Koniec, który mocuje się do jelita, posiada niewielkie zagięcie. Przymocuj zagięty koniec szpilki do przeciętego końca jelita tylnego. Po przymocowaniu jelita tylnego delikatnie przesuń naczynie, aż jelito tylne zostanie napięte.Należy zachować ostrożność podczas tego etapu, ponieważ jelito powinno być napięte, ale nie zbyt mocno. Zbyt silne napięcie może uszkodzić mięsień. Gdy naczynie znajduje się w optymalnej pozycji, należy użyć wosku lub gliny, aby je ustabilizować.Następnie uruchom oprogramowanie. Aby rozpocząć rejestrację, otwórz oprogramowanie LabChart. Zamknij okno powitalne (Welcome Center) programu LabChart.Przejdź do ustawień (setup) w lewym górnym rogu. Kliknij ustawienia kanałów (channel settings) w lewym dolnym rogu. Zmień ustawienia kanałów tak, aby pozostał tylko jeden kanał.Kliknij OK po prawej stronie ekranu. Przejdź do kanału jeden (channel one) i otwórz panel bridge pod. Ustaw zakres na najwyższą czułość, w tym przypadku 200 µV, znajdującą się w górnym prawym rogu wykresu.Ustaw liczbę cykli na sekundę na 2K. Można teraz rozpocząć rejestrację. Kliknij start, aby upewnić się, że układ działa prawidłowo.Lekko dotknij końcówki przetwornika pipetą. Powinnaś zaobserwować zmianę siły rejestrowanej przez oprogramowanie. Kliknij stop w oprogramowaniu, następnie kliknij start i pozwól programowi działać.Po około 20 sekundach kliknij stop i dodaj komentarz z etykietą saline. Oblicz częstość skurczów, mierząc czas od początku jednego wychylenia do początku następnego lub licząc całkowitą liczbę wychyleń w ciągu jednej lub dwóch minut. Oblicz częstość jako liczbę skurczów na minutę lub skurczów na sekundę, w zależności od tego, jak szybko występują.Aby zmierzyć siłę skurczów, należy zastosować pomiar względny w celu porównania skurczów w różnych warunkach na zapisanym pliku. Przesuń znacznik M do linii bazowej, a następnie przesuń kursor do szczytu wychylenia i zanotuj wartość wyświetlaną w prawym górnym rogu ekranu. Jest to wartość delta, stanowiąca różnicę między punktem M a szczytem.Należy pamiętać, że kursor musi pozostać w bezruchu na szczycie, aby zmierzyć zmianę. Następnie należy przenieść marker M oraz kursor do kolejnej interesującej formy fali i powtórzyć pomiar, aby zbadać wpływ modulatorów. W tym preparacie należy powoli zamienić sól fizjologiczną na roztwór testowy.W tym przypadku należy zastosować jedną mikromolarną dawkę serotoniny i kontynuować pomiar częstotliwości oraz siły skurczów jako ostatni test. W tej preparacji należy sprawdzić, czy inhibitory złączy szczelinowych zmieniają częstotliwość lub siłę skurczów; inhibitory złączy szczelinowych obejmują m.in. heptanol lub sól fizjologiczną nasyconą dwutlenkiem węgla. Związki te stosuje się na końcu, ponieważ mogą one uszkodzić włókna mięśniowe po przedłużonej ekspozycji. Aby porównać działanie poszczególnych związków, należy przedstawić dane na wykresie.Kolejnym interesującym zastosowaniem tego preparatu jest pomiar siły generowanej przez mięśnie okrężne. Jeśli jednak w preparacie zastosowano inhibitory połączeń szczelinowych, mogły one uszkodzić mięśnie okrężne, w związku z czym do ich badania należy użyć świeżego preparatu jelita tylnego. Aby odsłonić mięśnie okrężne, należy naciąć rurkę jelita wzdłużnie za pomocą precyzyjnych nożyczek.Użyj cienkich szpilek, aby bezpiecznie przymocować jeden koniec paska do naczynia. Przymocuj haczyk przetwornika do przeciwległego końca paska. Poddaj preparat działaniu tych samych związków, które były testowane na mięśniach podłużnych; zależność między testowanymi związkami a liczbą i rodzajem skurczów przedstawiono tutaj.Można sporządzić wykres liczby skurczów w funkcji czasu dla roztworów soli fizjologicznej, serotoniny i glutaminianu. Można również sporządzić wykres liczby skurczów w funkcji siły skurczów wyrażonej w miliwoltach dla roztworów soli fizjologicznej, serotoniny i glutaminianu. Wykresy te można wykonać zarówno dla mięśni podłużnych, jak i okrężnych, aby sprawdzić, czy mięśnie podłużne i okrężne w różnych regionach jelita wykazują odmienne reakcje na poszczególne modulatory.Powyższe eksperymenty można powtórzyć w różnych obszarach, począwszy od odbytu i kierując się w górę wzdłuż brzucha. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu ostrożności, aby nie uszkodzić pęcherzyka pokarmowego pęsetą oraz nie ciągnąć zbyt mocno za przetwornikiem siły. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak rejestracja elektrofizjologiczna mięśni, w celu zbadania innych kwestii, na przykład funkcji i modulacji kanałów jonowych, co może służyć jako model dla innych tkanek w innych modelach zwierzęcych.

physiological-experimentation-with-crayfish-hindgut-student

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Eksperyment fizjologiczny z tylnym jelitom rakowa: Ćwiczenie laboratoryjne dla studentów

Mięsień otwierający odnóża raków został zaprezentowany ze względu na jego historyczne znaczenie oraz wszechstronność eksperymentalną w badaniach nad fenotypem mięśni, fizjologią synaptyczną i plastycznością.

Historyczne ujęcie i demonstracja fizjologii złącza neuromięśniowego mięśnia otwieracza raków

Opracowaliśmy dwie metody badania wpływu bodźców wzrokowych na zachowanie w warunkach braku bodźców dotykowych i chemicznych. Pierwsza metoda polega na filmowaniu reakcji raków na odbijające światło ścianki akwarium; druga bada wpływ bodźców wzrokowych dostarczanych przez żywego raka znajdującego się za przezroczystą przegrodą.

Rejestracja reakcji behawioralnych na odbicie u raków

Niniejszy artykuł demonstruje, jak przeprowadzać rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi synaptycznych w mięśniu prostowniku nogi chodu raka oraz w jaki sposób wizualizować zakończenia nerwowe, aby wykazać ogólne różnice morfologiczne między zakończeniami nerwowymi o wysokiej i niskiej wydajności.

Rejestracje fizjologiczne złącza nerwowo-mięśniowego o wysokiej i niskiej wydajności w mięśniu prostowniku nogi raka

Doświadczenia te prezentują prosty sposób, dzięki któremu studenci mogą zdobyć doświadczenie w badaniu struktury mięśni, odpowiedzi synaptycznych oraz wpływu gradientów jonowych i przepuszczalności na potencjały błonowe. Przedstawiono również obwód sensoryczny-OUN-motoryczny-mięśniowy, aby pokazać metodę testowania wpływu związków chemicznych na obwód neuronalny.

Potencjały błonowe, odpowiedzi synaptyczne, obwody neuronalne, neuromodulacja i histologia mięśni z wykorzystaniem raka rzecznego: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Głównym celem niniejszego eksperymentu jest zrozumienie, w jaki sposób pierwotne neurony sensoryczne przekazują informacje o ruchach i pozycjach stawów jako informacje proprioceptywne u zwierzęcia. Dodatkowym celem niniejszego raportu jest przedstawienie anatomii preparatu poprzez sekcję i obserwację neuronów pod mikroskopem stereoskopowym.

Organy receptorowe mięśni w odwłoku raków: ćwiczenie laboratoryjne dla studentów z zakresu propriocepcji

Niniejszy materiał stanowi demonstrację sposobu rozumienia błon biologicznych przy użyciu modeli elektrycznych. Przedstawiamy również procedury rejestracji potencjałów czynnościowych z brzusznego sznura nerwowego raka, przeznaczone do wykorzystania w laboratoriach dydaktycznych.

Modelowanie błon biologicznych za pomocą płytek drukowanych i pomiar sygnałów elektrycznych w aksonach: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Tutaj opisujemy sekcję rdzenia nerwowego brzucha raka. Demonstrujemy również technikę elektrofizjologiczną rejestrowania fikcyjnej lokomocji z neuronów ruchowych pływaka.

System pływacki raków: praktyczny przewodnik po rozwarstwieniu rdzenia nerwowego i zewnątrzkomórkowych zapisach wzorca motorycznego

Przedstawiono protokół badania desensytyzacji i odzyskiwania wrażliwości fotoreceptorów raków w funkcji czasu okołodobowego.

Odczulanie i odzyskiwanie fotoreceptorów raków po dostarczeniu bodźca świetlnego

Ten artykuł przedstawia nieinwazyjny system biomonitoringu do ciągłego rejestrowania i analizowania aktywności serca i lokomotoryki raków. System ten składa się z czujnika optycznego bliskiej podczerwieni, modułu śledzenia wideo oraz oprogramowania do oceny bicia serca raków, które odzwierciedla ich stan fizjologiczny i charakteryzuje zachowanie raków podczas wahań bicia serca.

Ciągły nieinwazyjny pomiar czynności serca i zachowania raków

Modele zwierzęce nawrotów, znane jako procedury reinstalacji, są szeroko wykorzystywane do badania roli stresu w nawrotach poszukiwania narkotyków. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę indukowania reinstalacji poszukiwania kokainy u szczurów laboratoryjnych poprzez krótkotrwałą ekspozycję na łagodne, przerywane wstrząsy elektryczne stóp.

Procedura badania reinstatmentu poszukiwania kokainy indukowanego wstrząsem stopy u szczurów laboratoryjnych

Poznaj techniki badania fizjologii jelita grubego u raków, w tym pomiar skurczów perystaltycznych i testy farmakologiczne. Metoda ta pozwala studentom zrozumieć mechanizmy kontroli mięśni gładkich.

Eksperymenty fizjologiczne z jelitem tylnym raków: ćwiczenie laboratoryjne dla studentów

Przeglądaj więcej filmów