Modelowanie błon biologicznych za pomocą płytek drukowanych i pomiar sygnałów elektrycznych w aksonach: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie sposobu rozumienia błon biologicznych za pomocą modeli elektrycznych oraz przedstawienie procedur rejestracji potencjałów czynnościowych z brzusznego sznura nerwowego raka. W pierwszej części demonstracji wykorzystywane są komponenty obwodu na płytce stykowej do reprezentacji właściwości elektrycznych błon. Drugim krokiem procedury jest zmiana rezystancji i pojemności w obwodzie modelowym, aby zaobserwować wpływ tych zmian na przebiegi napięcia.

Trzecim krokiem procedury jest zastosowanie pojęć poznanych na przykładzie obwodu modelowego w preparacie żywego nerwu. Ostatnim krokiem procedury jest rejestracja złożonych potencjałów czynnościowych oraz zrozumienie właściwości okresów refrakcji progu pobudliwości oraz przewodnictwa synaptycznego. W końcowym rozrachunku wyniki pokazują, w jaki sposób analiza modeli obwodów elektrycznych błon biologicznych i właściwości żywych nerwów może służyć jako przydatne narzędzia dydaktyczne, co wykazano poprzez zmianę komponentów obwodu modelowego oraz różnicowanie stymulacji żywego nerwu.

Metoda ta pozwala zrozumieć, w jaki sposób błony biologiczne można opisać za pomocą modeli elektrycznych. Można ją również zastosować do innych tkanek, takich jak tkanka mięśniowa. Demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ sekcja brzusznego sznura nerwowego i konfiguracja układu rejestracyjnego mogą być na początku trudne, a zachowanie ostrożności jest niezbędne, aby uniknąć uszkodzenia nerwów i uzyskać właściwe warunki do stymulacji oraz rejestracji sygnałów ze sznura nerwowego.

W pierwszej części eksperymentu rezystory i kondensatory są wykorzystywane do symulacji aktywności elektrycznej błony komórkowej neuronu. Początkowy obwód składa się wyłącznie z rezystorów. Kondensatory zostaną dodane na późniejszym etapie.

Pasywne właściwości rezystywne błony nerwowej są reprezentowane przez przedstawiony tutaj obwód. Płytka stykowa została skonfigurowana z rezystorami 33 kilo omów połączonymi równolegle, reprezentującymi poprzeczną rezystancję błony, oraz rezystorami 10 kilo omów połączonymi szeregowo, reprezentującymi rezystancję wewnątrzkomórkową. Obwód ten zakłada, że rezystancja płynu zewnętrznego jest pomijalna w porównaniu z rezystancjami wewnątrzkomórkową i poprzeczną błony.

Po ukończeniu budowy modelu komórki podłącz przewody wyjściowe z PowerLab do modelu na płytce stykowej. PowerLab generuje bodziec i posiada sondę pomiarową do rejestracji napięcia. Następnie podłącz PowerLab do komputera.

Komputer służy do wyświetlania sygnałów elektrycznych rejestrowanych z płytki stykowej. Kolejnym krokiem jest konfiguracja oprogramowania komputerowego, które będzie kontrolować bodziec wysyłany przez PowerLab do modelowej komórki nerwowej. Otwórz program LabChart z pulpitu.

Wybierz nowy plik, wybierz konfigurację, a następnie ustawienia kanałów. Wybierz jeden kanał do wyświetlenia, a następnie wybierz panel stymulatora. Wymagane są długie impulsy o napięciu 1,5 V.

W tej części eksperymentu ustaw amplitudę na 1 V. Urządzenie Power Lab będzie emitować napięcie wahające się między +0,5 V a -0,5 V, co skutkuje bodźcem szczytowym o wartości 1 V. Ustaw częstotliwość na 0,75 Hz oraz czas trwania impulsu na 1 s.

W ustawieniach kanałów wybierz kanał pierwszy do monitorowania, kliknij wzmacniacz wejściowy, a następnie w polu kliknij przycisk różnicowy, ustaw zakres na 5 V i zatwierdź. Kolejnym krokiem jest przyłożenie sygnału elektrycznego do modelu komórki nerwowej i zbadanie tłumienia sygnału wzdłuż modelu. Przyłóż napięcie na jednym końcu obwodu między punktami A i B, klikając start na komputerze.

Zmierz napięcie dla pierwszej jednostki długości wzdłuż modelu aksonu i monitoruj je na komputerze. Pozostaw czerwony przewód sondy pomiarowej napięcia nieruchomo w punkcie A na płytce stykowej, przesuwając drugi przewód w różne miejsca pomiędzy rezystorami połączonymi szeregowo. Zauważ spadek napięcia w miejscach położonych dalej.

Teraz zakończ rejestrację, naciskając przycisk stop na komputerze. Zmierz zapisane różnice napięć na śladach przechowywanych w komputerze, przesuwając kursor do każdego zarejestrowanego impulsu. Użyj kursora markera M znajdującego się w lewym dolnym rogu, aby zaznaczyć dół śladu, a wolny kursor ustaw na szczycie śladu, aby zmierzyć różnicę napięć.

Odczytaj pomiar różnicy napięć z ekranu i zapisz go w zeszycie dla każdego punktu pomiarowego w obwodzie. Następnym krokiem jest obliczenie stałej długości dla komórki modelowej, która służy do opisania wykładniczego zaniku sygnału wraz z odległością. Przedstaw każdą wartość różnicy napięć na wykresie zależności różnicy potencjałów od odległości od źródła, przyjmując, że rezystory błony stanowią jedną jednostkę.

Oprócz wykonania wykresu, wyznacz stałą długości tego obwodu. Stała długości włókna nerwowego jest definiowana jako odległość, na której różnica potencjałów na błonie spada do 37% jej pierwotnej wartości w punkcie początkowym. Aby lepiej symulować pasywne właściwości kablowe włókien nerwowych i mięśniowych, model komórki nerwowej zostanie rozszerzony o komponenty rezystancyjne i pojemnościowe.

W błonie komórki nerwowej występuje nie tylko poprzeczna rezystancja błony, ale także pojemność powierzchniowa błony, która zniekształca sygnał komórki nerwowej. Aby to zasymulować, należy podłączyć równolegle do poprzecznej błony kondensatory o pojemności 10 µF. Rezystory znajdują się na płytce stykowej przy komputerze.

Ustaw stymulator na jedną sekundę, jeden wolt, co odpowiada ustawieniu amplitudy 0.5 volt i impulsom o częstotliwości 0.75 hertz. Następnie w prawym górnym rogu panelu ustaw częstotliwość próbkowania na 20 K na sekundę. Następnie kliknij kanał jeden po prawej stronie ekranu.

Kliknij wzmacniacz wejściowy w ramce. Kliknij przycisk różnicowy i ustaw zakres na pięć woltów. Kliknij OK.

Aby zapisać te zmiany, kliknij start, aby rozpocząć gromadzenie danych. Pomiarem danych należy dokonać w tych samych punktach na płytce stykowej. Po zakończeniu gromadzenia danych należy użyć okna powiększenia, aby rozszerzyć czas narastania jednego z impulsów prostokątnych.

Powtarzaj powiększenie w razie potrzeby, aby rozszerzyć przebieg. Zmierz czas, w którym sygnał wzrasta od linii bazowej do szczytu przebiegu napięcia, dokładnie w momencie jego stabilizacji.

Obserwuj przebieg czasowy zmiany potencjału oraz zniekształcenie impulsów prostokątnych. Zwróć również uwagę, czy zmierzone napięcie przekracza 0,2 V, używając kursora M oraz kursora swobodnego w ten sam sposób co wcześniej; odczytaj zmianę napięcia i zapisz dane w zeszycie, przyjmując napięcie progowe równe 0,2 V. Zmierz czas potrzebny do osiągnięcia potencjału progowego dla każdego rezystora błony.

Przedstaw wyniki na wykresie zależności czasu od odległości. Zwiększenie grubości osłonki mielinowej powoduje spadek pojemności błony. Zasymuluj ten proces, zastępując kondensatory 10 µF na płytcestykowej mniejszymi kondensatorami o pojemności 0,1 µF. Powtórz poprzednie doświadczenie.

Zwróć uwagę na zmianę czasu osiągnięcia wartości progowej przy wybranym rezystorze. Nałóż dane dla większych kondensatorów na poprzedni wykres czasu w funkcji odległości. Zwiększenie grubości osłonki mielinowej pozwala na szybszy wzrost i spadek sygnałów elektrycznych w komórce nerwowej, co zwiększa prędkość przewodzenia.

W kolejnej części eksperymentu zostaną zbadane właściwości elektrochemiczne aksonów w brzusznej sieci nerwowej raków. Właściwości pasywnego rozprzestrzeniania się prądu przedstawione w obwodach modelowych są obserwowane również w preparatach żywych. Jednakże, w sytuacjach, gdy sygnał musi zostać przesłany na odległość kilku milimetrów, niezbędny jest potencjał czynnościowy, ponieważ pasywne właściwości elektryczne komórek tłumiłyby sygnały na takim dystansie.

Gdy sygnały przemieszczają się wzdłuż brzusznego sznura nerwowego raka z różnymi prędkościami przewodzenia, najszybsze z nich zostaną zarejestrowane jako pierwsze, a wolniejsze nieco później. Niektóre z sygnałów będą sumować się w zapisie, w zależności od populacji aksonów o podobnych prędkościach przewodzenia. Ten zsumowany sygnał elektryczny z wielu aksonów nazywany jest złożonym potencjałem czynnościowym.

Kolejna seria eksperymentów koncentruje się na rejestracji złożonych potencjałów czynnościowych z nerwów homara w celu uzyskania brzusznego sznura nerwowego homara. Najpierw przygotuj instrumenty do sekcji do naczynia z nerwem oraz roztwory soli fizjologicznej. Umieść homara na lodzie przez około pięć minut, aby go zznieczulić.

Po znieczuleniu owiń raków wilgotnym ręcznikiem papierowym i utrzymaj go w jednej dłoni, trzymając szczypce między kciukiem a palcem wskazującym. Drugą ręką wykonaj nożyczkami nacięcie przez rostrum pomiędzy oczodołami. Tnij w dół od miejsca nacięcia, aż do całkowitego oddzielenia głowy.

Usuń szczypce i odnóża kroczne. Wykonaj nacięcie u podstawy cephalothorax powyżej odwłoka i oddziel cephalothorax. Usuń ogon oraz pływaki.

Wykonaj nacięcie wzdłuż obu stron brzusznej części odwłoka. Należy uważać, aby nie uszkodzić głębiej położonych tkanek. Odchyl uwolniony fragment egzoszkieletu aż do podstawy wachlarza ogonowego, aby odsłonić brzuszny sznur nerwowy.

Używając krawędzi pincety, ostrożnie usuń brzuszny sznur nerwowy, chwytając go za koniec. Należy uważać, aby nie rozciągać ani nie zmiażdżyć sznura nerwowego. Wszelkie zgrubienia widoczne na sznurze nerwowym to zwoje nerwowe raków.

Umieść sznur nerwowy w poprzek metalowych prętów w komorze nerwowej. Niezbędne jest utrzymanie brzusznego sznura nerwowego w stanie wilgotnym. Aby to osiągnąć, dodaj do komory nerwowej tyle soli fizjologicznej dla raków, aby poziom cieczy zrównał się z metalowymi prętami poprzecznymi.

Następnie odessaj pipetą odpowiednią ilość soli fizjologicznej dla raków, aby poziom cieczy stykał się z dolną krawędzią prętów. Po umieszczeniu sznura nerwowego podłącz do komory nerwowej kabel stymulatora z dwoma minihaczykami. Czerwoną elektrodę dodatnią przymocuj do jednej z zewnętrznych metalowych pętli znajdujących się w pobliżu końca sznura nerwowego, a czarną elektrodę ujemną do sąsiedniej pętli metalowej, która również styka się ze sznurem nerwowym.

Za pomocą manipulatora ustaw elektrodę ssącą w pobliżu końca nerwu, po przeciwnej stronie niż przewody ujemny i dodatni. Ostrożnie wciągnij koniec brzusznego sznura nerwowego do elektrody rejestrującej. Podłącz elektrodę do głowicy sondy, łącząc jeden przewód z elektrody ssącej z wejściem dodatnim sondy, a drugi przewód z wejściem ujemnym.

Nie ma znaczenia, który przewód zostanie podłączony do którego wejścia. Sondę można uziemić do klatki Faradaya lub kąpieli solnej za pomocą drutu z chlorku srebra albo podłączyć ją do wejścia uziemiającego w wzmacniaczu różnicowym, aby zmniejszyć potencjalne zakłócenia o częstotliwości 60 hertz. Podłącz sondę do wzmacniacza różnicowego, a wzmacniacz do systemu PowerLab.

Sprawdź ustawienia wzmacniacza RS przedstawione w tabeli w towarzyszącym artykule. Użyj kabla USB, aby podłączyć PowerLab do komputera. Otwórz oprogramowanie Scope znajdujące się na pulpicie komputera w prawym górnym rogu ekranu.

Wybierz kanał drugi i wyłącz go. Dostosuj ekran tak, aby widoczny był tylko kanał pierwszy, przesuwając pasek na środku do dolnej krawędzi ekranu. Sprawdź wzmacniacz wejściowy zgodnie z ustawieniami podanymi w towarzyszącej publikacji.

Następnie w sekcji konfiguracji (setup) w górnej części ekranu wybierz stymulator (stimulator), wyłącz funkcję izolowanego pnia (isolated stem) i ustaw opóźnienie (delay) na 5 ms, czas trwania (duration) na 1 ms, liczbę impulsów na dwa, odstęp (interval) na 15 ms, zakres (range) na 5 V oraz amplitudę (amplitude) na 0.5 V. Aby rozpocząć stymulację brzusznego sznura nerwowego, kliknij przycisk start w dolnym lewym rogu ekranu. W polu zbierania danych oscyloskopu powinien pojawić się wyraźnie zdefiniowany potencjał czynnościowy.

Narysuj w swoim notatniku ogólny kształt potencjału czynnościowego. Powoli zmniejszaj napięcie, korzystając z karty w lewym górnym rogu ekranu. Amplituda potencjału czynnościowego powinna maleć, aż jego charakterystyczny wzór fali całkowicie zniknie.

Zmniejszenie napięcia redukuje liczbę neuronów rekrutowanych do udziału w tworzeniu złożonego potencjału czynnościowego; aby odwrócić ten efekt, należy stopniowo zwiększać napięcie. W miarę rekrutacji kolejnych neuronów fala złożonego potencjału czynnościowego staje się większa. Ćwiczenie to ilustruje fakt, że poszczególne neurony mają różne progi pobudzenia, przy których generowane są ich potencjały czynnościowe.

Gdy dalszy wzrost napięcia stymulującego nie powoduje zwiększenia potencjału złożonego, oznacza to, że wszystkie neurony zostały aktywowane, a na ekranie komputera powinny być widoczne dwa wyraźne piki fali potencjału czynnościowego. Kolejna część eksperymentu dotyczy badania okresu refrakcji aksonów. Zmień opóźnienie między impulsami, korzystając z karty w lewym górnym rogu ekranu.

Stopniowo skracaj opóźnienie, aż do momentu, gdy drugi potencjał czynnościowy związku nie będzie mógł zostać wywołany. Bezwzględny okres refrakcji definiuje się jako opóźnienie czasowe między impulsami, przy którym drugi potencjał czynnościowy nie jest już wywoływany. Względny okres refrakcji definiuje się jako czas od zakończenia bezwzględnego okresu refrakcji do momentu, w którym podanie drugiego bodźca skutkuje wywołaniem drugiego potencjału czynnościowego o pełnej amplitudzie.

Można teraz zbadać właściwości inhibitora połączeń szczelinowych, takiego jak heptanol. Różnice w złożonym potencjale czynnościowym można porównać dla tych samych ustawień stymulacji, aby ustalić, które sygnały są przewodzone poprzez połączenia szczelinowe wzdłuż brzusznego sznura nerwowego. Można również zastosować zimny lub ciepły roztwór soli fizjologicznej i zmierzyć różnice w prędkościach przewodzenia poszczególnych elementów składających się na złożony potencjał czynnościowy.

Przedstawiono tutaj dwa złożone potencjały czynnościowe zarejestrowane z brzusznego sznura nerwowego raka. Rysunek ten ilustruje względny okres refrakcji, czyli czas po pełnym złożonym potencjale czynnościowym, podczas którego drugi bodziec wywołuje mniejszy złożony potencjał czynnościowy. Rysunek ten pokazuje wpływ zastosowania etanolu na złożony potencjał czynnościowy po przeprowadzeniu tej procedury.

Komponenty obwodu błony biologicznej można zmieniać w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak wpływ zmienionej gęstości kanałów przeciekowych w błonie lub funkcja kanałów bramkowanych napięciowo po ich opracowaniu. Techniki i procedury te torują drogę badaczom w dziedzinie fizjologii do zgłębiania sposobów, w jakie komórki funkcjonują jako obwody elektryczne oraz jak działają połączenia szczelinowe w żywej tkance zwierzęcej.