Name: Modelowanie błon biologicznych za pomocą obwodów drukowanych i pomiar sygnałów elektrycznych w aksonach: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: Poznaj modelowanie błon biologicznych za pomocą obwodów drukowanych i rejestrację potencjałów czynnościowych w nerwach raka. Ta metoda umożliwia studentom zrozumienie właściwości elektrycznych komórek nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Do przeprowadzenia tych eksperymentów wykorzystano zmodyfikowane procedury z podręcznika laboratoryjnego stosowanego w kursie organizowanym przez dr. H.L. Atwooda na Katedrze Zoologii Uniwersytetu w Toronto. Ćwiczenia zostały również opracowane i zmodyfikowane na podstawie podręcznika przygotowanego na „6th INTENSIVE IBRO WORKSHOP ON BASIC NEUROSCIENCE”, który odbył się na Uniwersytecie Korea w Seulu, w Korei Południowej w 1993 roku (Cooper et al., 1993). Obecne modyfikacje były konieczne, aby dostosować procedury do sprzętu powszechnie dostępnego w dzisiejszych laboratoriach studenckich na różnych uniwersytetach. Projekt wspierany przez Uniwersytet Kentucky, Katedrę Biologii, Biuro Studiów licencjackich oraz Kolegium Nauk i Sztuk.

<ol><li>Bennett, M. V. L., Barrio, L. C., Bargiello, T. A., Spray, D. C., Hertzberg, E., Sdez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions%3A+new+tools%2C+new+answers%2C+new+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Gap junctions: new tools, new answers, new questions.</a> Neuron. 6, 305-320 (1991).</li>
<li>Bernardini, G., Peracchia, C., Peracchia, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+effects+of+heptanol+on+gap+junction+structure+and+cell-to-cell+electrical+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reversible effects of heptanol on gap junction structure and cell-to-cell electrical coupling.</a> European Journal of Cell Biology. 34 (2), 307-312 (1984).</li>
<li>A report on the, "SIXTH INTENSIVE IBRO WORKSHOP ON BASIC NEUROSCIENCE". Cooper, R. L., Chang, J. J., Ito, M. July 1993, Seoul, South Korea, , Society for Neuroscience. 116-116 (1985).</li>
<li>Cragg, B. G., Thomas, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+conduction+velocity+and+the+diameter+and+internodal+length+of+peripheral+nerve+fibers.%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The relationship between conduction velocity and the diameter and internodal length of peripheral nerve fibers.</a> Journal of Physiology. 136, 606-614 (1957).</li>
<li>Erlanger, J. G. asser, S, H., Bishop, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+compound+nature+of+the+action+current+of+nerves+as+disclosed+by+the+cathode+ray+oscillograph%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The compound nature of the action current of nerves as disclosed by the cathode ray oscillograph.</a> American Journal of Physiology. 70, 624-666 (1924).</li>
<li>Furshpan, E. J., Potter, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+at+the+giant+motor+synapses+of+the+crayfish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transmission at the giant motor synapses of the crayfish.</a> Journal of Physiology. 145 (2), 289-325 (1959).</li>
<li>Johnston, M. F., Simon, S. A., Ramrn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+anesthetics+with+electrical+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Interaction of anesthetics with electrical synapses.</a> Nature (Lond). 286, 498-500 (1980).</li>
<li>Loewenstein, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+membrane+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+NY+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Permeability of membrane junctions.</a> Annual NY Academy of Sciences. 137, 441-472 (1966).</li>
<li>Meda, P., Bruzzone, R., Knodel, S., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockage+of+cell-to-cell+communication+within+pancreatic+acini+is+associated+with+increased+basal+release+of+amylase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Blockage of cell-to-cell communication within pancreatic acini is associated with increased basal release of amylase.</a> Journal of Cell Biology. 103 (2), 475-483 (1986).</li>
<li>Peracchia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+gap+junction+resistance+with+acidification+in+crayfish+septate+axons+is+closely+related+to+changes+in+intracellular+calcium+but+not+hydrogen+ion+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Increase in gap junction resistance with acidification in crayfish septate axons is closely related to changes in intracellular calcium but not hydrogen ion concentration.</a> Journal of Membrane Biology. 113 (1), 75-92 (1990).</li>
<li>Peracchia, C., Dulhunty, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+resistance+junctions+in+crayfish%3A+structural+changes+with+functional+uncoupling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Low resistance junctions in crayfish: structural changes with functional uncoupling.</a> Journal of Cell Biology. 70, 419-439 (1976).</li>
<li>Peracchia, C., Bernardini, G., Peracchia, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+calmodulin+involved+in+the+regulation+of+gap+junction+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Pf%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Is calmodulin involved in the regulation of gap junction permeability.</a> Pfügers Arch. 399, 152-154 (1983).</li>
<li>Peracchia, C., Lazrak, A., Peracchia, L. L. Molecular models of channel interaction and gating in gap junctions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeracchia%2C+C+%22Handbook+of+Membrane+Channels.+Molecular+and+Cellular+Physiology%22">Handbook of Membrane Channels. Molecular and Cellular Physiology</a>. Peracchia, C. , Academic Press. San Diego. 361-377 (1994).</li>
<li>Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+conductance+is+a+simple+and+sensitive+function+of+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Sciences+NY%22%5BJournal%5D)">Gap junctional conductance is a simple and sensitive function of intracellular pH.</a> Sciences NY. 211, 712-715 (1981).</li>
<li>Spray, D. C., Harris, L. L., Bennett, M. V. L. Comparison of pH and Ca dependence of gap junctional conductance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpray%2C+DC+%22Intracellular+pH%3A+Its+Measurement%2C+Regulation%2C+and+Utilization+in+Cellular+Functions%22">Intracellular pH: Its Measurement, Regulation, and Utilization in Cellular Functions</a>. Nuccitelli, R., Deamer, D. , Alan R. Liss. New York. 445-461 (1982).</li>
<li>Spray, D. C., White, R., De Carvalho, C., Harris, A. L., Bennett, M. L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+of+gap+junction+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Gating of gap junction channels.</a> Journal of Biophysics. 45, 219-230 (1984).</li>
<li>Watanabe, A., Grundfest, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impulse+propagation+at+the+septal+and+commissural+junctions+of+crayfish+lateral+giant+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Impulse propagation at the septal and commissural junctions of crayfish lateral giant axons.</a> Journal of General Physiology. 45, 267-308 (1961).</li>
<li>Wiersma, C. A. G., Hughes, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+functional+anatomy+of+neuronal+units+in+the+abdominal+cord+of+the+crayfish%2C+Procambarus+clarkii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">On the functional anatomy of neuronal units in the abdominal cord of the crayfish, Procambarus clarkii.</a> Journal of Comparative Neurology. 116, 209-228 (1961).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Naszym celem w prezentacji wideo online oraz w niniejszej pracy jest wykazanie, że właściwości biofizyczne komórek mogą być częściowo modelowane jako obwody elektryczne. Ponadto, dzięki zastosowaniu stosunkowo łatwo dostępnej żywej tkanki nerwowej, możliwe jest wprowadzenie do laboratoriów dla studentów studiów licencjackich fundamentalnych zasad dotyczących prędkości przewodzenia, okresów refrakcji i technik rejestracji elektrofizjologicznej przy niewielkich nakładach na sprzęt. Przedstawione zagadnienia i podstawowe paradygmaty mogą być łatwo dostosowane do wymagań różnych kursów.
Utrzymywanie raków oraz ich powszechność sprawiają, że są one atrakcyjnymi modelami do eksperymentów prowadzonych przez studentów. Brzuszne sznury nerwowe skorupiaków są zazwyczaj wytrzymałe i zachowują integralność fizjologiczną w minimalnym roztworze soli przez wiele godzin, co jest wystarczające dla 3-godzinnych zajęć laboratoryjnych dla studentów.
Biorąc pod uwagę, że niektóre z dużych aksonów w VNC homara są połączone za pomocą złączy szczelinowych, można przeprowadzić dodatkowe eksperymenty dotyczące ich wkładu i wykazać inne właściwości niż te występujące w standardnym preparacie nerwu kulszowego żaby. Nerw kulszowy jest klasycznym modelem do badania złożonych potencjałów czynnościowych oraz właściwości przewodzenia. Dla studentów interesującym eksperymentem porównawczym mogłoby być zestawienie właściwości przewodzenia, rekrutacji aksonów oraz okresów refrakcji w obu tych preparatach.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Płyta obwodowa&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;Elementy elektroniczne wymienione poniżej, niezbędne do eksperymentów na płytce stykowej, można nabyć w lokalnym sklepie z elektroniką, takim jak Radio Shack.&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Płytka stykowa, rezystory, kondensatory, baterie oraz przewody, które mogą służyć jako połączenia dla płytki stykowej, zgodnie z opisem w doświadczeniach.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Zwykły woltomierz (woltomierz Wavetek Meterman)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Karta A/D do rejestracji danych w czasie rzeczywistym na komputerze. Sygnały elektryczne są rejestrowane w czasie rzeczywistym na &lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/pl3504#overview&quot; Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;_puste&quot;&gt;interfejs PowerLab/4s&lt;/a&gt; (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). Stosujemy standardowe oprogramowanie firmy ADInstruments o nazwie Chart lub Scope.&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do przetłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy przełożyć materiały na język polski, zachowując odpowiedni rejestr akademicki, precyzję terminologiczną oraz naturalny styl publikacji naukowych.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Doświadczenia z zakresu fizjologii&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;Rak (&lt;em&gt;*Procambarus clarkii*&lt;/em&gt;). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Standardowy roztwór soli fizjologicznej dla raków: zmodyfikowany roztwór Van Harrevelda (1936). (w mM) 205 NaCl; 5,3 KCl; 13,5 CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; 2,45 MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; 5 HEPES i doprowadzono do pH 7,4. Wszystkie odczynniki soli pozyskano z firmy Sigma (St. Louis, MO).&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Narzędzia do sekcji: pęseta precyzyjna nr 5, nożyczki precyzyjne, uchwyt do ostrzy noży, szpilki entomologiczne nr #26002-20 (wszystkie zakupione w Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Szalka z komorą nerwową (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA) do unieruchomienia nerwu. Przewody dołączone do szalki z komorą nerwową mogą zostać wykorzystane do stymulacji nerwu.&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Do rejestracji sygnałów zastosowano elektrodę ssącą. &lt;/li&gt; &lt;li&gt;Manipulator lub zacisk na statywie laboratoryjnym będzie również służył jako uchwyt dla elektrody ssącej.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Klatka Faradaya&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Mikroskop stereoskopowy&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Iluminator o wysokiej intensywności (źródło światła)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Platforma mikroskopowa&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Wzmacniacz różnicowy AC/DC (A-M Systems Inc. Model 3000)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML856/&quot; cel=&quot;_puste&quot;&gt;PowerLab 26T&lt;/a&gt; (AD Instruments)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/hardware/education/product/FE185/&quot; Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;Wzmacniacz zewnątrzkomórkowy&lt;/a&gt; (AD Instruments)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/&quot; Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;LabChart 7&lt;/a&gt; (ADI Instruments)&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Narzędzia do sekcji&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Statyw laboratoryjny z uchwytem służący jako stabilizator dla ssącej elektrody rejestrującej&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

modelowanie błon biologicznych za pomocą płytek drukowanych i pomiar sygnałów elektrycznych w aksonach: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises

Niniejszy materiał jest demonstracją wykorzystania modeli elektrycznych do charakteryzacji błon biologicznych. Ćwiczenie to wprowadza również terminologię biofizyczną stosowaną w elektrofizjologii. W modelu błony wykorzystuje się ten sam sprzęt, co w przypadku preparatów żywych. Badane są wybrane właściwości izolowanego sznura nerwowego: potencjały czynnościowe nerwu, rekrutacja neuronów oraz reaktywność sznura nerwowego na czynniki środowiskowe.

Niniejszy materiał stanowi demonstrację sposobu rozumienia błon biologicznych przy użyciu modeli elektrycznych. Przedstawiamy również procedury rejestracji potencjałów czynnościowych z brzusznego sznura nerwowego raka, przeznaczone do wykorzystania w laboratoriach dydaktycznych.

Modelowanie błon biologicznych za pomocą płytek drukowanych i pomiar sygnałów elektrycznych w aksonach: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Niniejsza prezentacja demonstruje, w jaki sposób modele elektryczne mogą być wykorzystywane do charakteryzowania błon biologicznych. Ćwiczenie to wprowadza również terminologię biofizyczną ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie sposobu rozumienia błon biologicznych za pomocą modeli elektrycznych oraz przedstawienie procedur rejestracji potencjałów czynnościowych z brzusznego sznura nerwowego raka. W pierwszej części demonstracji wykorzystywane są komponenty obwodu na płytce stykowej do reprezentacji właściwości elektrycznych błon. Drugim krokiem procedury jest zmiana rezystancji i pojemności w obwodzie modelowym, aby zaobserwować wpływ tych zmian na przebiegi napięcia.Trzecim krokiem procedury jest zastosowanie pojęć poznanych na przykładzie obwodu modelowego w preparacie żywego nerwu. Ostatnim krokiem procedury jest rejestracja złożonych potencjałów czynnościowych oraz zrozumienie właściwości okresów refrakcji progu pobudliwości oraz przewodnictwa synaptycznego. W końcowym rozrachunku wyniki pokazują, w jaki sposób analiza modeli obwodów elektrycznych błon biologicznych i właściwości żywych nerwów może służyć jako przydatne narzędzia dydaktyczne, co wykazano poprzez zmianę komponentów obwodu modelowego oraz różnicowanie stymulacji żywego nerwu.Metoda ta pozwala zrozumieć, w jaki sposób błony biologiczne można opisać za pomocą modeli elektrycznych. Można ją również zastosować do innych tkanek, takich jak tkanka mięśniowa. Demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ sekcja brzusznego sznura nerwowego i konfiguracja układu rejestracyjnego mogą być na początku trudne, a zachowanie ostrożności jest niezbędne, aby uniknąć uszkodzenia nerwów i uzyskać właściwe warunki do stymulacji oraz rejestracji sygnałów ze sznura nerwowego.W pierwszej części eksperymentu rezystory i kondensatory są wykorzystywane do symulacji aktywności elektrycznej błony komórkowej neuronu. Początkowy obwód składa się wyłącznie z rezystorów. Kondensatory zostaną dodane na późniejszym etapie.Pasywne właściwości rezystywne błony nerwowej są reprezentowane przez przedstawiony tutaj obwód. Płytka stykowa została skonfigurowana z rezystorami 33 kilo omów połączonymi równolegle, reprezentującymi poprzeczną rezystancję błony, oraz rezystorami 10 kilo omów połączonymi szeregowo, reprezentującymi rezystancję wewnątrzkomórkową. Obwód ten zakłada, że rezystancja płynu zewnętrznego jest pomijalna w porównaniu z rezystancjami wewnątrzkomórkową i poprzeczną błony.Po ukończeniu budowy modelu komórki podłącz przewody wyjściowe z PowerLab do modelu na płytce stykowej. PowerLab generuje bodziec i posiada sondę pomiarową do rejestracji napięcia. Następnie podłącz PowerLab do komputera.Komputer służy do wyświetlania sygnałów elektrycznych rejestrowanych z płytki stykowej. Kolejnym krokiem jest konfiguracja oprogramowania komputerowego, które będzie kontrolować bodziec wysyłany przez PowerLab do modelowej komórki nerwowej. Otwórz program LabChart z pulpitu.Wybierz nowy plik, wybierz konfigurację, a następnie ustawienia kanałów. Wybierz jeden kanał do wyświetlenia, a następnie wybierz panel stymulatora. Wymagane są długie impulsy o napięciu 1,5 V.W tej części eksperymentu ustaw amplitudę na 1 V. Urządzenie Power Lab będzie emitować napięcie wahające się między +0,5 V a -0,5 V, co skutkuje bodźcem szczytowym o wartości 1 V. Ustaw częstotliwość na 0,75 Hz oraz czas trwania impulsu na 1 s.W ustawieniach kanałów wybierz kanał pierwszy do monitorowania, kliknij wzmacniacz wejściowy, a następnie w polu kliknij przycisk różnicowy, ustaw zakres na 5 V i zatwierdź. Kolejnym krokiem jest przyłożenie sygnału elektrycznego do modelu komórki nerwowej i zbadanie tłumienia sygnału wzdłuż modelu. Przyłóż napięcie na jednym końcu obwodu między punktami A i B, klikając start na komputerze.Zmierz napięcie dla pierwszej jednostki długości wzdłuż modelu aksonu i monitoruj je na komputerze. Pozostaw czerwony przewód sondy pomiarowej napięcia nieruchomo w punkcie A na płytce stykowej, przesuwając drugi przewód w różne miejsca pomiędzy rezystorami połączonymi szeregowo. Zauważ spadek napięcia w miejscach położonych dalej.Teraz zakończ rejestrację, naciskając przycisk stop na komputerze. Zmierz zapisane różnice napięć na śladach przechowywanych w komputerze, przesuwając kursor do każdego zarejestrowanego impulsu. Użyj kursora markera M znajdującego się w lewym dolnym rogu, aby zaznaczyć dół śladu, a wolny kursor ustaw na szczycie śladu, aby zmierzyć różnicę napięć.Odczytaj pomiar różnicy napięć z ekranu i zapisz go w zeszycie dla każdego punktu pomiarowego w obwodzie. Następnym krokiem jest obliczenie stałej długości dla komórki modelowej, która służy do opisania wykładniczego zaniku sygnału wraz z odległością. Przedstaw każdą wartość różnicy napięć na wykresie zależności różnicy potencjałów od odległości od źródła, przyjmując, że rezystory błony stanowią jedną jednostkę.Oprócz wykonania wykresu, wyznacz stałą długości tego obwodu. Stała długości włókna nerwowego jest definiowana jako odległość, na której różnica potencjałów na błonie spada do 37% jej pierwotnej wartości w punkcie początkowym. Aby lepiej symulować pasywne właściwości kablowe włókien nerwowych i mięśniowych, model komórki nerwowej zostanie rozszerzony o komponenty rezystancyjne i pojemnościowe.W błonie komórki nerwowej występuje nie tylko poprzeczna rezystancja błony, ale także pojemność powierzchniowa błony, która zniekształca sygnał komórki nerwowej. Aby to zasymulować, należy podłączyć równolegle do poprzecznej błony kondensatory o pojemności 10 µF. Rezystory znajdują się na płytce stykowej przy komputerze.Ustaw stymulator na jedną sekundę, jeden wolt, co odpowiada ustawieniu amplitudy 0.5 volt i impulsom o częstotliwości 0.75 hertz. Następnie w prawym górnym rogu panelu ustaw częstotliwość próbkowania na 20 K na sekundę. Następnie kliknij kanał jeden po prawej stronie ekranu.Kliknij wzmacniacz wejściowy w ramce. Kliknij przycisk różnicowy i ustaw zakres na pięć woltów. Kliknij OK.Aby zapisać te zmiany, kliknij start, aby rozpocząć gromadzenie danych. Pomiarem danych należy dokonać w tych samych punktach na płytce stykowej. Po zakończeniu gromadzenia danych należy użyć okna powiększenia, aby rozszerzyć czas narastania jednego z impulsów prostokątnych.Powtarzaj powiększenie w razie potrzeby, aby rozszerzyć przebieg. Zmierz czas, w którym sygnał wzrasta od linii bazowej do szczytu przebiegu napięcia, dokładnie w momencie jego stabilizacji.Obserwuj przebieg czasowy zmiany potencjału oraz zniekształcenie impulsów prostokątnych. Zwróć również uwagę, czy zmierzone napięcie przekracza 0,2 V, używając kursora M oraz kursora swobodnego w ten sam sposób co wcześniej; odczytaj zmianę napięcia i zapisz dane w zeszycie, przyjmując napięcie progowe równe 0,2 V. Zmierz czas potrzebny do osiągnięcia potencjału progowego dla każdego rezystora błony.Przedstaw wyniki na wykresie zależności czasu od odległości. Zwiększenie grubości osłonki mielinowej powoduje spadek pojemności błony. Zasymuluj ten proces, zastępując kondensatory 10 µF na płytcestykowej mniejszymi kondensatorami o pojemności 0,1 µF. Powtórz poprzednie doświadczenie.Zwróć uwagę na zmianę czasu osiągnięcia wartości progowej przy wybranym rezystorze. Nałóż dane dla większych kondensatorów na poprzedni wykres czasu w funkcji odległości. Zwiększenie grubości osłonki mielinowej pozwala na szybszy wzrost i spadek sygnałów elektrycznych w komórce nerwowej, co zwiększa prędkość przewodzenia.W kolejnej części eksperymentu zostaną zbadane właściwości elektrochemiczne aksonów w brzusznej sieci nerwowej raków. Właściwości pasywnego rozprzestrzeniania się prądu przedstawione w obwodach modelowych są obserwowane również w preparatach żywych. Jednakże, w sytuacjach, gdy sygnał musi zostać przesłany na odległość kilku milimetrów, niezbędny jest potencjał czynnościowy, ponieważ pasywne właściwości elektryczne komórek tłumiłyby sygnały na takim dystansie.Gdy sygnały przemieszczają się wzdłuż brzusznego sznura nerwowego raka z różnymi prędkościami przewodzenia, najszybsze z nich zostaną zarejestrowane jako pierwsze, a wolniejsze nieco później. Niektóre z sygnałów będą sumować się w zapisie, w zależności od populacji aksonów o podobnych prędkościach przewodzenia. Ten zsumowany sygnał elektryczny z wielu aksonów nazywany jest złożonym potencjałem czynnościowym.Kolejna seria eksperymentów koncentruje się na rejestracji złożonych potencjałów czynnościowych z nerwów homara w celu uzyskania brzusznego sznura nerwowego homara. Najpierw przygotuj instrumenty do sekcji do naczynia z nerwem oraz roztwory soli fizjologicznej. Umieść homara na lodzie przez około pięć minut, aby go zznieczulić.Po znieczuleniu owiń raków wilgotnym ręcznikiem papierowym i utrzymaj go w jednej dłoni, trzymając szczypce między kciukiem a palcem wskazującym. Drugą ręką wykonaj nożyczkami nacięcie przez rostrum pomiędzy oczodołami. Tnij w dół od miejsca nacięcia, aż do całkowitego oddzielenia głowy.Usuń szczypce i odnóża kroczne. Wykonaj nacięcie u podstawy cephalothorax powyżej odwłoka i oddziel cephalothorax. Usuń ogon oraz pływaki.Wykonaj nacięcie wzdłuż obu stron brzusznej części odwłoka. Należy uważać, aby nie uszkodzić głębiej położonych tkanek. Odchyl uwolniony fragment egzoszkieletu aż do podstawy wachlarza ogonowego, aby odsłonić brzuszny sznur nerwowy.Używając krawędzi pincety, ostrożnie usuń brzuszny sznur nerwowy, chwytając go za koniec. Należy uważać, aby nie rozciągać ani nie zmiażdżyć sznura nerwowego. Wszelkie zgrubienia widoczne na sznurze nerwowym to zwoje nerwowe raków.Umieść sznur nerwowy w poprzek metalowych prętów w komorze nerwowej. Niezbędne jest utrzymanie brzusznego sznura nerwowego w stanie wilgotnym. Aby to osiągnąć, dodaj do komory nerwowej tyle soli fizjologicznej dla raków, aby poziom cieczy zrównał się z metalowymi prętami poprzecznymi.Następnie odessaj pipetą odpowiednią ilość soli fizjologicznej dla raków, aby poziom cieczy stykał się z dolną krawędzią prętów. Po umieszczeniu sznura nerwowego podłącz do komory nerwowej kabel stymulatora z dwoma minihaczykami. Czerwoną elektrodę dodatnią przymocuj do jednej z zewnętrznych metalowych pętli znajdujących się w pobliżu końca sznura nerwowego, a czarną elektrodę ujemną do sąsiedniej pętli metalowej, która również styka się ze sznurem nerwowym.Za pomocą manipulatora ustaw elektrodę ssącą w pobliżu końca nerwu, po przeciwnej stronie niż przewody ujemny i dodatni. Ostrożnie wciągnij koniec brzusznego sznura nerwowego do elektrody rejestrującej. Podłącz elektrodę do głowicy sondy, łącząc jeden przewód z elektrody ssącej z wejściem dodatnim sondy, a drugi przewód z wejściem ujemnym.Nie ma znaczenia, który przewód zostanie podłączony do którego wejścia. Sondę można uziemić do klatki Faradaya lub kąpieli solnej za pomocą drutu z chlorku srebra albo podłączyć ją do wejścia uziemiającego w wzmacniaczu różnicowym, aby zmniejszyć potencjalne zakłócenia o częstotliwości 60 hertz. Podłącz sondę do wzmacniacza różnicowego, a wzmacniacz do systemu PowerLab.Sprawdź ustawienia wzmacniacza RS przedstawione w tabeli w towarzyszącym artykule. Użyj kabla USB, aby podłączyć PowerLab do komputera. Otwórz oprogramowanie Scope znajdujące się na pulpicie komputera w prawym górnym rogu ekranu.Wybierz kanał drugi i wyłącz go. Dostosuj ekran tak, aby widoczny był tylko kanał pierwszy, przesuwając pasek na środku do dolnej krawędzi ekranu. Sprawdź wzmacniacz wejściowy zgodnie z ustawieniami podanymi w towarzyszącej publikacji.Następnie w sekcji konfiguracji (setup) w górnej części ekranu wybierz stymulator (stimulator), wyłącz funkcję izolowanego pnia (isolated stem) i ustaw opóźnienie (delay) na 5 ms, czas trwania (duration) na 1 ms, liczbę impulsów na dwa, odstęp (interval) na 15 ms, zakres (range) na 5 V oraz amplitudę (amplitude) na 0.5 V. Aby rozpocząć stymulację brzusznego sznura nerwowego, kliknij przycisk start w dolnym lewym rogu ekranu. W polu zbierania danych oscyloskopu powinien pojawić się wyraźnie zdefiniowany potencjał czynnościowy.Narysuj w swoim notatniku ogólny kształt potencjału czynnościowego. Powoli zmniejszaj napięcie, korzystając z karty w lewym górnym rogu ekranu. Amplituda potencjału czynnościowego powinna maleć, aż jego charakterystyczny wzór fali całkowicie zniknie.Zmniejszenie napięcia redukuje liczbę neuronów rekrutowanych do udziału w tworzeniu złożonego potencjału czynnościowego; aby odwrócić ten efekt, należy stopniowo zwiększać napięcie. W miarę rekrutacji kolejnych neuronów fala złożonego potencjału czynnościowego staje się większa. Ćwiczenie to ilustruje fakt, że poszczególne neurony mają różne progi pobudzenia, przy których generowane są ich potencjały czynnościowe.Gdy dalszy wzrost napięcia stymulującego nie powoduje zwiększenia potencjału złożonego, oznacza to, że wszystkie neurony zostały aktywowane, a na ekranie komputera powinny być widoczne dwa wyraźne piki fali potencjału czynnościowego. Kolejna część eksperymentu dotyczy badania okresu refrakcji aksonów. Zmień opóźnienie między impulsami, korzystając z karty w lewym górnym rogu ekranu.Stopniowo skracaj opóźnienie, aż do momentu, gdy drugi potencjał czynnościowy związku nie będzie mógł zostać wywołany. Bezwzględny okres refrakcji definiuje się jako opóźnienie czasowe między impulsami, przy którym drugi potencjał czynnościowy nie jest już wywoływany. Względny okres refrakcji definiuje się jako czas od zakończenia bezwzględnego okresu refrakcji do momentu, w którym podanie drugiego bodźca skutkuje wywołaniem drugiego potencjału czynnościowego o pełnej amplitudzie.Można teraz zbadać właściwości inhibitora połączeń szczelinowych, takiego jak heptanol. Różnice w złożonym potencjale czynnościowym można porównać dla tych samych ustawień stymulacji, aby ustalić, które sygnały są przewodzone poprzez połączenia szczelinowe wzdłuż brzusznego sznura nerwowego. Można również zastosować zimny lub ciepły roztwór soli fizjologicznej i zmierzyć różnice w prędkościach przewodzenia poszczególnych elementów składających się na złożony potencjał czynnościowy.Przedstawiono tutaj dwa złożone potencjały czynnościowe zarejestrowane z brzusznego sznura nerwowego raka. Rysunek ten ilustruje względny okres refrakcji, czyli czas po pełnym złożonym potencjale czynnościowym, podczas którego drugi bodziec wywołuje mniejszy złożony potencjał czynnościowy. Rysunek ten pokazuje wpływ zastosowania etanolu na złożony potencjał czynnościowy po przeprowadzeniu tej procedury.Komponenty obwodu błony biologicznej można zmieniać w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak wpływ zmienionej gęstości kanałów przeciekowych w błonie lub funkcja kanałów bramkowanych napięciowo po ich opracowaniu. Techniki i procedury te torują drogę badaczom w dziedzinie fizjologii do zgłębiania sposobów, w jakie komórki funkcjonują jako obwody elektryczne oraz jak działają połączenia szczelinowe w żywej tkance zwierzęcej.

modeling-biological-membranes-with-circuit-boards-measuring

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Modelowanie błon biologicznych za pomocą płytek obwodów i pomiar sygnałów elektrycznych w aksonach: Ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Funkcja białek błonowych jest regulowana przez skład lipidowy błony komórkowej. Niniejszy artykuł wideo szczegółowo opisuje sposób tworzenia łatki za pomocą elektrod do łatki dwuwarstwowej, a także wykorzystanie kanałów gramicydyny jako reporterów zmienionych właściwości błony.

Metody pojedynczych cząsteczek do monitorowania zmian właściwości elastycznych dwuwarstwy

Planarne dwuwarstwy lipidowe, nazywane również sztucznymi dwuwarstwami lipidowymi, pozwalają na badanie kanałów przewodzących jony w ściśle określonym środowisku. W niniejszym materiale prezentujemy poszczególne kroki niezbędne do przygotowania komory do dwuwarstw, elektrod oraz sposób sprawdzenia, czy dwuwarstwa nadaje się do pomiarów pojedynczych kanałów.

Przygotowanie sztucznych dwuwarstw do eksperymentów elektrofizjologicznych

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Doświadczenia te prezentują prosty sposób, dzięki któremu studenci mogą zdobyć doświadczenie w badaniu struktury mięśni, odpowiedzi synaptycznych oraz wpływu gradientów jonowych i przepuszczalności na potencjały błonowe. Przedstawiono również obwód sensoryczny-OUN-motoryczny-mięśniowy, aby pokazać metodę testowania wpływu związków chemicznych na obwód neuronalny.

Potencjały błonowe, odpowiedzi synaptyczne, obwody neuronalne, neuromodulacja i histologia mięśni z wykorzystaniem raka rzecznego: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Tutaj prezentujemy metodę elektrofizjologiczną opartą na solidnych membranach z naciskiem na jej zastosowania do charakterystyki elektrogenicznych transporterów membranowych.

Wprowadzenie do elektrofizjologii opartej na membranach podpartych ciałem stałym

Protokoły zamkniętej pętli stają się coraz bardziej powszechne we współczesnej elektrofizjologii. Przedstawiamy prosty, wszechstronny i niedrogi sposób wykonywania złożonych protokołów elektrofizjologicznych w korowych neuronach piramidowych in vitro, przy użyciu komputera stacjonarnego i cyfrowej płytki akwizycyjnej.

Elektrofizjologia w czasie rzeczywistym: wykorzystanie protokołów zamkniętej pętli do badania dynamiki neuronów i nie tylko

W tym artykule przedstawiono eksperymentalny framework do przeprowadzania eksperymentów w pętli zamkniętej, w którym przetwarzanie informacji (tj. kodowanie i dekodowanie) oraz uczenie się zespołów neuronalnych są badane podczas ciągłej interakcji z ciałem robota.

Eksperymenty neurorobotyczne w pętli zamkniętej w celu przetestowania właściwości obliczeniowych sieci neuronowych

Techniki mikroskopii świetlnej w połączeniu z testami biochemicznymi wyjaśniają udział egzocytozy za pośrednictwem SNARE w zależnym od netryny rozgałęzianiu aksonów. Ta kombinacja technik pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych kontrolujących rozgałęzianie się aksonów i zmianę kształtu komórki.

Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak połączyć układy mikroelektrod in vitro z urządzeniami mikroprzepływowymi do badania transmisji potencjału czynnościowego w kulturach neuronalnych. Analiza danych, a mianowicie wykrywanie i charakteryzacja rozchodzących się potencjałów czynnościowych, odbywa się za pomocą nowego, zaawansowanego, a jednocześnie przyjaznego dla użytkownika i ogólnodostępnego narzędzia obliczeniowego.

Łączenie mikrofluidyki z układami mikroelektrod do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych

Miękkie, biomolekularne memrystory o niskiej mocy wykorzystują podobny skład, strukturę i mechanizmy przełączania biosynaps. Przedstawiono protokół składania i charakterystyki memrystorów biomolekularnych otrzymywanych z izolacji dwuwarstw lipidowych powstałych pomiędzy kropelkami wody w oleju. Włączenie aktywowanych napięciem peptydów alametycyny powoduje memrystywne przewodnictwo jonowe w poprzek błony.

Montaż i charakterystyka memrystorów biomolekularnych składających się z błon lipidowych domieszkowanych kanałami jonowymi

Przedstawiono protokół eksperymentalny do składania, stymulacji elektrycznej i analizy kropli dwuwarstwy lipidowych zmodyfikowanych gramicydyną A. Relacje struktura-funkcja lipidów i białek są ilościowo określane poprzez pomiar zmian w obszarze błony, przepływie jonowym i przewodnictwie pojedynczego kanału oraz odniesienie tych reakcji do zmian przypominających plasticzne zmiany w przewodnictwie jonowym w modelu błony inspirowanym synapsami elektrycznymi.

Charakterystyka struktury i funkcji błony lipidowo-białkowej z wykorzystaniem warstw dwubiegunowych interfejsu kropelkowego

Poznaj modelowanie błon biologicznych za pomocą obwodów drukowanych i rejestrację potencjałów czynnościowych w nerwach raka. Ta metoda umożliwia studentom zrozumienie właściwości elektrycznych komórek nerwowych.

Modelowanie błon biologicznych za pomocą obwodów drukowanych i pomiar sygnałów elektrycznych w aksonach: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów (Wideo) | JoVE Journal

Modelowanie błon biologicznych za pomocą płytek drukowanych i pomiar sygnałów elektrycznych w aksonach: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Przeglądaj więcej filmów