Name: Zapis całokomórkowy prądów wapnia aktywowanego uwalnianiem wapnia (CRAC) w ludzkich limfocytach T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Poznaj metodę całokomórkowego zapisu prądów CRAC w ludzkich limfocytach T przy użyciu techniki patch clamp. Protokół ten umożliwia niezawodne pomiary aktywności kanałów wapniowych kluczowych dla aktywacji komórek T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Katedrze Fizjologii i Biologii Błon komórkowych Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis za udostępnienie zaplecza oraz zapewnienie doskonałych warunków do prowadzenia badań nad kanałami jonowymi.

1. Przygotowanie spoczynkowych limfocytów T człowieka
<ol>
 <li>Używając zestawu RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail oraz medium RosetteSep Density Medium, oczyść limfocyty T z próbek ludzkiej krwi zgodnie z instrukcjami producenta. Uzyskana populacja komórek powinna zawierać 95% spoczynkowych limfocytów T CD3+. Limfocyty T izolujemy z próbek krwi obwodowej pobranych od zdrowych ochotników zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Internal Review Board UC Davis.</li>
 <li>Po izolacji resuspenduj spoczynkowe limfocyty T do gęstości 0,5 x 106 komórek/mL w medium do hodowli komórkowej zawierającym medium RPMI-1640 z glutaminą i HEPES, uzupełnione o 10% płodowej łydki serum, 2% GlutaMAX-I, 1% roztwór witamin RPMI 1640, 1% roztwór aminokwasów RPMI 1640, 1% pirogronianu sodu oraz 0,03% β-merkaptoetanolu.</li>
 <li>Przenieś zawiesinę komórkową do kolb hodowlanych i inkubuj w temperaturze 37°C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 do 24 h przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komory rejestracyjnej
<ol>
 <li>Do przygotowania komór rejestracyjnych potrzebne są: a) silikonowe pierścienie O-ring, b) okrągłe, 25-mm szkiełka nakrywki oczyszczone 70% etanolem i destylowaną H2O, c) zmieszany Sylgard184, przygotowany zgodnie z instrukcją producenta, oraz d) dwie płytki Petriego o wymiarach 60 x 15 mm.</li>
 <li>Do płytki Petriego 60x15 mm wlać ~0.5 mL zmieszanego Sylgard184.</li>
 <li>Za pomocą pęsety zanurzyć dolną część pierścienia O-ring w Sylgard184.</li>
 <li>Nadmiar Sylgard184 usunąć z krawędzi pierścienia O-ring, kładąc go na czystej powierzchni, np. na drugiej płytce Petriego.</li>
 <li>Umieścić pierścień na szkiełku nakrywce i docisnąć go.</li>
 <li>Utwardzić Sylgard184, ogrzewając komory w temperaturze 85° C przez 40-60 min lub do czasu polimeryzacji Sylgard184.</li>
 <li>Przechowywać komory rejestracyjne w pojemniku chroniącym przed kurzem.</li>
</ol>
3. Przygotowanie pipet do patch-clamp
<ol>
 <li>W dniu eksperymentu wyciągnij pipety o średnicy końcówki ~2-μm, wykorzystując kapilary szklane i wyciągarkę do pipet. Stosujemy rurki borokrzemowe z włóknem (średnica zewnętrzna: 1.5 mm i średnica wewnętrzna: 1.10 mm). Przechowuj pipety w miejscu wolnym od kurzu.</li>
 <li>Pokryj końcówki pipet preparatem Sylgard184 lub powłoką ochronną półprzewodników HIPEC R6101 zgodnie ze standardową procedurą 9.</li>
 <li>Przed rozpoczęciem eksperymentu delikatnie wypoleruj końcówki pipet metodą wypalania.</li>
</ol>
4. Przygotowanie zestawu do patch clamp
<ol>
 <li>Skonfiguruj i zapisz makra dla tworzenia gigaseala w oprogramowaniu sterującym wzmacniaczem patch-clamp. W naszych badaniach wykorzystujemy wzmacniacz EPC-10 obsługiwany przez system Windows XP oraz oprogramowanie Pulse do akwizycji danych. Makra „set-up”, „on-cell” oraz „whole-cell” ustawiamy zgodnie z instrukcją obsługi EPC-10 i stosujemy we wszystkich eksperymentach.</li>
 <li>Przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj roztwory do kąpieli oraz roztwory do pipet wymienione w Tabeli 1 i przechowuj je w temperaturze 4° C przez maksymalnie 1 tydzień.</li>
</ol>
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Odczynniki chemiczne</td>
 <td colspan="3">Roztwory kąpieli (mM)</td>
 <td>Odmiar rozwiąry (mM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td># 1</td>
 <td># 2</td>
 <td># 3</td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
 <tbody>
 <tr>
 <td>CH3SO3Na</td>
 <td>130</td>
 <td>110</td>
 <td>125</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>2</td>
 <td>4</td>
 <td>5</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ca(OH)22</td>
 <td>-</td>
 <td>20</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2</td>
 <td>3</td>
 <td>1</td>
 <td>-</td>
 <td>5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO₄4</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEDTA</td>
 <td>-</td>
 <td> </td>
 <td>10</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>1</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aspartonian cezu</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>125</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAPTA</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>12</td>
 </tr>
<tr>
<td>Glukoza</td>
<td>10</td>
<td>10</td>
<td>10</td>
<td>-</td>
</tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Roztwory do rejestracji prądów CARC w konfiguracji whole-cell.
Wszystkie odczynniki chemiczne zostały zakupione od firmy Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
<ol start="3">
 <li>Wyznacz potencjały złącza cieczowego (LJ) pomiędzy roztworem w pipecie patch a każdym z roztworów kąpieli 10Zapisz wartość LJ w odpowiednim miejscu za pomocą oprogramowania do akwizycji. Na przykład w programie Pulse wprowadź wartość LJ do pola sterowania „LJ” w oknie „Amplifier”.</li>
 <li>Przed rozpoczęciem eksperymentów skonfiguruj i zapisz protokoły stymulacji, zgodnie z rysunkiem 1, w odpowiednim miejscu w oprogramowaniu akwizycyjnym. W programie Pulse protokół akwizycji ustawiamy w oknie „Pulse Generation”. <img src="/files/ftp_upload/2346/2364fig1.jpg" alt="Schemat metody clampowania napięcia (voltage-clamp) przedstawiający skoki potencjału błonowego do wartości -120 mV, 30 mV i 100 mV." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rycina 1. Protokół stymulacji. Przykładany jest rampowy skok napięcia od -120 do +10 mV o czasie trwania 50 ms w odstępach od 0,2 do 2 s (5 – 0,5 Hz). Potencjał spoczynkowy (Vh) pomiędzy rampami utrzymuje się na poziomie +30 mV.</li>
</ol>
5. Umieszczanie komórek na stoliku mikroskopu
<ol>
 <li>Pokryj komory rejestracyjne poli-L-lizyną przez ok. 20 min, a następnie przemyć H2a następnie zbalansowanym roztworem soli Hanksa (HBSS) przed wysianiem komórek.</li>
<li>Płytka 	500 μL zawiesiny komórkowej zawierającej 0,2-0,5 x106 komórki do komory i inkubować przez 20 min w temperaturze 37° C.</li>
<li>Ustabilizuj komorę pomiarową z przytwierdzonymi komórkami w uchwycie do komory. Stosujemy wykonany na zamówienie uchwyt, w którym podstawa podtrzymuje dno szkiełka nakrywki, a część górna delikatnie dociska jej górną powierzchnię. </li>
<li>Umieść uchwyt komory na stole mikroskopu odwróconego.</li>
<li>Ustaw ostrość na komórki w świetle przechodzącym. Używamy obiektywu imersyjnego 40X.</li>
<li>Umieść elektrodę odniesienia Ag/AgCl w kąpieli.</li>
<li>Wyrównaj wielokanałowy system perfuzyjny sterowany grawitacyjnie. Końcówkę rurki dopływowej należy umieścić w 45° pod kątem do szkiełka nakrywki, blisko pola widzenia.</li>
<li>Ustaw rurkę ssącą naprzeciwko końcówki rurki dopływowej.</li>
<li>Przepłucz komorę solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) lub HBSS, aby usunąć pożywkę do hodowli komórkowej oraz słabo przytwierdzone komórki. </li>
</ol>
6. Rejestracja prądów kanałów CRAC
<ol>
 <li>Należy znaleźć komórkę, która jest mocno przytwierdzona do szkiełka nakrywkowe. Zazwyczaj wybieramy komórkę o średniej wielkości i okrągłym kształcie, z gładką powierzchnią zewnętrzną. </li>
 <li>Przeperfunduj komorę rejestracyjną roztworem Ca2+-wolny, 3 mM Mg2+-zawierający roztwór kąpieli nr 1 (Tabela 1) zawierający 0,5-1 μM tapsygargin przez 8–10 min w celu zablokowania pompy SERCA. Ten krok wykonujemy, aby opróżnić zapasy przed utworzeniem gigauszczelnienia (gigaseal). </li>
 <li>Używając mikroloadera Eppendorf oraz pipety wyporowej P-20, należy napełnić pipetę do patch-clampingu roztworem do pipety (Tabela 1), a następnie umieścić pipetę w uchwycie pipety na głowicy wzmacniacza. Ca2+ chelator BAPTA został dodany do roztworu w pipecie w celu pasywnego opróżnienia zapasów oraz zmniejszenia poziomu Ca2+2+zależna od [ukryta wartość] inaktywacja kanałów CRAC.</li>
 <li>Przyłożymy niewielkie dodatnie ciśnienie (~3 cale słupa wody)2O) wewnątrz pipety patch przed wprowadzeniem do kąpieli. Używamy wykonanego na zamówienie urządzenia do wytwarzania ciśnienia i podciśnienia, podłączonego do linii sprężonego powietrza i próżni, w celu wytworzenia ciśnienia dodatniego lub ujemnego wewnątrz pipety patch. </li>
 <li>Zanurz pipetę do patch-clamp w kąpieli, kontrolując proces wizualnie za pomocą mikroskopu. W oknie „Oscilloscope” powinien pojawić się prąd płynący przez pipetę. Skokowa zmiana amplitudy prądu powinna zostać wywołana przez impuls napięcia o małej amplitudzie (impuls testowy) podany za pomocą zdefiniowanego makra. W tym momencie należy wyznaczyć wartość oporności pipety. Oporność naszych pipet wynosi zazwyczaj 5–6 MΩ.</li>
 <li>Skoryguj potencjał „offsetowy” powstający między pipetą a elektrodą odniesienia.</li>
 <li>Pod kontrolą wizualną za pomocą mikroskopu zbliżyć końcówkę pipety do komórki, aż do momentu zetknięcia się z błoną komórkową.</li>
 <li>Przyłożyć podciśnienie (20-40 cali słupa wody)2O) wewnątrz pipety patch. </li>
 <li>Monitoruj tworzenie się giga-uszczelnienia (gigaseal) w oknie „oscyloskopu”. Zauważysz, że amplituda prądu indukowanego przez impuls testowy maleje, a wartość oporności pipety wzrasta do &gt;5 GΩ. Zazwyczaj gigaseal tworzy się w ciągu kilku sekund, jednak osiągnięcie stabilnego gigasealu może zająć od 1 do 2 minut.</li>
 <li>Skompensuj pojemność pipety („C-Fast”). </li>
 <li>Przerwij błonę patchową, przykładając dodatnie podciśnienie za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml.</li>
 <li>Ustaw potencjał holdingowy na +30 mV. Dodatni potencjał holdingowy pomaga zapobiegać zależnej od wapnia inaktywacji kanałów CRAC.</li>
 <li>Skompensuj pojemność błony komórkowej („C-slow”); zapisz lub odnotuj wartość C-slow. </li>
 <li>Sprawdź wartość rezystancji dostępowej „R”s. W naszych eksperymentach Rs wynosi zazwyczaj 7-20 MΩ.</li>
 <li>Rozpocząć aplikację serii ramp napięcia o częstotliwości 0,5 Hz (Ryc. 1) w roztworze Ca2+-wolny 3 mM Mg2+-zawierający roztwór kąpieli nr 1. W tym roztworze prąd CRAC jest pomijalnie mały w porównaniu z prądem „wycieku” ze względu na niską przepuszczalność kanałów CRAC dla Mg2+Zapisz i wykorzystaj aktualne ślady zarejestrowane w roztworze kąpieli nr 1 w przyszłych analizach jako prądy „wycieku” (leak currents). Bezwzględna amplituda prądu „wycieku” przy -10 mV powinna być mniejsza lub równa 5 pA. Jeśli komórka wykazuje „wyciek”, przerwij eksperyment i rozpocznij go ponownie, używając nowej pipety do patch-clampu i nowej komórki.</li>
 <li>Aby zarejestrować Ca2+2+ prąd przez kanały CRAC (ICa-CRAC), zastąp Ca2+pozbawiony Mg, 3 mM Mg2+roztwór kąpielowy nr 1 zawierający 20 mM Ca2+roztwór kąpieli nr 2 (Tabela 1) poprzez przełączenie zaworów perfuzyjnych. Pozwala to na Ca2+ przepływać przez kanały CRAC i generować prąd wewnątrzkomórkowy. W oknie „Oscilloscope” będzie widoczny rozwój wewnątrzprostującego prądu ICa-CRAC (Rycina 2). Amplituda prądu przy ujemnych napięciach będzie nadal wzrastać przez około 1 min z powodu Ca2+zależna od [czynnika] potencjalizacja prądu CRAC.</li>
 <li>Zwiększyć częstotliwość stymulacji rampami napięcia do 5 Hz, co jest niezbędne do zapisu przejściowego prądu Na++ prąd przez kanały CRAC.</li>
 <li>Zastąp 20 mM Ca2+roztwór do kąpieli nr 2 zawierający Na+-zawierającego roztworu nr 3 pozbawionego kationów dwuwartościowych (Tabela 1) poprzez przełączenie zaworów perfuzyjnych. W oknie „Oscyloskop” pojawi się przejściowy wzrost amplitudy prądu Na wewnątrznieprostującego+ prąd przepływający przez kanały CRAC (INa-CRAC; Rysunek 2).</li>
 <li>Można zastosować 20 mM Ca2+roztwór kąpieli nr 2 zawierający 1-5 μM La3+ na koniec eksperymentu w celu zarejestrowania prądu „upływu”. Nie uznaliśmy jednak tego podejścia za przydatne, ponieważ prąd „upływu” zmienia się w czasie i pod koniec eksperymentu może stać się większy lub mniejszy. Wolimy przyjąć wartość prądu zarejestrowaną w Ca2+wolny od 3 mM Mg2+roztwór kąpieli nr 1 zawierający [substancję] na początku eksperymentu jako prąd „upływu”.</li>
 <li>Zapisz zarejestrowane przebiegi prądowe do dalszej analizy.</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
 <li>Wczytaj zapisane rekordy prądowe do oprogramowania analitycznego. Do analizy wykorzystujemy program Pulse.</li>
 <li>Zmierz amplitudy prądu na początku i na końcu ramp napięciowych. Zazwyczaj mierzymy amplitudy prądu przy -10 mV oraz +100 mV, używając par kursorów w oknie „Oscilloscope” programu Pulse.</li>
 <li>Wyeksportuj wartości amplitud prądu do programu graficznego w celu dalszej analizy i prezentacji graficznej. Wykorzystujemy oprogramowanie Origin Scientific Graphing and Analysis Software w wersji 7.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2346/2346fig2.jpg" alt="Schematy eksperymentów elektrofizjologicznych przedstawiające analizę prądu jonowego (I) w funkcji napięcia błony (Vm)." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Prądy CRAC w spoczewającej ludzkiej limfocycie T. (A), przebieg czasowy prądów CRAC zarejestrowanych w konfiguracji voltage-clamp whole-cell przy -10 mV (zamalowane kółka) i +100 mV (puste kółka). Przed utworzeniem gigauszczelnienia (gigaseal) komórkę inkubowano wstępnie przez ok. 10 min w Ca2+wolny od 3 mM Mg2+roztwór kąpieli nr 1 zawierający 0.5 μM thapsygargin. Po okresie adaptacji kolejno stosowano następujące roztwory kąpielowe: Ca2+wolny od 3 mM Mg2+roztwór kąpielowy nr 1 zawierający (0 Ca + 3 Mg), a następnie 20 mM Ca2+-zawierający roztwór kąpielowy nr 2 (20 Ca), następnie roztwór kąpielowy nr 3 pozbawiony kationów dwuwartościowych (DVF), a następnie roztwór kąpielowy nr 2 (20 Ca). Komórkę stymulowano serią ramp napięciowych, zgodnie z rysunkiem 1. Częstotliwość ramp wynosiła 5 Hz w roztworze kąpielowym nr 3 (DVF) oraz 0,5 Hz we wszystkich pozostałych roztworach. Należy zwrócić uwagę na powolny rozwój prądu ICa-CRAC po zastosowaniu 20 mM Ca2+-zawierający roztwór kąpieli nr 2 oraz szybki, przejściowy rozwój INa-CRAC w roztworze kąpieli DVF nr 3. (B), reprezentatywne zapisy prądów zarejestrowane podczas ramp napięciowych w Ca2+-wolny 3 mM Mg2+roztwór kąpielowy nr 1 („wyciek”) zawierający 20 mM Ca2+zawierający roztwór kąpielowy nr 2 (20 Ca) oraz roztwór kąpielowy nr 3 (DVF). (C, D), zależności prądowo-napięciowe ICa-CRAC (C) i jaNa-CRAC (D) uzyskane poprzez odjęcie prądu „upływu” od prądów zarejestrowanych podczas ramp napięciowych w 20 mM Ca2+- zawierający roztwór kąpielowy nr 2 (20 Ca) oraz roztwór kąpielowy nr 3 (DVF) przedstawione na panelu (B).

<ol><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRAC+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CRAC channelopathies.</a> Pflugers Arch. , (2010).</li>
<li>Lewis, R. S., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2%2B+and+transmembrane+Ca2%2B+current+in+human+leukemic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current+%28ICRAC%29+due+to+local+calcium+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback.</a> J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium-dependent+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current.+Store-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms.</a> J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+potentiation+of+store-operated+calcium+channels+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+currents+through+store-operated+CRAC+channels+and+Mg2%2B-inhibited+cation+%28MIC%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels.</a> J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).</li>
<li>Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+channel+properties+and+regulated+expression+of+Ca%282%2B%29+release-activated+Ca%282%2B%29+%28CRAC%29+channels+in+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells.</a> J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Elektrofizjologiczne badanie prądów CRAC w spoczynkowych limfocytach T człowieka jest trudnym zadaniem, ponieważ amplituda endogennego prądu CRAC w tych komórkach jest niewielka ze względu na ich mały rozmiar (średnica spoczynkowego limfocytu T człowieka mieści się w zakresie 5-8 μm). W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółową procedurę niezawodnej rejestracji prądów CRAC w spoczynkowych limfocytach T człowieka wyizolowanych z mononuklearnych komórek krwi obwodowej. Technologia ta pozwala na badanie fizjologii i ...

<table><tbody><tr><td>Koktajl do wzbogacania ludzkich limfocytów T RosetteSep</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>Medium gęstościowe RosetteSep</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>15705</td><td></td></tr><tr><td>pożywka RPMI-1640 z glutaminą/HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>Płódcowa surowica cielęca</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (roztwór 100X)</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>roztwór witamin do medium RPMI 1640 (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7256</td><td></td></tr><tr><td>roztwór aminokwasów 1640 (50X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td></td></tr><tr><td>Pirowinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Inozytolotrifosforan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19766</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926</td><td></td></tr><tr><td>hydrobromian poli-L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek lantanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>262072</td><td></td></tr><tr><td>Tapsigargin</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania elastomeru silikonowego Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Powłoka ochronna do półprzewodników HIPEC R6101</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stół laboratoryjny do izolacji wibracji o wysokiej wydajności serii 63-500</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td>63-540</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz patch-clamp EPC 10 z przedwzmacniaczem głowicowym</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator </td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Olympus 1X71 z obiektywem imersyjnym 40x</td><td>Olympus Corporation</td><td>1X71</td><td></td></tr><tr><td>Komputer z systemem Windows</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Pulse</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do grafiki i analizy danych Origin Scientific</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wyciągarka pipet patch-clamp</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Szkło borokrzemianowe z włóknem (średnica zewnętrzna: 1,5 mm i średnica wewnętrzna: 1,10 mm)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Narashige&amp;rsquo;Microforge</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelki pierścieniowe silikonowe </td><td>McMaster-Carr</td><td>111 S70</td><td></td></tr><tr><td>Łaseczki 25 mm </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 mm 25CIR.-1</td><td></td></tr></tbody></table>

rejestracja w konfiguracji whole-cell prądów wapniowych aktywowanych przez uwalnianie wapnia (crac) w ludzkich limfocytach t

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

W limfocytach T wyczerpanie zapasów Ca2+ z wewnątrzkomórkowego magazynu Ca2+ prowadzi do aktywacji plazmalemmalnych kanałów Ca2+, nazywanych kanałami wapniowymi aktywowanymi przez uwalnianie wapnia (CRAC). Kanały CRAC odgrywają ważną rolę w regulacji proliferacji limfocytów T oraz ekspresji genów. Nieprawidłowe funkcjonowanie kanałów CRAC w limfocytach T wiąże się z ciężkim złożonym niedoborem odporności oraz chorobami autoimmunologicznymi 1, 2. Badanie funkcji kanałów CRAC w ludzkich limfocytach T może ujawnić nowe mechanizmy molekularne regulujące prawidłowe odpowiedzi immunologiczne i pomóc w zrozumieniu przyczyn powiązanych z nimi chorób ludzkich. Rejestracja elektrofizjologiczna prądów błonowych zapewnia najdokładniejszą ocenę funkcjonalnych właściwości kanałów oraz ich regulacji. Elektrofizjologiczna ocena prądów kanałów CRAC w komórkach T Jurkat, ludzkiej linii komórkowej białaczki T, została po raz pierwszy przeprowadzona ponad 20 lat temu 3, jednak pomiary prądów CRAC w normalnych ludzkich limfocytach T pozostają trudnym zadaniem. Trudności w rejestrowaniu prądów kanałów CRAC w normalnych limfocytach T wynikają z faktu, że limfocyty T pochodzące z krwi są znacznie mniejsze niż komórki T Jurkat, a w związku z tym endogenne prądy CRAC typu whole-cell mają bardzo niską amplitudę. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółową procedurę, której rutynowo używamy do rejestracji prądów Ca2+ lub Na+ przepływających przez kanały CRAC w spoczynkowych ludzkich limfocytach T wyizolowanych z krwi obwodowej zdrowych ochotników. Opisana tutaj metoda została zaadaptowana z procedur stosowanych do rejestracji prądów CRAC w komórkach T Jurkat oraz aktywowanych ludzkich limfocytach T 4-8.

Przedstawiamy szczegółowy protokół rejestracji prądów wapniowych aktywowanych uwalnianiem wapnia (CRAC) metodą patch clamp w konfiguracji whole-cell w ludzkich limfocytach T pochodzących z mononuklearnych komórek krwi obwodowej.

Rejestracja w konfiguracji whole-cell prądów wapniowych aktywowanych przez uwalnianie wapnia (CRAC) w ludzkich limfocytach T

W limfocytach T wyczerpanie zapasów Ca2+ z wewnątrzkomórkowego magazynu prowadzi do aktywacji kanałów Ca2+ w plazmalemmie, nazywanych wapniowymi kanałami aktywowanymi przez uwalnianie...

Kanały wapniowe aktywowane uwalnianiem wapnia (CRAC), zlokalizowane w błonie komórkowej, odgrywają istotną rolę w proliferacji limfocytów T oraz stymulacji ekspresji genów. Aktywacja receptorów limfocytów T przez antygen prowadzi do powstania wtórnego przekaźnika, trifosforanu inozytolu, i aktywacji uwalniania wapnia z magazynów za pośrednictwem receptorów trifosforanu inozytolu. Spadek stężenia wapnia w magazynach prowadzi do aktywacji kanałów CRAC i w konsekwencji do wzrostu stężenia wapnia w cytosolu. Nieprawidłowości w funkcjonowaniu kanałów CRAC w limfocytach T są powiązane z szeregiem chorób ludzi, w tym z ciężkimi złożonymi niedoborami odporności oraz chorobami autoimmunologicznymi.W niniejszym opracowaniu przedstawiono metodę umożliwiającą wiarygodną i powtarzalną rejestrację endogennych prądów kanałów wapniowych i sodowych aktywowanych przez spadek stężenia wapnia (crack channels) w ludzkich limfocytach T. W pierwszej kolejności podaje się FSA garin, bloker ATPase wapniowej siateczki sarkoplazmatyczno-endoplazmatycznej, w roztworze pozakomórkowym pozbawionym wapnia lub zawierającym 3 mM magnezu w celu wyczerpania zapasów.Procedura ta otwiera kanały pęknięć, ale nie indukuje prądu pęknięć ze względu na niską przepuszczalność tych kanałów dla magnezu. Następnie w błonie komórki T ustanawiane jest zaciskanie napięcia w całej komórce (whole cell voltage clamp). Komórka jest perfundowana roztworem pipetowym zawierającym wysoką koncentrację chelatora wapnia pta.Następnie sekwencyjnie stosuje się roztwory pozakomórkowe zawierające wapń lub pozbawione kationów dwuwartościowych, aby aktywować mierzalne prądy wapniowe i sodowe poprzez kanały crack. Otrzymane dane obrazują poziom funkcjonalnej ekspresji kanałów crack w spoczynkowych limfocytach T człowieka. Badanie prądów błonowych przepływających przez kanały crack może dostarczyć cennych informacji na temat regulacji i funkcji tych kanałów oraz pomóc w ustaleniu roli kanałów crack w prawidłowych odpowiedziach odpornościowych i chorobach immunologicznych.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na niewielki rozmiar ludzkich limfocytów T oraz niską amplitudę endogennych prądów pęknięcia w tych komórkach. Limfocyty T człowieka wykazujące ekspresję CD3 wykorzystane w tym doświadczeniu pobrano z próbki krwi obwodowej zdrowego ochotnika i wyizolowano przy użyciu zestawu do wzbogacania limfocytów T (TEP human T-cell enrichment cocktail) oraz medium gęstościowego TEP. Zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym protokole pisemnym, komórki hodowano w pożywce do hodowli limfocytów T w temperaturze 37°C w inkubatorze z CO2.Przygotować następujące roztwory: roztwór numer jeden zawierający 3 mM magnezu i bez wapnia, roztwór numer dwa zawierający 20 mM wapnia, roztwór numer trzy zawierający 10 mM chelatora wapnia EDTA i bez jonów dwuwartościowych oraz roztwór do pipetowania zawierający 12 mM chelatora wapnia BTA. Przechowywać roztwory w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia. W dniu eksperymentu wyciągnąć pipety o średnicy końcówki około 2 µm, używając kapilar szklanych i wyciągarki do pipet.Należy użyć rurek kwarcowych z włóknem o specyfikacji przedstawionej tutaj i wymienionej w towarzyszącym tekście. Po wyciągnięciu końcówki pipet są pokrywane półprzewodnikową powłoką ochronną PEC R 61 0 1 i polerowane ogniowo. Przechowywać je w miejscu chronionym przed kurzem, np. w uchwycie do pipet.Otwórz tutaj oprogramowanie sterujące wzmacniaczem patch-clamp. Wzmacniacz patch-clamp E PC 10 jest sterowany za pomocą oprogramowania Pulse. Skonfiguruj i zapisz ustawienia w makrach „cell” oraz „whole cell”, które są wykorzystywane do tworzenia giga-uszczelnienia (giga seal) i ustanawiania konfiguracji whole-cell.Następnie w oprogramowaniu akwizycyjnym skonfiguruj i zapisz tutaj protokół stymulacji do rejestracji prądów szczelinowych. Protokół akwizycji w oknie generowania impulsów jest ustawiony jako rampa napięcia od -120 do +100 mV o czasie trwania 50 ms.Stwórz dwa protokoły stymulacji z częstotliwościami stymulacji rampowej wynoszącymi 0,5 hertz oraz pięć hertz i zapisz je w oknie generowania impulsów odpowiednio pod nazwami ramp one i ramp two. Aby przygotować komórki do rejestracji, nanieś 500 microliters zawiesiny komórkowej zawierającej od 0,2 do 0,5 miliona komórek na komorę rejestracyjną składającą się z szkiełka nakrywkowego pokrytego poli-L-lizyną z przymocowanym silikonowym pierścieniem O-ring. Inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 degrees Celsius.Po inkubacji umieść komorę rejestracyjną w uchwycie komory. W tym przypadku zastosowano wykonany na zamówienie uchwyt, w którym część dolna podtrzymuje szkiełko nakrywki na dnie komory, a część górna dociska górną powierzchnię szkiełka nakrywki. Umieść uchwyt komory na stoliku mikroskopu odwróconego, korzystając z obiektywu imersyjnego 40 x i oświetlenia w polu jasnym.Znaleźć pole komórek i ustawić ostrość. Umieścić elektrodę odniesienia srebrowo-chlorkową w kąpieli. Następnie ustawić wielokanałowy grawitacyjny system perfuzyjny, umieszczając końcówkę rurki doprowadzającej pod kątem 45 stopni do szkiełka nakrywki w pobliżu pola widzenia; rurkę ssącą należy wprowadzić do górnej części uchwytu komory.Obracać górną część uchwytu komory, aż rurka ssąca znajdzie się naprzeciwko rurki dopływowej, aby zapewnić prawidłowy przepływ w kanale. Rejestrację prądów rozpoczyna się od otwarcia zaworu w systemie perfuzyjnym w celu przepłukania komory rejestracyjnej roztworem bat nr 1, pozbawionym wapnia i zawierającym 3 mM magnezu, z dodatkiem 0,5-1 µM AP argon przez 8-10 minut w celu zablokowania pompy CIRCA.Ten etap wyczerpuje zapasy wapnia. Następnie należy użyć mikroladera einor z pipetą wyporową powietrzną P 20. Aby napełnić pipetę roztworem do pipetowania, należy umieścić pipetę w uchwycie na głowicy wzmacniacza w tym miejscu.Specjalnie wykonane urządzenie do ssania ciśnieniowego jest podłączone do sprężonego powietrza oraz linii próżniowych. Aby wytworzyć nadciśnienie lub podciśnienie w pipecie do patch-clampu, należy przyłożyć niewielkie nadciśnienie o wartości około trzech cali słupa wody wewnątrz pipety, łącząc ją z wylotem urządzenia do ssania za pomocą rurki łączącej. Kliknij klawisz sterowania konfiguracją (setup control) w oknie EPC 10 patch clamp na ekranie komputera.Aby wykonać makro konfiguracji, należy znaleźć komórkę o okrągłym kształcie i przeciętnej wielkości, z gładką zewnętrzną powierzchnią, która jest ściśle przylegająca do szkiełka nakrywki. Następnie należy opuścić elektrodę patch do kąpieli pod kontrolą wizualną za pomocą mikroskopu w oknie oscyloskopu.Przepływ prądu przez pipetę można obserwować po zanurzeniu pipety w roztworze kąpieli. Skokowa zmiana amplitudy prądu jest wywoływana przez pięciomilisekundowy impuls testowy napięcia, przyłożony do pipety za pomocą makra konfiguracyjnego. Oprogramowanie impulsu automatycznie oblicza oporność pipety i wyświetla ją w oknie oporności błony.Na ekranie komputera rezystancja pipety wynosi zazwyczaj od pięciu do sześciu megaomów. Kliknij klawisz auto control w oknie wzmacniacza na ekranie komputera, aby skorygować potencjał offsetowy powstały między pipetą a elektrodą odniesienia. Prąd bazowy przesunie się do poziomu zerowego.Używając mikromanipulatora, zbliż końcówkę pipety tak, aby dotknęła błony komórkowej. Po nawiązaniu kontaktu nastąpi spadek amplitudy prądu wywołanego impulsem testowym. Przyłóż do pipety patch podciśnienie o wartości od 20 do 40 cali słupa wody.Monitoruj tworzenie się giga seal w oknie oscyloskopu. Amplituda prądu wywołanego impulsem testowym powinna stopniowo maleć w miarę wzrostu oporności pipety do wartości powyżej pięciu giga ohm. Zazwyczaj kontakt giga seal tworzy się szybko, jednak uzyskanie stabilnego giga seal może zająć od jednej do dwóch minut.Po uzyskaniu giga-uszczelnienia (giga seal), odłącz uchwyt pipety od urządzenia do ssania ciśnieniowego, wyjmując rurkę łączącą z wylotu. Kliknij klawisz sterowania onsell na ekranie komputera, aby uruchomić makro onsell, które zostało ustawione przed eksperymentem. Zgodnie z instrukcją EPC 10, skompensuj pojemność pipety, klikając klawisz auto control w oknie cfat.W oknie oscyloskopu zniknie przejściowy prąd, a w oknie cfat pojawi się wartość pojemności pipety. Aby przerwać błonę komórkową wewnątrz pipety, należy połączyć pipetę za pomocą rurki łączącej ze strzykawką o objętości 20 cm³ i cofnąć tłok, aby przyłożyć do pipety dodatkowe podciśnienie. W momencie przerwania błony komórkowej wewnątrz pipety pojawią się dwa przejścia prądowe, ładujące błonę komórkową do nowego poziomu napięcia. Kliknij klawisz sterowania whole cell na ekranie komputera, aby uruchomić zdefiniowane wcześniej makro whole cell.Następnie w oknie V membrane należy ustawić potencjał spoczynkowy na +30 mV; dodatni potencjał spoczynkowy pomaga zapobiec aktywacji kanałów typu crack zależnych od wapnia. Następnie należy kliknąć klawisz auto control w oknie C slow. Po skompensowaniu pojemności komórki w oknie oscyloskopu przejściowy skok prądu zniknie.Wartości pojemności komórki oraz rezystancji szeregowej pojawią się odpowiednio w oknach C slow i R series. Rezystancja szeregowa mieści się zazwyczaj w zakresie od 7 do 20 mega. Wartości C slow, odpowiadające wartościom pojemności komórki, mieszczą się zazwyczaj w zakresie od 1,5 do 2,5 pico fer.W spoczynkowych ludzkich limfocytach T kliknij klawisz sterujący rampą w oknie oscyloskopu, aby zastosować serię ramp napięcia o częstotliwości 0.5 hertz. Spowoduje to wykonanie protokołu stymulacji wygenerowanego i zapisanego w oknie oscyloskopu przed rozpoczęciem eksperymentu. Wyświetlone zostaną prądy wywołane rampami napięcia. Zarejestruj.Niniejsze zapisy prądowe w roztworze nr 1 pozbawionym wapnia, zawierającym 3 mM magnezu. W tym roztworze prąd CRAC jest bardzo mały ze względu na niską przepuszczalność kanałów CRAC dla magnezu. Należy wykorzystać te zapisy w dalszych analizach jako prądy przecieku.Bezwzględna amplituda prądu przecieku przy -100 mV powinna być równa lub mniejsza niż 5 pA. Jeśli komórka wykazuje przecieki, należy przerwać eksperyment i rozpocząć go ponownie, używając nowej pipety patch i nowej komórki.Aby zarejestrować prąd wapniowy przepływający przez kanały CRAC, należy przełączyć zawory perfuzyjne, aby zastąpić roztwór kąpieli nr 1 roztworem kąpieli nr 2 zawierającym 20 mM wapnia. Umożliwia to przepływ jonów wapnia przez kanały CRAC i generowanie prądu wewnątrzkomórkowego w oknie oscyloskopu. Wewnętrznie prostujący prąd wapniowy przez kanały CRAC rozwija amplitudę prądu przy ujemnych napięciach, która następnie zwiększa się przez około jedną minutę ze względu na zależne od wapnia potęgowanie prądu CRAC.Kliknij klawisz sterujący rampą dwa w oknie oscyloskopu, aby wykonać zaprogramowany protokół stymulacji, który zmienia częstotliwość stymulacji za pomocą ramp napięcia; zwiększenie częstotliwości stymulacji do 5 Hz pomaga zarejestrować maksymalny prąd sodowy przepływający przez kanały CRAC, który ma charakter przejściowy. Następnie ponownie przełącz zawory perfuzyjne, aby zastąpić roztwór kąpieli numer dwa roztworem numer trzy, zawierającym sód i pozbawionym kationów dwuwartościowych, w oknie oscyloskopu. Rozwinie się przejściowy prąd sodowy o większej amplitudzie, prostujący do wewnątrz, przepływający przez kanały CRAC.Po zakończeniu eksperymentu zamknij plik; zapisze on zarejestrowane przebiegi prądu do dalszej analizy. Aby przeanalizować dane, zaimportuj zapisane rekordy prądu do oprogramowania analitycznego. W tym przypadku do analizy wykorzystano oprogramowanie Pulse, używając par kursorów w oknie oscyloskopu programu Pulse. Zmierz amplitudy prądu na początku i na końcu ramp napięciowych.Amplitudy prądów mierzy się przy napięciu minus 100 millivolts oraz plus 100 millivolts. Wyeksportuj wartości amplitud prądów do programu graficznego, takiego jak oprogramowanie Origin scientific graphing and analysis. W celu przeprowadzenia dalszej analizy i prezentacji graficznej, prądy crack mierzono w komórkach T CD3+ w stanie spoczynku, pobranych od zdrowego człowieka, przy użyciu opisanej tutaj metody; rysunek ten przedstawia przebieg czasowy prądów crack zarejestrowanych w konfiguracji voltage clamp whole cell przy napięciu minus 100 millivolts (oznaczonym wypełnionymi kółkami) oraz plus 100 millivolts (oznaczonym pustymi kółkami).Przed utworzeniem gigauszczelnienia komórkę inkubowano wstępnie przez około 10 minut w bezwapniowym roztworze kąpieli nr 1 zawierającym 3 mM magnezu oraz 0,5 µM orthogon. Po przełamaniu oporu membrany roztwory kąpieli stosowano sekwencyjnie w następującej kolejności: bezwapniowy roztwór kąpieli nr 1 zawierający 3 mM magnezu, następnie roztwór kąpieli nr 2 zawierający 20 mM wapnia, potem roztwór kąpieli nr 3 wolny od kationów dwuwartościowych, a na koniec ponownie roztwór kąpieli nr 2 zawierający 20 mM wapnia. Komórkę stymulowano serią ramp napięciowych od -120 mV do +100 mV, jak pokazano tutaj.Rampy napięcia stosowano co 200 milisekund lub z częstotliwością pięciu herców w roztworze BAT nr 3 pozbawionym kationów dwuwartościowych oraz co dwie sekundy lub z częstotliwością 0,5 herca we wszystkich pozostałych roztworach. Zwróć uwagę na powolny rozwój prądu wapniowego poprzez kanały CRAC po zastosowaniu roztworu BAT nr 2 zawierającego 20 milimoli wapnia oraz szybki, przejściowy rozwój prądu sodowego poprzez kanały CRAC w roztworze BAT nr 3 pozbawionym kationów dwuwartościowych. Ta rycina przedstawia reprezentatywne przebiegi prądów zarejestrowane podczas ramp napięcia w warunkach braku wapnia.Roztwór kąpielowy nr 1 zawierający 3 mM magnezu, roztwór kąpielowy nr 2 zawierający 20 mM wapnia oraz roztwór kąpielowy nr 3 pozbawiony kationów dwudodatnich. Przebiegi prądów wapniowych i sodowych podczas poszczególnych ramp napięciowych można uzyskać poprzez odjęcie prądów zarejestrowanych w roztworze kąpielowym nr 1 (3 mM magnezu, bez wapnia) od prądów zarejestrowanych w roztworze kąpielowym nr 2 (20 mM wapnia) oraz w roztworze kąpielowym nr 3 (pozbawionym kationów dwudodatnich). Tutaj widoczne są uzyskane przebiegi prądów wykazujące zależności prądowo-napięciowe typowe dla prądów wapniowych i sodowych przechodzących przez kanały CRAC.Po opanowaniu tej techniki i prawidłowym przeprowadzeniu wszystkich etapów procedury, można rejestrować prądy kanałów potasowych z pięciu do 10 komórek dziennie. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób rejestracji prądu spoczynkowego w ludzkich limfocytach T. Postępując zgodnie z tą procedurą, będą Państwo w stanie rejestrować prądy w innych komórkach układu odpornościowego, takich jak aktywowane ludzkie limfocyty T, monocyty, makrofagi, a także w liniach komórkowych.Elektrofizjologia.Rejestracja prądów kanałów szczelinowych w komórkach układu odpornościowego może pozwolić badaczom na ustalenie ich roli w homeostazie wapnia w komórkach odpornościowych.

whole-cell-recording-calcium-release-activated-calcium-crac-currents

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rejestracja całego kalifa prądów aktywowanych uwalnianiem wapnia (CRAC) w ludzkich limfocytach T

Ten film analizuje indukowany przez receptory limfocytów T napływ wapnia do komórek T. Przeciwciała anty-CD3 aktywują szlaki sygnałowe limfocytów T, co prowadzi do wzrostu wewnątrzkomórkowych jonów wapnia, które wiążą się z barwnikiem Indo-1. W cytometrii przepływowej przesunięcie widma ze stanu wolnego od wapnia do stanu związanego z wapniem koreluje z napływem wapnia wywołanym przez receptor komórek T.

Ocena napływu wapnia indukowanego przez receptor limfocytów T za pomocą barwnika wskaźnikowego wapnia

Opisujemy izolację ludzkich miocytów przedsionkowych, które mogą być używane do wewnątrzkomórkowych pomiarów Ca2+ w połączeniu z elektrofizjologicznymi badaniami patch-clamp.

Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądów błonowych

Wapń bierze udział w licznych fizjologicznych i patofizjologicznych szlakach sygnałowych. Obrazowanie żywych komórek wymaga specjalistycznego sprzętu i może być czasochłonne. Zoptymalizowano szybką, prostą metodę wykorzystującą cytometr przepływowy do określenia względnych zmian wapnia cytozolowego w przylegających komórkach nabłonka wprowadzonych do zawiesiny.

Cytozolowe pomiary wapnia w komórkach nabłonka nerek za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy test wysokiej wydajności chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (HPLC-MS/MS) do ilościowego oznaczania immunosupresyjnego takrolimusu w wysuszonych plamach krwi przy użyciu prostego ręcznego etapu wytrącania białka i ekstrakcji kolumnowej online.

Oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Tutaj opisane są metody używane do badania funkcjonalnego efektu mutacji RYR1 endogennie wyrażanych w wirusie Epsteina-Barra, unieśmiertelnionych ludzkich limfocytach B oraz komórkach satelitarnych pochodzących z biopsji mięśni, zróżnicowanych w miotuby.

Charakterystyka funkcjonalna endogennych wariantów ludzkiego RYR1

Napływ wapnia, miara sygnalizacji limfocytów T, jest skutecznym sposobem analizy reakcji na stymulację receptorów limfocytów T. Ten protokół multipleksowania Indo-1 z panelami przeciwciał skierowanymi na cząsteczki powierzchniowe komórki wykorzystuje wysoce elastyczne możliwości cytometrii przepływowej w pełnym spektrum.

Analiza indukowanego przez receptor limfocytów T napływu wapnia w pierwotnych mysich limfocytach T za pomocą cytometrii przepływowej pełnego spektrum

Tutaj udostępniamy kompleksowy protokół do rozwiązywania początkowych lokalnych sygnałów Ca2+, znanych jako mikrodomeny Ca2+, w pierwotnych mysich i ludzkich limfocytach T za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten służy jako cenne źródło informacji dla naukowców badających szlaki sygnałowe Ca2+ w komórkach odpornościowych i do dalszego odkrywania ich funkcji.

Obrazowanie początkowych mikrodomen Ca2+ w pierwotnych limfocytach T

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Poznaj metodę całokomórkowego zapisu prądów CRAC w ludzkich limfocytach T przy użyciu techniki patch clamp. Protokół ten umożliwia niezawodne pomiary aktywności kanałów wapniowych kluczowych dla aktywacji komórek T.

Rejestracja w konfiguracji whole-cell prądów wapniowych aktywowanych przez uwalnianie wapnia (CRAC) w ludzkich limfocytach T

Przeglądaj więcej filmów