Name: Zapis całokomórkowy prądów wapnia aktywowanego uwalnianiem wapnia (CRAC) w ludzkich limfocytach T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Poznaj metodę całokomórkowego zapisu prądów CRAC w ludzkich limfocytach T przy użyciu techniki patch clamp. Protokół ten umożliwia niezawodne pomiary aktywności kanałów wapniowych kluczowych dla aktywacji komórek T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Katedrze Fizjologii i Biologii Błon komórkowych Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis za udostępnienie zaplecza oraz zapewnienie doskonałych warunków do prowadzenia badań nad kanałami jonowymi.

1. Przygotowanie spoczynkowych limfocytów T człowieka
<ol>
 <li>Używając zestawu RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail oraz medium RosetteSep Density Medium, oczyść limfocyty T z próbek ludzkiej krwi zgodnie z instrukcjami producenta. Uzyskana populacja komórek powinna zawierać 95% spoczynkowych limfocytów T CD3+. Limfocyty T izolujemy z próbek krwi obwodowej pobranych od zdrowych ochotników zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Internal Review Board UC Davis.</li>
 <li>Po izolacji resuspenduj spoczynkowe limfocyty T do gęstości 0,5 x 106 komórek/mL w medium do hodowli komórkowej zawierającym medium RPMI-1640 z glutaminą i HEPES, uzupełnione o 10% płodowej łydki serum, 2% GlutaMAX-I, 1% roztwór witamin RPMI 1640, 1% roztwór aminokwasów RPMI 1640, 1% pirogronianu sodu oraz 0,03% β-merkaptoetanolu.</li>
 <li>Przenieś zawiesinę komórkową do kolb hodowlanych i inkubuj w temperaturze 37°C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 do 24 h przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komory rejestracyjnej
<ol>
 <li>Do przygotowania komór rejestracyjnych potrzebne są: a) silikonowe pierścienie O-ring, b) okrągłe, 25-mm szkiełka nakrywki oczyszczone 70% etanolem i destylowaną H2O, c) zmieszany Sylgard184, przygotowany zgodnie z instrukcją producenta, oraz d) dwie płytki Petriego o wymiarach 60 x 15 mm.</li>
 <li>Do płytki Petriego 60x15 mm wlać ~0.5 mL zmieszanego Sylgard184.</li>
 <li>Za pomocą pęsety zanurzyć dolną część pierścienia O-ring w Sylgard184.</li>
 <li>Nadmiar Sylgard184 usunąć z krawędzi pierścienia O-ring, kładąc go na czystej powierzchni, np. na drugiej płytce Petriego.</li>
 <li>Umieścić pierścień na szkiełku nakrywce i docisnąć go.</li>
 <li>Utwardzić Sylgard184, ogrzewając komory w temperaturze 85° C przez 40-60 min lub do czasu polimeryzacji Sylgard184.</li>
 <li>Przechowywać komory rejestracyjne w pojemniku chroniącym przed kurzem.</li>
</ol>
3. Przygotowanie pipet do patch-clamp
<ol>
 <li>W dniu eksperymentu wyciągnij pipety o średnicy końcówki ~2-μm, wykorzystując kapilary szklane i wyciągarkę do pipet. Stosujemy rurki borokrzemowe z włóknem (średnica zewnętrzna: 1.5 mm i średnica wewnętrzna: 1.10 mm). Przechowuj pipety w miejscu wolnym od kurzu.</li>
 <li>Pokryj końcówki pipet preparatem Sylgard184 lub powłoką ochronną półprzewodników HIPEC R6101 zgodnie ze standardową procedurą 9.</li>
 <li>Przed rozpoczęciem eksperymentu delikatnie wypoleruj końcówki pipet metodą wypalania.</li>
</ol>
4. Przygotowanie zestawu do patch clamp
<ol>
 <li>Skonfiguruj i zapisz makra dla tworzenia gigaseala w oprogramowaniu sterującym wzmacniaczem patch-clamp. W naszych badaniach wykorzystujemy wzmacniacz EPC-10 obsługiwany przez system Windows XP oraz oprogramowanie Pulse do akwizycji danych. Makra „set-up”, „on-cell” oraz „whole-cell” ustawiamy zgodnie z instrukcją obsługi EPC-10 i stosujemy we wszystkich eksperymentach.</li>
 <li>Przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj roztwory do kąpieli oraz roztwory do pipet wymienione w Tabeli 1 i przechowuj je w temperaturze 4° C przez maksymalnie 1 tydzień.</li>
</ol>
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Odczynniki chemiczne</td>
 <td colspan="3">Roztwory kąpieli (mM)</td>
 <td>Odmiar rozwiąry (mM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td># 1</td>
 <td># 2</td>
 <td># 3</td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
 <tbody>
 <tr>
 <td>CH3SO3Na</td>
 <td>130</td>
 <td>110</td>
 <td>125</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>2</td>
 <td>4</td>
 <td>5</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ca(OH)22</td>
 <td>-</td>
 <td>20</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2</td>
 <td>3</td>
 <td>1</td>
 <td>-</td>
 <td>5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO₄4</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEDTA</td>
 <td>-</td>
 <td> </td>
 <td>10</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>1</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aspartonian cezu</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>125</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAPTA</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>12</td>
 </tr>
<tr>
<td>Glukoza</td>
<td>10</td>
<td>10</td>
<td>10</td>
<td>-</td>
</tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Roztwory do rejestracji prądów CARC w konfiguracji whole-cell.
Wszystkie odczynniki chemiczne zostały zakupione od firmy Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
<ol start="3">
 <li>Wyznacz potencjały złącza cieczowego (LJ) pomiędzy roztworem w pipecie patch a każdym z roztworów kąpieli 10Zapisz wartość LJ w odpowiednim miejscu za pomocą oprogramowania do akwizycji. Na przykład w programie Pulse wprowadź wartość LJ do pola sterowania „LJ” w oknie „Amplifier”.</li>
 <li>Przed rozpoczęciem eksperymentów skonfiguruj i zapisz protokoły stymulacji, zgodnie z rysunkiem 1, w odpowiednim miejscu w oprogramowaniu akwizycyjnym. W programie Pulse protokół akwizycji ustawiamy w oknie „Pulse Generation”. <img src="/files/ftp_upload/2346/2364fig1.jpg" alt="Schemat metody clampowania napięcia (voltage-clamp) przedstawiający skoki potencjału błonowego do wartości -120 mV, 30 mV i 100 mV." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rycina 1. Protokół stymulacji. Przykładany jest rampowy skok napięcia od -120 do +10 mV o czasie trwania 50 ms w odstępach od 0,2 do 2 s (5 – 0,5 Hz). Potencjał spoczynkowy (Vh) pomiędzy rampami utrzymuje się na poziomie +30 mV.</li>
</ol>
5. Umieszczanie komórek na stoliku mikroskopu
<ol>
 <li>Pokryj komory rejestracyjne poli-L-lizyną przez ok. 20 min, a następnie przemyć H2a następnie zbalansowanym roztworem soli Hanksa (HBSS) przed wysianiem komórek.</li>
<li>Płytka 	500 μL zawiesiny komórkowej zawierającej 0,2-0,5 x106 komórki do komory i inkubować przez 20 min w temperaturze 37° C.</li>
<li>Ustabilizuj komorę pomiarową z przytwierdzonymi komórkami w uchwycie do komory. Stosujemy wykonany na zamówienie uchwyt, w którym podstawa podtrzymuje dno szkiełka nakrywki, a część górna delikatnie dociska jej górną powierzchnię. </li>
<li>Umieść uchwyt komory na stole mikroskopu odwróconego.</li>
<li>Ustaw ostrość na komórki w świetle przechodzącym. Używamy obiektywu imersyjnego 40X.</li>
<li>Umieść elektrodę odniesienia Ag/AgCl w kąpieli.</li>
<li>Wyrównaj wielokanałowy system perfuzyjny sterowany grawitacyjnie. Końcówkę rurki dopływowej należy umieścić w 45° pod kątem do szkiełka nakrywki, blisko pola widzenia.</li>
<li>Ustaw rurkę ssącą naprzeciwko końcówki rurki dopływowej.</li>
<li>Przepłucz komorę solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) lub HBSS, aby usunąć pożywkę do hodowli komórkowej oraz słabo przytwierdzone komórki. </li>
</ol>
6. Rejestracja prądów kanałów CRAC
<ol>
 <li>Należy znaleźć komórkę, która jest mocno przytwierdzona do szkiełka nakrywkowe. Zazwyczaj wybieramy komórkę o średniej wielkości i okrągłym kształcie, z gładką powierzchnią zewnętrzną. </li>
 <li>Przeperfunduj komorę rejestracyjną roztworem Ca2+-wolny, 3 mM Mg2+-zawierający roztwór kąpieli nr 1 (Tabela 1) zawierający 0,5-1 μM tapsygargin przez 8–10 min w celu zablokowania pompy SERCA. Ten krok wykonujemy, aby opróżnić zapasy przed utworzeniem gigauszczelnienia (gigaseal). </li>
 <li>Używając mikroloadera Eppendorf oraz pipety wyporowej P-20, należy napełnić pipetę do patch-clampingu roztworem do pipety (Tabela 1), a następnie umieścić pipetę w uchwycie pipety na głowicy wzmacniacza. Ca2+ chelator BAPTA został dodany do roztworu w pipecie w celu pasywnego opróżnienia zapasów oraz zmniejszenia poziomu Ca2+2+zależna od [ukryta wartość] inaktywacja kanałów CRAC.</li>
 <li>Przyłożymy niewielkie dodatnie ciśnienie (~3 cale słupa wody)2O) wewnątrz pipety patch przed wprowadzeniem do kąpieli. Używamy wykonanego na zamówienie urządzenia do wytwarzania ciśnienia i podciśnienia, podłączonego do linii sprężonego powietrza i próżni, w celu wytworzenia ciśnienia dodatniego lub ujemnego wewnątrz pipety patch. </li>
 <li>Zanurz pipetę do patch-clamp w kąpieli, kontrolując proces wizualnie za pomocą mikroskopu. W oknie „Oscilloscope” powinien pojawić się prąd płynący przez pipetę. Skokowa zmiana amplitudy prądu powinna zostać wywołana przez impuls napięcia o małej amplitudzie (impuls testowy) podany za pomocą zdefiniowanego makra. W tym momencie należy wyznaczyć wartość oporności pipety. Oporność naszych pipet wynosi zazwyczaj 5–6 MΩ.</li>
 <li>Skoryguj potencjał „offsetowy” powstający między pipetą a elektrodą odniesienia.</li>
 <li>Pod kontrolą wizualną za pomocą mikroskopu zbliżyć końcówkę pipety do komórki, aż do momentu zetknięcia się z błoną komórkową.</li>
 <li>Przyłożyć podciśnienie (20-40 cali słupa wody)2O) wewnątrz pipety patch. </li>
 <li>Monitoruj tworzenie się giga-uszczelnienia (gigaseal) w oknie „oscyloskopu”. Zauważysz, że amplituda prądu indukowanego przez impuls testowy maleje, a wartość oporności pipety wzrasta do &gt;5 GΩ. Zazwyczaj gigaseal tworzy się w ciągu kilku sekund, jednak osiągnięcie stabilnego gigasealu może zająć od 1 do 2 minut.</li>
 <li>Skompensuj pojemność pipety („C-Fast”). </li>
 <li>Przerwij błonę patchową, przykładając dodatnie podciśnienie za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml.</li>
 <li>Ustaw potencjał holdingowy na +30 mV. Dodatni potencjał holdingowy pomaga zapobiegać zależnej od wapnia inaktywacji kanałów CRAC.</li>
 <li>Skompensuj pojemność błony komórkowej („C-slow”); zapisz lub odnotuj wartość C-slow. </li>
 <li>Sprawdź wartość rezystancji dostępowej „R”s. W naszych eksperymentach Rs wynosi zazwyczaj 7-20 MΩ.</li>
 <li>Rozpocząć aplikację serii ramp napięcia o częstotliwości 0,5 Hz (Ryc. 1) w roztworze Ca2+-wolny 3 mM Mg2+-zawierający roztwór kąpieli nr 1. W tym roztworze prąd CRAC jest pomijalnie mały w porównaniu z prądem „wycieku” ze względu na niską przepuszczalność kanałów CRAC dla Mg2+Zapisz i wykorzystaj aktualne ślady zarejestrowane w roztworze kąpieli nr 1 w przyszłych analizach jako prądy „wycieku” (leak currents). Bezwzględna amplituda prądu „wycieku” przy -10 mV powinna być mniejsza lub równa 5 pA. Jeśli komórka wykazuje „wyciek”, przerwij eksperyment i rozpocznij go ponownie, używając nowej pipety do patch-clampu i nowej komórki.</li>
 <li>Aby zarejestrować Ca2+2+ prąd przez kanały CRAC (ICa-CRAC), zastąp Ca2+pozbawiony Mg, 3 mM Mg2+roztwór kąpielowy nr 1 zawierający 20 mM Ca2+roztwór kąpieli nr 2 (Tabela 1) poprzez przełączenie zaworów perfuzyjnych. Pozwala to na Ca2+ przepływać przez kanały CRAC i generować prąd wewnątrzkomórkowy. W oknie „Oscilloscope” będzie widoczny rozwój wewnątrzprostującego prądu ICa-CRAC (Rycina 2). Amplituda prądu przy ujemnych napięciach będzie nadal wzrastać przez około 1 min z powodu Ca2+zależna od [czynnika] potencjalizacja prądu CRAC.</li>
 <li>Zwiększyć częstotliwość stymulacji rampami napięcia do 5 Hz, co jest niezbędne do zapisu przejściowego prądu Na++ prąd przez kanały CRAC.</li>
 <li>Zastąp 20 mM Ca2+roztwór do kąpieli nr 2 zawierający Na+-zawierającego roztworu nr 3 pozbawionego kationów dwuwartościowych (Tabela 1) poprzez przełączenie zaworów perfuzyjnych. W oknie „Oscyloskop” pojawi się przejściowy wzrost amplitudy prądu Na wewnątrznieprostującego+ prąd przepływający przez kanały CRAC (INa-CRAC; Rysunek 2).</li>
 <li>Można zastosować 20 mM Ca2+roztwór kąpieli nr 2 zawierający 1-5 μM La3+ na koniec eksperymentu w celu zarejestrowania prądu „upływu”. Nie uznaliśmy jednak tego podejścia za przydatne, ponieważ prąd „upływu” zmienia się w czasie i pod koniec eksperymentu może stać się większy lub mniejszy. Wolimy przyjąć wartość prądu zarejestrowaną w Ca2+wolny od 3 mM Mg2+roztwór kąpieli nr 1 zawierający [substancję] na początku eksperymentu jako prąd „upływu”.</li>
 <li>Zapisz zarejestrowane przebiegi prądowe do dalszej analizy.</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
 <li>Wczytaj zapisane rekordy prądowe do oprogramowania analitycznego. Do analizy wykorzystujemy program Pulse.</li>
 <li>Zmierz amplitudy prądu na początku i na końcu ramp napięciowych. Zazwyczaj mierzymy amplitudy prądu przy -10 mV oraz +100 mV, używając par kursorów w oknie „Oscilloscope” programu Pulse.</li>
 <li>Wyeksportuj wartości amplitud prądu do programu graficznego w celu dalszej analizy i prezentacji graficznej. Wykorzystujemy oprogramowanie Origin Scientific Graphing and Analysis Software w wersji 7.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2346/2346fig2.jpg" alt="Schematy eksperymentów elektrofizjologicznych przedstawiające analizę prądu jonowego (I) w funkcji napięcia błony (Vm)." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Prądy CRAC w spoczewającej ludzkiej limfocycie T. (A), przebieg czasowy prądów CRAC zarejestrowanych w konfiguracji voltage-clamp whole-cell przy -10 mV (zamalowane kółka) i +100 mV (puste kółka). Przed utworzeniem gigauszczelnienia (gigaseal) komórkę inkubowano wstępnie przez ok. 10 min w Ca2+wolny od 3 mM Mg2+roztwór kąpieli nr 1 zawierający 0.5 μM thapsygargin. Po okresie adaptacji kolejno stosowano następujące roztwory kąpielowe: Ca2+wolny od 3 mM Mg2+roztwór kąpielowy nr 1 zawierający (0 Ca + 3 Mg), a następnie 20 mM Ca2+-zawierający roztwór kąpielowy nr 2 (20 Ca), następnie roztwór kąpielowy nr 3 pozbawiony kationów dwuwartościowych (DVF), a następnie roztwór kąpielowy nr 2 (20 Ca). Komórkę stymulowano serią ramp napięciowych, zgodnie z rysunkiem 1. Częstotliwość ramp wynosiła 5 Hz w roztworze kąpielowym nr 3 (DVF) oraz 0,5 Hz we wszystkich pozostałych roztworach. Należy zwrócić uwagę na powolny rozwój prądu ICa-CRAC po zastosowaniu 20 mM Ca2+-zawierający roztwór kąpieli nr 2 oraz szybki, przejściowy rozwój INa-CRAC w roztworze kąpieli DVF nr 3. (B), reprezentatywne zapisy prądów zarejestrowane podczas ramp napięciowych w Ca2+-wolny 3 mM Mg2+roztwór kąpielowy nr 1 („wyciek”) zawierający 20 mM Ca2+zawierający roztwór kąpielowy nr 2 (20 Ca) oraz roztwór kąpielowy nr 3 (DVF). (C, D), zależności prądowo-napięciowe ICa-CRAC (C) i jaNa-CRAC (D) uzyskane poprzez odjęcie prądu „upływu” od prądów zarejestrowanych podczas ramp napięciowych w 20 mM Ca2+- zawierający roztwór kąpielowy nr 2 (20 Ca) oraz roztwór kąpielowy nr 3 (DVF) przedstawione na panelu (B).

<ol><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRAC+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CRAC channelopathies.</a> Pflugers Arch. , (2010).</li>
<li>Lewis, R. S., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2%2B+and+transmembrane+Ca2%2B+current+in+human+leukemic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current+%28ICRAC%29+due+to+local+calcium+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback.</a> J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium-dependent+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current.+Store-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms.</a> J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+potentiation+of+store-operated+calcium+channels+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+currents+through+store-operated+CRAC+channels+and+Mg2%2B-inhibited+cation+%28MIC%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels.</a> J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).</li>
<li>Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+channel+properties+and+regulated+expression+of+Ca%282%2B%29+release-activated+Ca%282%2B%29+%28CRAC%29+channels+in+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells.</a> J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Elektrofizjologiczne badanie prądów CRAC w spoczynkowych limfocytach T człowieka jest trudnym zadaniem, ponieważ amplituda endogennego prądu CRAC w tych komórkach jest niewielka ze względu na ich mały rozmiar (średnica spoczynkowego limfocytu T człowieka mieści się w zakresie 5-8 μm). W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółową procedurę niezawodnej rejestracji prądów CRAC w spoczynkowych limfocytach T człowieka wyizolowanych z mononuklearnych komórek krwi obwodowej. Technologia ta pozwala na badanie fizjologii i ...

<table><tbody><tr><td>Koktajl do wzbogacania ludzkich limfocytów T RosetteSep</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>Medium gęstościowe RosetteSep</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>15705</td><td></td></tr><tr><td>pożywka RPMI-1640 z glutaminą/HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>Płódcowa surowica cielęca</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (roztwór 100X)</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>roztwór witamin do medium RPMI 1640 (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7256</td><td></td></tr><tr><td>roztwór aminokwasów 1640 (50X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td></td></tr><tr><td>Pirowinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Inozytolotrifosforan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19766</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926</td><td></td></tr><tr><td>hydrobromian poli-L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek lantanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>262072</td><td></td></tr><tr><td>Tapsigargin</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania elastomeru silikonowego Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Powłoka ochronna do półprzewodników HIPEC R6101</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stół laboratoryjny do izolacji wibracji o wysokiej wydajności serii 63-500</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td>63-540</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz patch-clamp EPC 10 z przedwzmacniaczem głowicowym</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator </td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Olympus 1X71 z obiektywem imersyjnym 40x</td><td>Olympus Corporation</td><td>1X71</td><td></td></tr><tr><td>Komputer z systemem Windows</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Pulse</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do grafiki i analizy danych Origin Scientific</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wyciągarka pipet patch-clamp</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Szkło borokrzemianowe z włóknem (średnica zewnętrzna: 1,5 mm i średnica wewnętrzna: 1,10 mm)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Narashige&amp;rsquo;Microforge</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelki pierścieniowe silikonowe </td><td>McMaster-Carr</td><td>111 S70</td><td></td></tr><tr><td>Łaseczki 25 mm </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 mm 25CIR.-1</td><td></td></tr></tbody></table>

rejestracja w konfiguracji whole-cell prądów wapniowych aktywowanych przez uwalnianie wapnia (crac) w ludzkich limfocytach t

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

W limfocytach T wyczerpanie zapasów Ca2+ z wewnątrzkomórkowego magazynu Ca2+ prowadzi do aktywacji plazmalemmalnych kanałów Ca2+, nazywanych kanałami wapniowymi aktywowanymi przez uwalnianie wapnia (CRAC). Kanały CRAC odgrywają ważną rolę w regulacji proliferacji limfocytów T oraz ekspresji genów. Nieprawidłowe funkcjonowanie kanałów CRAC w limfocytach T wiąże się z ciężkim złożonym niedoborem odporności oraz chorobami autoimmunologicznymi 1, 2. Badanie funkcji kanałów CRAC w ludzkich limfocytach T może ujawnić nowe mechanizmy molekularne regulujące prawidłowe odpowiedzi immunologiczne i pomóc w zrozumieniu przyczyn powiązanych z nimi chorób ludzkich. Rejestracja elektrofizjologiczna prądów błonowych zapewnia najdokładniejszą ocenę funkcjonalnych właściwości kanałów oraz ich regulacji. Elektrofizjologiczna ocena prądów kanałów CRAC w komórkach T Jurkat, ludzkiej linii komórkowej białaczki T, została po raz pierwszy przeprowadzona ponad 20 lat temu 3, jednak pomiary prądów CRAC w normalnych ludzkich limfocytach T pozostają trudnym zadaniem. Trudności w rejestrowaniu prądów kanałów CRAC w normalnych limfocytach T wynikają z faktu, że limfocyty T pochodzące z krwi są znacznie mniejsze niż komórki T Jurkat, a w związku z tym endogenne prądy CRAC typu whole-cell mają bardzo niską amplitudę. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółową procedurę, której rutynowo używamy do rejestracji prądów Ca2+ lub Na+ przepływających przez kanały CRAC w spoczynkowych ludzkich limfocytach T wyizolowanych z krwi obwodowej zdrowych ochotników. Opisana tutaj metoda została zaadaptowana z procedur stosowanych do rejestracji prądów CRAC w komórkach T Jurkat oraz aktywowanych ludzkich limfocytach T 4-8.

Przedstawiamy szczegółowy protokół rejestracji prądów wapniowych aktywowanych uwalnianiem wapnia (CRAC) metodą patch clamp w konfiguracji whole-cell w ludzkich limfocytach T pochodzących z mononuklearnych komórek krwi obwodowej.

Rejestracja w konfiguracji whole-cell prądów wapniowych aktywowanych przez uwalnianie wapnia (CRAC) w ludzkich limfocytach T

W limfocytach T wyczerpanie zapasów Ca2+ z wewnątrzkomórkowego magazynu prowadzi do aktywacji kanałów Ca2+ w plazmalemmie, nazywanych wapniowymi kanałami aktywowanymi przez uwalnianie...

Kanały wapniowe aktywowane uwalnianiem wapnia (CRAC), zlokalizowane w błonie komórkowej, odgrywają istotną rolę w proliferacji limfocytów T oraz stymulacji ekspresji genów. Aktywacja receptorów limfocytów T przez antygen prowadzi do powstania wtórnego przekaźnika, trifosforanu inozytolu, i aktywacji uwalniania wapnia z magazynów za pośrednictwem receptorów trifosforanu inozytolu. Spadek stężenia wapnia w magazynach prowadzi do aktywacji kanałów CRAC i w konsekwencji do wzrostu stężenia wapnia w cytosolu. Nieprawidłowości w funkcjonowaniu kanałów CRAC w limfocytach T są powiązane z szeregiem chorób ludzi, w tym z ciężkimi złożonymi niedoborami odporności oraz chorobami autoimmunologicznymi.W niniejszym opracowaniu przedstawiono metodę umożliwiającą wiarygodną i powtarzalną rejestrację endogennych prądów kanałów wapniowych i sodowych aktywowanych przez spadek stężenia wapnia (crack channels) w ludzkich limfocytach T. W pierwszej kolejności podaje się FSA garin, bloker ATPase wapniowej siateczki sarkoplazmatyczno-endoplazmatycznej, w roztworze pozakomórkowym pozbawionym wapnia lub zawierającym 3 mM magnezu w celu wyczerpania zapasów.Procedura ta otwiera kanały pęknięć, ale nie indukuj

whole-cell-recording-calcium-release-activated-calcium-crac-currents

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rejestracja całego kalifa prądów aktywowanych uwalnianiem wapnia (CRAC) w ludzkich limfocytach T

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Ten film analizuje indukowany przez receptory limfocytów T napływ wapnia do komórek T. Przeciwciała anty-CD3 aktywują szlaki sygnałowe limfocytów T, co prowadzi do wzrostu wewnątrzkomórkowych jonów wapnia, które wiążą się z barwnikiem Indo-1. W cytometrii przepływowej przesunięcie widma ze stanu wolnego od wapnia do stanu związanego z wapniem koreluje z napływem wapnia wywołanym przez receptor komórek T.

Ocena napływu wapnia indukowanego przez receptor limfocytów T za pomocą barwnika wskaźnikowego wapnia

Opisujemy izolację ludzkich miocytów przedsionkowych, które mogą być używane do wewnątrzkomórkowych pomiarów Ca2+ w połączeniu z elektrofizjologicznymi badaniami patch-clamp.

Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądów błonowych

Procedury są opisane w celu jednoczesnego rejestrowania potencjału błonowego lub prądu oraz zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Neurony jądra nadskrzyżowaniowego są wypełnione wskaźnikiem wapnia bis-fura-2 za pomocą elektrody patch clamp w konfiguracji patch clamp całej komórki.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadskrzyżowaniowego

Rejestrowanie prądów Ca2+ na błonie czołowej uwalniania presynaptycznego jest kluczem do precyzyjnego zrozumienia wejścia Ca2+ i uwalniania neuroprzekaźników. Przedstawiamy ostrą dysocjację rdzenia kręgowego minoga, która daje funkcjonalne izolowane aksony siateczkowo-rdzeniowe, umożliwiające zapis bezpośrednio z błony czołowej uwalniającej poszczególne zakończenia presynaptyczne.

Ostra dysocjacja aksonów siateczkowo-rdzeniowych minoga w celu umożliwienia rejestracji z błony czołowej uwalniającej poszczególnych funkcjonalnych zakończeń presynaptycznych

Tutaj prezentujemy techniki obrazowania lokalnych zdarzeń Ca2+ za pośrednictwem IP3 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w nienaruszonych komórkach ssaków załadowanych wskaźnikami Ca2+ wraz z algorytmem, który automatyzuje identyfikację i analizę tych zdarzeń.

Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ w hodowanych komórkach ssaków

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Tutaj opisane są metody używane do badania funkcjonalnego efektu mutacji RYR1 endogennie wyrażanych w wirusie Epsteina-Barra, unieśmiertelnionych ludzkich limfocytach B oraz komórkach satelitarnych pochodzących z biopsji mięśni, zróżnicowanych w miotuby.

Charakterystyka funkcjonalna endogennych wariantów ludzkiego RYR1

Napływ wapnia, miara sygnalizacji limfocytów T, jest skutecznym sposobem analizy reakcji na stymulację receptorów limfocytów T. Ten protokół multipleksowania Indo-1 z panelami przeciwciał skierowanymi na cząsteczki powierzchniowe komórki wykorzystuje wysoce elastyczne możliwości cytometrii przepływowej w pełnym spektrum.

Analiza indukowanego przez receptor limfocytów T napływu wapnia w pierwotnych mysich limfocytach T za pomocą cytometrii przepływowej pełnego spektrum

Tutaj udostępniamy kompleksowy protokół do rozwiązywania początkowych lokalnych sygnałów Ca2+, znanych jako mikrodomeny Ca2+, w pierwotnych mysich i ludzkich limfocytach T za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten służy jako cenne źródło informacji dla naukowców badających szlaki sygnałowe Ca2+ w komórkach odpornościowych i do dalszego odkrywania ich funkcji.

Obrazowanie początkowych mikrodomen Ca2+ w pierwotnych limfocytach T

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Poznaj metodę całokomórkowego zapisu prądów CRAC w ludzkich limfocytach T przy użyciu techniki patch clamp. Protokół ten umożliwia niezawodne pomiary aktywności kanałów wapniowych kluczowych dla aktywacji komórek T.

Rejestracja w konfiguracji whole-cell prądów wapniowych aktywowanych przez uwalnianie wapnia (CRAC) w ludzkich limfocytach T

Przeglądaj więcej filmów