Izolacja mononuklearnych komórek mózgu i rdzenia kręgowego z wykorzystaniem gradientów Percollu

Komórki układu odpornościowego naciekają ośrodkowy układ nerwowy podczas infekcji, urazów, chorób autoimmunologicznych lub procesów neurodegeneracyjnych. Choć podejścia histochemiczne mogą być wykorzystywane do określenia lokalizacji naciekających komórek oraz analizy związanej z nimi patologii, techniki te są ograniczone liczbą przeciwciał, które można zastosować jednocześnie. W niniejszym materiale przedstawiono metodę szybkiej izolacji komórek mononuklearnych z tkanek mózgu i rdzenia kręgowego, w której pobrana tkanka jest najpierw homogenizowana.

Następnie przygotowuje się gradient Percoll, a po wirowaniu komórki mononuklearne są zbierane z interfejsu. Na koniec komórki są płukane i barwione przeciwciałami. Dzięki analizie cytometrii przepływowej rozróżnia się komórki hematogenne oraz mikroglej nadzorczy, co pozwala na oznaczenie ich relatywnych proporcji w stanach chorobowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak gradient Ficoll lub histochemia, jest fakt, że jest ona mniej czasochłonna.

Pozwala to na jednoczesne przetwarzanie większej liczby tkanek. Demonstrację przygotowania gradientu przeprowadzi technik z mojego laboratorium. Przygotuj odczynniki niezbędne do wykonania tego protokołu. Zacznij od czterech mililitrów roztworu izotonicznego SIP (stock isotonic perol) na jeden mózg.

Aby to osiągnąć, należy połączyć dziewięć części perol z jedną częścią 10-krotnego HBSS bez wapnia i magnezu, mieszając przez odwracanie. Następnie przygotuj 70% roztwór per call, mieszając przygotowany SIP z jednokrotnym HBSS bez wapnia i magnezu. Następnie odmierz dwa mililitry 70% per cole do 15-mililitrowej polipropylenowej probówki stożkowej w celu zebrania tkanki.

W tej procedurze wypreparowane mózgi i rdzenie kręgowe wszystkich myszy badawczych należy umieścić w zlewkach zawierających 10 mililitrów RPMI w lodzie. Następnie tkankę przenosi się do homogenizatora o pojemności siedmiu lub 15 mililitrów zawierającego trzy mililitry jednej mocy HBSS, używając luźno dopasowanego tłuczka typu A, aby delikatnie przygotować zawiesinę komórkową, a następnie należy zmienić tłuczek na ściśle dopasowany typ B i dalej dysocjować tkanki.

Po zhomogenizowaniu tkanki należy dodać RPMI lub jednokrotny roztwór HBSS do uzyskania końcowej objętości 7 ml, a następnie przejść do przygotowania gradientu PERCOCO. Rozpocznij od dodania 3 ml SIP do zawiesiny komórkowej, aby uzyskać końcowe stężenie PERCOCO wynoszące 30%. Należy pamiętać, że PERCOCO powinno być używane w temperaturze pokojowej. W przypadku użycia schłodzonego roztworu komórki mają tendencję do agregowania się, co obniża efektywność separacji komórek.

Następnie, używając pipety z ustawionym trybem grawitacyjnym, powoli nanieś 10 mililitrów zawiesiny komórkowej na wierzch 70% SIP. Unikaj zmieszania roztworów 70% i 30%. Jest to najważniejszy etap procedury.

Na styku roztworów 70% i 30% powinna być widoczna bardzo wyraźna płaska linia. Zazwyczaj osoby, które po raz pierwszy stosują tę metodę, mają z tym trudność, ponieważ roztwór trzeci i 70% mieszają się podczas warstwowania. W następnym kroku, aby ustabilizować granicę faz, odwiruj próbki przez 30 minut przy 500 Gs w temperaturze 18 °C.

Upewnij się, że wirówka zatrzyma się z minimalnym hamowaniem lub bez niego, aby nie zakłócić interfejsu. Po wirowaniu gradientów na górze probówki powinna zgromadzić się gruba i lepka warstwa zanieczyszczeń. Kolejną warstwą jest żółtawa warstwa 30% Percoll, która czasami zawiera zanieczyszczenia.

Następnie znajduje się granica między warstwami 70% a 30%, która powinna mieć wyraźną białą otoczkę i zawierać komórki mononuklearne. Na samym dnie probówki znajduje się przejrzysta warstwa Percola 70%. Jeśli granica ta nie jest widoczna, wydajność uzyskania komórek prawdopodobnie będzie bardzo niska, co znacznie utrudni dalszą analizę.

Dlatego w tym momencie może być konieczne użycie świeżych zawiesin komórkowych w celu zmniejszenia stopnia zanieczyszczenia. Ostrożnie usuń warstwę zanieczyszczeń z góry probówki i ją odrzuć. Następnie, używając plastikowej pipety, pobierz z górnej warstwy 30% dwa do trzech mililitrów interfazy 70/30 i przenieś ją do czystej probówki stożkowej zawierającej osiem mililitrów 1x HBSS.

Kilkakrotnie wymieszaj rozcieńczone interfejsy poprzez odwracanie, a następnie odwiruj przez siedem minut przy 500 GS w temperaturze 18 °C. Po wirowaniu usuń nadsącz i resuspenduj pellet. W jednym mililitrze buforu do barwienia komórek przenieś zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 1,5 ml i wypłucz ją jeszcze raz.

Przed przystąpieniem do barwienia przeciwciałami, odwiruj próbki w mikrocentryfużce przy 10 000 g przez jedną minutę w temperaturze 4 °C. Następnie resuspenduj osady w 50 µL oczyszczonych przeciwciał anty-US CD 16, CD 32, rozcieńczonych 1:200 w buforze do barwienia komórek, aby zablokować miejsca wiązania FC. Jak w każdej procedurze barwienia, niezbędne jest odpowiednie miareczkowanie wszystkich przeciwciał. Inkubuj na lodzie przez 10 minut. Podczas inkubacji pobierz od 2 do 5 µL zawiesiny komórkowej i policz komórki za pomocą hemocytometru.

Połączone tkanki naiwnego mózgu i rdzenia kręgowego powinny dostarczyć około 3-5 × 10⁵ komórek na mysz. W zapalonych mózgach liczba komórek zapalnych będzie zróżnicowana w zależności od momentu pobrania tkanek oraz modelu choroby. Po inkubacji z CD 16 i CD 32 należy dodać 50 µL mieszaniny przeciwciał specyficznych dla komórek odpornościowych. Mieszanina użyta w tym przykładzie zawiera przeciwciała przeciwko CD 45, CD 4 i CD 19; inkubować na lodzie przez 30 minut.

Ważne jest, aby każde przeciwciało zostało najpierw mianowane. W celu określenia optymalnego rozcieńczenia należy zastosować odpowiednie kombinacje fluorochromów, dobrana zgodnie z możliwościami laserów i ustawieniami filtrów konkretnego cytometru przepływowego. Po barwieniu komórek należy je przemyć buforem do barwienia komórek, dodając 1 mL bufora do barwienia komórek i wirując przez jedną minutę.

Po wirowaniu przy 10 000 G usunąć nadkład, a następnie zawiesić osad w 100–200 µL buforu do barwienia komórek w celu natychmiastowej analizy cytometrycznej lub do analizy w późniejszym terminie. Ponownie zawiesić komórki w 2% paraformaldehydzie przygotowanym w PBS i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. Przedstawiono tutaj komórki mononuklearne, które uzyskano i inkubowano z blokadą Fc, a następnie z przeciwciałami anty-CD45, CD4 i CD19.

Zgodnie z zaprezentowanym protokołem, barwienie CD 45 metodą cytometrii przepływowej pozwala na wyraźne oddzielenie komórek hematogennych o wysokiej ekspresji CD 45 od mikrogleju nadzorczego z niską ekspresją CD 45 (CD 45 DIM). Na tej rycinie porównano komórki wyizolowane z naiwnego oraz zapalnego mózgu myszy, u której wywołano eksperymentalne autoimmune encephalomyelitis. Intensywność sygnału CD 45 została przedstawiona na osi Y, gdzie w mózgu naiwnym widoczne są trzy odrębne populacje.

Wykrywa się bardzo niewielką liczbę komórek z wysoką ekspresją CD 45. Zazwyczaj stanowią one mniej niż 2% całkowitej izolowanej populacji. W porównaniu z nimi mózgi myszy z indukowanym EAE wykazują masowy napływ rekrutowanych do mózgu komórek krwi.

Dodanie innych markerów powierzchni komórkowych, takich jak CD 11 b, CD 4, CD 8 i tym podobnych, pozwala na dalszą charakterystykę populacji CD 45 high. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu trzech do czterech godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać, że podejścia histologiczne w połączeniu z immunofenotypowaniem metodą cytometrii przepływowej są kluczowe dla pełnej charakterystyki składu nacieków zapalnych OUN.