Name: Izolacja komórek jednojądrzastych mózgu i rdzenia kręgowego za pomocą gradientów Percoll (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Naucz się izolować komórki jednojądrzaste z mózgu i rdzenia kręgowego myszy za pomocą gradientów Percoll. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę fenotypową komórek odpornościowych CNS przy użyciu cytometrii przepływowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1/T dla AEC) oraz University of Texas at San Antonio.

Przygotowanie odczynników
Przygotować zapasowy izotoniczny percoll (SIP), 4 ml na mózg, mieszając 9 części percollu z jedną częścią 10X HBSS bez Ca++ i Mg++.
Przygotować SIP w stężeniu 70% w 1X HBSS bez Ca++ i Mg++, w ilości 2 ml na mózg, odmierzonej do 15 ml polipropylenowej probówki stożkowej.
Uwaga: Zaleca się stosowanie percolu w temperaturze pokojowej; w przypadku użycia zimnego roztworu komórki mają tendencję do agregowania się, a separacja komórek jest mniej wydajna.
Pobieranie i homogenizacja tkanek
Znieczulić myszy i przeprowadzić perfuzję przez lewą komorę serca lodowatym 1X HBSS. Wypreparować mózg oraz rdzeń kręgowy i przechowywać w RPMI bez czerwieni fenolowej do momentu uśmiercenia wszystkich myszy.
Umieścić tkanki w homogenizatorze Dounce o pojemności 7 lub 15 ml zawierającym 3 ml RPMI, delikatnie przygotować zawiesinę komórkową za pomocą luźno dopasowanego tłoka (rozmiar A), a następnie ciasno dopasowanego tłoka (rozmiar B), aby dalej rozdzielić tkanki. Uzupełnić objętość zawiesin komórkowych do 7 ml za pomocą RPMI.
Konfiguracja gradientu
Dodać 3 ml SIP do zawiesiny komórek, aby uzyskać końcowe stężenie 30% SIP
Powoli nanieś 10 mL zawiesiny komórkowej na wierzch 70% SIP. Jest to najbardziej krytyczny etap procedury; należy użyć pipetora ustawionego w trybie grawitacyjnym, aby uniknąć zmieszania roztworów 70% i 30%. Na styku faz 70% i 30% powinna być widoczna bardzo wyraźna, płaska linia.
Wiruj przez 30 min przy 500G w temperaturze 18°C. Upewnij się, że wirówka zatrzyma się z minimalnym hamowaniem lub bez niego, aby nie zaburzyć interfejsu.
Za pomocą pipety transferowej ostrożnie usuń warstwę zanieczyszczeń z góry probówki, a następnie pobierz 2,0-3,0 ml interfazy 70%-30% do czystej probówki stożkowej zawierającej 8 ml 1X HBSS. Upewnij się, że percoll zawierający interfazę został rozcieńczony około trzykrotnie, wymieszaj kilka razy poprzez odwracanie probówki i wiruj przez 7 min przy 500G w temperaturze 18°C.
Resuspender osad w 1 ml buforu do barwienia komórek, przenieść go do probówki 1,5 ml i przemyć ponownie, odwirugowując w mikrocentry fudze przy 10,000G przez 1 min w 4°C.
Barwienie przeciwciałami
Osady resuspender w 50 μl oczyszczonego przeciwciała anty-mysiego CD16/CD32 rozcieńczonego 1:200 w buforze do barwienia komórek w celu zablokowania miejsc wiązania Fc. Inkubować na lodzie przez 10 min. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
Dodaj 50 μl mieszaniny koktajlu przeciwciał i inkubuj na lodzie przez 30 min. Każde przeciwciało musi zostać najpierw mianowane w celu ustalenia optymalnego rozcieńczenia. Użyj odpowiednich kombinacji fluorochromów dobranych zgodnie z możliwościami laserów i ustawieniami filtrów konkretnego cytometru przepływowego.
Przemyj komórki buforem do barwienia komórek, resuspenduj osady w 100-200 μl buforu do barwienia komórek i poddaj natychmiastowej analizie w cytometrze; alternatywnie komórki można resuspendować w 2% paraformaldehydzie (PFA) przygotowanym w PBS i przechowywać przez noc w temperaturze 4°C.
Reprezentatywne wyniki:
Po wirowaniu gradientów interfaza 70%-30% powinna wykazywać wyraźną białą otoczkę, a ilościowe oznaczenie komórek odzyskanych od myszy naiwnej powinno dać wynik 3-5 x105 komórek na mysz (mózg wraz z rdzeniem kręgowym). W przypadku zapalenia mózgu liczba komórek zapalnych może być zróżnicowana w zależności od rodzaju uszkodzenia OUN lub modelu choroby (Rycina 1).
<img src="/files/ftp_upload/2348/2348fig1.jpg" alt="Analiza cytometrii przepływowej; naiwne komórki mózgu vs komórki mózgu z EAE; wykresy rozproszenia; leukocyty CD45, mikroglej, różnicowanie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Izolacja komórek mononuklearnych z mózgów osobników naiwnych oraz z mózgów z EAE w szczycie choroby. Zawiesiny komórek mózgu rozdzielono na nieciągłych gradientach Percoll 70%/30%. Barwione komórki inkubowano z Fc-block, a następnie z przeciwciałami anty-CD45 przez 30 min w lodzie. Komórki przepłukano buforem do barwienia komórek i utrwalono w 2% PFA przed akwizycją w cytometrze LSR-II. Intensywność CD45 jest mierzona na osi Y, gdzie uwidoczniono trzy odrębne populacje. Dalsza charakterystyka fenotypu immunologicznego naciekających komórek CD45hi została przeprowadzona z użyciem dodatkowych przeciwciał, a następnie przeanalizowana metodą cytometrii przepływowej.

<ol><li>Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4%2B+T+cells+compared%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Juedes, A. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+and+infiltrating+central+nervous+system+APCs+regulate+the+emergence+and+resolution+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tickets+to+the+brain%3A+Role+of+CCR2+and+CX%283%29CR1+in+myeloid+cell+entry+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS.</a> J Neuroimmunol. , (2010).</li>
<li>Mildner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6ChiCCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).</li>
<li>Djukic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+monocytes+engraft+in+the+brain%2C+differentiate+into+microglia+and+contribute+to+the+pathology+following+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice.</a> Brain. 129, 2394-2403 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Analizy markerów powierzchniowych leukocytów OUN z prawidłowych i zapalnych tkanek mysich są stosowane od kilku dekad1-3. Protokoły izolacji opierają się na rozdziale mikrogleju i leukocytów poprzez wirowanie gradientowe4. W niniejszej pracy opisujemy szybką i skuteczną metodę izolacji leukocytów OUN z wykorzystaniem nieciągłych gradientów Percoll. Po izolacji komórek barwienie różnymi przeciwciałami, takimi jak – lecz nie ograniczając się do nich – CD45, CD4, CD8, CD11b, CD19 itp., pozwala na ident...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Homogenizacja tkanek i gradienty&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;Li (lit)&gt;Percoll (Amersham)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;10X Hanksa&amp;rsquo; Zrównoważony roztwór soli, bez wapnia i magnezu (Gibco)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;pożywka RPMI 1640, bez czerwieni fenolowej (Gibco)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;homogenizatory tkankowe Dounce o pojemności 7 ml lub 15 ml (VWR)&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Cytometria przepływowa&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Bufor do barwienia komórek (Biolegend)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Oczyszczone przeciwciało szczurze anty-mysie CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), BD Pharmingen&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Hemacytometr (Fisher)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Przeciwciała anty-mysie CD45 (klon 30-F11), CD4 (klon RM4-5), CD19 (klon 6D5), BioLegend&lt;/li&gt;&lt;li&gt;10X roztwór soli fosforanowo-buforowanej, bez wapnia i magnezu (Thermo Scientific)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Paraformaldehyd (Sigma Aldrich)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Analiza cytometrii przepływowej wykonana za pomocą urządzenia LSR II (BD Biosciences)&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

izolacja mononuklearnych komórek mózgu i rdzenia kręgowego z wykorzystaniem gradientów percollu

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Izolacja komórek odpornościowych naciekających ośrodkowy układ nerwowy (OUN) podczas infekcji, urazów, autoimmunizacji lub neurodegeneracji jest często niezbędna do zdefiniowania ich fenotypu i funkcji efektorowych. Podejścia histochemiczne są kluczowe dla określenia lokalizacji naciekających komórek oraz analizy związanej z nimi patologii OUN. Jednakże techniki histochemii in-situ i barwienia immunofluorescencyjnego są ograniczone liczbą przeciwciał, które można wykorzystać jednocześnie do charakterystyki podtypów komórek odpornościowych w danej tkance. Dlatego podejścia histologiczne w połączeniu z immunofenotypowaniem metodą cytometrii przepływowej są krytyczne dla pełnej charakterystyki składu miejscowego nacieku w OUN. Niniejszy protokół opiera się na rozdzielaniu zawiesin komórkowych z OUN w nieciągłych gradientach Percoll. Obecny artykuł opisuje szybki protokół wydajnej izolacji komórek mononuklearnych z tkanek mózgu i rdzenia kręgowego, który może być efektywnie wykorzystany do identyfikacji różnych populacji komórek odpornościowych w jednej próbce za pomocą cytometrii przepływowej.

Niniejszy artykuł opisuje szybki protokół wydajnej izolacji komórek mononuklearnych z tkanek mózgu i rdzenia kręgowego, które mogą być skutecznie wykorzystane w analizach cytometrycznych.

Izolacja mononuklearnych komórek mózgu i rdzenia kręgowego z wykorzystaniem gradientów Percollu

Izolacja komórek odpornościowych naciekających ośrodkowy układ nerwowy (OUN) podczas infekcji, urazów, procesów autoimmunizacyjnych lub neurodegeneracji jest często wymagana ...

Komórki układu odpornościowego naciekają ośrodkowy układ nerwowy podczas infekcji, urazów, chorób autoimmunologicznych lub procesów neurodegeneracyjnych. Choć podejścia histochemiczne mogą być wykorzystywane do określenia lokalizacji naciekających komórek oraz analizy związanej z nimi patologii, techniki te są ograniczone liczbą przeciwciał, które można zastosować jednocześnie. W niniejszym materiale przedstawiono metodę szybkiej izolacji komórek mononuklearnych z tkanek mózgu i rdzenia kręgowego, w której pobrana tkanka jest najpierw homogenizowana.Następnie przygotowuje się gradient Percoll, a po wirowaniu komórki mononuklearne są zbierane z interfejsu. Na koniec komórki są płukane i barwione przeciwciałami. Dzięki analizie cytometrii przepływowej rozróżnia się komórki hematogenne oraz mikroglej nadzorczy, co pozwala na oznaczenie ich relatywnych proporcji w stanach chorobowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak gradient Ficoll lub histochemia, jest fakt, że jest ona mniej czasochłonna.Pozwala to na jednoczesne przetwarzanie większej liczby tkanek. Demonstrację przygotowania gradientu przeprowadzi technik z mojego laboratorium. Przygotuj odczynniki niezbędne do wykonania tego protokołu. Zacznij od czterech mililitrów roztworu izotonicznego SIP (stock isotonic perol) na jeden mózg.Aby to osiągnąć, należy połączyć dziewięć części perol z jedną częścią 10-krotnego HBSS bez wapnia i magnezu, mieszając przez odwracanie. Następnie przygotuj 70% roztwór per call, mieszając przygotowany SIP z jednokrotnym HBSS bez wapnia i magnezu. Następnie odmierz dwa mililitry 70% per cole do 15-mililitrowej polipropylenowej probówki stożkowej w celu zebrania tkanki.W tej procedurze wypreparowane mózgi i rdzenie kręgowe wszystkich myszy badawczych należy umieścić w zlewkach zawierających 10 mililitrów RPMI w lodzie. Następnie tkankę przenosi się do homogenizatora o pojemności siedmiu lub 15 mililitrów zawierającego trzy mililitry jednej mocy HBSS, używając luźno dopasowanego tłuczka typu A, aby delikatnie przygotować zawiesinę komórkową, a następnie należy zmienić tłuczek na ściśle dopasowany typ B i dalej dysocjować tkanki.Po zhomogenizowaniu tkanki należy dodać RPMI lub jednokrotny roztwór HBSS do uzyskania końcowej objętości 7 ml, a następnie przejść do przygotowania gradientu PERCOCO. Rozpocznij od dodania 3 ml SIP do zawiesiny komórkowej, aby uzyskać końcowe stężenie PERCOCO wynoszące 30%. Należy pamiętać, że PERCOCO powinno być używane w temperaturze pokojowej. W przypadku użycia schłodzonego roztworu komórki mają tendencję do agregowania się, co obniża efektywność separacji komórek.Następnie, używając pipety z ustawionym trybem grawitacyjnym, powoli nanieś 10 mililitrów zawiesiny komórkowej na wierzch 70% SIP. Unikaj zmieszania roztworów 70% i 30%. Jest to najważniejszy etap procedury.Na styku roztworów 70% i 30% powinna być widoczna bardzo wyraźna płaska linia. Zazwyczaj osoby, które po raz pierwszy stosują tę metodę, mają z tym trudność, ponieważ roztwór trzeci i 70% mieszają się podczas warstwowania. W następnym kroku, aby ustabilizować granicę faz, odwiruj próbki przez 30 minut przy 500 Gs w temperaturze 18 °C.Upewnij się, że wirówka zatrzyma się z minimalnym hamowaniem lub bez niego, aby nie zakłócić interfejsu. Po wirowaniu gradientów na górze probówki powinna zgromadzić się gruba i lepka warstwa zanieczyszczeń. Kolejną warstwą jest żółtawa warstwa 30% Percoll, która czasami zawiera zanieczyszczenia.Następnie znajduje się granica między warstwami 70% a 30%, która powinna mieć wyraźną białą otoczkę i zawierać komórki mononuklearne. Na samym dnie probówki znajduje się przejrzysta warstwa Percola 70%. Jeśli granica ta nie jest widoczna, wydajność uzyskania komórek prawdopodobnie będzie bardzo niska, co znacznie utrudni dalszą analizę.Dlatego w tym momencie może być konieczne użycie świeżych zawiesin komórkowych w celu zmniejszenia stopnia zanieczyszczenia. Ostrożnie usuń warstwę zanieczyszczeń z góry probówki i ją odrzuć. Następnie, używając plastikowej pipety, pobierz z górnej warstwy 30% dwa do trzech mililitrów interfazy 70/30 i przenieś ją do czystej probówki stożkowej zawierającej osiem mililitrów 1x HBSS.Kilkakrotnie wymieszaj rozcieńczone interfejsy poprzez odwracanie, a następnie odwiruj przez siedem minut przy 500 GS w temperaturze 18 °C. Po wirowaniu usuń nadsącz i resuspenduj pellet. W jednym mililitrze buforu do barwienia komórek przenieś zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 1,5 ml i wypłucz ją jeszcze raz.Przed przystąpieniem do barwienia przeciwciałami, odwiruj próbki w mikrocentryfużce przy 10 000 g przez jedną minutę w temperaturze 4 °C. Następnie resuspenduj osady w 50 µL oczyszczonych przeciwciał anty-US CD 16, CD 32, rozcieńczonych 1:200 w buforze do barwienia komórek, aby zablokować miejsca wiązania FC. Jak w każdej procedurze barwienia, niezbędne jest odpowiednie miareczkowanie wszystkich przeciwciał. Inkubuj na lodzie przez 10 minut. Podczas inkubacji pobierz od 2 do 5 µL zawiesiny komórkowej i policz komórki za pomocą hemocytometru.Połączone tkanki naiwnego mózgu i rdzenia kręgowego powinny dostarczyć około 3-5 × 10⁵ komórek na mysz. W zapalonych mózgach liczba komórek zapalnych będzie zróżnicowana w zależności od momentu pobrania tkanek oraz modelu choroby. Po inkubacji z CD 16 i CD 32 należy dodać 50 µL mieszaniny przeciwciał specyficznych dla komórek odpornościowych. Mieszanina użyta w tym przykładzie zawiera przeciwciała przeciwko CD 45, CD 4 i CD 19; inkubować na lodzie przez 30 minut.Ważne jest, aby każde przeciwciało zostało najpierw mianowane. W celu określenia optymalnego rozcieńczenia należy zastosować odpowiednie kombinacje fluorochromów, dobrana zgodnie z możliwościami laserów i ustawieniami filtrów konkretnego cytometru przepływowego. Po barwieniu komórek należy je przemyć buforem do barwienia komórek, dodając 1 mL bufora do barwienia komórek i wirując przez jedną minutę.Po wirowaniu przy 10 000 G usunąć nadkład, a następnie zawiesić osad w 100–200 µL buforu do barwienia komórek w celu natychmiastowej analizy cytometrycznej lub do analizy w późniejszym terminie. Ponownie zawiesić komórki w 2% paraformaldehydzie przygotowanym w PBS i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. Przedstawiono tutaj komórki mononuklearne, które uzyskano i inkubowano z blokadą Fc, a następnie z przeciwciałami anty-CD45, CD4 i CD19.Zgodnie z zaprezentowanym protokołem, barwienie CD 45 metodą cytometrii przepływowej pozwala na wyraźne oddzielenie komórek hematogennych o wysokiej ekspresji CD 45 od mikrogleju nadzorczego z niską ekspresją CD 45 (CD 45 DIM). Na tej rycinie porównano komórki wyizolowane z naiwnego oraz zapalnego mózgu myszy, u której wywołano eksperymentalne autoimmune encephalomyelitis. Intensywność sygnału CD 45 została przedstawiona na osi Y, gdzie w mózgu naiwnym widoczne są trzy odrębne populacje.Wykrywa się bardzo niewielką liczbę komórek z wysoką ekspresją CD 45. Zazwyczaj stanowią one mniej niż 2% całkowitej izolowanej populacji. W porównaniu z nimi mózgi myszy z indukowanym EAE wykazują masowy napływ rekrutowanych do mózgu komórek krwi.Dodanie innych markerów powierzchni komórkowych, takich jak CD 11 b, CD 4, CD 8 i tym podobnych, pozwala na dalszą charakterystykę populacji CD 45 high. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu trzech do czterech godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać, że podejścia histologiczne w połączeniu z immunofenotypowaniem metodą cytometrii przepływowej są kluczowe dla pełnej charakterystyki składu nacieków zapalnych OUN.

isolation-brain-spinal-cord-mononuclear-cells-using-percoll

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja komórek jednojądrowych mózgu i rdzenia kręgowego za pomocą gradientów Percoll

W tym filmie demonstrujemy, jak izolować komórki mononuklearne z ośrodkowego układu nerwowego szczurów z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego.

Izolacja komórek mononuklearnych z ośrodkowego układu nerwowego szczurów z EAE

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli progenitorowych komórek ziarnistych neuronów móżdżku oraz neuronów ziarnistych móżdżku z myszy w okresie postnatalnym. <br...

Izolacja i hodowla postnatalnych progenitorów neuronów ziarnistych oraz neuronów z móżdżku myszy

Opisano szybką metodę pozyskiwania leukocytów naciekających mózg myszy. Metoda ta wykorzystuje ciągły gradient Percoll oraz nieciągły gradient Ficoll w celu wyselekcjonowania i oczyszczenia warstwy wzbogaconej w leukocyty. Wyizolowane leukocyty mogą być następnie scharakteryzowane za pomocą pomiarów cytometrycznych.

Izolacja leukocytów naciekających mózg

W tym filmie przeprowadzamy izolację komórek jednojądrzastych z mózgu myszy za pomocą wirowania gradientu gęstości. Wyizolowaną zawiesinę komórek jednojądrzastych można wykorzystać do dalszej analizy.

Izolacja komórek jednojądrzastych z mózgu myszy: technika wirowania w gradimencie gęstości do izolowania komórek jednojądrzastych rezydujących w mózgu

W tym filmie opisujemy krok po kroku protokół izolacji neuronów rdzenia kręgowego od noworodka myszy do badań in vitro.

Izolacja neuronów rdzenia kręgowego: procedura gradientu gęstości w celu izolacji neuronów rdzenia kręgowego noworodków do badań in vitro

Film pokazuje izolację komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z mózgu myszy za pomocą mechanicznej dysocjacji i trawienia enzymatycznego. Następnie następuje wirowanie w gradiencie gęstości w celu zebrania komórek odpornościowych do dalszej analizy.

Izolowanie komórek odpornościowych naciekających nowotwór z mysiego mózgu

Film demonstruje przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny komórek odpornościowych z mysiej tkanki mózgowej. Obejmuje trawienie enzymatyczne w celu uwolnienia komórek z tkanki mózgowej, a następnie wirowanie w gradiencie gęstości w celu wyizolowania komórek odpornościowych na podstawie ich gęstości w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.

Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny komórek odpornościowych z mysiej tkanki mózgowej

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli pierwotnych mieszanych komórek glejowych z tkanki rdzenia kręgowego dorosłej myszy. Protokół obejmuje enzymatyczne trawienie tkanki, a następnie usunięcie uszkodzonych błon komórkowych i resztek mieliny w celu uzyskania populacji pojedynczej komórki. Komórki są następnie hodowane w pożywkach zoptymalizowanych pod kątem wzrostu mieszanych komórek glejowych.

Ustanawianie pierwotnych mieszanych kultur komórek glejowych z rdzenia kręgowego myszy

Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.

Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

Ten artykuł przedstawia dwa zoptymalizowane protokoły badania rezydentnych i obwodowo pochodzących komórek odpornościowych w ośrodkowym układzie nerwowym, w tym mózgu, rdzeniu kręgowym i oponach mózgowych. Każdy z tych protokołów pomaga ustalić funkcję i skład komórek zajmujących te przedziały w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych.

Izolowanie tkanek ośrodkowego układu nerwowego i związanych z nimi opon mózgowych w celu dalszej analizy komórek odpornościowych

Do tej pory, protokoły jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od tej samej myszy są niezaspokojonym wymaganiem. Protokół przedstawia procedurę mającą zastosowanie u myszy z nieleczonym i eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia w celu zbadania złożonych sieci komórkowych podczas zapalenia nerwów i jednoczesnego zmniejszenia wymaganej liczby myszy.

Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia

Naucz się izolować komórki jednojądrzaste z mózgu i rdzenia kręgowego myszy za pomocą gradientów Percoll. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę fenotypową komórek odpornościowych CNS przy użyciu cytometrii przepływowej.

Izolacja mononuklearnych komórek mózgu i rdzenia kręgowego z wykorzystaniem gradientów Percollu

Przeglądaj więcej filmów