Izolacja komórek jednojądrzastych mózgu i rdzenia kręgowego za pomocą gradientów Percoll

Komórki odpornościowe infiltrują ośrodkowy układ nerwowy podczas infekcji, urazu, autoimmunizacji lub neurodegeneracji. Chociaż podejścia histochemiczne mogą być stosowane do określenia lokalizacji komórek naciekających i analizy związanej z tym patologii, techniki te są ograniczone liczbą przeciwciał, które można stosować jednocześnie. W tym miejscu przedstawiono metodę szybkiej izolacji komórek jednojądrzastych z tkanek mózgu i rdzenia kręgowego, w której wypreparowana tkanka jest najpierw homogenizowana.

Następnie ustawiany jest gradient perolu i po odwirowaniu komórki jednojądrzaste są pobierane z granicy faz. Na koniec komórki są płukane i barwione przeciwciałami Dzięki analizie cytometrii przepływowej rozróżnia się komórki hematogenne i mikroglej nadzorujący oraz można określić ich względne proporcje w stanach chorobowych. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak gradient Arisa czy w takiej histochemii, jest to, że jest mniej czasochłonna.

Pozwala to na przetwarzanie większej liczby tkanek w tym samym czasie. Demonstracja konfiguracji gradientu będzie palino Technik z mojego laboratorium Przygotuj odczynniki, które będą potrzebne do tego protokołu. Zaczynając od czterech mililitrów zapasowego izotonicznego perolu, określanego jako SIP na mózg.

Aby to zrobić, połącz dziewięć części perolu z jedną częścią 10 razy HBSS bez wapnia i magnezu zmieszanych przez inwersję. Następnie przygotuj 70% na rozmowę, mieszając przygotowany SIP z jednorazowym HBSS bez wapnia i magnezu. Następnie dozuj dwa mililitry 70% na cole do 15-mililitrowej stożkowej rurki polipropylenowej, aby zebrać tkankę.

W tej procedurze umieść wypreparowane mózgi i rdzenie kręgowe wszystkich badanych myszy w zlewkach zawierających 10 mililitrów RPMI nad lodem. Następnie przenieś tkankę do homogenizatora o pojemności siedmiu lub 15 mililitrów zawierającego trzy mililitry jednorazowego HBSS o luźnym rozmiarze. Tłuczek delikatnie tworzy zawiesinę komórek, a następnie przełącza się na ciasno dopasowany tłuczek w rozmiarze B i dalej dysocjuje tkanki.

Gdy tkanka zostanie zhomogenizowana, dodaj RPMI lub jednorazowy HBSS do końcowej objętości siedmiu mililitrów i przystąp do ustawiania gradientu, aby ustawić gradient perkoko. Zacznij od dodania trzech mililitrów SIP do zawiesiny komórek, aby uzyskać końcowe stężenie PERCOCO 30%Należy pamiętać, że perol należy stosować w temperaturze pokojowej. Jeśli jest używany na zimno, komórki mają tendencję do zbijania się, a separacja komórek jest mniej wydajna.

Następnie, korzystając z naszego trybu grawitacyjnego ustawiania pipet, powoli nałóż 10-mililitrową zawiesinę komórek na 70% SIP. Unikaj mieszania roztworów 70% i 30%. Jest to najbardziej krytyczny etap procedury.

Na skrzyżowaniu od 70 do 30% powinna być widoczna bardzo wyraźna płaska linia. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ trzecie i 70% roztwory będą mieszać się podczas nakładania warstw. Następny krok, naruszenie interfejsu Odwiruj 30 minut po 500 g w temperaturze 18 stopni Celsjusza.

Upewnij się, że wirówka zatrzyma się z minimalną lub żadną przerwą, aby interfejs nie został zakłócony. Po obróceniu gradientów na górze rurki powinna gromadzić się gruba i lepka warstwa gruzu. Następna warstwa to żółtawe 30% na warstwę rdzenia, która czasami zawiera zanieczyszczenia.

Następny jest interfejs od 70 do 30, który powinien mieć zdefiniowane białe halo i zawierać komórki jednojądrzaste. Wreszcie, na dnie tubki znajduje się przezroczysta warstwa 70% perolu. Jeśli nie zostanie zaobserwowany żaden interfejs, wydajność komórek będzie prawdopodobnie bardzo niska, co niezwykle utrudni dalszą analizę.

Dlatego w tym momencie mogą być wymagane świeże zawiesiny komórek, aby zmniejszyć zanieczyszczenie. Ostrożnie usuń warstwę zanieczyszczeń z górnej części rurki i wyrzuć ją. Następnie za pomocą plastikowej pipety przejdź przez górne 30% na warstwę rdzenia i zbierz od dwóch do trzech mililitrów interfazy 70 30 i przenieś ją do czystej stożkowej rurki zawierającej osiem mililitrów jednorazowego HBSS.

Wymieszaj rozcieńczone interfejsy kilka razy przez inwersję, a następnie odwiruj przez siedem minut w temperaturze 500 GS w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Po wirowaniu wyjmij supenę i ponownie zawieś granulkę. W jednym mililitrze buforu do barwienia komórek przenieś zawiesinę komórek do 1,5 mililitrowej probówki i umyj ją jeszcze raz.

Używając mikrowirówki w temperaturze 10 000 GS przez jedną minutę w czterech stopniach Celsjusza przed przystąpieniem do barwienia przeciwciał w celu przeprowadzenia barwienia przeciwciał, ponownie zawieś granulki w 50 mikrolitrach oczyszczonego anty-US CD 16, CD 32, rozcieńczonego od jednego do 200 w buforze do barwienia komórek w celu zablokowania miejsc wiązania FC. Podobnie jak w przypadku każdej procedury barwienia, konieczne jest odpowiednie miareczkowanie wszystkich przeciwciał i inkubacja na lodzie przez 10 minut. Podczas inkubacji usuń od dwóch do pięciu mikrolitrów komórek i policz je za pomocą hemocytometru.

Połączone naiwne tkanki mózgu i rdzenia kręgowego powinny dać około trzy do pięciu razy 10 do pięciu komórek na mysz. Mózgi z zapaleniem będą miały różną liczbę komórek zapalnych w zależności od punktu czasowego, w którym są zbierane, i modelu choroby Po inkubacji z CD 16 i CD 32 dodaj 50 mikrolitrów mieszanki koktajli przeciwciał specyficznych dla komórek odpornościowych. Mieszanina użyta w tym przykładzie zawiera przeciwciała przeciwko CD 45, CD 4 i CD 19 inkubowane na lodzie przez 30 minut.

Co ważne, każde przeciwciało musi być najpierw randetowane. Aby ocenić optymalne rozcieńczenie, należy użyć odpowiednich kombinacji fluorochromu dobranych zgodnie z możliwościami ustawień lasera i filtra dla danego przepływu. Cytometr, po zabarwieniu komórek, umyj je w buforze do barwienia komórek, dodając jeden mililitr buforu do barwienia komórek i obracając je przez jedną minutę.

Przy 10 000 G po wirowaniu wyrzuć środek leżący na wznak, a następnie ponownie zawieś palety w 100 do 200 mikrolitrach buforu do barwienia komórek w celu natychmiastowej analizy cytometrycznej przepływu do późniejszej analizy. Reus zawiesił komórki w 2% par formaldehydzie przygotowanym w PBS i przechowywał przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pokazano tutaj komórki jednojądrzaste uzyskane i inkubowane z blokiem FC, a następnie przeciwciała anty CD 45, CD cztery i CD 19.

Zgodnie z zademonstrowanym protokołem cytometrii przepływowej barwienie CD 45 ładnie oddziela komórki wysokokrwiotwórcze CD 45 od CD 45, mikrogleju DIM nadzoru. Rysunek ten porównuje komórki wyizolowane z naiwnego i zapalnego mózgu od myszy wywołanej do rozwoju eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego. CD 45 Intensywność PC jest pokazana na osi Y, gdzie trzy odrębne populacje są wizualizowane w naiwnym mózgu.

Wykrywa się bardzo niewiele komórek o wysokiej wysokości CD 45. Zwykle mniej niż 2% całej izolowanej populacji. Dla porównania, mózgi myszy dotkniętych EAE wykazują ogromny napływ komórek krwi rekrutowanych do mózgu.

Dodanie innych markerów powierzchni komórek, takich jak CD 11 b, CD cztery, CD osiem i tak dalej, pozwala na dalszą charakterystykę populacji o wysokiej populacji CD 45 Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu trzech do czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas tej procedury należy pamiętać, że podejścia histologiczne w połączeniu z fenotypowaniem immunologicznym za pomocą cytometrii przepływowej mają kluczowe znaczenie dla pełnego scharakteryzowania składu nacieków zapalnych OUN.