Monitorowanie przemieszczania się komórek odpornościowych do fluorescencyjnych pręcików prionowych w godzinach po zakażeniu drogą dosytrychialną

Głównym celem niniejszej procedury jest monitorowanie pobierania i transportu prionów przez komórki odpornościowe w ciągu kilku godzin po zakażeniu. W pierwszej kolejności należy oczyścić i znakować fluorochromem agregaty prętów prionowych wyizolowanych z zakażonego mózgu, a następnie inokulować te pręty prionowe do jamy otrzewnej myszy. Po dwóch godzinach należy pobrać komórki z otrzewnej, śledziony, a także z węzłów chłonnych śródpiersiowych i krezkowych. Na koniec odzyskane komórki należy barwić markerami fenotypowymi układu odpornościowego i poddać analizie pod kątem retencji PreOn.

Na przykład wyniki cytometrii przepływowej mogą posłużyć do wykazania, że pręciki prionowe są zatrzymywane i transportowane przede wszystkim przez makrofagi i komórki dendrytyczne, w drugiej kolejności przez monocyty, a w trzeciej przez limfocyty B. Ten system eksperymentalny został zaprojektowany w celu wyjaśnienia kwestii rezerwuarów prionów oraz potencjalnych celów terapeutycznych poprzez udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania, takie jak: które komórki pobierają PreOn bezpośrednio po zakażeniu? Gdzie je transportują i jak szybko tam trafiają?

Procedurę tę zaprezentują Crystal, Mt.And Brady Michael, doktoranci z mojego laboratorium, w celu wyizolowania białek PreOn. Homogenizować 100 milligrams zakażonej tkanki mózgowej PreOn w 900 milliliters lodowatego buforu do homogenizacji przez jedną minutę z maksymalną prędkością w komercyjnym blenderze, a następnie natychmiast umieścić na lodzie na dwie minuty. Powtórzyć ten proces trzykrotnie, aby zwiększyć wydajność białka.

Wirować homogenat przez 10 minut przy 3000 Gs i temperaturze czterech stopni Celsius. Odlać i przechowywać nadosad na lodzie. Resuspender osad w jednym litrze hp, a następnie powtórzyć etapy homogenizacji i wirowania.

Następnie należy połączyć supernatanty i wirować przez 60 minut przy 100 000 g w temperaturze 0 °C. Znadpływ należy odrzucić. Osad należy resuspender w 100 ml TBST.

Oszacuj stężenie białka za pomocą metody Bradforda i dostosuj objętość do poziomu 5 mg/mL białka w buforze TBST. Schłodź na lodzie przez 30 minut. Ponownie odwiruj przez 30 minut przy 100 000 ×g w temperaturze 0 °C.

Odciśnij supernatant i przemyj osad najpierw 50 ml TBST. Następnie 100 ml TBS, zawiesić otrzymany osad w 100 ml 1x PBS zawierającego 1% sarkosylu i koktajl inhibitorów proteaz i mieszać przez 120 minut w temperaturze 37 °C. Aby przeprowadzić gradient sacharozy, nanieś próbkę na 900 ml 320 mM sacharozy i wiruj przez 60 minut.

Wiruj przy 100 000 g w temperaturze 10 °C. Odlej nadsącz i resuspenduj osad w 10 ml 2,3 M NaCl z dodatkiem 5% Sarco seal. Następnie poddaj próbkę sonikacji pięć razy po 40 s przy 70% mocy maksymalnej w odstępach jednominutowych.

Odmiar jeden mililitr próbki do probówek typu Eppendorf i wiruj przez 15 minut przy 13 000 g w temperaturze 4 °C. Osady przemyć dwukrotnie buforem TBS i przechowywać zapasy w temperaturze -70 °C. Przeciwciała w jednej probówce oczyszczonych pręcików PreOn skoniugować, używając jednej fiolki fluorochromu DITE 6 49, zgodnie z protokołem producenta.

Na koniec należy wymienić bufor do znakowania barwnikiem na PBS poprzez wirowanie w kolumnach filtracyjnych. Próbki należy przechowywać w alikwotach po 20 µL w temperaturze -70 °C, w ciemności, do momentu użycia. Ta sekcja obejmuje podanie dosytroniczne, inokulację prionami oraz odzyskiwanie komórek z otrzewnej, węzłów chłonnych śródpiersia i krezkowych oraz śledziony bezpośrednio przed użyciem fluorescencyjnego prionu D loop.

Utrzymaj myszy od 1 do 50 w PBS, chwytając je za skórę karku kciukiem i palcem wskazującym. Delikatnie obróć mysz przodem do siebie i unieruchom ogon małym palcem. Ułóż mysz w pozycji supnacyjnej, unosząc tylną część tułowia powyżej głowy i trzymając zwierzę lekko do góry nogami.

Używając strzykawki insulinowej o rozmiarze 30 G, wstrzyknij 100 µL fluorescencyjnych prętów pionowych, jeden centymetr bocznie od linii środkowej i od jednego do dwóch centymetrów przed stawem krzyżowo-biodrowym. Wprowadź igłę na głębokość jednego centymetra przez skórę, kierując ją pod kątem 45 stopni w stronę przyśrodkową; w przypadku myszy kontrolnych zastosuj rozcieńczenie fluorescencyjnych kuleczek w stosunku 1:50 lub sam PBS. Zgodnie z planem eksperymentu, inkubuj myszy przez wyznaczony czas przed rozpoczęciem analiz.

Uśmierć myszy zgodnie z zatwierdzonymi protokołami komisji ds. opieki i wykorzystania zwierząt. Wstrzyknij 10 ml PBS do jamy otrzewnowej, używając strzykawki 12 ml i igły o rozmiarze 25G. Delikatnie kołysz mysz wzdłużnie przez jedną minutę, a następnie przystąp do sekcji myszy.

Brzuszną stronę futra myszy dokładnie zwilż 70%ethanol. Za pomocą pęsety unieś skórę w linii środkowej tuż poniżej klatki piersiowej i nożyczkami wykonaj małe nacięcie skóry. Następnie wykonaj nacięcie skóry o długości od trzech do pięciu centymetrów w obu kierunkach, w stronę głowy i ogona.

Wykonaj dwucentymetrowe nacięcia wzdłuż linii środkowej w kierunku bocznym od każdego końca, odchyl i przypnij skórę, aby odsłonić jamę otrzewnową i jamę klatki piersiowej. Pobierz zawiesinę komórkową z otrzewnej, używając tej samej strzykawki i igły o rozmiarze 16 G. Przenieś wysięk do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml i przechowuj w lodzie.

Ostrożnie przetnij cienką, półprzezroczystą błonę otaczającą otrzewną i odchyl klatkę piersiową, aby odsłonić śródpiersie. Następnie zlokalizuj i usuń od dwóch do czterech węzłów chłonnych śródpiersia, znajdujących się nieco grzbietowo i bocznie w sąsiedztwie grasicy, a przyśrodkowo obok tętnicy szyjno-głowowej w pobliżu brzusznej strony tchawicy. W kolejnym kroku zlokalizuj i usuń do sześciu węzłów chłonnych krezkowych, osadzonych w miękkiej, białej tkance krezkowej, która mocuje jelita do tylnej ściany jamy brzusznej.

Przechowywać węzły chłonne w 1 ml medium PMI 1640 na lodzie do czasu zakończenia sekcji. Na koniec zlokalizować i usunąć śledzionę. Jest to długi, ciemnoczerwony organ znajdujący się tuż bocznie od linii środkowej i grzbietowo względem jelit, po lewej stronie myszy.

Używając tłoka strzykawki o pojemności 1 ml, rozetrzeć i przecisnąć węzły chłonne przez sito o oczkach 40 µm do 3 ml PBS w plastikowej szalce Petriego. Przepłukać sito dodatkowymi 2 ml PBS i przenieść otrzymaną zawiesinę komórkową o całkowitej objętości 5 ml do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Następnie przepłukać szalkę Petriego dodatkowymi 5 ml PBS i przenieść zawartość do tej samej probówki.

Wiruj próbkę przez pięć minut przy 250 gs. Odlej nadsącz i resuspenduj osad komórkowy. Przenieś wyizolowane komórki w 1 ml buforu fax do probówki EOR o pojemności 1,5 ml.

Zazwyczaj ten protokół barwienia można stosować do identyfikacji subpopulacji komórek odpornościowych, wykorzystując przeciwciała fluorescencyjne przeciwko dobrze scharakteryzowanym markerom powierzchniowym komórek odpornościowych, aby rozpuścić wszystkie przeciwciała w buforze FACS. Bezpośrednio przed użyciem należy policzyć komórki i odmierzyć 10⁶ komórek do probówek typu Eppendorf, osadzić komórki poprzez wirowanie i przemyć osad dwukrotnie 1 ml buforu FACS w celu zablokowania endogennych receptorów FC.

Inkubować komórki w 100 µL przeciwciała rat anti-US CD 1632 w stężeniu 2 ng/mL przez 20 minut w lodzie, a następnie zwirować i przemyć komórki buforem FACS. Następnie dodać do każdej próbki 100 µL odpowiedniego przeciwciała lub przeciwciał fluorescencyjnych w stężeniu 1 ng/mL i inkubować w lodzie przez jedną godzinę. Do komórek kontrolnych dodać 100 µL samego buforu FACS, a następnie zwirować i dwukrotnie przemyć komórki buforem FACS.

Resuspenduj komórki w 1 ml buforu ACT i inkubuj na lodzie przez jedną minutę. W celu lizy erytrocytów odwiruj osad i przemyj komórki buforem FAX, a następnie resuspenduj je w 1 ml buforu FAX. Próbki analizuj za pomocą cytometru przepływowego, zazwyczaj z laserami wzbudzającymi o długościach fal 405, 488 i 633 nm oraz od pięciu do dziesięciu detektorów emisji fluorescencji.

Surowy homogenat mózgu zainfekowany prionami jest silnie wzbogacony w priony. Proces oczyszczania obejmuje solubilizację detergentem oraz ultrawirowanie homogenatu mózgu dwóch jeleni. Produktem jest proteaza.

Analiza FACS populacji komórek opornych na K wykazuje, że komórki prezentujące antygen migrują do otrzewnej w ciągu dwóch godzin i zatrzymują fluorescencyjne kuleczki oraz priony w formie prętów. Komórki pochodzące z myszy inokulowanych kuleczkami i prionami wykazywały znaczącą fluorescencję, szczególnie w przypadku monocytów, komórek dendrytycznych i makrofagów.

W węzłach chłonnych śródpiersia stwierdzono również obecność monocytów, komórek dendrytycznych i makrofagów niosących PreOn. Dwie godziny po inokulacji nie wykryto koralików ani pręcików PreOn w węzłach chłonnych jamnych ani krezkowych. W tym doświadczeniu w materiale wideo zaprezentowano kilka protokołów służących do oczyszczania zagregowanych pręcików prionowych z zakażonego mózgu w celu wykonania wtryskiwań doszpikowych, do prawidłowej identyfikacji i izolacji węzłów chłonnych, a na koniec do izolacji i barwienia komórek odpornościowych.