Name: Organtypowa kultura plasterkowa mózgów szczurów E18 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 48 s
Description: Naucz się przygotowywać organtypowe kultury plasterkowe mózgów szczurów E18. Ta metoda obejmuje disekcję, zatopienie w agarozie, cięcie wibratorem i hodowlę. Technika ta umożliwia badanie rozwoju kory mózgowej oraz migracji neuronów in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

organotypowa hodowla plastrów mózgu szczura w 18. dniu embrionalnym (e18)

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypowe hodowle skrawków z embrionalnych mózgów gryzoni są szeroko stosowane w badaniach nad rozwojem mózgu. Choć systemy in vivo często oferują pewne zalety, organotypowe hodowle skrawków umożliwiają przeprowadzenie szeregu manipulacji, które obecnie nie są możliwe do wykonania in vivo. Do tej pory organotypowe hodowle skrawków embrionalnego mózgu wykorzystywano do śledzenia pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii time-lapse, manipulowania ekspresją genów w wypustkach zwojowych (regionie trudnym do ukierunkowania podczas elektroporacji in utero) oraz do badań farmakologicznych. W niniejszym protokole wideo demonstrujemy, jak przygotować organotypowe hodowle skrawków z embrionów szczura w 18. dniu rozwoju embrionalnego. Protokół obejmuje wypreparowanie embrionów, ich zatapianie na lodzie w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, krojenie zatopionych mózgów na wibratomie, a na koniec przenoszenie skrawków na filtry w naczyniach hodowlanych. Niniejszy protokół w obecnej formie jest również możliwy do zastosowania przy tworzeniu organotypowych hodowli skrawków z różnych stadiów embrionalnych zarówno u szczurów, jak i myszy.

Organotypowa hodowla plastrów mózgu szczura w 18. dniu embrionalnym (E18)

Organotypowe hodowle skrawków embrionalnego mózgu gryzoni są szeroko stosowane w badaniach nad rozwojem mózgu. Choć systemy in vivo często oferują pewne korzyści, ...

Nazywam się Laura Elias. Jestem doktorantką w dziedzinie neuronauki, pracującą w laboratorium Arnolda K. Steina. Znajdujemy się w Instytucie Medycyny Regeneracyjnej na UCSF i dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzić organotypową hodowlę plastrów mózgu szczura w stadium E 18.Procedura ta obejmuje wypreparowanie mózgów, ich zatopienie w niskotopliwym agarozie, a następnie krojenie na wibrotomie w celu uzyskania przekrojów koronowych i umieszczenie ich w systemie hodowli plastrów. Do przeprowadzenia tej procedury hodowli plastrów wykorzystuje się kilka ważnych narzędzi i odczynników. Do wypreparowania mózgów niezbędny będzie mikroskop stereoskopowy.Używamy również tego urządzenia w sposób podobny do wibrotomu VT 1000 S, który jest dobrym systemem do wycinania skrawków. Dobór kleju może mieć duże znaczenie. Stosujemy ten rodzaj kleju, ponieważ bardzo dobrze mocuje on mózg; w przypadku użycia niewłaściwego rodzaju kleju tkanka może odkleić się podczas próby cięcia, co może być problematyczne.Używamy również filtrów typu milli-cell, na których osadzamy nasze skrawki podczas hodowli; jest to również istotna część procesu. Zanim rozpoczniecie proces hodowli skrawków, należy wykonać kilka kroków przygotowawczych. Po pierwsze, należy przygotować A CSF, a po zakończeniu jego sporządzania należy umieścić go w lodzie w celu schłodzenia oraz rozpocząć napowietrzanie go karbogenem.Należy również przygotować 4% agarozę. W tym celu należy użyć agarozy o niskiej temperaturze topnienia, rozpuścić ją w CSF, podgrzać w mikrofalówce, a następnie utrzymać w temperaturze 50°C aż do momentu zatopienia mózgów. Należy także przygotować pożywkę do hodowli plastrów, a po jej przygotowaniu umieścić ją w temperaturze 37°C, aby zaczęła się ogrzewać, tak aby w momencie umieszczenia w niej plastrów na końcu procesu miała odpowiednią temperaturę.W tym momencie powinni być Państwo gotowi do przygotowania narzędzi i rozpoczęcia procesu hodowli skrawków. Teraz przygotujemy hodowle skrawków z mózgów embrionów szczura z 18. dnia embrionalnego. Najpierw sprawdzę, czy samica jest w pełni znieczulona, wykonując ucisk palca u nogi.Oto przykład, w którym szczur nadal wykazuje niewielki odruch i lekko cofa tylną łapę, gdy ściskam stopę. W związku z tym musimy poczekać dłużej lub ponownie podać środek znieczulający, aż do momentu, gdy nie będziemy obserwować żadnej reakcji. Teraz przystąpię do otwarcia zwierzęcia, aby pobrać zarodki.Chcę teraz unieść skórę, aby uzyskać ładne, czyste cięcie. Usunę tutaj część embrionów, a następnie je wytnę. Można przeciąć przestrzeń między dwoma embrionami, a potem ciąć wzdłuż.Teraz możemy wyjąć ten embrion i oddzielić go od łożyska, wykonując nacięcie bezpośrednio przy łożysku. Następnie przeniesiemy embrion do zimnego A CSF i usuniemy pozostałą część pęcherzyka. Tak, i odcinamy tutaj.Zarodek jest już gotowy, teraz przygotujemy przekroje mózgu. Dobrze, mamy już nasz zarodek, a teraz za pomocą nożyczek usunę głowę. Dobrze, jestem teraz gotowy do wypreparowania mózgu.Najpierw musimy unieruchomić głowę, co osiągamy poprzez umieszczenie pinów w oczodołach oraz w tylnym mózgowiu. Pomaga nam to ustabilizować mózg w naczyniu. Jak widać, mamy teraz unieruchomiony mózg w naczyniu; rozpoczniemy od wykonania nacięcia w tylnym mózgowiu, a następnie będziemy przesuwać się bardziej rostralnie.Zacznę od wykonania nacięcia tutaj, w pobliżu móżdżku. Wsunę nożyczki pod skórę i czaszkę, a następnie przedłużę nacięcie w górę, w stronę obszaru rhomboideus. Następnie wykonam dwa kolejne nacięcia bocznie, na samym końcu kory, w pobliżu sero meum.Wykonam nacięcia bocznie w tym kierunku, a następnie nacięcie w tym miejscu. Następnie za pomocą pęsety odsunę czaszkę w ten sposób. W ten sposób odsłoniliśmy mózg, który teraz wyjmę z głowy.W ten sposób uzyskujemy w pełni wypreparowany mózg. Teraz osadzimy te mózgi w agarozie; przygotowałem wcześniej 4% agarozę o niskiej temperaturze topnienia. Należy przygotować ją w CSF, podgrzać w mikrofalówce, a następnie utrzymać w temperaturze około 50 °C, aby pozostała w stanie ciekłym.Przystępuję teraz do procesu zatapiania. Pobiorę nieco agarozy, przeleję ją do tych naczyń i wypełnię je niemal do pełna. Dobrze, pierwszym krokiem jest zatem wzięcie mózgów i ich podstawowe wypłukanie w naczyniu z agarozą.Należy unikać nadmiaru cieczy na mózgach, ponieważ utrudnia to ich prawidłowe osadzenie i przyleganie do agaru. Jeśli nie zostaną one dokładnie wypłukane w pierwszym kroku, mają tendencję do wypadania z agaru podczas próby ich krojenia na mikrotomie. Dlatego delikatnie nimi potrząsamy, aby pozbyć się nadmiaru cieczy.Następnie przeniesiemy te mózgi do innych naczyń wypełnionych 4% agarozy pokazanej tutaj. Obecnie pozycjonujemy mózgi w agarozie. Należy zadbać o to, aby nie znajdowały się one zbyt blisko dna ani górnej krawędzi naczynia, tak aby były z każdej strony otoczone agarozą.Następnie nałożymy pokrywkę na tę szalkę, przykryjemy ją, a następnie umieścimy szalkę w lodzie, aby agar stwardniał i mózg został odpowiednio osadzony w agarze; proces twardnienia powinien zająć około 5 lub 10 minut. Dobrze, teraz mamy mózgi osadzone w agarze i możemy przystąpić do ich krojenia na wibratomie, aby uzyskać przekroje o grubości około 300 µm, których będziemy używać do hodowli plastrów. Cały ten proces, podobnie jak wszystkie poprzednie etapy, będziemy przeprowadzać w zimnym roztworze CSF napowietrzanym karbogenem.Jesteśmy zatem gotowi do rozpoczęcia. Dobrze, teraz zaczniemy od wyjęcia mózgu z agarozy. Po prostu zdejmiemy tutaj górną część, a czasami trzeba pomóc, aby upewnić się, że blok agarozy wyjdzie górą.Spójrzmy tutaj. Można to po prostu wsunąć do dolnej części. Mamy teraz agros i to, co zrobimy, to nacięcie agros w taki sposób, aby w zasadzie wyciąć mózg.Wykonam cztery cięcia: jedno wzdłużnie, jedno z przodu oraz dwa po bokach. W zasadzie wycinam mózg dokładnie tak, jak został on zatopiony. W ten sposób wykonaliśmy nacięcia i podzieliliśmy mózg na bloki.W tym momencie powinniśmy być w stanie po prostu wyjąć mózg z agarozu. Mózg wyszedł bez problemu i jest zatopiony w agarozie. Teraz weźmiemy klej i umieścimy go na tej małej platformie. Gotowe.Teraz nałożymy niewielką ilość kleju i umieścimy mózg bezpośrednio na nim. Zatem móżdżek i pień mózgu będą przylegać do kleju, natomiast opuszka węchowa lub koniec rostralny będą skierowane pionowo do góry. Następnie przeniesiemy preparat do komory Vibram.Teraz przenoszę mózg do vibrotomu, w którym zostanie on pocięty na sekcje. Zatem zaczynamy. Umieszczamy go w vibrotomie i przykręcamy w ten sposób.Następnie dodamy schłodzony, napowietrzany CSF, który mam tutaj w lodzie. Powoduje to również utwardzenie kleju, co jest istotne. W ten sposób nasz mózg zostanie przymocowany do płytki w wibrotomie.Jesteśmy teraz gotowi do rozpoczęcia krojenia mózgu na wibratomie. Usunę teraz niewielką ilość nadmiaru agaru. Wykonam nacięcie i usunę go.Mamy teraz przed sobą mózg. Umieszczę ostrze na głowicy wibratomu. Zostanie ono tutaj wstawione i zamocowane na wibratomie.Odcinę również fragment tej pipety, aby była wystarczająco duża, by móc pobrać plasterki po ich wycięciu. Gotowe. Teraz możemy przystąpić do krojenia.Zatem, jak wspomniałem, do tego celu zastosowałem skrawki o grubości 300 µm. Przesuniemy teraz ostrze w stronę mózgu, przesuwając stolik. Dobrze, najpierw pozycjonujemy ostrze tuż przed tkanką; pierwsze kilka cięć przetnie jedynie agar lub ewentualnie obszary najbardziej obwodowe, ale służy to przede wszystkim właściwemu ustawieniu ostrza.Ustawiliśmy wibracje na około siedem, a prędkość na około pięć. Wykonujemy tutaj cięcia, aby uzyskać koronalne przekroje kory. Zaczynamy od najbardziej rostralnego końca mózgu i w tej chwili ledwo weszliśmy w tkankę mózgową.Właśnie zaczynamy. To nasz pierwszy przekrój, który w tym momencie jest bardzo rostralny. Będę więc przechowywać moje sekcje.W miarę jak przekroje są wyjmowane, usuwam je stopą i umieszczam w bąbelkującym, pokojowym A CSF. Opcjonalnie do komory można dodać lód, aby utrzymać jeszcze niższą temperaturę w przypadku tych mózgów embrionalnych. Pierwsza kultura na lodzie.Wydają się one przetrwać bez problemu, pod warunkiem że używany A CSF jest lodowaty. Jednak w przypadku innych eksperymentów lub gdy tkanka mózgowa jest nieco starsza, można umieścić lód w komorze, aby utrzymać ekstremalnie niską temperaturę. Obecnie nasze skrawki znajdują się w napowietrzanym A CSF.Mogą one pozostać tutaj przez maksymalnie około godziny, ale możemy również przejść bezpośrednio do umieszczenia ich w naszym systemie kultur plastrów. Dobrze, teraz jesteśmy gotowi do przygotowania naczyń oraz systemu hodowlanego, aby móc inkubować przygotowane właśnie plastry. Użyjemy do tego płytki sześciodołkowej.Do każdego z tych dołków wlejemy około 1,5 mL uprzednio przygotowanego i ogrzanego do 37 °C pożywki do hodowli skrawków tkankowych – około 1,5 mL do każdego z tych naczyń. Następnie wezmę filtry. Przekroje mózgu zostaną umieszczone na tych filtrach, ale najpierw filtry te należy położyć na wspomnianej pożywce.Następnie umieścimy filtry na powierzchni pożywki, którą chcemy usunąć, przesuwając pęcherzyki powietrza przynajmniej na bok. Pęcherzyki nie mogą znajdować się pod filtrem. Filtry te umożliwiają plastrom wchłanianie składników odżywczych z pożywki przy jednoczesnym zachowaniu kontaktu z powietrzem, aby w zasadzie nie uległy one uduszeniu.Filtry znajdują się już w szalce i możemy przystąpić do pobrania plastrów oraz ich przeniesienia na filtry. Plastry znajdują się tutaj, w tej szalce; usunąłem większość AC SF. Teraz chcę szybko dodać pożywkę do hodowli plastrów, ponieważ należy je niezwłocznie przenieść z AC SF do pożywki do hodowli plastrów.Do moich skrawków dodam teraz pożywkę hodowlaną. Staram się robić to delikatnie, aby nie uszkodzić nadmiernie skrawków. Teraz, gdy skrawki znajdują się w pożywce, przeniosę je na filtry – na te trzy filtry, które mam tutaj przygotowane.W takim razie użyję pipety, aby pobrać plaster i umieścić go na filtrze. Na jednym filtrze można umieścić kilka plastrów lub, jeśli wolicie, tylko jeden. Ja umieszczę tutaj na tym filtrze kilka plastrów.Następnie ważne jest usunięcie nadmiaru pożywki, która została przeniesiona. W tym miejscu po prostu odbiorę nadmiar pożywki przeniesionej wraz z plastrami, ponieważ zbyt duża ilość pożywki w naczyniach spowodowałaby ich całkowite zakrycie, co skróciłoby czas ich przeżycia z powodu niedostatecznego dotlenienia. W ten sposób usunąłem nadmiar pożywki i teraz plastry spoczywają w naczyniu, gotowe do umieszczenia w inkubatorze.Dobrze, teraz plastry są gotowe do umieszczenia w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Powinny pozostać w dobrym stanie przez pięć do siedmiu dni. Pożywkę wymieniamy mniej więcej co trzy dni, usuwając połowę objętości i zastępując ją świeżą pożywką.Zatem przejdę teraz do umieszczenia tych kultur w inkubatorze. Dobrze, to wszystko. Zakończyliśmy.W naszym laboratorium stosujemy tę technikę do badania różnych aspektów rozwoju kory mózgowej, w tym podziałów komórek progenitorowych i migracji neuronów. Metoda ta może być szczególnie przydatna w połączeniu z mikroskopią poklatkową, co umożliwia śledzenie pojedynczych komórek podczas ich podziału i migracji w hodowli skrawków tkankowych.

organotypic-slice-culture-of-e18-rat-brains

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Organotypiczna kultura kroju mózgów szczurów E18

Organoptypowy model hodowli plastrów hipokampa jest modelem in vitro stosowanym do badania uszkodzeń neuronalnych w różnych paradygmatach. W niniejszym artykule opisujemy metody przygotowania hodowli plastrów oraz ilościowego oznaczania uszkodzeń neuronalnych.

Model organotypowej hodowli skrawków hipokampa do badania uszkodzeń neuronów

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania i utrzymania preparatu przekroju nowokory w kulturze organotypowej w celu wykonania rejestracji elektrycznej z neuronów piramidowych.

Rejestracja całokomórkowa z organotypowego preparatu skrawka neokory

Opisano metodę przygotowania organotypowych skrawków z embrionalnego śródmózgowia myszy w stadium E12.5. Organotypowe hodowle skrawków mogą być wykorzystywane do obserwacji zachowania neuronów dopaminergicznych lub innych neuronów z brzusznej części śródmózgowia.

Organotypowe hodowle plastrów embrionalnego brzusznego śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro

W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.

Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Ten film demonstruje metodę przygotowania organotypowych kultur wycinków hipokampa z mózgu szczeniaka szczura. Przedstawia etapy związane z sekcją hipokampa, krojeniem i warunkami hodowli wymaganymi do promowania żywotności i wzrostu komórek w wycinkach hipokampa, ostatecznie generując organotypowe kultury warstwowe.

Przygotowanie organtypowych kultur plasterkowych z hipokampa szczeniaka szczura

Wideo demonstruje metodę uzyskiwania wycinków kory nosowej i hipokampa z mózgu szczeniaka szczura i hodowania ich w błoniastych wkładkach na wielodołkowej płytce wypełnionej pożywką do dalszej analizy.

Przygotowanie plasterków kory nosa i hipokampa z mózgu szczeniaka szczura

Opisano technikę badania komórek NG2 i oligodendrocytów za pomocą systemu hodowli plasterkowej w przodomózgowiu i móżdżku.  Metoda ta pozwala na badanie dynamiki proliferacji i różnicowania komórek w obrębie linii oligodendrocytów, w której można łatwo manipulować środowiskiem zewnątrzkomórkowym przy zachowaniu cytoarchitektury tkanek.

Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Tutaj opisujemy technikę badania neurogenezy poporodowej hipokampa za pomocą techniki organotypowej hodowli plastrów. Metoda ta pozwala na manipulację neurogenezą dorosłych w warunkach in vitro i pozwala na bezpośrednie zastosowanie środków farmakologicznych do hodowanego hipokampa.

Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Opisujemy protokół specyficznej dla typu komórki ekspresji genetycznie kodowanego czujnika opartego na FRET ATeam1.03YEMK w organotypowych kulturach warstwowych przodomózgowia myszy. Ponadto pokazujemy, jak wykorzystać ten czujnik do dynamicznego obrazowania komórkowych poziomów ATP w neuronach i astrocytach.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowego ATP w organotypowych wycinkach tkanki mózgu myszy przy użyciu czujnika ATeam1.03YEMK opartego na FRET

Tutaj opisujemy przygotowanie organicznych plastrów kory nosa i hipokampa. Przy stopniowym i kontrolowanym pozbawianiu surowicy, plastry te przedstawiają ewoluujące zdarzenia podobne do padaczki i mogą być uważane za model epileptogenezy ex vivo. System ten stanowi doskonałe narzędzie do monitorowania dynamiki spontanicznej aktywności, a także do oceny progresji cech neurozapalnych w całym przebiegu epileptogenezy.

Model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa

Naucz się przygotowywać organtypowe kultury plasterkowe mózgów szczurów E18. Ta metoda obejmuje disekcję, zatopienie w agarozie, cięcie wibratorem i hodowlę. Technika ta umożliwia badanie rozwoju kory mózgowej oraz migracji neuronów in vitro.

Organotypowa hodowla plastrów mózgu szczura w 18. dniu embrionalnym (E18)

Przeglądaj więcej filmów