Podwójne rejestracje metodą patch-clamp z neuronów ruchowych i docelowych mięśni szkieletowych u danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesna rejestracja elektrofizjologiczna potencjału czynnościowego neuronu ruchowego oraz związanej z nim odpowiedzi synaptycznej w mięśniu docelowym. Jest to osiągane poprzez wstępne usunięcie skóry z górnej strony ryby. Drugim etapem procedury jest odsłonięcie rdzenia kręgowego poprzez usunięcie wszystkich nadkładających go komórek mięśni grzbietowych.

Trzecim krokiem procedury jest odsłonięcie docelowego mięśnia szybkiego poprzez usunięcie górnej warstwy mięśnia wolnego. Ostatnim etapem procedury jest zastosowanie zacisku prądowego (current clamp) dla pierwotnego neuronu lub neuronu czapki oraz zacisku napięciowego (voltage clamp) dla docelowego mięśnia szkieletowego. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące odpowiedzi synaptyczne w mięśniu związane z generowaniem potencjałów czynnościowych przez neuron ruchowy, dzięki jednoczesnemu zastosowaniu zacisku prądowego w neuronie ruchowym i zacisku napięciowego w docelowym mięśniu.

Model LaVar Super Fish oferuje szereg zalet, ułatwiając rejestrację z par motoneuronu i mięśnia szkieletowego; niewielki rozmiar mięśnia pozwala na efektywną metodę voltage clamp, a stereotypowe cechy motoneuronu w czepcu umożliwiają jego łatwą identyfikację i dostęp. Teraz przedstawię procedury wymagane do ustanowienia patch clamp zarówno neuronu, jak i mięśnia. Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować pięć kluczowych roztworów: roztwór kąpielowy (Bath solution), roztwór kąpielowy z Trica, roztwór kąpielowy z IDE, wewnętrzny roztwór neuronu oraz wewnętrzny roztwór mięśnia.

Następnie należy odłowić jedną larwę danio pręgowanego w wieku od 72 do 96 godzin i umieścić ją w roztworze kąpielowym z tricainą. W ciągu jednej minuty od ekspozycji na środek znieczulający ryba przestanie reagować. Aby sprawdzić brak reakcji na dotyk, należy położyć rybę na plastikowej płytce i, korzystając ze stereomikroskopu, przeprowadzić dekapitację za pomocą dwustronnej żyletki.

Przenieś rybę do szklanej komory rejestracyjnej powleczonej sarda i wypełnionej roztworem bass. Za pomocą szpilki wykonaj płat skóry w pobliżu końca rostralnego ryby, który zapewni odpowiedni uchwyt dla pęsety precyzyjnej. Usuń znajdującą się powyżej skórę, chwytając ją pęsetą precyzyjną w pobliżu szpilki rostralnej.

Powoli odwarstw skórę, przesuwając palcami w kierunku ogona, aby ją usunąć. Potraktuj rybę 3 mL roztworu kąpieli z form IDE przez 3 do 5 minut, aby zablokować skurcze mięśni, które mogłyby zakłócić pomiary. Przepłucz pięciokrotnie standardowym roztworem kąpieli.

Usuń część powierzchownej warstwy mięśni nad pięcioma do sześciu segmentami, delikatnie skrobiąc ją bokiem igły wolframowej. Przenieś rybę pod mikroskop pionowy umieszczony w klatce Faradaya w celu ekranowania zakłóceń elektrycznych. Mikroskop jest wyposażony w stały stolik, obiektyw 40 x o dużej odległości roboczej oraz zoom od 0,5 do 4 x.

Mikroskop jest zamontowany na zmotoryzowanym stole przesuwczym XY. Aby przemieszczyć preparat między nerwem a mięśniem przy dużym powiększeniu, zastosowanie optyki kontrastu interferencyjnego różnicowego pomaga w wizualizacji neuronów przy powiększeniu 0,5 x. Należy użyć pipety o szerokim świetle 15 micron, aby usunąć nadleżący mięsień i odsłonić rdzeń kręgowy.

Podciśnienie jest wytwarzane za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 3 cc, a komórki mięśniowe są usuwane jedna po drugiej. Procedurę tę powtarza się dla pięciu do sześciu grzbietowych segmentów mięśni szkieletowych. Tą samą pipetą o szerokim wlocie usuwa się również dwie górne warstwy mięśni brzusznych w celu uzyskania docelowych szybkich mięśni szkieletowych.

To kończy przygotowania do rejestracji parzystych, a powiększenie mikroskopu zostaje zwiększone do około 1.6 x. Przeskanowano czyste segmenty w celu zlokalizowania neuronów czapkowych. Każdy segment HEMI rdzenia kręgowego zawiera jeden duży motoneuron czapkowy o średnicy 10 micron.

To ciało komórki w kształcie łzy znajduje się powierzchownie pod spinal Jira, w pobliżu najbardziej dystalnego końca granicy segmentarnej. Wybierany jest neuron czapkowy do rejestracji, a następnie skanowany jest powiązany segment dystalny oraz brzuszne pole mięśni docelowych w celu sprawdzenia ich integralności. Dwie elektrody patch-clamp są rozmieszczone do rejestracji: jedna dla neuronu, a druga dla mięśnia.

Górna elektroda posiada niewielki stożek umożliwiający przebicie twardej opony twardej rdzenia kręgowego oraz otwór w końcówce o średnicy około dwóch mikronów. Dolna elektroda posiada bardziej stromy stożek, przeznaczony do rejestracji metodą voltage clamp z niską rezystancją w mięśniach szkieletowych. Ustaw elektrodę neuronową pod kątem około 30 stopni, aby przebić oponę twardą rdzenia kręgowego.

Około połowy segmentu rostralnie od wybranego neuronu czepnego (cap neuron) należy posunąć elektrodę za pomocą manipulatora z napędem osiowym, stosując jednocześnie delikatne, ciągłe nadciśnienie o wartości około 60 mmHg. W momencie przebijania opony twardej przez elektrodę, neuron czepny może zostać przesunięty przez perfuzję z elektrody, co będzie wymagało ponownego ustawienia ogniska. Gdy elektroda dotknie SOMY neuronu czepnego, nadciśnienie zostaje zwolnione, co zazwyczaj skutkuje natychmiastowym utworzeniem giga-uszczelnienia (giga seal).

Jednak w niektórych przypadkach, gdy nie udaje się stworzyć szczelnego połączenia, konieczne staje się zastosowanie delikatnego podciśnienia. Po utworzeniu uszczelnienia potencjał elektrody zostaje ustawiony na -80 mV, a przyłożenie podciśnienia powoduje przerwanie błony komórkowej. Neuron czepkowy charakteryzuje się rezystancją wejściową od 140 do 180 MΩ oraz potencjałem czynnościowym, którego przeskok przekracza +40 mV.

Jest to testowane poprzez wstrzykiwanie stopniowo zwiększających się skoków depolaryzujących w trybie clamp prądowy, aż do wywołania potencjału czynnościowego. Następnie, przy użyciu zmotoryzowanego translatora XY, mikroskop zostaje przesunięty na mięsień brzuszny. Przy dużym powiększeniu, z wybranego pola obserwacyjnego wybierana jest komórka mięśnia szkieletowego o szybkim skurczu.

Elektrodę mięśniową przesuwa się w kierunku docelowej komórki mięśniowej pod dodatnim ciśnieniem, które po zwolnieniu tworzy giga-uszczelnienie (giga seal); potencjał elektrody zostaje ustawiony na -50 mV w celu inaktywacji kanałów sodowych. Następnie, pod wpływem delikatnego ssania, dochodzi do przerwania membrany komórkowej. Spadek rezystancji do 100–200 MΩ oraz nagłe pojawienie się dużego przejściowego prądu pojemnościowego sygnalizują wejście do komórki i gotowość do testowania pary.

Rejestruje się depolaryzację neuronu ruchowego poprzez stopniowo zwiększane wstrzyknięcia prądu, aż do wywołania potencjału czynnościowego. W tym momencie w mięśniu powinien zostać wywołany prąd płytki końcowej; dalsza stymulacja neuronu ruchowego z częstotliwością 1 Hz skutkuje występowaniem prądów płytki końcowej bez występowania niepowodzeń. Po zwiększeniu częstotliwości stymulacji do 100 Hz amplituda prądów płytki końcowej ulega wahaniom, a w ciągu 10 s stymulacji dochodzi do ich funkcjonalnego wyczerpania.

Zazwyczaj rejestracja z neuronu jest stabilna do jednej godziny, jednak komórki mięśniowe ulegają degradacji, co objawia się wzrostem oporu szeregowego. W takim przypadku eksperyment zostaje zakończony lub przeprowadza się patch-clamp kolejnej komórki mięśniowej. Wszystkie rejestracje powinny zostać ukończone w ciągu jednej godziny.

Po opanowaniu techniki pracy z jedną parą, nagrywanie można ukończyć w czasie od godziny do półtorej godziny. Możliwe jest również uzyskanie jednej lub dwóch dodatkowych par w sąsiednich segmentach. Typowy dzień nagrań pozwala na uzyskanie od dwóch do trzech par.

Rejestracje par neuronów ruchowych i mięśni szkieletowych dają wyjątkową możliwość zbadania podstawowych mechanizmów przekaźnictwa nerwowo-mięśniowego. W połączeniu z liniami ryb z mutacją Motility metoda ta pozwala precyzyjnie określić źródło dysfunkcji nerwowo-mięśniowej oraz dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw ludzkich schorzeń, takich jak zespół przerzutowy.