Name: Sparowane nagrania patch clamp z neuronu ruchowego i docelowych mięśni szkieletowych u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Poznaj metodę patch clamp do jednoczesnego rejestrowania aktywności neuronu ruchowego i mięśnia szkieletowego u larw Danio rerio. Technika ta umożliwia badanie przekazywania sygnałów w złączach nerwowo-mięśniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowane przez NIH (NS-18205).

1. Przygotowanie ryb do rejestracji parowych
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować pięć kluczowych roztworów: roztwór kąpielowy (Bath Solution), roztwór kąpielowy z trikainą (MS222), roztwór kąpielowy z formamidem, wewnętrzny roztwór neuronów oraz wewnętrzny roztwór mięśni.</li>
	<li>Następnie należy pobrać jedną larwę danio pręgowanego w wieku od 72 do 96 godzin i umieścić ją w roztworze kąpielowym z trikainą. W ciągu jednej minuty od kontaktu z anestetykiem ryba przestanie reagować na dotyk.</li>
	<li>Umieść rybę na plastikowym spodku i, korzystając ze stereomikroskopu, oddziel głowę za pomocą dwustronnej żyletki.</li>
	<li>Przenieś rybę do szklanej komory rejestracyjnej pokrytej sylgardem i wypełnionej roztworem kąpielowym. Przymocuj ją na obu końcach, wbijając elektrochemicznie zaostrzone piny wolframowe przez strunę grzbietową.</li>
	<li>Za pomocą pinu stwórz płatek skóry w pobliżu końca rostralnego ryby, który zapewni odpowiedni uchwyt dla precyzyjnej pęsety. Usuń znajdującą się powyżej skórę, chwytając ją w pobliżu pinu rostralnego precyzyjną pęsetą. Powoli odrywaj skórę w kierunku caudalnym, aby ją usunąć.</li>
	<li>Potraktuj rybę 3 ml roztworu kąpielowego z formamidem przez 3-5 minut, aby zablokować skurcze mięśni, które mogłyby zakłócić pomiary. Przepłucz 5 razy zwykłym roztworem kąpielowym. Usuń część powierzchownej warstwy mięśni nad 5 do 6 segmentami, delikatnie zeskrobując ją bokiem pinu wolframowego.</li>
	<li>Przenieś rybę pod mikroskop pionowy umieszczony w klatce Faradaya w celu ekranowania zakłóceń elektrycznych. Mikroskop jest wyposażony w stały stolik, obiektyw 40x o dużej odległości roboczej oraz zoom od 0,5 do 4x. Mikroskop jest zamontowany na zmotoryzowanym stoliku translacyjnym X-Y, aby umożliwić przemieszczanie preparatu między nerwem a mięśniem przy dużym powiększeniu. Zastosowanie optyki kontrastu interferencyjnego (DIC) pomaga w wizualizacji neuronów.</li>
	<li>Przy powiększeniu 0,5x użyj pipety o szerokim otworze (15 µm), aby usunąć nadległy mięsień i odsłonić rdzeń kręgowy. Podciśnienie jest wytwarzane za pomocą jednorazowej strzykawki 3 cc, a komórki mięśniowe są usuwane pojedynczo. Procedurę tę powtarza się dla 5 do 6 grzbietowych segmentów mięśni szkieletowych. Tą samą pipetą o szerokim otworze usuwa się również dwie górne warstwy mięśni brzusznych, aby uzyskać docelowe szybkie mięśnie szkieletowe.</li>
	<li>To kończy przygotowanie do rejestracji sparowanej; powiększenie mikroskopu zwiększa się do około 1,6x.</li>
</ol>
2. Rejestracje sparowane neuronów ruchowych CaP i komórek mięśni docelowych
<ol>
	<li>Oczyszczone segmenty są skanowane w celu zlokalizowania neuronów CaP. Każdy półsegment rdzenia kręgowego zawiera jeden duży neuron ruchowy CaP o średnicy 10 µm. To łezkowate ciało komórki znajduje się powierzchownie pod oponą twardą rdzenia, w pobliżu najbardziej kaudalnego końca granicy segmentu. Wybierany jest neuron CaP do rejestracji, a następnie skanowany jest docelowy mięsień brzuszny w sąsiednim segmencie kaudalnym w celu sprawdzenia jego integralności.</li>
	<li>Do rejestracji ustawiane są dwie elektrody typu patch, jedna dla neuronu i druga dla mięśnia. Górna elektroda ma łagodny stożek, umożliwiający penetrację twardej opony rdzenia, oraz otwór końcowy o średnicy około 2 µm. Dolna elektroda ma bardziej stromy stożek, przeznaczony do rejestracji w konfiguracji voltage clamp o niskiej rezystancji w mięśniach szkieletowych.</li>
	<li>Elektrodę do neuronu ustawia się pod kątem około 30 stopni, aby spenetrować oponę twardą rdzenia, około półsegmenta rostralnie względem wybranego neuronu CaP. Elektrodę posuwa się za pomocą manipulatora z napędem osiowym, przykładając delikatne, ciągłe nadciśnienie o wartości około 60 mmHg. W momencie przebicia opony twardej neuron CaP może zostać przesunięty przez perfuzję z elektrody, co wymaga ponownego ustawienia ostrości.</li>
	<li>Gdy elektroda dotknie ciała komórki neuronu CaP, nadciśnienie jest zwalniane, co zazwyczaj prowadzi do natychmiastowego utworzenia uszczelnienia gigaohmostowego (gigaohm seal). Jednak w niektórych przypadkach, gdy uszczelnienie nie powstaje, konieczne jest zastosowanie delikatnego podciśnienia. Po utworzeniu uszczelnienia potencjał elektrody jest ustawiany na -80 mV, a zastosowanie podciśnienia powoduje przerwanie błony komórkowej. Neuron CaP charakteryzuje się rezystancją wejściową od 140 do 180 MΩ oraz potencjałem czynnościowym, który przekracza +40 mV. Jest to sprawdzane poprzez wstrzykiwanie inkrementalnie zwiększających się skoków depolaryzacyjnych w konfiguracji current clamp, aż do wywołania potencjału czynnościowego.</li>
	<li>Następnie, przy użyciu zmotoryzowanego translatora X-Y i dużym powiększeniu, mikroskop zostaje przesunięty na mięsień brzuszny. Z wyznaczonego pola wybierana jest szybka komórka mięśniowa.</li>
	<li>Elektroda do mięśnia jest posuwana w kierunku docelowej komórki mięśniowej pod nadciśnieniem, które po zwolnieniu tworzy uszczelnienie gigaohmostowe. Potencjał elektrody jest ustawiany na -50 mV w celu inaktywacji kanałów sodowych, a następnie pod wpływem delikatnego ssania błona komórkowa zostaje przerwana. Spadek rezystancji do 100–200 MΩ oraz nagłe pojawienie się dużych przejściowych prądów pojemnościowych sygnalizują wejście do komórki.</li>
	<li>Aby przetestować rejestrację sparowaną, neuron ruchowy jest depolaryzowany poprzez inkrementalnie większe wstrzyknięcia prądu, aż do wywołania potencjału czynnościowego. W tym momencie w mięśniu powinien zostać wywołany prąd blaszki końcowej. Dalsza stymulacja neuronu ruchowego z częstotliwością 1 Hz skutkuje powtarzalnym występowaniem prądów blaszki końcowej. Po zwiększeniu częstotliwości stymulacji do 100 Hz amplituda prądów blaszki końcowej ulega wahaniom i dochodzi do ich funkcjonalnego wyczerpania w ciągu 10 sekund stymulacji.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Zazwyczaj rejestracja z neuronu jest stabilna przez maksymalnie jedną godzinę, natomiast komórki mięśniowe ulegają degradacji, co objawia się wzrostem oporności szeregowej. W takim przypadku eksperyment zostaje przerwany lub poddaje się patch-clampowi inną komórkę mięśniową. Wszystkie pomiary powinny zostać zakończone w ciągu jednej godziny.
<img src="/files/ftp_upload/2351/2351fig1.jpg" alt="Wykres elektrofizjologiczny przedstawiający pomiary AP i EPC w wynikach eksperymentu zacisku napięciowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Rejestracje potencjału czynnościowego neuronu ruchowego (AP, góra) oraz powiązanego z nim prądu blaszki końcowej mięśnia (EPC, dół). Potencjał czynnościowy neuronu CaP powinien przekroczyć +40 mV, a EPC powinien wzrosnąć w ciągu 300 μsec i zanikać zgodnie z przebiegiem wykładniczym ze stałą czasową poniżej 1 msec.
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Nazwa </td>
 <td>Procedura przygotowania</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Roztwór kąpieli (w mM)</td>
 <td>134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl22, 10 glukozy, 10 Na-HEPES, pH 7,8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Roztwór kąpielowy z trikainą</td>
 <td>Roztwór kąpielowy zawierający 0,02% tricainy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Roztwór kąpieli z formamidem</td>
 <td>Roztwór do kąpieli zawierający 2M formamid</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Roztwór wewnętrzny neuronu (w mM)</td>
 <td>115 K-glukonianu, 15 KCl, 2 MgCl22, 10 mM HEPES-K, 5 mM EGTA-K, 4 mM Mg-ATP, pH 7,2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Roztwór wewnętrzny mięśnia (w mM)</td>
 <td>120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, pH 7,4</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Roztwory.

<ol><li>Fetcho, J. R., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+networks+in+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal networks in behaving animals.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7, 832-838 (1997).</li>
<li>Fetcho, J. R., S, H. igashijima <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+and+genetic+approaches+toward+understanding+neuronal+circuits+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical and genetic approaches toward understanding neuronal circuits in zebrafish.</a> Integr Comp Biol. 44, 57-70 (2004).</li>
<li>Ibañez-Tallon, I., Wen, H., Miwa, J., Xing, J., Aslantas-Tekinay, A., Ono, F., Brehm, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethering+naturally+occurring+peptide+toxins+for+cell+autonomous+modulation+of+ion+channels+and+receptors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tethering naturally occurring peptide toxins for cell autonomous modulation of ion channels and receptors in vivo.</a> Neuron. 43, 305-311 (2004).</li>
<li>Li, W., Ono, F., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurements+of+presynaptic+release+in+mutant+zebrafish+lacking+postsynaptic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optical measurements of presynaptic release in mutant zebrafish lacking postsynaptic receptors.</a> J. Neuroscience. , 23-10467 (2003).</li>
<li>Ono, F., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+receptors+direct+rapsyn+clusters+to+the+neuromuscular+synapse+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine receptors direct rapsyn clusters to the neuromuscular synapse in zebrafish.</a> J. Neuroscience. 24, 475-5481 (2004).</li>
<li>Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Fetcho, J., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralytic+zebrafish+lacking+ACh+receptors+fail+to+localize+rapsyn+clusters+to+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Paralytic zebrafish lacking ACh receptors fail to localize rapsyn clusters to the synapse.</a> J. Neuroscience. 21, 5439-5448 (2001).</li>
<li>Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+motility+mutant+twitch+once+reveals+new+roles+for+rapsyn+in+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The zebrafish motility mutant twitch once reveals new roles for rapsyn in synaptic function.</a> J. Neuroscience. 22, 6491-6498 (2002).</li>
<li>Wang, M., Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+neuromuscular+synapses+in+the+zebrafish+choline-acetyltransferase+mutant+bajan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Function of neuromuscular synapses in the zebrafish choline-acetyltransferase mutant bajan.</a> J Neurophysiol. , 100-104 (2008).</li>
<li>Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+motor-neuron+muscle+recordings+in+zebrafish+test+the+receptor+blockade+model+for+shaping+synaptic+current%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Paired motor-neuron muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current.</a> J. Neuroscience. 25, 8104-8111 (2005).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Stosujemy podwójne rejestracje u rybek zebrafish (Wen i Brehm, 2005) głównie w celu badania procesów uwalniania i recyklingu pęcherzyków podczas stymulacji o wysokiej częstotliwości. Proces ten jest zaburzony u mutantów ruchowych, u których prawidłowa transmisja synaptyczna jest upośledzona z powodu mutacji punktowych w kluczowych komponentach synaptycznych. Na przykład mutacje zakłócające agregaty receptorów postsynaptycznych (Ono et al., 2001, 2002, 2004) oraz syntezę przekaźnika presynaptycznego (Wang et al., 2008) skutkują nieskoordynowanym pływaniem. Podwójne rejestracje dostarczają informacji, które pozwalają precyzyjnie określić źródło defektu funkcjonalnego, łącząc w ten sposób zachowanie, genetykę i fizjologię. Obecnie możliwe powinno być dalsze analizowanie procesów leżących u podstaw transmisji synaptycznej za pomocą przejściowej ekspresji w neuronach ruchowych CaP przy użyciu odpowiednio dobranych promotorów. W ten sposób geny dominująco negatywne lub zmutowane mogą być specyficznie wyrażane w tych neuronach, co pozwala na określenie skutków zarówno behawioralnych, jak i elektrofizjologicznych. Dodatkową zaletą oferowaną przez konfigurację whole-cell jest możliwość dializy somy CaP za pomocą czynników, które mogą potencjalnie zmieniać recykling pęcherzyków, takich jak toksyny klostrydialne i bufory wapnia. Ze względu na krótką odległość między somą a mięśniem, dyfuzja powinna zachodzić w czasie mniejszym niż czas trwania rejestracji. Potencjał tej preparatyki został dopiero zaczęty być wykorzystany. Przezroczystość ryby w tym wieku oraz powierzchowne rozmieszczenie synaps ułatwiają również stosowanie narzędzi optycznych (Fetcho i O'Malley, 1997; Fetcho i Higashijima, 2004). Odnieśliśmy sukcesy w pomiarach endocytozy i egzocytozy u żywych ryb przy użyciu barwników FM i wskaźników genetycznych, takich jak Synaptophluorin (Li et al., 2003). Dodatkowo, toksyny sprzężone z fluorescencją mogą być używane do znakowania białek synaptycznych w celu obrazowania żywych ryb (Ibanez-Tallon et al., 2004). Biorąc pod uwagę prostotę tej preparatyki, daje ona duże nadzieje na przyszłe badania.

<table><tbody><tr><td>Tester przetwornika pneumatycznego</td><td>Fluke Biomedical</td><td>DPM1B</td><td></td></tr><tr><td>Pręt wolframowy 0.002 x 3 inch</td><td>A-M Systems</td><td>715000</td><td></td></tr><tr><td>Elastomer Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Grubość aplikacji wpłynie na optykę DIC</td></tr></tbody></table>

podwójne rejestracje metodą patch-clamp z neuronów ruchowych i docelowych mięśni szkieletowych u danio pręgowanego

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larwy danio pręgowanego stanowią pierwszy kręgowcowy system modelowy umożliwiający jednoczesną rejestrację metodą patch-clamp z rdzeniowego neuronu ruchowego i mięśnia docelowego. Jest to bezpośredni skutek dostępności obu typów komórek oraz możliwości wizualnego odróżnienia pojedynczego segmentowego neuronu ruchowego CaP na podstawie morfologii i lokalizacji. Niniejszy film prezentuje metody mikroskopowe stosowane do identyfikacji neuronu ruchowego CaP i komórek mięśni docelowych, a także metodologię rejestracji z każdego z tych typów komórek. Identyfikacja typu neuronu ruchowego CaP jest potwierdzana poprzez wypełnianie barwnikiem lub na podstawie cech biofizycznych, takich jak kształt potencjału czynnościowego i oporność wejściowa komórki. Rejestracje z neuronów ruchowych trwają rutynowo jedną godzinę, co pozwala na długoterminowe pomiary z wielu różnych komórek mięśni docelowych. Kontrola nad wzorcem wyładowań neuronu ruchowego umożliwia pomiary zależności częstotliwościowej przewodnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym. Dzięki dużej wielkości kwantowej i niskiemu poziomowi szumów zapewnianemu przez metodę voltage clamp w konfiguracji whole-cell, wszystkie zdarzenia jednostkowe w mięśniu mogą zostać rozdzielone. Cecha ta pozwala na badanie podstawowych właściwości synaptycznych, takich jak właściwości uwalniania, recykling pęcherzyków, a także depresja i facylitacja synaptyczna. Zalety oferowane przez tę preparację in vivo przewyższają poprzednie badane systemy modelowe złącza nerwowo-mięśniowego, w których neurony ruchowe są zazwyczaj stymulowane elektrodami zewnątrzkomórkowymi, a mięśnie są zbyt duże dla metody patch-clamp w konfiguracji whole-cell. Preparat z danio pręgowanego umożliwia łączenie analizy elektrofizjologicznej z szerokim zakresem podejść, w tym z wykorzystaniem linii transgenicznych, wyciszaniem za pomocą morfolino, interwencją farmakologiczną oraz obrazowaniem in vivo. Podejścia te, w połączeniu z rosnącą liczbą modeli chorób nerwowo-mięśniowych dostarczanych przez mutantowe linie danio pręgowanego, otwierają drogę do nowego zrozumienia ludzkich zaburzeń nerwowo-mięśniowych.

Larwy danio pręgowanego stanowią pierwszy kręgowcowy system modelowy umożliwiający jednoczesną rejestrację metodą patch-clamp z motoneuronu rdzeniowego i docelowego mięśnia szkieletowego. Niniejszy film prezentuje metody mikroskopowe stosowane do identyfikacji segmentowego motoneuronu CaP oraz docelowych komórek mięśniowych, a także metodologię rejestracji z każdego z tych typów komórek.

Podwójne rejestracje metodą patch-clamp z neuronów ruchowych i docelowych mięśni szkieletowych u danio pręgowanego

Larwy zebrafish stanowią pierwszy kręgowy model systemowy umożliwiający jednoczesną rejestrację metodą patch clamp z motoneuronu rdzeniowego i mięśnia docelowego. ...

Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesna rejestracja elektrofizjologiczna potencjału czynnościowego neuronu ruchowego oraz związanej z nim odpowiedzi synaptycznej w mięśniu docelowym. Jest to osiągane poprzez wstępne usunięcie skóry z górnej strony ryby. Drugim etapem procedury jest odsłonięcie rdzenia kręgowego poprzez usunięcie wszystkich nadkładających go komórek mięśni grzbietowych.Trzecim krokiem procedury jest odsłonięcie docelowego mięśnia szybkiego poprzez usunięcie górnej warstwy mięśnia wolnego. Ostatnim etapem procedury jest zastosowanie zacisku prądowego (current clamp) dla pierwotnego neuronu lub neuronu czapki oraz zacisku napięciowego (voltage clamp) dla docelowego mięśnia szkieletowego. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące odpowiedzi synaptyczne w mięśniu związane z generowaniem potencjałów czynnościowych przez neuron ruchowy, dzięki jednoczesnemu zastosowaniu zacisku prądowego w neuronie ruchowym i zacisku napięciowego w docelowym mięśniu.Model LaVar Super Fish oferuje szereg zalet, ułatwiając rejestrację z par motoneuronu i mięśnia szkieletowego; niewielki rozmiar mięśnia pozwala na efektywną metodę voltage clamp, a stereotypowe cechy motoneuronu w czepcu umożliwiają jego łatwą identyfikację i dostęp. Teraz przedstawię procedury wymagane do ustanowienia patch clamp zarówno neuronu, jak i mięśnia. Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować pięć kluczowych roztworów: roztwór kąpielowy (Bath solution), roztwór kąpielowy z Trica, roztwór kąpielowy z IDE, wewnętrzny roztwór neuronu oraz wewnętrzny roztwór mięśnia.Następnie należy odłowić jedną larwę danio pręgowanego w wieku od 72 do 96 godzin i umieścić ją w roztworze kąpielowym z tricainą. W ciągu jednej minuty od ekspozycji na środek znieczulający ryba przestanie reagować. Aby sprawdzić brak reakcji na dotyk, należy położyć rybę na plastikowej płytce i, korzystając ze stereomikroskopu, przeprowadzić dekapitację za pomocą dwustronnej żyletki.Przenieś rybę do szklanej komory rejestracyjnej powleczonej sarda i wypełnionej roztworem bass. Za pomocą szpilki wykonaj płat skóry w pobliżu końca rostralnego ryby, który zapewni odpowiedni uchwyt dla pęsety precyzyjnej. Usuń znajdującą się powyżej skórę, chwytając ją pęsetą precyzyjną w pobliżu szpilki rostralnej.Powoli odwarstw skórę, przesuwając palcami w kierunku ogona, aby ją usunąć. Potraktuj rybę 3 mL roztworu kąpieli z form IDE przez 3 do 5 minut, aby zablokować skurcze mięśni, które mogłyby zakłócić pomiary. Przepłucz pięciokrotnie standardowym roztworem kąpieli.Usuń część powierzchownej warstwy mięśni nad pięcioma do sześciu segmentami, delikatnie skrobiąc ją bokiem igły wolframowej. Przenieś rybę pod mikroskop pionowy umieszczony w klatce Faradaya w celu ekranowania zakłóceń elektrycznych. Mikroskop jest wyposażony w stały stolik, obiektyw 40 x o dużej odległości roboczej oraz zoom od 0,5 do 4 x.Mikroskop jest zamontowany na zmotoryzowanym stole przesuwczym XY. Aby przemieszczyć preparat między nerwem a mięśniem przy dużym powiększeniu, zastosowanie optyki kontrastu interferencyjnego różnicowego pomaga w wizualizacji neuronów przy powiększeniu 0,5 x. Należy użyć pipety o szerokim świetle 15 micron, aby usunąć nadleżący mięsień i odsłonić rdzeń kręgowy.Podciśnienie jest wytwarzane za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 3 cc, a komórki mięśniowe są usuwane jedna po drugiej. Procedurę tę powtarza się dla pięciu do sześciu grzbietowych segmentów mięśni szkieletowych. Tą samą pipetą o szerokim wlocie usuwa się również dwie górne warstwy mięśni brzusznych w celu uzyskania docelowych szybkich mięśni szkieletowych.To kończy przygotowania do rejestracji parzystych, a powiększenie mikroskopu zostaje zwiększone do około 1.6 x. Przeskanowano czyste segmenty w celu zlokalizowania neuronów czapkowych. Każdy segment HEMI rdzenia kręgowego zawiera jeden duży motoneuron czapkowy o średnicy 10 micron.To ciało komórki w kształcie łzy znajduje się powierzchownie pod spinal Jira, w pobliżu najbardziej dystalnego końca granicy segmentarnej. Wybierany jest neuron czapkowy do rejestracji, a następnie skanowany jest powiązany segment dystalny oraz brzuszne pole mięśni docelowych w celu sprawdzenia ich integralności. Dwie elektrody patch-clamp są rozmieszczone do rejestracji: jedna dla neuronu, a druga dla mięśnia.Górna elektroda posiada niewielki stożek umożliwiający przebicie twardej opony twardej rdzenia kręgowego oraz otwór w końcówce o średnicy około dwóch mikronów. Dolna elektroda posiada bardziej stromy stożek, przeznaczony do rejestracji metodą voltage clamp z niską rezystancją w mięśniach szkieletowych. Ustaw elektrodę neuronową pod kątem około 30 stopni, aby przebić oponę twardą rdzenia kręgowego.Około połowy segmentu rostralnie od wybranego neuronu czepnego (cap neuron) należy posunąć elektrodę za pomocą manipulatora z napędem osiowym, stosując jednocześnie delikatne, ciągłe nadciśnienie o wartości około 60 mmHg. W momencie przebijania opony twardej przez elektrodę, neuron czepny może zostać przesunięty przez perfuzję z elektrody, co będzie wymagało ponownego ustawienia ogniska. Gdy elektroda dotknie SOMY neuronu czepnego, nadciśnienie zostaje zwolnione, co zazwyczaj skutkuje natychmiastowym utworzeniem giga-uszczelnienia (giga seal).Jednak w niektórych przypadkach, gdy nie udaje się stworzyć szczelnego połączenia, konieczne staje się zastosowanie delikatnego podciśnienia. Po utworzeniu uszczelnienia potencjał elektrody zostaje ustawiony na -80 mV, a przyłożenie podciśnienia powoduje przerwanie błony komórkowej. Neuron czepkowy charakteryzuje się rezystancją wejściową od 140 do 180 MΩ oraz potencjałem czynnościowym, którego przeskok przekracza +40 mV.Jest to testowane poprzez wstrzykiwanie stopniowo zwiększających się skoków depolaryzujących w trybie clamp prądowy, aż do wywołania potencjału czynnościowego. Następnie, przy użyciu zmotoryzowanego translatora XY, mikroskop zostaje przesunięty na mięsień brzuszny. Przy dużym powiększeniu, z wybranego pola obserwacyjnego wybierana jest komórka mięśnia szkieletowego o szybkim skurczu.Elektrodę mięśniową przesuwa się w kierunku docelowej komórki mięśniowej pod dodatnim ciśnieniem, które po zwolnieniu tworzy giga-uszczelnienie (giga seal); potencjał elektrody zostaje ustawiony na -50 mV w celu inaktywacji kanałów sodowych. Następnie, pod wpływem delikatnego ssania, dochodzi do przerwania membrany komórkowej. Spadek rezystancji do 100–200 MΩ oraz nagłe pojawienie się dużego przejściowego prądu pojemnościowego sygnalizują wejście do komórki i gotowość do testowania pary.Rejestruje się depolaryzację neuronu ruchowego poprzez stopniowo zwiększane wstrzyknięcia prądu, aż do wywołania potencjału czynnościowego. W tym momencie w mięśniu powinien zostać wywołany prąd płytki końcowej; dalsza stymulacja neuronu ruchowego z częstotliwością 1 Hz skutkuje występowaniem prądów płytki końcowej bez występowania niepowodzeń. Po zwiększeniu częstotliwości stymulacji do 100 Hz amplituda prądów płytki końcowej ulega wahaniom, a w ciągu 10 s stymulacji dochodzi do ich funkcjonalnego wyczerpania.Zazwyczaj rejestracja z neuronu jest stabilna do jednej godziny, jednak komórki mięśniowe ulegają degradacji, co objawia się wzrostem oporu szeregowego. W takim przypadku eksperyment zostaje zakończony lub przeprowadza się patch-clamp kolejnej komórki mięśniowej. Wszystkie rejestracje powinny zostać ukończone w ciągu jednej godziny.Po opanowaniu techniki pracy z jedną parą, nagrywanie można ukończyć w czasie od godziny do półtorej godziny. Możliwe jest również uzyskanie jednej lub dwóch dodatkowych par w sąsiednich segmentach. Typowy dzień nagrań pozwala na uzyskanie od dwóch do trzech par.Rejestracje par neuronów ruchowych i mięśni szkieletowych dają wyjątkową możliwość zbadania podstawowych mechanizmów przekaźnictwa nerwowo-mięśniowego. W połączeniu z liniami ryb z mutacją Motility metoda ta pozwala precyzyjnie określić źródło dysfunkcji nerwowo-mięśniowej oraz dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw ludzkich schorzeń, takich jak zespół przerzutowy.

paired-patch-clamp-recordings-from-motor-neuron-target-skeletal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Nagrania z pojedynczymi elektrodami łatkowymi z komórek ruchowych i docelowym mięśniem szkieletowym u danio pręgowanego

Celem tego filmu jest zaprezentowanie procedur pozyskiwania zdrowych, nienaruszonych komórek rzęskowych z organów ucha wewnętrznego dorosłych danio pręgowanych, a następnie wykorzystania ich w badaniach metodą patch clamp w celu scharakteryzowania właściwości biofizycznych ich kanałów sterowanych napięciem.

Rejestracje metodą patch-clamp w komórkach rzęsatych ucha wewnętrznego wyizolowanych z ryby danio-ostrobramowej

Ten protokół opisuje technikę zwaną elektrofizjologią klamer całokomórkowych, która jest metodą badania właściwości elektrycznych neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego.

Elektrofizjologia klamer krosowych całych komórek: metoda badania właściwości elektrycznych neuronów

Ten film demonstruje nieinwazyjny test do badania elektrofizjologii neuronów ruchowych w zarodkach danio pręgowanego. Po zmierzeniu zwijania ogona w zarodkach w wyniku spontanicznej depolaryzacji neuronów ruchowych rdzenia kręgowego, stosuje się bloker kanału sodowego w celu zmniejszenia częstotliwości zwijania. Następnie zarodki są unieruchamiane w agarozie i umieszczane pod mikroskopem fluorescencyjnym. Genetycznie zmodyfikowane neurony ruchowe wyrażają bioczujnik wykrywający napięcie z...

Nieinwazyjne podejście do badania elektrofizjologii neuronów ruchowych w zarodkach danio pręgowanego

Ten film demonstruje rejestrację sygnałów elektrycznych z neuronów doprowadzających u sparaliżowanej larwy danio pręgowanego poprzez umieszczenie mikropipety w pobliżu zwoju linii bocznej i utworzenie luźnej uszczelki do przechwytywania sygnału. Roztwór zewnątrzkomórkowy utrzymuje żywotność neuronów podczas tego procesu.

Monitorowanie sygnałów elektrycznych z neuronów aferentnych w unieruchomionej larwie danio pręgowanego

Danio pręgowany to nowy system do modelowania zaburzeń mięśni szkieletowych u ludzi.  Opisujemy szybką i skuteczną metodę izolowania włókien mięśniowych mięśni szkieletowych od embrionalnego i larwalnego danio pręgowanego.  Metoda ta pozwala uzyskać preparat z włókien mięśniowych o dużej gęstości, odpowiedni do badania morfologii pojedynczych włókien mięśni szkieletowych, lokalizacji subkomórkowej białek i fizjologii mięśni.

Analiza embrionalnych i larwalnych włókien mięśniowych szkieletu danio pręgowanego z preparatów zdysocjowanych

Opracowaliśmy nienaruszony preparat mózgowo-rdzeniowy do rejestrowania i monitorowania aktywności elektrycznej za pomocą zapisu za pomocą zacisku punktowego z neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego. W ten sposób jesteśmy w stanie rejestrować pobudzające i hamujące prądy synaptyczne, aktywność kanałów bramkowanych napięciem oraz potencjały czynnościowe z kluczowych neuronów w rozwijającym się zarodku.

Nagrania patch clamp z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego

Ten manuskrypt opisuje metody zapisów elektrofizjologicznych z neuronów rdzeniowych zarodków i larw danio pręgowanego. Preparat utrzymuje neurony in situ i często wiąże się z minimalnym rozwarstwieniem. Metody te pozwalają na badanie elektrofizjologiczne różnych neuronów rdzeniowych, od początkowego nabycia pobudliwości elektrycznej do wczesnych stadiów larwalnych.

Przygotowanie rdzenia kręgowego danio pręgowanego in situ do zapisów elektrofizjologicznych z rdzeniowych neuronów czuciowych i ruchowych

Opisujemy protokół monitorowania zmian w aktywności neuronu doprowadzającego podczas poleceń motorycznych w modelowym systemie komórek rzęsatych kręgowców.

Aktywność neuronów aferentnych tylnej linii bocznej podczas pływania u danio pręgowanego

Obecny protokół opisuje ostrą izolację żywotnych komórek mięśni gładkich serca i naczyń krwionośnych od dorosłego, młodocianego, larwalnego i embrionalnego danio pręgowanego (Danio rerio), nadającego się do badań elektrofizjologicznych.

Izolacja komórek mięśni gładkich serca i naczyń krwionośnych od dorosłych, młodocianych, larwalnych i embrionalnych danio pręgowanego do badań elektrofizjologicznych

Przejrzystość optyczna jest główną zaletą dla biologicznej i fizjologicznej pracy komórek u danio pręgowanego. Opisano solidne metody pomiaru wzrostu komórek u poszczególnych zwierząt, które pozwalają na nowy wgląd w to, w jaki sposób wzrost mięśni szkieletowych i sąsiednich tkanek jest zintegrowany ze wzrostem całego ciała.

Wielokrotne pomiary wzrostu mięśni szkieletowych w czasie rzeczywistym u poszczególnych żywych ryb danio pręgowanych poddanych zmienionej aktywności elektrycznej

Połączenie nerwowo-mięśniowe larw danio pręgowanego jest atrakcyjnym modelem do badania fizjologii synaptycznej. Jest podatny na wiele technik eksperymentalnych, w tym elektrofizjologię i obrazowanie optyczne. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania transmisji synaptycznej za pomocą sondy na bazie pHluoryny pod pionowym mikroskopem epifluorescencyjnym.

Obrazowanie na żywo recyklingu pęcherzyków synaptycznych w złączu nerwowo-mięśniowym wypreparowanych larw danio pręgowanego

Poznaj metodę patch clamp do jednoczesnego rejestrowania aktywności neuronu ruchowego i mięśnia szkieletowego u larw Danio rerio. Technika ta umożliwia badanie przekazywania sygnałów w złączach nerwowo-mięśniowych.

Podwójne rejestracje metodą patch-clamp z neuronów ruchowych i docelowych mięśni szkieletowych u danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów