Name: Transfekcja i mutageneza docelowych genów w komórkach komarów przez zablokowane oligonukleotydy modyfikowane kwasami nukleinowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj metodę mutagenezy ukierunkowanej w komórkach komara Anopheles przy użyciu modyfikowanych oligonukleotydów LNA. Technika ta umożliwia precyzyjną edycję genów i kwantyfikację konwersji genowej metodą cytometrii przepływowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Abbie Spinner z California National Primate Research Center za pomoc w przeprowadzeniu cytometrii przepływowej. Badanie to zostało sfinansowane z funduszy National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799 oraz AI078183.

<ol>
<li>Przed rozpoczęciem protokołu ważne jest upewnienie się, że komórki komara wykorzystywane w eksperymencie są zdrowe i osiągnęły stopień konfluencji około 80%, jeśli są to komórki adherentne (Rycina 1). Przerośnięte lub niezdrowe komórki spowodują niską wydajność transfekcji i doprowadzą do niespójnych wyników.</li>
<li>Podgrzej wszystkie pożywki przed użyciem w 28°C kąpiel wodna przez 30 minut. 
	<ol class="lalpha">
<li>*A. stephensi* Komórki MSQ43 wymagają pożywki E5: MEM, Earle's z glutaminą, 5% inaktywowanego ciepłem FCS, 0,2% D-glukozy, 1% antybiotyku penicylina-streptomycyna oraz 1% nieistotnych aminokwasów.</li>
<li>A. gambiae Komórki SUA5B wymagają pożywki S2: Schneidera Muszka owocówka pożywka, 5% inaktywowana ciepłem surowica cielęca (FCS) i 1% antybiotyk penicylina-streptomycyna</li>
</ol>
</li>
<li>Odmrozić i przechowywać na lodzie wszystkie odczynniki do transfekcji, plazmidy oraz oligonukleotydy.</li>
<li>Wszystkie procedury należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, stosując technikę sterylną.</li>
<li>Dla komórek adherentnych (*A. gambiae* SUA5B, A. stephensi MSQ43) odessać starą pożywkę, nie naruszając komórek, i dodać równoważną objętość świeżej pożywki podgrzanej do 28°Cnastępnie należy wypłukać komórki z dna kolby za pomocą pipety.</li>
<li>Należy oznaczyć stężenie komórek i dostosować je do stężenia końcowego 1x106 komórek/ml. Komórki można przechowywać w temperaturze pokojowej podczas przygotowywania materiałów do odczynnika do transfekcji.</li>
<li>Dodaj 1 ml komórek komara (1x106 (komórek/ml) do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Przygotuj oddzielną płytkę dla każdego warunku eksperymentalnego (patrz poniżej). 
Tabela I przedstawia schemat pipietowania dla ogólnej transfekcji. Tabela II opisuje pięć warunków testowych w celu sprawdzenia skuteczności mutogenezy pojedynczego nukleotydu z wykorzystaniem LNA-ON specyficznych dla BFP. Dwie pierwsze próbki, pGFP i pBFP, stanowią odpowiednio kontrolę pozytywną i negatywną. Pozostałe to warunki eksperymentalne pBFP z rosnącym stężeniem LNA-ON specyficznych dla BFP. W krokach od 8 do 12 należy dodać odpowiednie objętości odczynników zgodnie z każdym warunkiem.
</li>
<li>Przenieś plazmidowe DNA do sterylnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i dodaj odpowiednią objętość buforu EC.
<ol class="lalpha">
<li>Dla 1 μL plazmidowe DNA (1 μg/ μL), dodać 99 μL buforu EC.</li>
<li>Dla 1 μL pGFP (1μg/ μL), dodać 99 μL buforu EC.</li>
<li>Dla 1 μL pBFP (1μg/ μL), dodać 99 μL buforu EC.</li>
<li>Dla 1 μL pBFP (1μg/ μL) i 1 μL WŁ.μg/ μL), dodaj 98 μL buforu EC.</li>
<li>Dla 1 μL pBFP (1μg/ μL) oraz 5 μL WŁ. (1μg/ μL), dodać 94 μL buforu EC.</li>
<li>Dla 1 μL pBFP (1μg/ μL) i 10 μL WŁ. (1μg/ μL), dodać 89 μL buforu EC.</li>
</ol>
</li>
<li>Następnie powoli dodawaj Enhancer na 1 μg wykorzystanego DNA.
<ol class="lalpha">
<li>Dla 1 μL plazmidowe DNA, dodać 8 μL Enhancer.</li>
<li>Dla 1 μL pGFP, dodać 8 μL Enhancer</li>
<li>Dla 1 μL pBFP, dodać 8 μL Wzmacniacz.</li>
<li>Dla 1 μL pBFP i 1 μL WŁĄCZ, dodaj 16 μL Enhancer.</li>
<li>Dla 1 μL pBFP i 5 μL WŁĄCZ, dodaj 48 μL Wzmacniacz.</li>
<li>Dla 1 μL pBFP i 10 μL WŁĄCZ, dodaj 88 μL Enhancer.</li>
</ol>
</li>
<li>Wymieszaj DNA, bufor i Enhancer na wirówce typu vortex przez 1 s, upewniając się, że cała zawiesina znajduje się na dnie probówki. Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
<li>Dodać odczynnik Effectene zgodnie z 1 μg DNA plazmidowego i mieszaj w wirówce Vortex przez 10 s. Upewnij się, że cały roztwór znajduje się na dnie probówki, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 min.
<ol class="lalpha">
<li>Dla 1 μL plazmidowe DNA, dodać 10 μL Effectene (Tabela I).</li>
<li>Dla 1 μL pGFP, dodać 10 μL Effectene (Tabela II).</li>
<li>Dla 1 μL pBFP, dodać 10 μL Effectene (Tabela II).</li>
<li>Dla 1 μL pBFP i 1 μL WŁ. dodaj 20 μL Effectene (Tabela II).</li>
<li>Dla 1 μL pBFP i 5 μL WŁ., dodać 60 μL Effectene (Tabela II).</li>
<li>Dla 1 μL pBFP i 10 μL WŁ., dodać 110 μL Effectene (Tabela II).</li>
</ol>
</li>
<li>Dopełnić objętość w każdej probówce do końcowej wartości 1000 μL poprzez kroplowe dodawanie ogrzanej pożywki do mieszaniny DNA/buforu/Enhancera/Effectene. Na tym etapie może dojść do wytrącenia DNA, jeśli pożywka zostanie dodana zbyt szybko. Należy delikatnie wymieszać roztwór, pipetując go w górę i w dół 3–4 razy.
<ol class="lalpha">
<li>Dla 1 μL plazmidowy DNA, dodać 882 μL pożywki (Tabela I).</li>
<li>Dla 1 μL dodaj pGFP 882 μL pożywki (Tabela II).</li>
<li>Dla 1 μL pBFP, dodać 882 μL pożywki (Tabela II).</li>
<li>Dla 1 μL pBFP i 1 μL WŁĄCZ, dodaj 864 μL pożywki (Tabela II).</li>
<li>Dla 1 μL pBFP i 5 μL WŁĄCZ, dodaj 792 μL pożywki (tabela II).</li>
<li>Dla 1 μL pBFP i 10 μL WŁ., dodaj 702 μL podłoża (Tabela II).</li>
</ol>
</li>
<li>Następnie powoli dodawaj do każdej studzienki po 1 ml odpowiedniej mieszaniny DNA/Enhancer/Effectene, dozując ją kropla po kropli.</li>
<li>Delikatnie zakręć płytką, aby zapewnić równomierny rozkład komórek i mieszaniny do transfekcji. Inkubuj komórki w standardowych warunkach hodowli.</li>
<li>Jeden dzień po transfekcji należy delikatnie odessać medium i powoli zastąpić je równą objętością świeżo podgrzanego medium. Ważne jest, aby podczas tej czynności nie naruszyć warstw komórek znajdujących się na dnie studzienek.</li>
<li>Dwa dni po transfekcji należy zbadać pod mikroskopem fluorescencyjnym komórki kontroli pozytywnej transfekowane pGFP w celu określenia wydajności transfekcji (Rycina 2).</li>
<li>Komórki SUA5B rosną bardzo szybko i mogą ulec przerośnięciu. Cztery dni po transfekcji należy rozrzedzić te komórki, odsysając stare medium i powoli dodając równą objętość świeżego, ogrzanego medium.</li>
<li>Po dodaniu nowej pożywki do studniek, ododziel wszystkie komórki od dna każdej studnienki poprzez pipetowanie w górę i w dół, odlej połowę objętości (1 ml) zawiesiny komórkowej i dodaj 1 ml świeżej, ogrzanej pożywki, aby uzyskać objętość końcową 2 ml.</li>
<li>Codziennie sprawdzać stan komórek, aby upewnić się, że są zdrowe i nie uległy nadmiernemu rozrostowi; w razie potrzeby przeprowadzić pasażowanie.</li>
<li>Pozostawić komórki do wzrostu w normalnych warunkach przez pięć do siedmiu dni po transfekcji przed ich zebraniem do analizy.</li>
<li>Pięć do siedmiu dni po transfekcji zebrać komórki, odsysając stare medium ze wszystkich studzienek i dodając do każdej z nich 1 ml sterylnego PBS o temperaturze pokojowej.</li>
<li>Odseparować komórki od dna dołka poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieść zawiesinę komórkową do probówek z zakrętką typu snap cap o pojemności 5 ml i niezwłocznie poddać komórki analizie metodą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>

Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig1.jpg" alt="Mikroskopowy obraz hodowli komórkowej; panele lewy i prawy pokazują zmienność gęstości komórek w badaniu eksperymentalnym." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Nietransfekcyjne zdrowe komórki A. stephensi MSQ43 (A) i A. gambiae SUA5B (B) przy konfluencji około 80%.
<img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig2.jpg" alt="Analiza ekspresji genów z użyciem GFP; obrazy mikroskopowe: światło widzialne, fluorescencja GFP, widok scalony." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Komórki A. stephensi MSQ43 (A) oraz A. gambiae SUA5B (B) przetransfekowane plazmidem kontrolnym wyrażającym GFP.
<img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig3.jpg" alt="Schemat cytometrii przepływowej przedstawiający analizę ekspresji GFP; populacje komórek według FSC, SSC, PI, GFP." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Dane cytometrii przepływowej potwierdzające konwersję BFP na GFP poprzez mutogenezę pojedynczego nukleotydu po transfekcji specyficznymi dla BFP oligonukleotydami z modyfikacją blokowanego kwasu nukleinowego (LNA-ONs). Komórki SUA5B transfektowano plazmidem wykazującym ekspresję GFP (pGFP) jako kontrolę pozytywną, plazmidem wykazującym ekspresję BFP (pBFP) jako kontrolę negatywną lub pBFP wraz z rosnącymi stężeniami specyficznych dla BFP LNA-ONs. (A) Strategia bramkowania danych cytometrii przepływowej przedstawiająca od lewej do prawej: rozproszenie przednie (FSC) względem bocznego (SSC) żywych komórek, komórki negatywne pod kątem jodku propidyny (PI) oraz komórki pozytywne dla GFP pięć dni po transfekcji. (B) Wykres procentowej zawartości komórek pozytywnych dla GFP przedstawionych na (A) po transfekcji pBFP i rosnącymi stężeniami LNA-ONs.
<img src="/files/ftp_upload/2355/2355table1.jpg" alt="Tabela transfekcji DNA z objętościami odczynników dla procedur z 1 μg i 10 μg DNA, konfiguracja eksperymentu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela I. Warunki transfekcji.
<img src="/files/ftp_upload/2355/2355table2.jpg" alt="Tabela transfekcji DNA, ilości plazmidów, bufor, wzmacniacz, effectene, pożywka w mikrolitrach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 2"> 
Tabela II. Warunki transfekcji zastosowane na Rysunku 1.

<ol><li>Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+controlling+malaria+transmission+in+the+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi.</a> PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Braasch, D. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid+%28LNA%29%3A+fine-tuning+the+recognition+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA.</a> Chem Biol. 8, 1-7 (2001).</li>
<li>Andrieu-Soler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transmission+of+targeted+gene+modification+using+single-stranded+oligonucleotides+with+flanking+LNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).</li>
<li>Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nucleotide+exchange+in+Saccharomyces+cerevisiae+directed+by+short+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).</li>
<li>Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+accessibility+and+signal+specificity+in+live-cell+detection+of+BMP-4+mRNA+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).</li>
<li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+SNPs+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotyping SNPs with molecular beacons.</a> Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).</li>
<li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).</li>
<li>Blandin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+genetic+basis+of+resistance+to+malaria+parasites+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae.</a> Science. 326, 147-150 (2009).</li>
<li>Niare, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+loci+affecting+resistance+to+human+malaria+parasites+in+a+West+African+mosquito+vector+population%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population.</a> Science. 298, 213-216 (2002).</li>
<li>Riehle, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+malaria+infection+in+Anopheles+gambiae+is+regulated+by+a+single+genomic+control+region%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region.</a> Science. 312, 577-579 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiamy tutaj metodę in vitro oraz dowody na ukierunkowaną konwersję pojedynczego nukleotydu w docelowym genie episomalnym po transfekcji LNA-ON do komórek A. stephensi i A. gambiae. Konwersja genu zapśredniczona przez LNA-ON wymaga indukcji specyficznej dla danego miejsca odpowiedzi naprawy DNA; nasze dane wskazują, że komórki komarów mogą wspierać ten mechanizm w celu mutagenezy specyficznej dla danego miejsca. Chociaż przedstawiona tutaj metoda opiera się na konwersji celu episomalnego...

<table><tbody><tr><td>odczyn do transfekcji Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>plazmid kontrolny GFP (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)</td><td>Invitrogen</td><td>K4935-00</td><td></td></tr><tr><td>plazmid BFP (pcDNA5/FRT/TO)</td><td></td><td></td><td>Prezent od dr. Concordeta&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>LNA-ONs </td><td></td><td></td><td>Prezent od dr Concordeta&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>MEM, Earle&amp;rsquo;z glutaminą</td><td>Invitrogen</td><td>11095</td><td></td></tr><tr><td>płódcowa surowica cielęca (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;S &lt;em&gt;Muszka owocówka&lt;/em&gt; pożywka</td><td>Invitrogen</td><td>11730</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy nieesencjalne</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>10% D-glukozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk penicylina-streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>płytki hodowlane 6-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

transfekcja i mutagenza genów docelowych w komórkach komarów przy użyciu oligonukleotydów modyfikowanych kwasem nukleinowym typu locked nucleic acid

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Plasmodium, pasożyty wywołujące malarię, są przenoszone poprzez ukąszenia zakażonych komarów z rodzaju Anopheles, co skutkuje ponad 250 milionami nowych zakażeń każdego roku. Pomimo dziesięcioleci badań, wciąż nie istnieje szczepionka przeciw malarii, co podkreśla potrzebę opracowania nowych strategii kontroli. Jednym z innowacyjnych podejść jest wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych komarów do skutecznego ograniczenia transmisji pasożytów malarii. Wykazano, że celowe zmiany w szlakach sygnalizacji komórkowej komara, dokonane za pomocą celowanej mutagenezy, regulują rozwój pasożyta 1. Na podstawie tych badań możemy zacząć identyfikować potencjalne geny będące celami transformacji. Celowana mutageneza opierała się tradycyjnie na rekombinacji homologicznej między genem docelowym a dużą cząsteczką DNA. Jednak konstrukcja i wykorzystanie tak złożonych cząsteczek DNA do generowania stabilnie przekształconych linii komórkowych jest kosztowne, czasochłonne i często nieefektywne. Dlatego strategia wykorzystująca oligonukleotydy modyfikowane zablokowanymi kwasami nukleinowymi (LNA-ONs) stanowi użyteczną alternatywę dla wprowadzania sztucznych substytucji pojedynczych nukleotydów do epigenowych i chromosomalnych celów genowych (przegląd w 2). Celowana mutageneza za pośrednictwem LNA-ONs była stosowana do wprowadzania mutacji punktowych w interesujących genach w hodowlach komórkowych drożdży oraz myszy 3,4. Pokazujemy tutaj, że LNA-ONs mogą być użyte do wprowadzenia zmiany pojedynczego nukleotydu w transfektowanym celu episomalnym, co skutkuje przełączeniem ekspresji z niebieskiego białka fluorescencyjnego (BFP) na zielone białko fluorescencyjne (GFP) w komórkach Anopheles gambiae oraz Anopheles stephensi. Konwersja ta dowodzi po raz pierwszy, że efektywna mutageneza genów docelowych w komórkach komarów może być zapośredniczona przez LNA-ONs i sugeruje, że technika ta może znaleźć zastosowanie w mutagenezie celów chromosomalnych in vitro oraz in vivo.

Oligonukleotydy można wykorzystać do specyficznej lokalnie podstawienia pojedynczego nukleotydu w transfekowanych genach docelowych zarówno w komórkach Anopheles gambiae, jak i Anopheles stephensi.

Transfekcja i mutagenza genów docelowych w komórkach komarów przy użyciu oligonukleotydów modyfikowanych kwasem nukleinowym typu Locked Nucleic Acid

pasożyty z rodzaju *Plasmodium*, będące czynnikiem etiologicznym malarii, są przenoszone poprzez ukąszenia zakażonych komarów z rodzaju *Anopheles*, co skutkuje ponad 250 milionami nowych ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie nowej strategii mutagenezy celowanej w komórkach komarów z rodzaju Anopheles. Osiąga się to poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności zdrowych hodowli komórkowych do transfekcji. Następnie komórki są transfekowane odpowiednimi kontrolnymi i testowymi kwasami DNA poprzez dodanie odczynników do transfekcji.Kolejnym krokiem procedury jest monitorowanie fluorescencji w komórkach kontrolnych oraz zmniejszenie gęstości komórek eksperymentalnych. Na koniec, w piątym do siódmego dnia po transfekcji, za pomocą cytometrii przepływowej można oznaczyć częstotliwość konwersji genów w komórkach eksperymentalnych. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące mutogenezę celowaną genu episomalnego indukowaną naprawą DNA za pomocą oligonukleotydów z zablokowanymi kwasami nukleinowymi.Witajcie, jestem dr Nazy Pacor z laboratorium dr Shirley Lockhart w Katedrze Mikrobiologii Medycznej i Immunologii na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu nową procedurę mutagenezy celowanej w komórkach komarów gatunku Anopheles. Stosujemy tę procedurę do badania funkcji genów odpowiedzi immunologicznej nieswoistej komarów za pomocą mutagenezy celowanej.Zacznijmy zatem. Przed rozpoczęciem protokołu należy uzyskać zdrowe komórki komara o konfluencji wynoszącej około 80%. W przypadku komórek adherentnych, ich nadmierny rozrost lub zły stan zdrowotny doprowadzą do niskiej wydajności transfekcji i niespójnych wyników.Protokół ten został zaprezentowany z wykorzystaniem komórek B ananais Gambier SUA five. Można jednak również zastosować komórki Ananais ensi MS Q4 three. Przygotowanie do transfekcji należy rozpocząć od ogrzewania medium S two w kąpieli wodnej o temperaturze 28 °C przez 30 minut.Wszystkie materiały do transfekcji, plazmidy i oligonukleotydy należy utrzymać w lodzie. Stosując technikę sterylną w komorze do hodowli tkanek, należy odessać starą pożywkę, nie naruszając komórek, dodać równą objętość świeżej, ogrzanej pożywki i wypłukać komórki z dna kolby. Następnie, używając pipety, należy oznaczyć stężenie komórek i dostosować je do stężenia końcowego 1 × 10⁶ komórek na ml.Po dostosowaniu końcowego stężenia, należy dodać jeden mililitr komórek komara do każdego dołka płytki sześciodołkowej. Komórki można przechowywać w temperaturze pokojowej podczas przygotowywania materiałów do transfekcji; w tym czasie należy przenieść plazmidowe DNA do sterylnych probówek do mikrocentryfugi. Tutaj plazmidu wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego użyto jako kontroli pozytywnej, a plazmidu wykazującego ekspresję niebieskiego białka fluorescencyjnego jako kontroli negatywnej.Testowe DNA obejmuje również plazmid wykazujący ekspresję BFP, lecz z rosnącymi stężeniami specyficznych dla BFP zablokowanych kwasów nukleinowych, zmodyfikowanych oligonukleotydów lub LNA os. Po podzieleniu DNA na aliquoty, do każdego mikrograma plazmidowego DNA i L-N-A-O-N należy dodać 99 µL buforu kage i EC. Następnie powoli dodaj 8 µL enhance’ra na każdy mikrogram użytego DNA i wymieszaj w wirówce mieszaninę DNA, buforu i enhance’ra.Przez jedną sekundę krótko odwiruj roztwór, a następnie inkubuj próbki w temperaturze pokojowej. Przez pięć minut dodawaj 10 µL odpowiedniego odczynnika na każdy 1 µg plazmowego DNA i mieszaj w wirówce typu vortex przez 10 s. Krótko odwiruj roztwór na dno probówek, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 min. Po inkubacji doprowadź objętość końcową w każdej probówce do 1000 µL, powoli dodając świeżą, ogrzaną pożywkę do mieszaniny DNA z wzmacniaczem buforu DNA. Jeśli pożywka zostanie dodana zbyt szybko, w tym momencie może dojść do wytrącenia DNA; delikatnie wymieszaj zawartość, pipetując ją w górę i w dół trzy lub cztery razy.Na koniec, do każdej studni z komórkami powoli dodaj 1 ml odpowiedniej mieszaniny wzmacniacza DNA. Dodawaj po jednej kropli. Delikatnie zakręć płytką, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek i mieszaniny do transfekcji.Inkubuj komórki w normalnych warunkach wzrostu przez jeden dzień po transfekcji, ostrożnie odessaj pożywkę z komórek i powoli zastąp ją równą objętością świeżej, ogrzanej pożywki. Należy uważać, aby nie naruszyć warstw komórek na dnie studni. Dwa dni po transfekcji zbadaj pod mikroskopem fluorescencyjnym komórki kontroli pozytywnej przetransfekowane plazmidem wykazującym ekspresję GFP w celu określenia wydajności transfekcji.Cztery dni po transfekcji s uua, należy rozcieńczyć pięć linii komórek B, ponieważ rosną one bardzo szybko i mogą nadmiernie przerość. W tym celu odessaj stare medium z komórek i powoli dodaj równą objętość świeżego, ogrzanego medium. Po dodaniu nowego medium do studzienek, odlep wszystkie komórki z dna każdej studzienki poprzez pipetowanie w górę i w dół, odrzuć połowę objętości zawiesiny komórkowej i dodaj jeden mililitr świeżego, ogrzanego medium, aby uzyskać objętość końcową dwóch mililitrów.Codziennie sprawdzaj komórki, aby upewnić się, że są zdrowe i nie przerosły. W razie potrzeby wykonaj pasaż w celu zmniejszenia gęstości komórek. Pozostaw komórki do wzrostu w normalnych warunkach od pięciu do siedmiu dni po transfekcji, zanim zostaną one zebrane do analizy.Od pięciu do siedmiu dni po transfekcji należy zebrać komórki, odsysając stare medium i dodając 1 ml sterylnego PBS o temperaturze pokojowej do każdej studni. Komórki należy odseparować od dna każdej studni poprzez pipetowanie w górę i w dół. Na koniec mieszaninę komórek należy przenieść do probówek 5 ml z zakrętką typu snap cap i niezwłocznie poddać analizie za pomocą cytometrii przepływowej.Obrona oka. Komórki MS Q4 three oraz gambier UA five B zostały transfektowane plazmidem kontrolnym wyrażającym GFP. Komórki przedstawiono w świetle mikroskopu optycznego i fluorescencyjnego, a uzyskane dane z cytometrii przepływu obrazowego potwierdzają konwersję BFP do GFP poprzez mutogenezę pojedynczego nukleotydu po transfekcji specyficznymi dla BFP LNAO Ns. Komórki SUA five B transfektowano plazmidem wyrażającym GFP jako kontrolę pozytywną, plazmidem wyrażającym BFP jako kontrolę negatywną lub plazmidem wyrażającym BFP wraz z rosnącymi stężeniami specyficznych dla BFP LNAO ns.Strategia bramkowania dla danych z cytometrii przepływowej przedstawia rozproszenie przednie względem bocznego dla żywych komórek, komórek negatywnych pod względem jodku propidyny oraz komórek pozytywnych pod względem GFP pięć dni po transfekcji; tutaj w formie graficznej można zobaczyć procent komórek pozytywnych pod względem GFP po transfekcji plazmidem wykazującym ekspresję BFP oraz zwiększającymi się stężeniami LNAO NS, co potwierdza konwersję BFP do GFP przez L aos. Przedstawiliśmy nową procedurę mutagenezy celowanej dla komórek komara Aedes. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że komórki są zdrowe i mają odpowiednią gęstość przed transfekcją.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

transfection-mutagenesis-target-genes-mosquito-cells-locked-nucleic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Transfekcja i mutageneza genów docelowych w komórkach komarów za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów kwasem rybonukleinowym

Tutaj opisujemy procedurę hamowania funkcji genów u komarów wektorów chorób za pomocą chitozanu/interferujących nanocząsteczek RNA, które są połykane przez larwy.

Wyciszanie genów za pośrednictwem chitozanu/interferujących nanocząstek RNA w larwach komarów wektorów chorób

Interferencja RNA (RNAi) jest niezwykle cennym narzędziem do odkrywania funkcji genów. Jednak zdolność do celowania w geny za pomocą RNAi w stadiach przeddorosłych jest ograniczona w przypadku głównego wektora malarii u ludzi Anopheles gambiae. Opisujemy protokół RNAi w celu zmniejszenia funkcji genu poprzez bezpośrednią iniekcję podczas rozwoju poczwarki.

Dostarczanie RNAi do poczwarek Anopheles gambiae

Informujemy o użyciu sztucznej strategii ekspresji małego RNA w celu opracowania niewadliwego systemu dostarczania rekombinowanego densowirusa Aedes aegypti (AaeDV) in vivo. Opisano szczegółową procedurę budowy, pakowania i analizy ilościowej wektorów rAaeDV, a także infekcji larwalnej.

Zastosowanie rekombinowanego densowirusa komarów jako wektora dostarczania genów do analizy funkcjonalnej genów w larwach komarów

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 jest coraz częściej używany do charakteryzowania funkcji genów w organizmach niemodelowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować linie nokautujące Culex pipiens, od przygotowania mieszanek iniekcyjnych, po pozyskiwanie i wstrzykiwanie zarodków komarów, a także jak hodować, krzyżować i badać przesiewowo komary, którym wstrzyknięto implanty i ich potomstwo pod kątem pożądanych mutacji.

Przygotowanie i wstrzykiwanie zarodków komarów Culex w celu wygenerowania mutacji zerowych przy użyciu CRISPR/Cas9

Dwuczęściowy system GAL4-UAS jest wszechstronnym narzędziem do modyfikacji ekspresji genów w kontrolowany sposób czasoprzestrzenny, co pozwala na funkcjonalną analizę genetyczną w Anopheles gambiae. Opisane procedury korzystania z tego systemu to częściowo ustandaryzowana strategia klonowania, określanie płci i badanie przesiewowe poczwarek pod kątem fluorescencyjnych markerów białkowych i utrwalanie zarodków.

Wykorzystanie systemu GAL4-UAS do genetyki funkcjonalnej u Anopheles gambiae

Protokół opisuje, jak dokonać zmian w genomie komarów malarii Anopheles za pomocą systemu φC31. Opisane modyfikacje obejmują zarówno integrację, jak i wymianę transgenicznych kaset w genomie linii dokujących zawierających attP.

Ukierunkowana na miejsce integracja za pośrednictwem φC31 i wymiana kaset w wektorach Anopheles malarii

Przedstawione tutaj protokoły ilustrują trzy alternatywne sposoby oceny wydajności genetycznie modyfikowanych komarów przeznaczonych do kontroli wektorów w laboratoryjnych próbach z małymi klatkami. Każdy protokół jest dostosowany do konkretnej modyfikacji, jaką niesie ze sobą szczep komarów (napęd genowy lub nie-genowy) oraz rodzajów mierzonych parametrów.

Badania laboratoryjne w małych klatkach genetycznie modyfikowanych komarów anofeliny

Ten artykuł opisuje protokół szybkiej identyfikacji indeli indukowanych przez CRISPR/Cas9 i selekcji linii mutantów u komara Aedes aegypti za pomocą analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Wykrywanie indel po mutagenezie CRISPR/Cas9 przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości u komara Aedes aegypti

Doustne podawanie dsRNA wytwarzanego przez bakterie, metoda dostarczania interferencji RNA (RNAi), która jest rutynowo stosowana u Caenorhabditis elegans, została tutaj z powodzeniem zastosowana u dorosłych komarów. Nasza metoda pozwala na rzetelne badania genetyki odwrotnej i badania wektorów blokujących transmisję bez użycia iniekcji.

Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół edycji genomu poprzez mikroiniekcję embrionalną u komara A. aegypti przy użyciu technologii CRISPR-Cas9.

Edycja genomu u komara Aedes aegypti z żółtą febrą przy użyciu CRISPR-Cas9

Poznaj metodę mutagenezy ukierunkowanej w komórkach komara Anopheles przy użyciu modyfikowanych oligonukleotydów LNA. Technika ta umożliwia precyzyjną edycję genów i kwantyfikację konwersji genowej metodą cytometrii przepływowej.

Transfekcja i mutageneza docelowych genów w komórkach komarów przez zablokowane oligonukleotydy modyfikowane kwasami nukleinowymi (Wideo) | JoVE Journal

Transfekcja i mutagenza genów docelowych w komórkach komarów przy użyciu oligonukleotydów modyfikowanych kwasem nukleinowym typu Locked Nucleic Acid

Przeglądaj więcej filmów