Name: Peptydy z biblioteki wyświetlania fagów modulują ekspresję genów w komórkach mezenchymalnych i nasilają osteogenezę w jednokorowych ubytkach kości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj metodę biopanningu z biblioteką fagową do identyfikacji peptydów wzmacniających różnicowanie komórek mezenchymalnych i naprawę kości. Technika ta oferuje potencjalne terapie dla osteoporozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

National Institutes of Health, AR53579, Osteogeneza: Potencjowanie za pomocą peptydów tropowych kości 
National Institutes of Health, AR056422, Efekt anaboliczny peptydów osteogennych 
National Institutes of Health, T32 AR050960, Naprawa i regeneracja tkanek mięśniowo-szkieletowych 
DOD, PC051219 Nukleolina: Nowy mediator adhezji komórek raka prostaty i komórek śródbłonka szpiku kostnego 
Department of Defense, PC061508, Mediatory adhezji komórek przerzutowych raka prostaty do szpiku kostnego

<ol><li>Diduch, D. R., Coe, M. R., Joyner, C., Owen, M. E., Balian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+cell+lines+from+bone+marrow+that+differ+in+terms+of+collagen+synthesis%2C+osteogenic+characteristics%2C+and+matrix+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Two cell lines from bone marrow that differ in terms of collagen synthesis, osteogenic characteristics, and matrix mineralization.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 75, 92-105 (1993).</li>
<li>Stoddart, M. J., Furlong, P. I., Simpson, A. E., Davies, C. M., Richards, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+in+ex+vivo+cultured+cancellous%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Cells.+Mater%22%5BJournal%5D)">Viability in ex vivo cultured cancellous.</a> Eur. Cells. Mater. 13, 69-70 (2007).</li>
<li>Lehr, J. E., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+adhesion+of+prostate+cancer+cells+to+a+human+bone+marrow+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Preferential adhesion of prostate cancer cells to a human bone marrow endothelial cell line.</a> J. Natl. Cancer Inst. 90, 118-123 (1998).</li>
<li>Schuster, N., Götz, C., Faust, M., Schneider, E., Prowald, A., Jungbluth, A., Montenarh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+p53+inhibits+protein+kinase+CK2+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Wild-type p53 inhibits protein kinase CK2 activity.</a> J. Cell Biochem. 81, 172-183 (2001).</li>
<li>Cwirla, S. E., Peters, E. A., Barrett, R. W., Dower, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+on+phage%3A+a+vast+library+of+peptides+for+identifying+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Peptides on phage: a vast library of peptides for identifying ligands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 6378-6382 (1990).</li>
<li>Doorbar, J., Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+peptide+antagonist+to+the+thrombin+receptor+using+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a peptide antagonist to the thrombin receptor using phage display.</a> J. Mol. Biol. 244, 361-369 (1994).</li>
<li>Ellerby, H. M., Arap, W., Ellerby, L. M., Kain, R., Andrusiak, R., Rio, G. D., Krajewski, S., Lombardo, C. R., Rao, R., Ruoslahti, E., Bredesen, D. E., Pasqualini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-cancer+activity+of+targeted+pro-apoptotic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Anti-cancer activity of targeted pro-apoptotic peptides.</a> Nat. Med. 5, 1032-1038 (1999).</li>
<li>Goodson, R. J., Doyle, M. V., Kaufman, S. E., Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+urokinase+receptor+antagonists+identified+with+bacteriophage+peptide+display%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High-affinity urokinase receptor antagonists identified with bacteriophage peptide display.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 7129-7133 (1994).</li>
<li>Pasqualini, R., Koivunen, E., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide+isolated+from+phage+display+libraries+is+a+structural+and+functional+mimic+of+an+RGD-binding+site+on+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A peptide isolated from phage display libraries is a structural and functional mimic of an RGD-binding site on integrins.</a> J. Cell Biol. 130, 1189-1196 (1995).</li>
<li>Pasqualini, R., Koivunen, E., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+v+integrins+as+receptors+for+tumor+targeting+by+circulating+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Alpha v integrins as receptors for tumor targeting by circulating ligands.</a> Nat. Biotechnol. 15, 542-546 (1997).</li>
<li>Pasqualini, R., Koivunen, E., Kain, R., Lahdenranta, J., Sakamoto, M., Stryhn, A., Ashmun, R. A., Shapiro, L. H., Arap, W., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminopeptidase+N+is+a+receptor+for+tumor-homing+peptides+and+a+target+for+inhibiting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aminopeptidase N is a receptor for tumor-homing peptides and a target for inhibiting angiogenesis.</a> Cancer Res. 60, 722-727 (2000).</li>
<li>Rajotte, D., Arap, W., Hagedorn, M., Koivunen, E., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+heterogeneity+of+the+vascular+endothelium+revealed+by+in+vivo+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Molecular heterogeneity of the vascular endothelium revealed by in vivo phage display.</a> J. Clin. Invest. 102, 430-437 (1998).</li>
<li>Rajotte, D., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+dipeptidase+is+the+receptor+for+a+lung-targeting+peptide+identified+by+in+vivo+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane dipeptidase is the receptor for a lung-targeting peptide identified by in vivo phage display.</a> J. Biol. Chem. 274, 11593-11598 (1999).</li>
<li>Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-affinity+peptide+antagonists+of+14-3-3+proteins+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-affinity peptide antagonists of 14-3-3 proteins by phage display.</a> Biochemistry. 38, 12499-12504 (1999).</li>
<li>Sugahara, K. N., Teesalu, T., Karmali, P. P., Kotamraju, V. R., Agemy, L., Greenwald, D. R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coadministration+of+a+tumor-penetrating+peptide+enhances+the+efficacy+of+cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coadministration of a tumor-penetrating peptide enhances the efficacy of cancer drugs.</a> Science. 328, 1031-1035 (2010).</li>
<li>Sikes, R. A., Cooper, C. R., Beck, G. L., Pruitt, F., Brown, M. L., Balian, G. Bone Stromal Cells as Therapeutics Targets in Osseous Metastasis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSikes%2C+RA+%22Cancer+Growth+and+Progression.+%22Integration%2FInteraction+of+Oncologic+Growth%22%22">Cancer Growth and Progression. "Integration/Interaction of Oncologic Growth"</a>. Meadows, G., Kluwer, K. H. , Academic Publishers. Boston, MA. 369-386 (2005).</li>
<li>Santos, J. L., Pandita, D., Rodrigues, J., Pêgo, A. P., Granja, P. L., Tomás, H., Balian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-Mediated+Gene+Delivery+in+Mesenchymal+Stem+Cells+using+PAMAM+Dendrimers+conjugated+with+Osteotropic+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Receptor-Mediated Gene Delivery in Mesenchymal Stem Cells using PAMAM Dendrimers conjugated with Osteotropic Peptides.</a> Molecular Pharmaceutics. , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

Produkcja tego filmu była sponsorowana przez New England Biolabs, Inc, firmę produkującą część odczynników wykorzystanych w niniejszym artykule.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do tworzenia bibliotek peptydów metodą phage display-Ph.D-12</td><td>New England Biolabs</td><td>E8110S</td><td></td></tr></tbody></table>

peptydy z biblioteki phage display modulują ekspresję genów w komórkach mezenchymalnych i potęgują osteogenezę w jedokortykalnych defektach kostnych

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Dwa nowe syntetyczne peptydy przyspieszają tworzenie kości i mogą być dostarczane przy użyciu macierzy kolagenowej. Celem niniejszego badania było zbadanie efektów naprawy kości w modelu defektu jednokortykalnego. Leczenie komórek mezenchymalnych spowodowało wzrost aktywności fosfatazy alkalicznej, wywołało tworzenie guzków przez komórki oraz zwiększyło ekspresję genów runx2, osterix, sialoproteiny kostnej i osteokalcyny. Gąbka kolagenowa nasączona peptydem promowała naprawę defektów kostnych, podczas gdy grupa kontrolna była mniej skuteczna. Wyniki tego badania wykazały, że komórki mezenchymalne traktowane peptydem in vitro różnicują się w kierunku osteogenezy, a peptydy dostarczone in vivo przy użyciu gąbki kolagenowej promują naprawę defektów jednokortykalnych.

W celu zidentyfikowania sekwencji peptydowych celujących w kość wykorzystano bibliotekę displayu fagowego. Celem badania było sprawdzenie wpływu tych peptydów na różnicowanie komórek mezenchymalnych oraz określenie ich oddziaływania na regenerację kości.

Peptydy z biblioteki phage display modulują ekspresję genów w komórkach mezenchymalnych i potęgują osteogenezę w jedokortykalnych defektach kostnych

Dwa nowe syntetyczne peptydy przyspieszają tworzenie kości i mogą być dostarczane przy użyciu macierzy kolagenowej. Celem niniejszego badania była analiza efektów ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zidentyfikowanie sekwencji, które potęgują różnicowanie komórek mezenchymalnych i wspomagają regenerację kości. Pierwszym krokiem jest izolacja za pomocą biopanningu faga wiążącego się z kością. Następnie należy zidentyfikować sekwencje peptydowe wiążące się z komórkami mezenchymalnymi oraz określić następujące po tym zmiany w ekspresji genów.Przeprowadź eksperymenty w celu ustalenia, w jaki sposób sekwencje peptydowe mogą być dostarczane do kości w celach regeneracyjnych. W ostatnim kroku zbadaj histologicznie naprawę kości; zestawienie tych wyników może dostarczyć istotnych informacji na temat mechanizmów różnicowania komórek in vitro oraz naprawy kości in vivo. Zaletą zastosowania techniki biopanningu z wykorzystaniem biblioteki phagemu jest możliwość zidentyfikowania peptydów celujących w kość, które mogą być użyte do stymulacji różnicowania komórek mezenchymalnych i wzmocnienia procesu naprawy kości.W ostateczności sekwencje peptydowe te mogą znaleźć zastosowanie w modalnościach terapeutycznych w celu regeneracji kości oraz w leczeniu utraty masy kostnej, takiej jak osteopenia i osteoporoza. Opierając się na badaniu, w którym ULA i Pascal wykazali, że biopanning może być wykorzystany do izolacji sekwencji peptydowych celujących w naczynia krwionośne, zdecydowaliśmy się zaadaptować tę metodę do badania mechanizmów w tkance kostnej. W procedurze biopanningu in vivo przepływiono 10¹⁰ jednostek tworzących plakietki biblioteki peptydowej fagejnej N-E-B-P-H-D 12 przez serce 10-tygodniowej myszy szczepu valve C.Po około pięciu minutach uśmierć mysz, odsłoń i wypreparuj kości udowe, odetnij ich końce i usuń szpik kostny. Przepłucz lewą kość udową zarówno od wewnątrz, jak i od zewnątrz, 10 razy w PBS. Następnie przenieś kość do bakterii ER 2 5 3 7.W celu usunięcia nie związanych fagów, należy użyć 2% suszonego mleka odtłuszczonego w strzykawce z igłą 21G, aby 10 razy wypłukać kanał szpikowy prawej kości udowej. Następnie należy eluować związane fagi z kanału szpikowego, używając buforu glicynowo-kwasu solnego o pH 2.2 zneutralizowanego roztworem Tris o stężeniu 1 M.Aby namnożyć fag, należy dodać EIT do bakterii ER 2 5 3 7 i inkubować przez 4,5 godziny. Ostrożnie przenieść nadsącz do nowych probówek i trzykrotnie wytrącić faga poprzez dodanie roztworu glikolu polietylenowego i chlorku sodu, a następnie inkubować probówki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsius.Na koniec odzawiesić osad w buforze TBS z 0,02% azotku sodu. Wykonać metodę płytkową dla fagów w celu oznaczenia jednostek tworzących plaques (PFU) dla namnożonych EITs. Powtórzyć procedurę biopanningu in vivo cztery razy, zarówno dla fagów elowanych, jak i nieelowanych.Namnożyć pulę fagów w kulturach bakteryjnych. Oczyścić i skwantyfikować sekwencję DNA, końcowe DNA fagowe, wykorzystując starter 98 dostarczony w zestawie do wyświetlania fagowego. Co istotne, obliczyć częstotliwość reprezentacji sekwencji DNA fagów.Następnie zsyntetyzowano peptydy zawierające sekwencję glicyna glicyna glicyna seryna lizyna oraz namnożono komórki D1, klonowaną linię wielopotencjalnych komórek szpiku kostnego myszy opracowaną w naszym laboratorium, do osiągnięcia 90% konfluencji. Komórki poddano trypsynizacji, odwirowano w celu utworzenia osadu i policzono przed barwieniem peptydowym; komórki wysiano na szkiełka z komorami pokryte żelatyną i inkubowano przez 24 godziny.Przemyj komórki buforem PBS i utrwal za pomocą 4% paraldehydu przez 30 minut. Następnie przeprowadź inkubacje blokujące z glikyną, a potem z BSA Aden i BBSA. Roztwory blokujące biotynę.Dodaj 100 µM biotynilowanych peptydów L7 oraz R1. Następnie przemyj komórki trzy razy PBS, każdorazowo przez pięć minut. Dodaj roztwór LOR strippin w rozcieńczeniu 1:1000, przykryj naczynie folią i inkubuj w ciemnej szufladzie przez 30 minut.Przemyć komórki i zamocować szkiełka nakrywki, używając medium montażowego Vector Shield. Następnie przeanalizować preparaty pod mikroskopem fluorescencyjnym na 24 godziny przed operacją. Namoczyć cylindry z gąbki żelowej.Przenieś cylindry z pianki żelowej zawierające 20 µM peptydu L7 lub R1 lub bufor PBS bez peptydu do sterylnych 12-dołkowych naczyń hodowlanych i przechowuj w lodówce przez noc w temperaturze 4 °C przed planowanym zabiegiem chirurgicznym. Przed użyciem umieść kompozyt z pianki żelowej na lodzie.Używając pneumatycznego wiertła przy irygacji solą fizjologiczną, należy wyciąć duży wydłużony defekt jednokortykalny o szerokości 3 mm i długości 8 mm. Defekt kostny należy potraktować przygotowanymi piankami żelowymi, wprowadzając wszystkie implantowane rusztowania za pomocą delikatnego wklepywania. Szczury należy poddać eutanazji, a następnie pobrać kości piszczelowe w określonych punktach czasowych, uważnie sprawdzając miejsce defektu kostnego; pobrane kości piszczelowe należy utrwalić w 10% neutralnym buforowanym formalinie w celu wykonania przekrojów parafinowych.Na koniec wszystkie przekroje tkanek należy zabarwić hematoksyną i eozyną, aby oznakować macierz kostną. Adenzyny znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny umożliwiają mikroskopową detekcję wiązania peptydów z komórkami hodowanymi in vitro. W tym przypadku peptydy wiążą się z komórkami mezenchymalnymi w hodowli, aby określić osteogenny wpływ peptydów na komórki.Komórki mezenchymalne w hodowli in vitro można traktować peptydami testowymi w celu określenia zmian w morfologii komórek. Na przykład w czwartym dniu komórki zaczynają agregować, a agregaty powiększają się z czasem, tworząc guzki. Co ciekawe, przekrój kostny barwiony h i e wykazuje autofluorescencję w świetle UV.Większy kontrast pomiędzy tkanką kostną a tkankami niekostnymi ułatwia analizy ilościowe obecności kości w przekrojach w celu określenia stopnia naprawy kostnej w ubytkach leczonych gelfoamem z dodatkiem peptydu. W porównaniu do zastosowania samego gelfoamu, ubytki wypełnione gelfoamem z dodatkiem peptydu wykazały największy stopień regeneracji kory kostnej w czasie. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby być niezwykle systematycznym w wprowadzaniu danych ze względu na dużą liczbę próbek, które nieuchronnie będą się gromadzić do momentu wybrania końcowej grupy peptydów.Opracowanie metody biopanningu in vivo jako techniki identyfikacji peptydów celujących w kości oznacza, że dysponujemy obecnie potencjalnymi lekami, które mogłyby zostać wykorzystane w terapii regeneracji kości oraz w leczeniu ubytku masy kostnej. Jeden z mechanizmów leżących u podstaw regeneracji kości bierze udział również w procesie utraty tkanki kostnej. Szczegółowe zrozumienie tych mechanizmów oraz posiadanie narzędzi, które mogłyby być stosowane w leczeniu zaburzeń, takich jak opóźnione zrosty złamań i osteoporoza, pomoże w udoskonaleniu terapii opracowywanych w ramach opieki zdrowotnej.

peptides-from-phage-display-library-modulate-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Peptydy z biblioteki Phage Display modulują ekspresję genów w komórkach mezenchymalnych i wzmacniają osteogenezę w jednowarstwowych defektach kości

Różnicowanie komórek prekursorowych w osteoklasty jest regulowane przez cytokiny i czynniki wzrostu. W tym artykule opisano nową technikę transferu genów do różnicowania osteoklastów in vivo oraz protokoły hodowli komórkowych do różnicowania komórek prekursorowych w osteoklasty in vitro jako metodę badania wpływu cytokin na osteoklastogenezę.

Nowatorska technika transferu genów in vivo i testy komórkowe in vitro do badania utraty masy kostnej w zaburzeniach układu mięśniowo-szkieletowego

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym na rusztowaniach 3D za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Angiogenezę w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniach badano w mysim modelu krytycznego ubytku kości kalwarycznej. W grupie leczonej wykryto więcej nowych naczyń krwionośnych niż w grupie kontrolnej.

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

Biomateriały domieszkowane białkiem morfogenetycznym kości 2 (BMP2) zostały użyte jako nowa strategia terapeutyczna do leczenia złamań kostnych bez zrostu. Aby przezwyciężyć skutki uboczne wynikające z niekontrolowanego uwalniania czynnika, proponujemy nową strategię bezpośredniego unieruchomienia czynnika, tworząc w ten sposób materiały o ulepszonych zdolnościach osteogennych.

Ukierunkowane na miejsce unieruchomienie białka morfogenetycznego kości 2 na powierzchniach stałych za pomocą chemii kliknięć

Przedstawiamy protokół do zbadania biomarkerów ekspresji mRNA komórek pochodzących z okostnej (PDC) indukowanych przez witaminę C (witaminę C) i 1,25-dihydroksywitaminę D [1,25-(OH)2D3]. Ponadto oceniamy zdolność PDC do różnicowania się w osteocyty, chondrocyty i adipocyty.

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej okostnej pęcherzyków płucnych i wpływ witaminy D na aktywność osteogenną komórek pochodzących z okostnej

Przedstawiamy protokół do porównywania stanu minerałów w pęcherzykach uwalnianych przez dwie linie ludzkich komórek kostnych: hFOB 1.19 i Saos-2. Ich profile mineralizacji analizowano za pomocą barwienia czerwienią Alizarin Red-S (AR-S), wizualizacji światła ultrafioletowego (UV), obrazowania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) oraz mikroanalizy rentgenowskiej z dyspersją energii (EDX).

Analiza minerałów wytwarzanych przez ogniwa hFOB 1.19 i Saos-2 przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej z mikroanalizą rentgenowską z dyspersją energii

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania przesiewowego małych peptydów, które wiążą się z FGFR2, przy użyciu biblioteki peptydów wyświetlających fagi. Dalej analizujemy powinowactwo wybranych peptydów do FGFR2 in vitro i jego zdolność do hamowania proliferacji komórek.

Badania przesiewowe i identyfikacja małych peptydów ukierunkowanych na receptor czynnika wzrostu fibroblastów2 przy użyciu biblioteki peptydów wyświetlających fagi

Ten protokół opisuje mikrodysekcję laserową do izolacji chrząstki i kości ze świeżo zamrożonych fragmentów zarodka myszy. Chrząstka i kość mogą być szybko uwidocznione przez barwienie fioletem krezylo i precyzyjnie zebrane w celu uzyskania wysokiej jakości RNA do analizy transkryptomicznej.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji chrząstki embrionalnej i kości myszy w celu analizy ekspresji genów

Ten protokół opisuje kanoniczną metodę zrozumienia krytycznych genów kontrolujących aktywność osteoklastów in vivo. Metoda ta wykorzystuje transgeniczny model myszy i niektóre techniki kanoniczne do analizy fenotypu szkieletu.

Analiza fenotypu szkieletowego modelu myszy z warunkową delecją Stat3

Ubikwitynacja jest krytyczną modyfikacją potranslacyjną białka, której dysregulacja jest przyczyną wielu chorób ludzkich. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób można wykorzystać wyświetlanie fagów do izolowania nowych wariantów ubikwityny, które mogą wiązać i modulować aktywność ligazów E3, które kontrolują specyficzność, wydajność i wzorce ubikwitynacji.

Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do opracowania modulatorów wariantów ubikwityny dla ligaz E3

Protokół przedstawia metodę izolowania lizatów białkowych całych komórek z wypreparowanych procesów twarzy zarodków myszy lub hodowanych mysich embrionalnych komórek mezenchymy zarodkowej i przeprowadzania następnie western blot w celu oceny poziomu fosforylowanego białka.

Izolacja lizatów białkowych całych komórek z procesów twarzy myszy i hodowanych komórek mezenchymy podniebienia do analizy fosfoprotein

Poznaj metodę biopanningu z biblioteką fagową do identyfikacji peptydów wzmacniających różnicowanie komórek mezenchymalnych i naprawę kości. Technika ta oferuje potencjalne terapie dla osteoporozy.

Peptydy z biblioteki wyświetlania fagów modulują ekspresję genów w komórkach mezenchymalnych i nasilają osteogenezę w jednokorowych ubytkach kości (Wideo) | JoVE Journal

Peptydy z biblioteki phage display modulują ekspresję genów w komórkach mezenchymalnych i potęgują osteogenezę w jedokortykalnych defektach kostnych

Przeglądaj więcej filmów