Peptydy z biblioteki wyświetlania fagów modulują ekspresję genów w komórkach mezenchymalnych i nasilają osteogenezę w jednokorowych ubytkach kości

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zidentyfikowanie sekwencji, które nasilają różnicowanie komórek mezenchymalnych i promują naprawę kości. Pierwszym krokiem jest wyizolowanie faga przez biopowanie faga, który wiąże się z kością. Przystąp do identyfikacji sekwencji peptydowych, które wiążą się z komórkami mezenchymalnymi, a także określ kolejne zmiany w ekspresji genów.

Wykonaj eksperymenty, aby określić, w jaki sposób sekwencje peptydowe mogą być dostarczane do kości w celach regeneracyjnych. Ostatnim krokiem jest zbadanie naprawy kości pod względem histologicznym, a wyniki mogą dostarczyć ważnych informacji na temat mechanizmów różnicowania komórek in vitro i naprawy kości in vivo. Zaletą stosowania techniki panoramowania biopów z biblioteką wyświetlania fagów jest to, że byliśmy w stanie zidentyfikować peptydy, które celują w kość i mogą być wykorzystywane do stymulowania różnicowania komórek mezenchymalnych i nasilania naprawy kości.

Ostatecznie te sekwencje peptydowe mogą być przydatne w modalnościach terapeutycznych do naprawy kości i leczenia utraty masy kostnej, takiej jak osteopenia i osteoporoza. Opierając się na badaniu, w którym ULA i Pascal wykazały, że płukanie biopów może być stosowane do izolowania sekwencji peptydowych, które celują w naczynia krwionośne, zdecydowaliśmy się dostosować tę metodę do mechanizmów zapytania w kościach. W przypadku procedury panoramowania biopów in vivo, perfuzja 10 razy 10 do 10. jednostki wykonujące płytkę z biblioteki peptydów fagowych N-E-B-P-H-D 12 fagów przez serce 10-tygodniowej myszy z zastawką C.

Po około pięciu minutach poddaj mysz eutanazji, odsłoń i wypreparuj kości udowe, odetnij końce i usuń szpik kostny. Przepłucz lewą kość udową zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz 10 razy PBS. Następnie dodaj kość do bakterii ER 2, 5, 3, 7.

W celu usunięcia niezwiązanego faga należy użyć 2% odtłuszczonego mleka w proszku w strzykawce z igłą o rozmiarze 21, aby 10 razy przepłukać kanał pośredni prawej kości udowej. Teraz wymyj związanego faga z kanału pośredniego buforem glicyny kwasu solnego. pH 2,2 neutralizowane jednym mo la triss.

Aby amplifikować faga, dodaj EIT do bakterii ER 2 5 3 7 i hoduj przez 4,5 godziny. Ostrożnie przenieść supernatanty do świeżych probówek i trzykrotnie wytrącić faga przez dodanie glikolu polietylenowego. Roztwór chlorku sodu, inkubować probówki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Na koniec ponownie zawiesić osad w TBS z 0,02% azydkiem sodu. Umieść faga na płytkach, aby określić jednostki tworzące płytkę amplifikowanych EIT. Powtórzyć procedurę biopłukania in vivo zarówno dla faga, który wymykał się, jak i nie został wymyty, czterokrotnie.

Amplifikacja zbiorczych fagów w kulturach bakteryjnych. Oczyść i określ ilościowo sekwencję DNA, końcowe DNA faga, używając startera 98 dostarczonego z zestawem do wyświetlania fagów. Co ważne, należy obliczyć częstotliwość reprezentacji sekwencji DNA faga.

Teraz zsyntetyzuj peptydy zawierające glicynę, glicynę, glicynę, sinusoidalną sekwencję lizyny, nasiona i amplifikację komórek D-jeden. Sklonowana mysia wielopotencjalna linia komórek zrębu szpiku kostnego, która została opracowana w naszym laboratorium przy 90% zbieżności. Trypsyna to komórki i wirówka do osadzania i liczenia komórek płytki barwiącej peptydy na szkiełkach komorowych pokrytych żelatyną i hodowli przez 24 godziny.

Umyj komórki PBS i utrwal 4% paraldehydem przez 30 minut. Teraz wykonaj inkubacje blokujące z glicyną, a następnie BSA Aden i BBSA. Roztwory blokujące biotynę.

Dodać 100 mikromoli biotynylowanych peptydów L 7 i R one. Kontynuuj trzykrotne mycie komórek PBS przez pięć minut każda. Dodać rozcieńczenie 1 do 1000 pokrywy i folii LOR i inkubować w ciemnej szufladzie przez 30 minut.

Umyj ogniwa i zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą osłony wektorowej Nośnik montażowy. Teraz przeanalizuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym 24 godziny przed zabiegiem. Namocz cylindry z pianki żelowej.

Przenieść cylindry z pianki żelowej z 20 peptydami mikromolowymi L 7 lub R jeden lub buforem PBS bez peptydu do sterylnego 12. Dobrze hoduj naczynia i wstaw do lodówki na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w czasie zabiegu. Umieść żelowy kompozyt do telefonu na lodzie do czasu użycia.

Używając pneumatycznego zadzioru pod nawadnianiem solą, utwórz dużą podłużną jednolitą wadę korową o szerokości trzech milimetrów i długości ośmiu milimetrów. Ubytek kostny należy leczyć przygotowanymi piankami żelowymi, wkładając wszystkie wszczepione rusztowania za pomocą delikatnego wklepywania. Poddaj szczury eutanazji i zbierz piszczel w określonych punktach czasowych, dokładnie sprawdź, czy nie ma ubytku kostnego i utrwal pobraną kość piszczelową w 10% neutralnej buforowanej formalinie do sekcji parafiny.

Na koniec zabarwić wszystkie skrawki tkanki hematyną eozyną, aby oznaczyć matrycę kostną. Izotiocyjanian fluoresceiny znakowany Aden umożliwia mikroskopowe wykrywanie wiązania peptydów na komórkach hodowanych in vitro. Tutaj peptydy wiążą się z komórkami mezenchymalnymi w hodowli, aby określić osteogenny wpływ peptydów na komórki.

Komórki mezenchymalne in vitro w hodowli można leczyć peptydami testowymi w celu określenia zmian w morfologii komórki. Na przykład w czwartym dniu komórki zaczynają się agregować, a agregaty powiększają się z czasem, tworząc guzki. Co ciekawe, wycinek kości wybarwiony autofluorescencją h i e w świetle UV.

Ten większy kontrast między tkankami kostnymi i niekostnymi ułatwia analizy ilościowe określania obecności kości w skrawkach w celu określenia naprawy kości w ubytkach leczonych pianką żelową i peptydem. W porównaniu z samą pianką żelową w tym przypadku, defekty, które były wypełnione peptydem plus, wykazały największą naprawę kory mózgowej w czasie podczas próby tej procedury. Ważne jest, aby być niezwykle metodycznym we wprowadzaniu danych ze względu na dużą liczbę próbek, które niezmiennie gromadzą się w czasie, aż do wybrania ostatecznej grupy peptydów.

Opracowanie płukania biopów in vivo jako techniki identyfikacji peptydów, które celują w kość, oznacza, że mamy teraz potencjalne leki, które mogą być stosowane jako terapia naprawy kości i utraty masy kostnej. Jeden z mechanizmów, który leży u podstaw naprawy kości, jest również zaangażowany w utratę masy kostnej. Bardziej szczegółowe zrozumienie tych mechanizmów i posiadanie narzędzi, które można wykorzystać w leczeniu zaburzeń, takich jak opóźnione złamania i osteoporoza, pomoże udoskonalić terapie, które można opracować dla opieki zdrowotnej.