Peptydy z biblioteki phage display modulują ekspresję genów w komórkach mezenchymalnych i potęgują osteogenezę w jedokortykalnych defektach kostnych

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zidentyfikowanie sekwencji, które potęgują różnicowanie komórek mezenchymalnych i wspomagają regenerację kości. Pierwszym krokiem jest izolacja za pomocą biopanningu faga wiążącego się z kością. Następnie należy zidentyfikować sekwencje peptydowe wiążące się z komórkami mezenchymalnymi oraz określić następujące po tym zmiany w ekspresji genów.

Przeprowadź eksperymenty w celu ustalenia, w jaki sposób sekwencje peptydowe mogą być dostarczane do kości w celach regeneracyjnych. W ostatnim kroku zbadaj histologicznie naprawę kości; zestawienie tych wyników może dostarczyć istotnych informacji na temat mechanizmów różnicowania komórek in vitro oraz naprawy kości in vivo. Zaletą zastosowania techniki biopanningu z wykorzystaniem biblioteki phagemu jest możliwość zidentyfikowania peptydów celujących w kość, które mogą być użyte do stymulacji różnicowania komórek mezenchymalnych i wzmocnienia procesu naprawy kości.

W ostateczności sekwencje peptydowe te mogą znaleźć zastosowanie w modalnościach terapeutycznych w celu regeneracji kości oraz w leczeniu utraty masy kostnej, takiej jak osteopenia i osteoporoza. Opierając się na badaniu, w którym ULA i Pascal wykazali, że biopanning może być wykorzystany do izolacji sekwencji peptydowych celujących w naczynia krwionośne, zdecydowaliśmy się zaadaptować tę metodę do badania mechanizmów w tkance kostnej. W procedurze biopanningu in vivo przepływiono 10¹⁰ jednostek tworzących plakietki biblioteki peptydowej fagejnej N-E-B-P-H-D 12 przez serce 10-tygodniowej myszy szczepu valve C.

Po około pięciu minutach uśmierć mysz, odsłoń i wypreparuj kości udowe, odetnij ich końce i usuń szpik kostny. Przepłucz lewą kość udową zarówno od wewnątrz, jak i od zewnątrz, 10 razy w PBS. Następnie przenieś kość do bakterii ER 2 5 3 7.

W celu usunięcia nie związanych fagów, należy użyć 2% suszonego mleka odtłuszczonego w strzykawce z igłą 21G, aby 10 razy wypłukać kanał szpikowy prawej kości udowej. Następnie należy eluować związane fagi z kanału szpikowego, używając buforu glicynowo-kwasu solnego o pH 2.2 zneutralizowanego roztworem Tris o stężeniu 1 M.

Aby namnożyć fag, należy dodać EIT do bakterii ER 2 5 3 7 i inkubować przez 4,5 godziny. Ostrożnie przenieść nadsącz do nowych probówek i trzykrotnie wytrącić faga poprzez dodanie roztworu glikolu polietylenowego i chlorku sodu, a następnie inkubować probówki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsius.

Na koniec odzawiesić osad w buforze TBS z 0,02% azotku sodu. Wykonać metodę płytkową dla fagów w celu oznaczenia jednostek tworzących plaques (PFU) dla namnożonych EITs. Powtórzyć procedurę biopanningu in vivo cztery razy, zarówno dla fagów elowanych, jak i nieelowanych.

Namnożyć pulę fagów w kulturach bakteryjnych. Oczyścić i skwantyfikować sekwencję DNA, końcowe DNA fagowe, wykorzystując starter 98 dostarczony w zestawie do wyświetlania fagowego. Co istotne, obliczyć częstotliwość reprezentacji sekwencji DNA fagów.

Następnie zsyntetyzowano peptydy zawierające sekwencję glicyna glicyna glicyna seryna lizyna oraz namnożono komórki D1, klonowaną linię wielopotencjalnych komórek szpiku kostnego myszy opracowaną w naszym laboratorium, do osiągnięcia 90% konfluencji. Komórki poddano trypsynizacji, odwirowano w celu utworzenia osadu i policzono przed barwieniem peptydowym; komórki wysiano na szkiełka z komorami pokryte żelatyną i inkubowano przez 24 godziny.

Przemyj komórki buforem PBS i utrwal za pomocą 4% paraldehydu przez 30 minut. Następnie przeprowadź inkubacje blokujące z glikyną, a potem z BSA Aden i BBSA. Roztwory blokujące biotynę.

Dodaj 100 µM biotynilowanych peptydów L7 oraz R1. Następnie przemyj komórki trzy razy PBS, każdorazowo przez pięć minut. Dodaj roztwór LOR strippin w rozcieńczeniu 1:1000, przykryj naczynie folią i inkubuj w ciemnej szufladzie przez 30 minut.

Przemyć komórki i zamocować szkiełka nakrywki, używając medium montażowego Vector Shield. Następnie przeanalizować preparaty pod mikroskopem fluorescencyjnym na 24 godziny przed operacją. Namoczyć cylindry z gąbki żelowej.

Przenieś cylindry z pianki żelowej zawierające 20 µM peptydu L7 lub R1 lub bufor PBS bez peptydu do sterylnych 12-dołkowych naczyń hodowlanych i przechowuj w lodówce przez noc w temperaturze 4 °C przed planowanym zabiegiem chirurgicznym. Przed użyciem umieść kompozyt z pianki żelowej na lodzie.

Używając pneumatycznego wiertła przy irygacji solą fizjologiczną, należy wyciąć duży wydłużony defekt jednokortykalny o szerokości 3 mm i długości 8 mm. Defekt kostny należy potraktować przygotowanymi piankami żelowymi, wprowadzając wszystkie implantowane rusztowania za pomocą delikatnego wklepywania. Szczury należy poddać eutanazji, a następnie pobrać kości piszczelowe w określonych punktach czasowych, uważnie sprawdzając miejsce defektu kostnego; pobrane kości piszczelowe należy utrwalić w 10% neutralnym buforowanym formalinie w celu wykonania przekrojów parafinowych.

Na koniec wszystkie przekroje tkanek należy zabarwić hematoksyną i eozyną, aby oznakować macierz kostną. Adenzyny znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny umożliwiają mikroskopową detekcję wiązania peptydów z komórkami hodowanymi in vitro. W tym przypadku peptydy wiążą się z komórkami mezenchymalnymi w hodowli, aby określić osteogenny wpływ peptydów na komórki.

Komórki mezenchymalne w hodowli in vitro można traktować peptydami testowymi w celu określenia zmian w morfologii komórek. Na przykład w czwartym dniu komórki zaczynają agregować, a agregaty powiększają się z czasem, tworząc guzki. Co ciekawe, przekrój kostny barwiony h i e wykazuje autofluorescencję w świetle UV.

Większy kontrast pomiędzy tkanką kostną a tkankami niekostnymi ułatwia analizy ilościowe obecności kości w przekrojach w celu określenia stopnia naprawy kostnej w ubytkach leczonych gelfoamem z dodatkiem peptydu. W porównaniu do zastosowania samego gelfoamu, ubytki wypełnione gelfoamem z dodatkiem peptydu wykazały największy stopień regeneracji kory kostnej w czasie. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby być niezwykle systematycznym w wprowadzaniu danych ze względu na dużą liczbę próbek, które nieuchronnie będą się gromadzić do momentu wybrania końcowej grupy peptydów.

Opracowanie metody biopanningu in vivo jako techniki identyfikacji peptydów celujących w kości oznacza, że dysponujemy obecnie potencjalnymi lekami, które mogłyby zostać wykorzystane w terapii regeneracji kości oraz w leczeniu ubytku masy kostnej. Jeden z mechanizmów leżących u podstaw regeneracji kości bierze udział również w procesie utraty tkanki kostnej. Szczegółowe zrozumienie tych mechanizmów oraz posiadanie narzędzi, które mogłyby być stosowane w leczeniu zaburzeń, takich jak opóźnione zrosty złamań i osteoporoza, pomoże w udoskonaleniu terapii opracowywanych w ramach opieki zdrowotnej.