System transdukcji alfawirusów: narzędzia do wizualizacji infekcji w wektorach komarzych

Wirusy alfa to przenoszone przez komary wirusy RNA, które trwale infekują podatne komórki komarów przy minimalnej cytopatologii. Niniejszy protokół demonstruje użyteczność zakaźnych systemów transdukcyjnych wirusów alfa, które wykazują ekspresję reporterów fluorescencyjnych w celu wykrywania infekcji wektora oraz transmisji wirusa. W pierwszej kolejności należy podać samicom komarów posiłek krwi zawierający interesujący nas wirus alfa, a następnie określić wydajność infekcji komarów i wybrać wyłącznie te osobniki, które wykazują ekspresję genu markerowego.

Następnie pobierz ślinę z zainfekowanych komarów i wykaż zdolność do transmisji poprzez zakażenie hodowlanych komórek komara zebraną śliną. Wyniki uzyskaj za pomocą mikroskopii epi-fluorescencyjnej. Wizualizacja białka reporterowego, takiego jak GFP, pozwoli na śledzenie infekcji wektora i transmisji wirusa u gatunków komarów Aedes lub Culex.

Systemy ekspresji wirusów alfa lub ATS mogą być wykorzystywane do szybkiej oceny ekspresji genów oraz wektorowych komarów, zarówno w badaniach nad arbowirusami, jak i przed przeprowadzeniem trudniejszych manipulacji u komarów, takich jak transgeneza komarów. Procedury te zaprezentują dr Irma Sanchez Vargas, dr Eric Mossel oraz Aaron Phillips z laboratorium dr. Kena Olsona. Aby wyprodukować wirusa TS w komórkach BHK 21, należy użyć rekombinowanego wirusa symbis, który wykazuje ekspresję reportera GFP po transkrypcji in vitro, a następnie przeprowadzić elektroporację RNA transdukującego systemu wirusa alfa w komórkach BHK 21.

Następnie wyizoluj i namnóż wirusa przed przeprowadzeniem infekcji. Przygotuj komary do efektywnego żerowania na sztucznym karmniku poprzez głodzenie. Usuń cukier na 24 godziny i wodę na 12 godzin przed karmieniem.

Wymieszano komercyjnie pozyskaną krew zwierzęcą (defibrylowaną lub cytratywaną) z przygotowaną kulturą komórkową, aby otrzymać zawiesinę wirusa TS do efektywnego zakażenia jelita środkowego komarów. Opracowano miano wirusa w posiłku krwiowym na poziomie 10⁷ jednostek tworzących plak (PFU) na ml, aby pobudzić komary do ssać krew. Dodano TP do stężenia końcowego 0,02 M.

Umieść membranę jelitową o określonej wielkości porów nad wylotem szklanego podajnika z płaszczem wodnym. Następnie przygotuj podajniki z cyrkulującą wodą o temperaturze 37 °C. Po tym pipetuj pożywkę do komory i stabilnie ustaw podajniki na kartonie.

Po karmieniu komarów przez 10 do 30 minut, odsortuj z zimno znieczulonych owadów osobniki nasycone krwią, aby umożliwić replikację i rozprzestrzenianie się wirusa TS w wybranych komarach. Inkubuj je w temperaturze 28 °C i przy 75% wilgotności względnej przez 8 do 10 dni. W celu unieruchomienia komarów.

Umieścić kartonik z papierem w temperaturze 4 °C na około 15 minut. Następnie przenieść od 5 do 10 komarów na stół chłodzący przystosowany do użytku z mikroskopem fluorescencyjnym. Zbadać i posegregować komary na podstawie obecności lub braku fluorescencji.

Przenieś wybrane komary z powrotem do papierowego pudełka do dalszego wykorzystania zgodnie z potrzebami. Na tym etapie określ wydajność infekcji, wykorzystując natężenie fluorescencji jako wskaźnik. Na koniec wypreparuj tkanki, takie jak jelita środkowe, gruczoly SIV i ciała tłuszczowe, a następnie monitoruj obecność fluorescencji.

Organy i tkanki te można wypreparować we wcześniejszych odstępach czasu, jeśli jest to pożądane. Przed karmieniem należy odciąć komarom dostęp do źródła cukru na 24 godziny. Przygotować kapilarę o pojemności 50 µL, która została podgrzana, rozciągnięta i przycięta, wypełniając ją od trzech do pięciu µL Cargill.

Nalej olej immersyjny typu B, aby zapobiec ucieczce komarów. Usuń ich odnóża i skrzydła. Następnie wprowadź proboscis do rurki.

Uważnie monitoruj krople śliny wydzielane z proboscis do oleju immersyjnego. W razie potrzeby nanieś kroplę 1% pilokarpiny na przedplecze komara, aby zwiększyć ślinienie; po 60 do 90 minutach usuń komary i przechowuj je do późniejszej izolacji wirusa. Aby zebrać roztwór z rurki kapilarnej, wypchnij mieszaninę śliny i oleju do probówki zawierającej 500 µL sterylnego 20% F-B-S-P-B-S.

Przefiltruj inokulum przez filtr strzykawkowy o porach 0,2 mikrona, a następnie użyj tego inokulum do zakażenia hodowlanych komórek komara. Skuteczność zakażenia wirusem five prime DS MRE 16 GFP oceniano na podstawie ekspresji GFP. W czasie komórki te były zakażane wirusem przy wielokrotności zakażenia 0,01.

Mikroskop fluorescencyjny z oświetleniem epifluorescencyjnym umożliwia obserwację GFP w całym ciele zainfekowanego komara, a także w jego poszczególnych częściach, tutaj 10 dni po zakażeniu. Organoselektywna ekspresja GFP świadczy o rozsianym charakterze infekcji. W jelitach środkowych zazwyczaj występują wyraźne ogniska infekcji w krótkim czasie po spożyciu posiłku z krwi zawierającego wirusa, który w późniejszych etapach po zakażeniu rozprzestrzenia się w tylnej części jelita środkowego.

Zdarzenia te są sygnalizowane przez reportery GFP i DS RED. Test transmisji wskazuje, że wirus five prime DS MRE 16 GFP stabilnie wykazuje ekspresję GFP przez cały okres inkubacji zewnętrznej. U badanego komara GFP oraz ślina komara są wykrywalne już w ósmym dniu po zakażeniu.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić doustną infekcję komara wirusem A TS, jak wizualnie ocenić infekcję wirusową u komara oraz jak ocenić transmisję wirusa z komara.