System transdukcji alfawirusów: narzędzia do wizualizacji infekcji u wektorów komarów

Wirusy alfa to wirusy RNA przenoszone przez komary, które uporczywie infekują podatne komórki komara przy minimalnej cytopatologii. Protokół ten pokazuje użyteczność zakaźnych systemów transdukcji wirusa alfa, które wyrażają reportery fluorescencyjne do wykrywania infekcji wektorowej i transmisji wirusa. Najpierw nakarm samice komarów mączką z krwi zawierającą wirusa alfa, który ich interesuje, a następnie określ skuteczność infekcji komarami i wybierz tylko komary wykazujące ekspresję genu markera.

Następnie zbierz ślinę od zakażonych komarów i wykaż zdolność przenoszenia się poprzez zakażenie wyhodowanych komórek komarów pobraną śliną. Wyniki uzyskane metodą mikroskopii fluorescencyjnej. Wizualizuj raport o białku, takim jak GFP, a tym samym śledź infekcję wektorową i przenoszenie wirusa przez gatunki komarów z lat osiemdziesiątych lub QE.

Systemy ekspresji wirusa alfa lub ATS mogą być używane do szybkiej oceny ekspresji genów i komarów wektorowych zarówno w badaniach arbowirusów, jak i przed wykonaniem trudniejszych manipulacji komarami, takich jak transgeneza komarów. Procedury te zademonstrują dr Irma Sanchez Vargas, dr Eric Mossel i Aaron Phillips z laboratorium dr Kena Olsona. Aby wytworzyć wirusa TS w komórkach Bhk 21, należy użyć rekombinowanego wirusa symbis, który wyraża reportera GFP po transkrypcji in vitro, elektrolitycznie oceń system transdukujący genomowy wirus alfa RNA do komórek bhk 21.

Następnie uratuj i amplifikuj wirusa przed infekcją. Przygotuj komary do efektywnego odżywiania się krwią ze sztucznego karmnika przez brak pożywienia. Usuń cukier i wodę na 12 godzin przed karmieniem.

Zmieszana komercyjnie uzyskana defibrylowana lub cytrynowana krew zwierzęca z przygotowaną hodowlą komórkową uzyskała zawiesinę wirusa TS do skutecznego zakażenia komarów w jelicie środkowym. Sformułuj od 10 do siedmiu jednostek tworzących blaszkę miażdżycową na mililitr miana wirusa dla mączki z krwi, aby stymulować obrzęk komarów. Dodać TP do końcowego stężenia 0,02 molowego.

Umieść błonę jelitową ze znakiem porów nad ujściem szklanego podajnika z płaszczem wodnym. Następnie ustaw karmniki z krążącą wodą o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie odpipetuj mączkę do komory i bezpiecznie umieść podajniki na kartonie.

Po karmieniu komarów przez 10 do 30 minut, posortuj komary w zimnym znieczuleniu dla próbek nabrzmiałych krwią, aby umożliwić replikację i rozprzestrzenianie się wirusa TS w wybranych komarach. Inkubuj je w temperaturze 28 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 75% przez osiem do 10 dni. W celu unieruchomienia komarów.

Umieść karton z papierem w temperaturze czterech stopni Celsjusza na około 15 minut. Teraz przenieś od pięciu do 10 komarów na stół chłodzący, który jest przystosowany do użytku pod mikroskopem fluorescencyjnym. Zbadaj i posortuj komary na podstawie obecności lub braku fluorescencji.

Zwróć wybrane komary do papierowego kartonu, aby użyć ich zgodnie z potrzebami. W tym momencie określ skuteczność infekcji, używając intensywności fluorescencji jako wskaźnika proxy. Na koniec przeanalizuj tkanki, takie jak jelito środkowe, gruczoły SIV i ciała tłuszczowe, i monitoruj fluorescencję.

W razie potrzeby te narządy i tkanki można wypreparować wcześniej. Pozbawić komary źródła cukru na 24 godziny przed karmieniem. Przygotuj rurkę kapilarną o pojemności 50 mikrolitrów, która została podgrzana, wyciągnięta i odcięta od trzech do pięciu mikrolitrów Cargill.

Olejek immersyjny typu B, aby komary nie uciekły. Usuń ich nogi i skrzydła. Teraz włóż sondy do rurki.

Uważnie monitoruj kropelki śliny, które wydzielają się z trąbek do olejku immersyjnego. W razie potrzeby umieść kroplę 1% pilokarpiny na klatce piersiowej komara, aby zwiększyć wydzielanie śliny po 60 do 90 minutach, usuń komary i przechowuj je do przyszłej izolacji wirusa. Teraz, aby pobrać roztwór z rurki kapilarnej, wyrzuć mieszaninę oleju ze śliny do probówki zawierającej 500 mikrolitrów sterylnego 20% F-B-S-P-B-S.

Przefiltruj inokulum przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,2 mikrona, a następnie użyj tego inokulum do zainfekowania hodowanych komórek w komórkach komara. Skuteczność zakażenia wirusem Five Prime DS MRE 16 GFP ocenia się na podstawie ekspresji GFP. Z biegiem czasu komórki te zostały zainfekowane wirusem przy 0,01 wielokrotności infekcji.

Mikroskop epifluorescencyjny umożliwia obserwację GFP z całego ciała u zakażonego komara, a także w różnych częściach ciała po 10 dniach od zakażenia. Selektywna ekspresja GFP w narządach wskazuje na zakażenie rozsiane. Jelito środkowe zwykle ma wyraźne ogniska infekcji wcześnie po spożyciu mączki z krwi zawierającej wirusa, który rozprzestrzenia się w tylnym jelicie środkowym w późniejszym czasie po zakażeniu.

Zdarzenia te są sygnalizowane przez reporterów GFP i DS RED. Test transmisji wskazuje, że pięć głównych wirusów GFP DS MRE 16 stabilnie wykazuje ekspresję GFP przez cały okres inkubacji zewnętrznej. U tutejszych komarów GFP i ślina komara są wykrywane już po ośmiu dniach od zakażenia.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak doustnie zainfekować komara wirusem A TS, jak wizualnie ocenić infekcję wirusową komara i jak ocenić przenoszenie wirusa przez komara.