Name: System transdukcji alfawirusów: narzędzia do wizualizacji infekcji u wektorów komarów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj systemy transdukcji alfawirusów do wizualizacji infekcji u komarów dorosłych. Ta metoda umożliwia śledzenie transmisji wirusa i ekspresji białek fluorescencyjnych w komórkach wektorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest wspierana przez National Institutes of Health (NIH R01 AI46435) oraz RMRCE (NIH AI065357).

Poniższy protokół został opracowany w celu produkcji i wykorzystania ATS opartego na wirusie Sindbis MRE16. ATS został zaprojektowany do ekspresji GFP w wektorze komarowym Aedes aegypti. Obecnie dostępne są cDNA klony infekcyjne kilku alfawirusów (wirus Sindbis, wirus Chikungunya, wirus O'nyong-nyong, wirus zachodniego zapalenia mózgu koni), które zostały zaprojektowane jako ATS (Tabela 1). Aby uzyskać najlepsze wyniki, DNA plazmidowe należy namnażać w bakteriach, takich jak kompetentne bakterie SURE (Stratagene/Agilent Technologies), aby uniknąć niepożądanej rekombinacji i utraty cDNA wirusa. Wszystkie plazmidy klonów infekcyjnych posiadają promotor bakteriofaga T7 lub SP6 bezpośrednio na końcu 5' cDNA wirusa w celu transkrypcji pełnowartościowego RNA genomowego oraz unikalną endonukleazę restrykcyjną na końcu 3' do transkrypcji typu runoff. W przypadku każdego ATS użytkownicy muszą zastosować odpowiednią zależną od DNA polimerazę RNA bakteriofaga oraz unikalną endonukleazę restrykcyjną do transkrypcji in vitro genomu RNA wirusa.
1. Generowanie zakaźnego RNA z klonu cDNA.
<ol>
 <li>Zlinearyzuj 5 μg plazmidu klonu infekcyjnego (p5'dsMRE16/GFP) za pomocą 20 jednostek enzymu restrykcyjnego XhoI w 100 μL reakcji. Inkubuj przez 2-3 h w temperaturze 37°C.</li>
 <li>Oczyść zlinearyzowane DNA, korzystając z alternatywnego protokołu oczyszczania z zestawu Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit, eluiąc DNA z kolumny spinowej w 50 μL wody wolnej od RNaz. Stężenie plazmidu powinno wynosić około 1,0 μg/μL.</li>
 <li>W wolnej od RNaz probówce do PCR o pojemności 0,2 mL przygotuj 50 μL reakcji transkrypcji z użyciem zestawu Ambion MAXIscript zgodnie z następującym protokołem: 
 <ul>
 <li>22,5 μL dH2O wolnej od RNaz
 <ul>
 <li>5,0 μL zlinearyzowanej matrycy DNA (1,0 μg/μL)</li>
 <li>2,5 μL 10mM ATP</li>
 <li>2,5 μL 10mM CTP</li>
 <li>2,5 μL 10mM UTP</li>
 <li>2,5 μL 1mM GTP</li>
 <li>2,5 μL 10mM analogu czapeczki (m7G(5')ppp(5')G)</li>
 <li>5,0 μL 10X buforu do transkrypcji</li>
 <li>5,0 μL mieszaniny polimerazy T7 lub SP6</li>
 </ul>
 </li>
 <li>50,0 μL objętości całkowitej</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Inkubuj reakcję transkrypcji przez 1 h w temperaturze 37°C. Po inkubacji produkt reakcji należy niezwłocznie wykorzystać do elektroporacji komórek BHK-21. Przygotowanie komórek BHK-21 do elektroporacji powinno rozpocząć się w trakcie inkubacji reakcji transkrypcji.</li>
</ol>
2. Generowanie wirusa z zakaźnego RNA
<ol>
 <li>Przeprowadzić trypsynizację komórek BHK-21 w dwóch kolbach 150 cm2 (T-150) o konfluencji 70-80% na każdą próbkę ATS.</li>
 <li>Przenieść wszystkie komórki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mL.</li>
 <li>Zwirować komórki w konwencjonalnej wirówce stołowej przy 2000 rpm przez 10 min w temperaturze 4°C w celu uzyskania osadu.</li>
 <li>Resuspendować komórki w sterylnym PBS bez Mg++ i Ca++. Powtórzyć kroki 2.3 i 2.4, aż komórki zostaną trzykrotnie przemyte PBS.</li>
 <li>Resuspendować osad komórkowy w 0,5 mL MEM zawierającego 10% FBS.</li>
 <li>Rozcieńczyć 10 μL zawiesiny komórkowej w 90 μL MEM z 10% FBS i policzyć komórki za pomocą hemacytometru. W razie potrzeby rozcieńczyć komórki do stężenia 2,5-12,5 x 107 cells/mL przy użyciu MEM zawierającego 10% FBS.</li>
 <li>Do schłodzonej na lodzie kuwety do elektroporacji o szerokości 0,2 cm dodać 400 μL zawiesiny komórkowej oraz 20 μL mieszaniny do reakcji transkrypcji. Przetrzeć kuwetę z kondensatu.</li>
 <li>Wykonać dwa impulsy elektryczne w kuwecie: 450V, 1200Ω, 150 μF. Używamy urządzenia Electro Cell Manipulator, Harvard Apparatus Model ECM630.</li>
 <li>Przenieść całą zawartość kuwety do kolby hodowlanej 25 cm2 zawierającej 5 mL MEM z 10% FBS.</li>
 <li>Inkubować kolbę(s) w temperaturze 37C w atmosferze 5% CO2.</li>
 <li>Monitorować infekcję codziennie za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednim zestawem filtrów (np. filtr GFP: długość fali wzbudzenia = 460-490 nm, długość fali emisji = 510-550 nm; lub filtr dsRed: długość fali wzbudzenia = 460-560 nm, długość fali emisji = &gt;590 nm).</li>
 <li>Gdy fluorescencja wskazuje, że infekcja jest konfluenta i/lub w całej kolbie widoczny jest efekt CPE, zebrać zawartość kolby, dodać 30% FBS, podzielić na aلیکwoty zgodnie z potrzebami i przechowywać w temperaturze -80°C. W razie potrzeby lizaty komórkowe można oczyścić przez wirowanie (2000 rpm, 10 min, 4°C) przed dodaniem FBS.</li>
 <li>Przeprowadzić co najmniej jedno pasażowanie wirusa na nową kolbę z komórkami, aby zwiększyć miano wirusa na potrzeby późniejszych testów karmienia krwią.</li>
</ol>
3. Zakażanie komarów drogą per os
<ol>
 <li>Wymieszać krew (zazwyczaj zakupioną beztrombową krew owczą) z zawiesiną wirusa pochodzącą z hodowli komórkowych z kroku 2.13. Końcowy miano wirusa w posiłku krwiowym powinno wynosić zazwyczaj ~1x107 jednostek tworzących plaki (pfu)/mL, aby zapewnić efektywną infekcję jelita środkowego komara. W celu pobudzenia komarów do żerowania można dodać adenozynotrifosforan (ATP) do stężenia końcowego 0,02M.</li>
 <li>Przed infekcją komary mogą wymagać odstawienia wody i cukru, aby pobudzić je do efektywnego pobierania krwi z sztucznego karmnika. Czas deprywacji powinien zostać wcześniej ustalony w celu zminimalizowania śmiertelności. Terminy te zależą od gatunku komara, wilgotności w insekterium itp. Jako punkt wyjścia, należy usunąć cukier na 24h i wodę na 12h przed karmieniem. W tym protokole zastosowano szklane karmniki z płaszczem wodnym17 z cyrkulującą wodą o temperaturze 37°C. Membranę jelita świńskiego (np. dokładnie wypłukaną osłonkę do kiełbas dostępną w większości sklepów spożywczych) umieszcza się na wylocie karmnika, a posiłek pipetuje do komory. W zależności od rodzaju wektora dostępne są różne konstrukcje, membrany i protokoły.</li>
 <li>Komary są sortowane w celu wyselekcjonowania wyłącznie osobników nasyconych krwią. Nasycone komary przenosi się do kartonu z organdyną na górze i inkubuje w temperaturze 28°C przy 75-80% wilgotności względnej do czasu analizy ekspresji GFP.</li>
</ol>
4. Inokulacja wewnątrzklatkowa komarów
Inokulacja wewnątrzklatkowa jest alternatywną metodą zakażania stawonogów. Metodę tę stosuje się, gdy nie jest wymagane rozprzestrzenianie się patogenu przez jelito środkowe. (Metoda opisana poniżej, jednak technika ta nie jest pokazana w niniejszym eksperymencie wizualnym).
<ol>
 <li>Niewielka liczba komarów (5-10) zostaje odessana z klatek hodowlanych do plastikowych probówek transportowych. Szczelnie zamknięte probówki umieszcza się w temperaturze 4°C na 15 min, aby schłodzić komary.</li>
 <li>2-5 komarów wysypuje się z probówki na szklaną szalkę Petri spoczywającą na lodzie. Gdy szalka nie jest używana lub gdy komary zaczną się poruszać, należy nałożyć na nią pokrywkę. Podczas manipulacji komarami należy zachować ostrożność, aby policzyć i kontrolować liczbę przekładanych osobników. W miarę wysypywania komarów na stół chłodniczy, całkowitą liczbę zapisuje się na liczniku laboratoryjnym.</li>
 <li>Igłę przygotowuje się poprzez stapianie rurek kapilarnych przy użyciu szkła dedykowanego dla Nanoject oraz wyciągacza do igieł.</li>
 <li>Mikrowstrzykiwacz Nanoject II należy przygotować zgodnie z instrukcją producenta w celu podania 69 nL inokulum. Należy zachować ostrożność podczas pobierania inokulum do igły, aby jej nie uszkodzić.</li>
 <li>Używając mikroskopu stereoskopowego, należy wprowadzić igłę do klatki piersiowej komara i aktywować Nanoject w celu inokulacji. Podczas inokulacji komarów należy zachować ostrożność, aby igła nie przebiła komara na wylot, co spowodowałoby jego późniejszą śmierć. Przed zdjęciem komara z igły należy sprawdzić, czy inokulum zostało prawidłowo podane.</li>
 <li>Po inokulacji, gdy komar wciąż znajduje się na igle, należy go umieścić w papierowym pudełku transportowym przez mały otwór w boku, który w pozostałym czasie jest zatkany watą lub korkiem.</li>
 <li>Gdy komary zostaną zinokulowane i umieszczone w pudełku (do około 50 osobników na pudełko), należy ostrożnie przykleić korek taśmą, aby zapobiec przypadkowemu uwolnieniu owadów. Pudełka należy umieścić w bezpiecznym pojemniku przed dalszą inkubacją w insekterium w temperaturze 28°C i 80% wilgotności względnej.</li>
</ol>
5. Monitorowanie zakażenia komarów
<ol>
 <li>Umieścić karton z papierem w temperaturze 4°C na około 15 minut, aby unieruchomić komary.</li>
 <li>Przenieść niewielką liczbę komarów (po 5-10 sztuk) na stół chłodzący przystosowany do użytku z mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
 <li>Zbadać i posegregować komary na podstawie obecności lub braku fluorescencji. Dodatkowo intensywność fluorescencji może służyć jako przybliżony pomiar ilościowy zakażenia. Można przeprowadzić sekcję tkanek komarów, takich jak jelita środkowe, gruczoły ślinowe i ciało tłuszczowe, i monitorować je pod kątem fluorescencji.</li>
 <li>W razie potrzeby przenieść wybrane komary z powrotem do kartonu papierowego, aby kontynuować inkubację zakażonych osobników.</li>
</ol>
6. Test transmisji (wymuszona salwacja w celu wykazania transmisji wirusa)
<ol>
 <li>Pozbawić komary źródła cukru na 24 h przed karmieniem.</li>
 <li>Usunąć odnóża i skrzydła.</li>
 <li>Do kapilary o objętości 50 μL, która została podgrzana, wyciągnięta i odcięta z jednego końca, dodać 3-5 μL oleju immersyjnego Cargille Type B lub 10% roztworu surowicy z sacharozą.</li>
 <li>Wprowadzić proboscis do kapilary. W przypadku zastosowania oleju zauważalny będzie wysięk kropli śliny z proboscis. W celu stymulacji można nanieść na klatkę piersiową 1 μL 1% roztworu pilokarpiny w PBS z dodatkiem 0.1% Tween 80.</li>
 <li>Po 60-90 minutach usunąć komary i przechowywać do izolacji wirusa, jeśli jest to wymagane.</li>
 <li>Usunąć roztwór z kapilary poprzez wirowanie w probówce zawierającej 100 μL 20% FBS-PBS.</li>
 <li>Przefiltrować inokulum sterylnie za pomocą filtra strzykawkowego 0.2 μm, a następnie wykorzystać przefiltrowane inokulum do zakażenia hodowli komórkowych.</li>
</ol>
UWAGA DOTYCZĄCA BIOBEZPIECZEŃSTWA: Niniejszy protokół opisuje metodę generowania, identyfikacji i monitorowania zainfekowanych komarów. W zależności od dostępnych zapleczy (np. stołu chłodniczego, zaplecza izolacyjnego itp.) oraz zgody IBC, badanie owadów może być ograniczone do etapu po usunięciu skrzydeł i odnóży, aby zapobiec ich ucieczce. ATS oparte na SINV mogą być generowane i wykorzystywane w środowisku BSL2. Stosowanie ATS opartych na innych alfawirusach, takich jak wirus Chikungunya lub wirusy zachodniego zapalenia mózgu koni, wymaga zaplecza BSL3.
7. Reprezentatywne wyniki
Przegląd ekspresji genu markera (GFP) z wykorzystaniem ATS 5'dsMRE16/GFP przedstawiono na rysunku 1. Ekspresję GFP w komórkach BHK-21 oraz C6/36 (Aedes albopictus) pokazano na rysunku 2 w określonych odstępach czasu po zakażeniu komórek wirusem 5'dsMRE16/GFP przy wielokrotności zakażenia 0.01. Rysunek 3 stanowi przegląd zakażeń komarów wirusem alfawirusa oraz wirusem ATS w przypadku dostarczenia wirusa poprzez zakażony posiłek krwi. Rysunek 4 przedstawia przygotowanie posiłku krwi zawierającego ~107 pfu/mL wirusa ATS, a następnie zakażenie doustne Aedes aegypti. Widok całego ciała zakażonego komara oraz wybranych części ciała w 10. dniu po zakażeniu przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego (rysunek 5). Detekcja GFP i dsRED w jelitach środkowych zakażonych komarów po zakażeniu wirusami ATS 5'dsMRE16 wykazującymi ekspresję każdego z fluorescencyjnych genów markerowych (rysunek 6). Test transmisji z wykorzystaniem komarów zakażonych wirusem ATS 5'dsMRE16/GFP (rysunek 7).
Tabela 1. Obecnie opracowane sekwencje ATS do ekspresji genów u komarów.
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>  Alfawirus</td>
 <td>ATS</td>
 <td>Komar</td>
 <td>Bibliografia</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wirus Sindbis</td>
 <td>TE/3'2J i TE/5'2J</td>
 <td>Aedes aegypti</td>
 <td>12 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>Ochlerotatus triseriatus</td>
 <td>13 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>3'dsMRE16 oraz 5'dsMRE16</td>
 <td>A. aegypti</td>
 <td>5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>Culex tritaeniorhynchus</td>
 <td>5 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>5'dsTR339</td>
 <td>A. aegypti</td>
 <td>2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wirus chikungunya </td>
 <td>3'dsCHIKV i 5'dsCHIKV</td>
 <td>A. aegypti/A. albopictus</td>
 <td>20 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wirus O'nyong-nyong </td>
 <td>5'dsONNV </td>
 <td>Anopheles gambiae</td>
 <td>1,9 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wirus zachodniego zapalenia mózgu koni </td>
 <td>5'dsWEEV.McMillan</td>
 <td>Culex tarsalis</td>
 <td>Stauft i wsp., nieopublikowane </td>
 </tr>
</tbody>
</table>
Tabela 2. Zalety i wady stosowania ATS w ekspresji genów u komarów.
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Zalety:</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Szybka produkcja wirusa o wysokim mianie</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Szeroki zakres gospodarzy (SINV)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wysoka szybkość replikacji RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wysokie poziomy ekspresji transgenu</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Względna łatwość manipulacji genami</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stabilna, uporczywa ekspresja genów u owadów</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Minimalna patologia u owadów</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wady:</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Krótkotrwały tryb ekspresji w komórkach kręgowców</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silne efekty cytopatyczne w komórkach kręgowców</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ograniczenia dotyczące wielkości genu (&lt;1Kb, idealnie)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Niektóre alphaviruses wymagają poziomu bezpieczeństwa BSL3</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
<img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig1.jpg" alt="Schemat wirusa ATS Double Subgenomic SIN; proces transkrypcji i replikacji, rekombinowany alfawirus." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd produkcji wirusa ATS w komórkach BHK-21 z użyciem p5'dsMRE/GFP SINV wykazującego ekspresję GFP. Po transkrypcji in vitro genomowe RNA ATS jest wprowadzane do komórek BHK-21 metodą elektroporacji, gdzie dochodzi do odzyskania wirusa. Wirus ATS może być następnie wykorzystany do zakażania komarów. SGP = promotor subgenomowy. W komórkach transkrybowane są trzy rodzaje RNA ATS: genomowe, subgenomowe 1 oraz subgenomowe 2. Białko kapsydu (C) oraz glikoproteiny E2 i E1 są montowane wraz z genomem ATS w celu wytworzenia wirusa zakaźnego.
<img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig2.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna komórek C6/36 z ekspresją GFP w czasie od 24 do 72 h po infekcji, wykazująca efekty wirusowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Ekspresja GFP w komórkach komarów (C6/36) po infekcji wirusem SINV 5'dsMRE16/GFP.
<img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig3.jpg" alt="Proces zakażenia wirusem ATS u Aedes aegypti, schemat szczegółowo przedstawiający etapy transmisji wirusa i inkubacji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przegląd zakażenia wirusem ATS u komarów prowadzącego do transmisji wirusa.
<img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig4.jpg" alt="Proces infekcji ATS; przygotowanie posiłku krwi i ustawienie szklanego karmnika do badania transmisji wirusa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Infekcja ATS SINV 5'dsMRE16 poprzez wystawienie komarów na zakaźny posiłek krwi.
<img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig5.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej Aedes aegypti z infekcją wirusową, z wyróżnionymi gruczołami ślinowymi." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Infekcja ATS SINV 5'dsMRE16/GFP w 10. dniu po zakażeniu. Wykrycie GFP w całym organizmie wskazuje, że wirus przedostał się z jelita środkowego i rozprzestrzenił do tkanek wtórnych. Rycina przedstawia również ekspresję GFP w wybranych częściach ciała, co również świadczy o rozprzestrzenieniu się infekcji.
<img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig6.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna pokazująca ekspresję transgenu z 5'dsMRE16 w EGFP (zielony) i dsRed (czerwony)." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Infekcja jelit środkowych wirusami ATS SINV 5'dsMRE16/GFP oraz 5'dsMRE16/dsRED w określonych odstępach czasu po zakażeniu. W jelitach środkowych zazwyczaj występują wyraźne ogniska infekcji wczesną fazą po spożyciu posiłku krwi zawierającego wirusa, który w późniejszych etapach po zakażeniu rozprzestrzenia się w całej tylnej części jelita środkowego.
<img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig7.jpg" alt="Analiza chemiczna poprzez interakcję z owadami; mikroskopia fluorescencyjna, obserwacja procesów biologicznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Detekcja ATS 5'dsMRE16/GFP w ślinie komara już 8 dni po zakażeniu. Test został zaprojektowany w celu wykazania transmisji wirusa ATS i pokazuje, że wirus 5'dsMRE16/GFP może stabilnie ekspresować GFP przez cały okres inkubacji zewnętrznej u komara. Panel lewy przedstawia komara wydzielającego ślinę do rurki kapilarnej, panel środkowy przedstawia komórki C6/36 zainfekowane śliną po 1 dniu, a panel prawy po 3 dniach od zakażenia.

<ol><li>Brault, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+patterns+of+o%27nyong+nyong+virus+in+the+malaria-transmitting+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Infection patterns of o'nyong nyong virus in the malaria-transmitting mosquito Anopheles gambiae.</a> Insect Mol. Biol. 13, 625-625 (2004).</li>
<li>Campbell, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+uses+RNA+interference+in+defense+against+Sindbis+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti uses RNA interference in defense against Sindbis virus infection.</a> BMC. Microbiol. 8, 47-47 (2008).</li>
<li>Cirimotich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+RNA+interference+increases+alphavirus+replication+and+virus-associated+mortality+in+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Suppression of RNA interference increases alphavirus replication and virus-associated mortality in Aedes aegypti mosquitoes.</a> BMC. Microbiol. 9, 49-49 (2009).</li>
<li>Capurro, deL. ara, M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-expressed%2C+recombinant+single-chain+antibody+blocks+sporozoite+infection+of+salivary+glands+in+Plasmodium+gallinaceum-infected+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Virus-expressed, recombinant single-chain antibody blocks sporozoite infection of salivary glands in Plasmodium gallinaceum-infected Aedes aegypti.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 427-427 (2000).</li>
<li>Foy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+Sindbis+virus+transducing+system+and+its+characterization+in+three+Culicine+mosquitoes+and+two+lepidopteran+species%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of a new Sindbis virus transducing system and its characterization in three Culicine mosquitoes and two lepidopteran species.</a> Insect Mol. Biol. 13, 89-89 (2004).</li>
<li>Foy, B. D., Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alphavirus+transducing+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Alphavirus transducing systems.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 627, 19-19 (2008).</li>
<li>Franz, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+RNA+interference-based+resistance+to+dengue+virus+type+2+in+genetically+modified+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 4198-4198 (2006).</li>
<li>Hahn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+Sindbis+virus+transient+expression+vectors+for+studying+antigen+processing+and+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Infectious Sindbis virus transient expression vectors for studying antigen processing and presentation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 2679-2679 (1992).</li>
<li>Keene, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+acts+as+a+natural+antiviral+response+to+O%27nyong-nyong+virus+%28Alphavirus%3B+Togaviridae%29+infection+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">RNA interference acts as a natural antiviral response to O'nyong-nyong virus (Alphavirus; Togaviridae) infection of Anopheles gambiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 17240-17240 (2004).</li>
<li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mammalian+membrane+proteins+in+mammalian+cells+using+Semliki+Forest+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of mammalian membrane proteins in mammalian cells using Semliki Forest virus vectors.</a> Methods Mol. Biol. 601, 149-149 (2010).</li>
<li>Myles, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alphavirus-derived+small+RNAs+modulate+pathogenesis+in+disease+vector+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Alphavirus-derived small RNAs modulate pathogenesis in disease vector mosquitoes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 19938-19938 (1993).</li>
<li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+resistance+to+dengue-2+virus+transmission+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered resistance to dengue-2 virus transmission in mosquitoes.</a> Science. 272, 884-884 (1996).</li>
<li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+chloramphenicol+acetyltransferase+in+Aedes+albopictus+%28C6%2F36%29+cells+and+Aedes+triseriatus+mosquitoes+using+a+double+subgenomic+recombinant+Sindbis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The expression of chloramphenicol acetyltransferase in Aedes albopictus (C6/36) cells and Aedes triseriatus mosquitoes using a double subgenomic recombinant Sindbis virus.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 24, 39-39 (1994).</li>
<li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Sindbis+virus+expression+system+that+efficiently+expresses+green+fluorescent+protein+in+midguts+of+Aedes+aegypti+following+per+os+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of a Sindbis virus expression system that efficiently expresses green fluorescent protein in midguts of Aedes aegypti following per os infection.</a> Insect Mol. Biol. 9, 57-57 (2000).</li>
<li>Parikh, G. R., Oliver, J. D., Bartholomay, L. C., C, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+haemocyte+tropism+for+an+arbovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">A haemocyte tropism for an arbovirus.</a> J. Gen. Virol. 90, 292-292 (2009).</li>
<li>Pierro, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+orally+infectious+Sindbis+virus+transducing+system+that+efficiently+disseminates+and+expresses+green+fluorescent+protein+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of an orally infectious Sindbis virus transducing system that efficiently disseminates and expresses green fluorescent protein in Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 12, 107-107 (2003).</li>
<li>Rutledge, L. C. W. ard, A, R., Gould, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+feeding+response+of+mosquitoes+to+nutritive+solutions+in+a+new+membrane+feeder%5BTitle%5D)+AND+%22Mosq.+News%22%5BJournal%5D)">Studies on the feeding response of mosquitoes to nutritive solutions in a new membrane feeder.</a> Mosq. News. 24, 407-407 (1964).</li>
<li>Sanders, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sindbis+virus+induces+transport+processes+and+alters+expression+of+innate+immunity+pathway+genes+in+the+midgut+of+the+disease+vector+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sindbis virus induces transport processes and alters expression of innate immunity pathway genes in the midgut of the disease vector Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1293-1293 (2005).</li>
<li>Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Sindbis+virus-mediated+RNA+interference+to+demonstrate+a+conserved+role+of+Broad-Complex+in+insect+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Use of Sindbis virus-mediated RNA interference to demonstrate a conserved role of Broad-Complex in insect metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 15607-15607 (2003).</li>
<li>Vanlandingham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+double+subgenomic+chikungunya+virus+infectious+clone+to+express+heterologous+genes+in+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a double subgenomic chikungunya virus infectious clone to express heterologous genes in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1162-1162 (2005).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inducing+or+inhibiting+apoptosis+on+Sindbis+virus+replication+in+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of inducing or inhibiting apoptosis on Sindbis virus replication in mosquito cells.</a> J. Gen. Virol. 89, 2651-2651 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Metody przedstawione w niniejszej pracy umożliwiają badaczom śledzenie infekcji alphavirus w hodowli komórkowej komarów oraz u dorosłych samic komarów. Zalety i wady stosowania wirusów ATS zestawiono w Tabeli 2. Infekcyjny klon ATS może być modyfikowany genetycznie w celu ekspresji dowolnego GOI; wykorzystywano go do ekspresji przeciwciał jednoczynnościowych, supresorów RNAi, antysensownych RNA celujących w geny endogenne oraz białek proapoptotycznych. W przypadku braku zastosowania reportera, część metody dotycząca obrazowania nie jest istotna. Niemniej jednak, wiele z tych samych protokołów jest niezbędnych do ratowania wirusa ATS, jego propagacji oraz zakażania komarów. Istnieją ograniczenia dotyczące maksymalnej wielkości transgenu wstawianego do systemu transdukcyjnego alphavirus. Ograniczenia wielkości różnią się w zależności od szczepu rodzicielskiego użytego do wygenerowania ATS i zazwyczaj wynoszą około 1kb, choć w konstrukcjach ATS do zastosowań u komarów używano większych genów reporterowych, takich jak lucyferaza świetlika. Laboratoria badawcze z podstawową wiedzą z zakresu wirusologii powinny być w stanie stosować ATS zgodnie z tymi protokołami. Liczne laboratoria badawcze zrobiły to już, wykorzystując ATS oparte na SINV.

<table><tbody><tr><td>Zestaw QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw MAXIscript Kit</td><td>Ambion</td><td>AB1312</td><td>Należy upewnić się, że zestaw zawiera polimerazę odpowiednią dla danej konstrukcji.</td></tr><tr><td>Analog czapeczki (m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;rsquo;)ppp(5&amp;rsquo;)G)</td><td>Ambion</td><td>AM8050</td><td></td></tr><tr><td>Iniektor nanolitrowy Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Elektryczny manipulator komórkowy (Electro Cell Manipulator)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>ECM 630</td><td></td></tr></tbody></table>

system transdukcji alfawirusów: narzędzia do wizualizacji infekcji w wektorach komarzych

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Systemy transdukcyjne alfabetawirusów (ATS) są ważnymi narzędziami do ekspresji genów zainteresowania (GOI) podczas infekcji. ATS są pochodnymi klonów cDNA wirusów RNA przenoszonych przez komary (rodzaj Alphavirus; rodzina Togaviridae). Rodzaj Alphavirus obejmuje około 30 różnych gatunków wirusów przenoszonych przez komary. Alfabetawirusy są wirusami otoczkowymi i posiadają jednoniciowe genomy RNA (~11,7 Kb). Alfabetawirusy transkrybują subgenomiczne mRNA, które koduje białka strukturalne wirusa niezbędne do enkapsydacji genomu i dojrzewania wirusa. Alfabetawirusy są zazwyczaj silnie lityczne w komórkach kręgowców, ale trwale zakażają podatne komórki komarów przy minimalnej cytopatologii. Te cechy czynią je doskonałymi narzędziami do ekspresji genów u wektorów komarów. Najczęściej stosowane systemy ATS pochodzą z wirusa Sindbis (SINV). Szeroki tropizm gatunkowy SINV umożliwia zakażanie komórek owadów, ptaków i ssaków8. Opracowano jednak systemy ATS pochodzące również z innych alfabetawirusów9,10,20. Ekspresja obcych genów jest możliwa dzięki wstawieniu dodatkowego wirusowego miejsca inicjacji subgenomicznego RNA lub promotora. ATS, w których sekwencja egzogennego genu znajduje się po stronie 5' względem wirusowych genów strukturalnych, są wykorzystywane do stabilnej ekspresji białek u owadów. ATS, w których sekwencja genu znajduje się po stronie 3' względem genów strukturalnych, są stosowane do wyzwalania RNAi i wyciszania ekspresji tego genu u owada.
Systemy ATS okazały się cennymi narzędziami w zrozumieniu interakcji między wektorem a patogenem, szczegółów molekularnych replikacji wirusowej oraz utrzymania cykli zakaźnych3,4,11,19,21. W szczególności ekspresja reporterów fluorescencyjnych i bioluminescencyjnych odegrała kluczową rolę w śledzeniu infekcji wirusowej w wektorze oraz transmisji wirusa5,14-16,18. Ponadto odpowiedź immunologiczna wektora została opisana z wykorzystaniem dwóch szczepów SINV zmodyfikowanych genetycznie w celu ekspresji GFP2,9.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę produkcji SINV zawierającego fluorescencyjny reporter (GFP) z infekcyjnego klonu cDNA. Infekcyjne, pełnowymiarowe RNA jest transkrybowane z linearyzowanego klonu cDNA. Infekcyjne RNA jest wprowadzane do podatnych komórek docelowych poprzez elektroporację. Transfekowane komórki generują infekcyjne cząsteczki wirusa wykazujące ekspresję GOI. Zebrany wirus jest wykorzystywany do zakażania komarów, zgodnie z opisem przedstawionym w niniejszej pracy, lub innych gatunków gospodarzy (nie pokazano tutaj). Kompetencję wektora ocenia się poprzez wykrywanie fluorescencji poza jelitem środkowym lub poprzez monitorowanie transmisji wirusa7. Zastosowanie fluorescencyjnego reportera jako GOI pozwala na wygodną ocenę rozprzestrzeniania się wirusa w całej hodowli komórkowej, wyznaczenie szybkości infekcji, rozprzestrzeniania się w wystawionych na działanie wirusa komarach oraz transmisję wirusa z komara, a także zapewnia szybki wskaźnik kompetencji wektora.

Opisano metody wykorzystania systemów transdukcyjnych alfawirusów do ekspresji reporterów fluorescencyjnych in vitro oraz u dorosłych komarów. Technikę tę można dostosować w celu ekspresji dowolnego białka docelowego zamiast reportera lub dodatkowo do niego.

System transdukcji alfawirusów: narzędzia do wizualizacji infekcji w wektorach komarzych

Systemy transdukcyjne alfawirusów (ATS) są istotnymi narzędziami do ekspresji wybranych genów (GOI) podczas infekcji. Systemy ATS pochodzą z klonów cDNA...

Wirusy alfa to przenoszone przez komary wirusy RNA, które trwale infekują podatne komórki komarów przy minimalnej cytopatologii. Niniejszy protokół demonstruje użyteczność zakaźnych systemów transdukcyjnych wirusów alfa, które wykazują ekspresję reporterów fluorescencyjnych w celu wykrywania infekcji wektora oraz transmisji wirusa. W pierwszej kolejności należy podać samicom komarów posiłek krwi zawierający interesujący nas wirus alfa, a następnie określić wydajność infekcji komarów i wybrać wyłącznie te osobniki, które wykazują ekspresję genu markerowego.Następnie pobierz ślinę z zainfekowanych komarów i wykaż zdolność do transmisji poprzez zakażenie hodowlanych komórek komara zebraną śliną. Wyniki uzyskaj za pomocą mikroskopii epi-fluorescencyjnej. Wizualizacja białka reporterowego, takiego jak GFP, pozwoli na śledzenie infekcji wektora i transmisji wirusa u gatunków komarów Aedes lub Culex.Systemy ekspresji wirusów alfa lub ATS mogą być wykorzystywane do szybkiej oceny ekspresji genów oraz wektorowych komarów, zarówno w badaniach nad arbowirusami, jak i przed przeprowadzeniem trudniejszych manipulacji u komarów, takich jak transgeneza komarów. Procedury te zaprezentują dr Irma Sanchez Vargas, dr Eric Mossel oraz Aaron Phillips z laboratorium dr. Kena Olsona. Aby wyprodukować wirusa TS w komórkach BHK 21, należy użyć rekombinowanego wirusa symbis, który wykazuje ekspresję reportera GFP po transkrypcji in vitro, a następnie przeprowadzić elektroporację RNA transdukującego systemu wirusa alfa w komórkach BHK 21.Następnie wyizoluj i namnóż wirusa przed przeprowadzeniem infekcji. Przygotuj komary do efektywnego żerowania na sztucznym karmniku poprzez głodzenie. Usuń cukier na 24 godziny i wodę na 12 godzin przed karmieniem.Wymieszano komercyjnie pozyskaną krew zwierzęcą (defibrylowaną lub cytratywaną) z przygotowaną kulturą komórkową, aby otrzymać zawiesinę wirusa TS do efektywnego zakażenia jelita środkowego komarów. Opracowano miano wirusa w posiłku krwiowym na poziomie 10⁷ jednostek tworzących plak (PFU) na ml, aby pobudzić komary do ssać krew. Dodano TP do stężenia końcowego 0,02 M.Umieść membranę jelitową o określonej wielkości porów nad wylotem szklanego podajnika z płaszczem wodnym. Następnie przygotuj podajniki z cyrkulującą wodą o temperaturze 37 °C. Po tym pipetuj pożywkę do komory i stabilnie ustaw podajniki na kartonie.Po karmieniu komarów przez 10 do 30 minut, odsortuj z zimno znieczulonych owadów osobniki nasycone krwią, aby umożliwić replikację i rozprzestrzenianie się wirusa TS w wybranych komarach. Inkubuj je w temperaturze 28 °C i przy 75% wilgotności względnej przez 8 do 10 dni. W celu unieruchomienia komarów.Umieścić kartonik z papierem w temperaturze 4 °C na około 15 minut. Następnie przenieść od 5 do 10 komarów na stół chłodzący przystosowany do użytku z mikroskopem fluorescencyjnym. Zbadać i posegregować komary na podstawie obecności lub braku fluorescencji.Przenieś wybrane komary z powrotem do papierowego pudełka do dalszego wykorzystania zgodnie z potrzebami. Na tym etapie określ wydajność infekcji, wykorzystując natężenie fluorescencji jako wskaźnik. Na koniec wypreparuj tkanki, takie jak jelita środkowe, gruczoly SIV i ciała tłuszczowe, a następnie monitoruj obecność fluorescencji.Organy i tkanki te można wypreparować we wcześniejszych odstępach czasu, jeśli jest to pożądane. Przed karmieniem należy odciąć komarom dostęp do źródła cukru na 24 godziny. Przygotować kapilarę o pojemności 50 µL, która została podgrzana, rozciągnięta i przycięta, wypełniając ją od trzech do pięciu µL Cargill.Nalej olej immersyjny typu B, aby zapobiec ucieczce komarów. Usuń ich odnóża i skrzydła. Następnie wprowadź proboscis do rurki.Uważnie monitoruj krople śliny wydzielane z proboscis do oleju immersyjnego. W razie potrzeby nanieś kroplę 1% pilokarpiny na przedplecze komara, aby zwiększyć ślinienie; po 60 do 90 minutach usuń komary i przechowuj je do późniejszej izolacji wirusa. Aby zebrać roztwór z rurki kapilarnej, wypchnij mieszaninę śliny i oleju do probówki zawierającej 500 µL sterylnego 20% F-B-S-P-B-S.Przefiltruj inokulum przez filtr strzykawkowy o porach 0,2 mikrona, a następnie użyj tego inokulum do zakażenia hodowlanych komórek komara. Skuteczność zakażenia wirusem five prime DS MRE 16 GFP oceniano na podstawie ekspresji GFP. W czasie komórki te były zakażane wirusem przy wielokrotności zakażenia 0,01.Mikroskop fluorescencyjny z oświetleniem epifluorescencyjnym umożliwia obserwację GFP w całym ciele zainfekowanego komara, a także w jego poszczególnych częściach, tutaj 10 dni po zakażeniu. Organoselektywna ekspresja GFP świadczy o rozsianym charakterze infekcji. W jelitach środkowych zazwyczaj występują wyraźne ogniska infekcji w krótkim czasie po spożyciu posiłku z krwi zawierającego wirusa, który w późniejszych etapach po zakażeniu rozprzestrzenia się w tylnej części jelita środkowego.Zdarzenia te są sygnalizowane przez reportery GFP i DS RED. Test transmisji wskazuje, że wirus five prime DS MRE 16 GFP stabilnie wykazuje ekspresję GFP przez cały okres inkubacji zewnętrznej. U badanego komara GFP oraz ślina komara są wykrywalne już w ósmym dniu po zakażeniu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić doustną infekcję komara wirusem A TS, jak wizualnie ocenić infekcję wirusową u komara oraz jak ocenić transmisję wirusa z komara.

alphavirus-transducing-system-tools-for-visualizing-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

System transdukcji alfawirusów: narzędzia do wizualizacji infekcji w komarzych wektorach

Opisujemy metodę przetwarzania i przesiewania komarów zebranych w terenie pod kątem różnorodnych wirusów za pomocą testu z hodowlą komórek Vero. Stosując tę technikę, wykryliśmy 9 różnych wirusów z 4 rodzin taksonomicznych w komarach zebranych w Connecticut.

Wykrywanie wirusów zakaźnych z komarów zebranych w terenie za pomocą testu hodowli komórek Vero

Wykorzystując postępy w opracowywaniu fluoroforów oraz technologii obrazowania, opracowano prostą metodę znakowania wirusa dengi barwnikami Alexa Fluor w celu wizualizacji wczesnych oddziaływań między wirusem a komórką.

Wizualizacja wirusa dengi za pomocą znakowania Alexa Fluor

Malowanie chromosomów jest użyteczną metodą do badania organizacji jądra komórkowego i ewolucji kariotypu. W tym miejscu demonstrujemy podejście do izolowania i amplifikacji określonych regionów zainteresowania z pojedynczych chromosomów politenowych, które są następnie wykorzystywane do dwu- i trójwymiarowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Malowanie chromosomów 2D i 3D u komarów malarii

Ten manuskrypt wykorzystuje oparty na Fidżi pakiet oprogramowania open-source VirusMapper do zastosowania analizy pojedynczej cząstki do obrazów mikroskopowych o wysokiej rozdzielczości w celu wygenerowania precyzyjnych modeli struktury w nanoskali.

Analiza pojedynczych cząstek typu open source do mikroskopii superrozdzielczej za pomocą VirusMapper

Informujemy o użyciu sztucznej strategii ekspresji małego RNA w celu opracowania niewadliwego systemu dostarczania rekombinowanego densowirusa Aedes aegypti (AaeDV) in vivo. Opisano szczegółową procedurę budowy, pakowania i analizy ilościowej wektorów rAaeDV, a także infekcji larwalnej.

Zastosowanie rekombinowanego densowirusa komarów jako wektora dostarczania genów do analizy funkcjonalnej genów w larwach komarów

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Prezentowany protokół może określić kompetencję wektorową populacji komarów Aedes aegypti dla danego wirusa, takiego jak Zika, w warunkach powstrzymywania.

Wektorowe analizy kompetencyjne komarów Aedes aegypti z wykorzystaniem wirusa Zika

Ta metodologia, która obejmowała karmienie doustne i infekcję iniekcją dopiersiową, mogła skutecznie ocenić wpływ barier środkowego jelita i/lub gruczołów ślinowych na infekcję arbowirusem.

Eksperymentalna infekcja wirusowa u dorosłych komarów przez karmienie doustne i mikroiniekcję

Liczne nowe sekwencje wirusopodobne zostały znalezione u komarów dzięki szerokiemu zastosowaniu technologii sekwencjonowania. Zapewniamy skuteczną procedurę izolacji i amplifikacji wirusów przy użyciu linii komórkowych kręgowców i komarów, która może posłużyć jako podstawa do przyszłych badań nad wirusami związanymi z komarami, w tym wirusami przenoszonymi przez komary i specyficznymi dla komarów.

Izolacja wirusa związanego z komarami od komarów zebranych na polu

Obecny protokół opisuje, jak mierzyć dane dotyczące typowych parametrów życia komarów Aedes aegypti, w tym płodności, rozmiaru skrzydeł, płodności, stosunku płci, żywotności, czasu rozwoju, wkładu samców i długowieczności dorosłych. Pomiary te można wykorzystać do oceny przydatności komarów transgenicznych.

Ilościowe określanie kosztów przystosowania u transgenicznych komarów Aedes aegypti

Poznaj systemy transdukcji alfawirusów do wizualizacji infekcji u komarów dorosłych. Ta metoda umożliwia śledzenie transmisji wirusa i ekspresji białek fluorescencyjnych w komórkach wektorów.

System transdukcji alfawirusów: narzędzia do wizualizacji infekcji w wektorach komarzych

Przeglądaj więcej filmów