Protokół otrzymywania krzyżówki genetycznej pasożytów malarii gryzoni

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie krzyżowania genetycznego pasożyta malarii gryzoni Plasmodium yoi w celu uzyskania potomstwa rekombinowanego. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie grupie myszy mieszanego inokulum zawierającego dwa klony rodzicielskie pasożytów przeznaczonych do krzyżowania. Zainfekowane myszy służą następnie jako pokarm dla komarów; w ich organizmach gamety obu szczepów rodzicielskich łączą się w diploidalny zygot. Podział mejotyczny na tym etapie może prowadzić do rekombinacji genetycznej, co skutkuje powstaniem potomstwa rekombinowanego.

Otrzymane sporozoity są następnie pozyskiwane z gruczołów ślinowych komarów i ponownie wstrzykiwane naiwnym myszom biorcom w celu uzyskania pasożytów w stadium krwi, wśród których znajdują się poszczególne klony rekombinowane, które można wyizolować metodą ograniczonego rozcieńczenia. W udanym eksperymencie od 5 do 10% linii klonalnych będą rekombinantami, które można scharakteryzować poprzez genotypowanie odpowiednich markerów genetycznych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad malarią, takie jak: jakie są genetyczne determinanty oporności na leki i transmisyjności malarii?

Pasożyty W temperaturze pokojowej rozmrozić dwie fiolki zawierające zamrożone stadium krwi pasożytów malarii przeznaczonych do krzyżowania. W tym przykładzie użyte szczepy pasożytów malarii gryzoni to plasmodium yoi, oi i plasmodium. Yoi Nigerians Wyposażyć strzykawkę w igłę o rozmiarze od 22 do 30 G i pobrać 400 µL PBS pH 7,4, używając tej samej strzykawki.

Należy pobrać 100 µL krwi zakażonej Thor, a następnie odwracać strzykawkę w górę i w dół do momentu homogenicznego wymieszania zawartości. W niniejszej demonstracji zostaną wykorzystane zwierzęta zdezanestezjowane, aby zminimalizować ból i stres. Anestezję przeprowadza się poprzez wstrzyknięcie do otrzewnej myszy 50 µL koktajlu leków anestetycznych zawierającego 82,5 mg/kg ketaminy oraz 7,5 mg/kg ksylazyny.

Monitoruj myszy pod kątem głębokości znieczulenia, aby zapobiec śmiertelności. Stosując tę procedurę, myszy pozostaną pod wpływem znieczulenia przez 20 do 30 minut. Przed wybudzeniem wstrzyknij 200 µL roztworu zawierającego pasożyty bezpośrednio do otrzewnej myszy.

Po zakończeniu procedury strzykawkę należy wyrzucić do pojemnika na odpady ostre. Stosując tę metodę, zakaź dwie myszy każdym z dwóch szczepów pasożytów, które mają zostać skrzyżowane, trzy do pięciu dni po iniekcjach. U zakażonych myszy rozwiną się pasożyty w stadium krwi.

Za pomocą sterylnych nożyczek odetnij końcówki ogonów myszy dawców zainfekowanych różnymi szczepami pasożytów. Pobierz kroplę krwi z ogona myszy na szkiełko przedmiotowe i wykonaj cienkie rozmazy. Zabarw cienki rozmaz krwi barwnikiem Giemsy.

Barwnik Guillem SA nie barwi niezinfekowanych erytrocytów ze względu na brak jądra w niezinfekowanych komórkach. SAI zabarwi jądra pasożytów w zainfekowanych erytrocytach; pasożyty w erytrocytach występują w postaci stadiów pierścieniowatych, trofozoitów i pękających merozoitów. Gdy poziom anemii u obu myszy osiągnie od 1 do 5%, pasożyty w stadium krwi mogą zostać pobrane do zakażenia mieszanym klonem.

Odciąć końcówkę ogona myszy dawców zakażonych różnymi pasożytami. Szczepy przyciąć sterylnymi nożyczkami zgodnie z wcześniejszym opisem. Pobrać jeden mikrolitr krwi z ogona myszy za pomocą szklanej kapilary do jednego mililitra sterylnego PBS. Użyć 20 mikrolitrów zawiesiny krwi do analizy gęstości erytrocytów za pomocą systemu cell ome.

Wykorzystując pomiary gęstości erytrocytów oraz parametry, rozcieńczyć próbki krwi w fizjologicznym roztworze soli z cytrynianem tak, aby uzyskać stężenie zainfekowanych erytrocytów wynoszące 1 milion na 100 µL. Połączyć próbki zainfekowanej krwi od dwóch dawców w stosunku jeden do jednego, aby otrzymać mieszane inokulum klonalne. Następnie wstrzyknąć 100 µL zmieszanej próbki do otrzewnej każdej myszy przeznaczonej do zakażenia.

Do infekcji pojedynczymi klonami należy wykorzystać dwie myszy, aby umożliwić potwierdzenie skutecznej transmisji każdego szczepu rodzicielskiego. Stadium płciowe pasożyta, zwane gametocytami męskimi i żeńskimi, powinno zacząć pojawiać się we krwi myszy około czterech dni po infekcji. Należy rozpocząć codzienne monitorowanie myszy pod kątem obecności gametocytów poprzez pobieranie krwi z ogona zgodnie z wcześniejszym opisem i przygotowywanie cienkich rozmazów krwi z ogona.

Komórki męskie i żeńskie są rozpoznawalne dzięki obecności dużych granuli lub pigmentów. Cytoplazma męskich komórek gato jest różowa, podczas gdy cytoplazma żeńskich komórek TER jest niebieska. Tylko dojrzałe komórki gato wykazują obecność dużej wakuoli.

Po wykryciu dojrzałych gametocytów obu płci myszy mogą zostać wykorzystane do karmienia komarów. Wstrzyknij 50 µL roztworu ketaminy, ksylazyny i środka znieczulającego do otrzewnej każdej zainfekowanej myszy. Po znieczuleniu myszy umieść jedną z nich brzuchem do góry na górze klatki zawierającej od 50 do 100 samic komarów Anis defense enzyme, które były pozbawione dostępu do cukru przez 24 godziny, i pozwól komarom żerować przez 30 minut bez przerwy.

Myszy należy poddać humanitarnej eutanazji bezpośrednio po okresie karmienia. Jeśli transmisja przebiegła pomyślnie, dziewięć dni po karmieniu gametocyty pobrane przez komary zfuzją się w diploidalne zygoty, które dojrzeją do postaci oocyst widocznych w jelicie środkowym owadów. Im więcej oocyst zostanie wykrytych, tym większa jest szansa na wygenerowanie rekombinowanych pasożytów.

Za pomocą aspiratora należy zebrać od pięciu do 10 zakażonych komarów z klatki i przenieść je do małego pojemnika. Komary należy znieczulić za pomocą dwutlenku węgla i przenieść do szklanej szalki Petriego umieszczonej na lodzie. Samce komarów, których czułki są wyraźnie bardziej puszyste niż u samic, należy odrzucić.

Napełnij dwie strzykawki PBS i załóż do nich igły o rozmiarze 26 G i długości pół cala. Nanieś około 100 µL PBS ze strzykawki na szkiełko przedmiotowe. Przenieś od pięciu do 10 znieczulonych samic komarów do kropli PBS, a następnie za pomocą igieł umieść szkiełko pod mikroskopem stereoskopowym.

Usuń skrzydła i odnóża każdego komara, a następnie chwyć owada za klatkę piersiową i tylną część odwłoka. Rozdziel ciało, aż zostanie uwolniony jelito środkowe, przypominające biały woreczek. Odseparuj jelito środkowe i usuń pozostałą część ciała podczas przeprowadzania sekcji.

Należy dbać o to, aby jelita środkowe pozostały wilgotne, używając PBS z igieł sekcyjnych. Po zakończeniu sekcji na jelitach środkowych należy umieścić szkiełko nakrywkowe. Jelita środkowe należy zbadać pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 100x.

OOS będą rozpoznawalne jako okrągłe struktury o grubych ścianach znajdujące się na zewnętrznej powierzchni jelit środkowych. Należy policzyć liczbę OOS w każdym jelicie środkowym. 17 dni po karmieniu sporozoity uwolnione z sys powinny migrować do gruczołów ślinowych komarów, będące formami zarodnikowymi pasożytów malarii.

Cienkie komórki wrzecionowate do pozyskiwania sporozoitów. Najpierw przygotuj probówkę do zbierania, używając czystych nożyczek. Odetnij nakrętkę małej probówki einor o pojemności 500 µL.

Rozgrzej końcówkę sterylnej igły o rozmiarze 19 G i przebij dno probówki. Wypełnij jedną trzecią probówki szkłem ściennym, aby stworzyć filtr. Włóż probówkę z filtrem do większej probówki typu einor o pojemności 1,5 ml.

Po przygotowaniu aparatury filtracyjnej należy zebrać i znieczulić komary zgodnie z wcześniejszym opisem. Owady należy zamocować metodą „na sucho” do sekcji, a następnie usunąć głowy, skrzydła, nogi i odwłoki. Tylko w klatce piersiowej znajdują się zainfekowane gruczoły ślinowe.

Za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami przenieś klatkę piersiową do homogenizatora o pojemności 1,5 ml zawierającego 500 µl PBS. Homogenizuj klatkę piersiową w lodzie, aby uwolnić sporozoity z gruczołów ślinowych, a następnie za pomocą pipety szklanej przenieś homogenaty do aparatu filtracyjnego. Wirowarkuj probówkę z filtrem przez 10 do 20 sekund przy 1000 obr./min.

Po odwirowaniu homogenatów należy zebrać nadsącz za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze od 22 do 30 G. Wstrzyknij od 100 do 500 µL zawiesiny sporozoitów do otrzewnej myszy. Monitorowanie gęstości leukocytów i erytrocytów u myszy należy rozpocząć trzy dni po infekcji.

Wybierz mysz wykazującą poziom parasitemii od 0,1 do 1%, w której zakażone erytrocyty zawierają głównie pojedyncze pasożyty, jako dawcę do procedury klonowania. Pobierz odpowiednią ilość krwi z ogona myszy i rozcieńcz ją w PBS w zimnym roztworze surowicy cielęcej i roztworu Ringera dla ssaków w stosunku 1:1, aby uzyskać stężenie od 0,6 do 1 zakażonego erytrocytu na 100 µL, a następnie przechowuj inokulum w lodzie. Oczyść miejsce wstrzyknięcia dożylnego w ogonie za pomocą etanolu.

Wstrzyknij 100 µL rozcieńczonej zakażonej krwi każdemu ze 100 myszy. W ten sposób każda mysz powinna otrzymać jednego lub zero pasożytów. W przypadku udanego eksperymentu, od 20 do 50% myszy wykaże poziom pasożytów od 0,1 do 0,5% w ósmym dniu.

Pięć do siedmiu dni później należy przeprowadzić przesiew myszy w kierunku obecności pasożytów w stadium krwi, badając przygotowane cienkie rozmazy krwi. Pasożyty potomne z krzyżówki można następnie genotypować za pomocą PCR DNA wyekstrahowanego z próbek krwi z ogona, wykorzystując markery genetyczne na różnych chromosomach, takie jak mikrosatelity i polimorfizmy pojedynczego nukleotydu. Klonami rekombinacyjnymi są pasożyty, których niezależne loci genetyczne pochodzą od obu klonów rodzicielskich.

Krew pobrana od zwierząt zakażonych rekombinantnymi pasożytami może być kriozachowana do późniejszego wykorzystania. W udanym eksperymencie od 5 do 10% wszystkich myszy będzie posiadać niezależne potomstwo rekombinantne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat sposobu przeprowadzania procesów genetycznych w malarii.

Pasożyt plus pożywka yoi. Metodę tę można w takim samym stopniu zastosować do innych gatunków pasożytów.