Name: Protokół produkcji krzyżówki genetycznej pasożytów malarii u gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 39 s
Description: Poznaj metodę krzyżowania genetycznego pasożytów malarii Plasmodium yoelii u gryzoni. Procedura obejmuje zakażanie myszy, karmienie komarów i izolację sporozoitów w celu uzyskania rekombinowanych potomstwa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Randy'emu Elkinsowi, dr Robin Kastenmayer, dr. Tedowi Torreyowi, dr. Danowi Pare oraz dr Tovi Lehman za krytyczną lekturę manuskryptów. Praca ta była wspierana przez Intramural Research Program of the Division of Intramural Research, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, a także przez 973 National Basic Research Program of China, #2007CB513103. Dziękujemy redaktorowi wewnętrznemu NIAID, Brendzie Rae Marshall, za pomoc.

W przypadku wszystkich materiałów podawanych zwierzętom należy stosować techniki aseptyczne, aby uniknąć niezamierzonego wprowadzenia egzogennych czynników zakaźnych do organizmów myszy, co mogłoby zakłócić wyniki eksperymentu.

1. Zakażanie myszy laboratoryjnych pasożytami malarii w stadium krwi
<ol>
<li>W temperaturze pokojowej rozmrozić dwie fiolki zawierające zamrożone pasożyty malarii w stadium krwi, które mają zostać skrzyżowane. W tym przykładzie wykorzystane szczepy pasożytów malarii gryzoni to Plasmodium yoelii yoelii oraz Plasmodium yoelii nigeriensis.</li>
<li>Wyposażyć strzykawkę w igłę o rozmiarze 22-30 G i pobrać 40 μL sterylnego PBS klasy farmaceutycznej (pH 7.4).</li>
<li>Za pomocą tej samej strzykawki pobrać 10 μL rozmrożonej zakażonej krwi; odwracać strzykawkę do góry i dołu, aż zawartość zostanie homogenicznie wymieszana. (Opcjonalnie: do przeniesienia PBS i zakażonej krwi do probówki przed wprowadzeniem ich do strzykawki w celu iniekcji można użyć pipety).</li>
<li>Wstrzyknąć 20 μL roztworu zawierającego pasożyty bezpośrednio do otrzewnej myszy. Po zakończeniu wyrzucić strzykawkę do pojemnika na odpady ostre. (Patrz również Materiały uzupełniające w zakresie utrzymania myszy laboratoryjnych). Generalnie standardowa objętość inokulatu wynosi od 100 do 500 μL, w zależności od poziomu zakażenia pasożytami w oryginalnych zamrożonych materiałach.</li>
<li>Wstrzyknąć dwa szczepy pasożytów przeznaczonych do krzyżowania do dwóch myszy dla każdego szczepu. Myszy staną się pozytywne w badaniu mikroskopowym od 3 do 5 dni po iniekcjach. Gdy poziom parasitemii osiągnie wartość od 1% do 5%, przejść do następnego kroku.</li>
</ol>
2. 	Infekcja myszy mieszanką klonów
<ol>
<li>Przed zakażeniem mieszanym klonów pobrać krew z ogona od dwóch myszy dawców zakażonych różnymi szczepami pasożytów w celu przeprowadzenia badania mikroskopowego cienkich rozmazów krwi barwionych metodą Giemsy (Rys. 3) oraz pomiaru gęstości erytrocytów (szczegółowe procedury znajdują się w Materiałach uzupełniających).</li>
<li>Obliczyć objętość soli fizjologicznej (1,5% w/v cytrynianu trysodu dwuwodnego, 0,85% w/v chlorku sodu) oraz krwi mysiej niezbędnej do przygotowania mieszaniny inokulum, wykorzystując wcześniej uzyskane pomiary parasitemii i gęstości erytrocytów.</li>
<li>Dostosować roztwór pasożytów do końcowego stężenia jednego miliona zakażonych erytrocytów na 100μl.</li>
<li>Połączyć zakażoną krew od dwóch dawców w stosunku 1:1, aby uzyskać inokulum z mieszanych klonów. W przypadku różnic w tempie wzrostu dwóch klonów rodzicielskich, dostosować proporcje klonu szybciej rosnącego do wolniej rosnącego w stosunku 1:2 lub 1:5.</li>
<li>Wstrzyknąć 10 μL mieszanej próbki do otrzewnej każdej myszy przeznaczonej do zakażenia (patrz również krok 3.9 w celu określenia liczby myszy do zakażenia).</li>
<li>Stosując tę metodę, zakażyć dwie myszy pojedynczymi szczepami rodzicielskimi. Zakażenia pojedynczymi klonami pozwolą na potwierdzenie skutecznej transmisji obu szczepów rodzicielskich.</li>
</ol>
3. Karmienie komarów
<ol>
<li>Przygotuj trzy klatki zawierające każda po 300-50 dorosłych (samców i samic) komarów Anopheles stephensi w wieku 5-7 dni po wyjściu z poczwarek. Pojemniki są przykryte siatką zabezpieczoną plastikową lub metalową pokrywą. Dwie klatki służą do karmienia klonów rodzicielskich, a trzecia klatka do przygotowania krzyżówki genetycznej.</li>
<li>Cztery dni po zakażeniu mieszanym klonami przygotuj cienkie rozmazy krwi z ogonów zakażonych myszy, barwione metodą Giemsy.</li>
<li>Zbadaj rozmazy pod mikroskopem, skanując co najmniej 50 pól widzenia przy powiększeniu 10x i określ, czy obecne są gametocyty męskie i żeńskie.</li>
<li>Gametocyty męskie i żeńskie są rozpoznawalne dzięki obecności dużej wakuoli i dużych ziarnistości (Ryc. 3). Gametocyty męskie i żeńskie mają odpowiednio różową i niebieską cytoplazmę. Jeśli gametocyty są obecne, przejdź do kroku 3.6.</li>
<li>Jeśli gametocyty nie są obecne, kontynuuj codzienne monitorowanie aż do ich pojawienia się. Jeśli gametocyty są obecne, przejdź do następnego kroku.</li>
<li>Wstrzyknij 50 μL koktajlu leków znieczulających zawierającego 3 mg/mL ketaminy i 3 mg/mL ksylazyny do otrzewnej każdej zakażonej myszy w celu znieczulenia (na 20 g masy ciała myszy). Końcowa dawka ketaminy i ksylazyny wynosi odpowiednio 82,5 i 7,5 mg/Kg.</li>
<li>Umieść myszy brzuchem do góry na górze klatki zawierającej dorosłe komary Anopheles stephensi, które były pozbawione dostępu do cukru przez 24 h, i pozwól komarom żerować przez 30 minut bez przerwy.</li>
<li>Utrzymuj komary w insektarium w standardowych warunkach (temperatura utrzymywana w zakresie 24-26°C; zapoznaj się również z Materiałami Uzupełniającymi dotyczącymi utrzymania komarów laboratoryjnych).</li>
<li>Wykorzystaj jedną zakażoną mysz na każde 50-10 samic komarów. Eutanizuj myszy natychmiast po karmieniu poprzez zwichnięcie karku, gdy myszy wciąż znajdują się pod wpływem znieczulenia.</li>
</ol>
4.	Disekcja jelit środkowych komarów i liczenie oocyst
<ol>
<li>Dziewięć dni po karmieniu sprawdzono obecność oocyst w jelicie środkowym komarów. Obecność oocyst u komarów, które żywiły się myszami zainfekowanymi pojedynczym klonem, wskazuje, że gametocyty dwóch szczepów rodzicielskich są zakaźne.</li>
<li>Aby wypreparować jelito środkowe komara, należy użyć aspiratora podłączonego do małego pojemnika, aby zebrać z klatki od 5 do 10 zainfekowanych komarów.</li>
<li>Za pomocą gazu CO2 znieczulono komary i przeniesiono je do szklanej szalki Petriego umieszczonej na lodzie. Oddzielono i odrzucono samce. Czułki samców są wyraźnie bardziej pierzaste w porównaniu do samic.</li>
<li>Dwie strzykawki napełniono PBS i wyposażono w igły o rozmiarze 26 gauge pół cala (G½). Na szkiełko przedmiotowe naniesiono około 10 μL PBS ze strzykawki.</li>
<li>Przeniesiono od 5 do 10 znieczulonych samic komarów na kroplę PBS i umieszczono szkiełko pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
<li>Za pomocą tych samych igieł usunięto skrzydła i odnóża każdego komara, a następnie, trzymając owada za przedplecze i tylną część odwłoka, rozdzielono ciało, aż do momentu uwolnienia jelita środkowego, które ma postać białego workowatego narządu. Odizolowano jelito środkowe i odrzucono resztę ciała.</li>
<li>Jeśli szkiełka wyschły, dodano więcej PBS na jelito środkowe. Jelito środkowe ulegnie degradacji, jeśli zostanie doprowadzone do wyschnięcia. Na jelita środkowe nałożono szkiełko nakrywkę.</li>
<li>Jelita środkowe badano pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 10x. Policzono liczbę oocyst w każdym jelicie środkowym (Fig 3). Oocysty są rozpoznawalne jako okrągłe struktury z grubą ścianą, znajdujące się na zewnętrznej powierzchni jelit środkowych.</li>
<li>Po zakończeniu pracy strzykawki, igły i szkiełka zutylizowano w pojemniku na odpady ostre.</li>
<li>W przypadku braku oocyst w jelitach środkowych, należy karmić komary myszami zakażonymi większą liczbą gametocytów i wydłużyć czas karmienia. Temperatura jest kluczowa w tym kroku. Należy upewnić się, że temperatura jest ustawiona w zakresie od 24 do 26° C.</li>
</ol>
5.	Pozyskiwanie sporozoitów z komarów metodą wirowania
<ol>
<li>Przygotuj probówki do zbierania sporozoitów w następujący sposób: odetnij zakrętkę czystej probówki do odwirowywania o pojemności 0,5 mL i wykonaj otwór (o średnicy 0,1-0,2 mm) w dnie probówki za pomocą wypalonej igły 19 G.</li>
<li>Wypełnij 1/3 probówki wełną szklaną. Włóż probówkę filtrującą do probówki zbiorczej o pojemności 1,5 mL (jedna probówka wystarcza do zebrania sporozoitów z ok. 10 komarów).</li>
<li>W 17. dniu po karmieniu zbierz komary (Krok 4) z klatek do małego pojemnika za pomocą aspiratora.</li>
<li>Użyj gazu CO2 do znieczulenia komarów.</li>
<li>Oddziel samice od samców. Przenieś znieczulone samice komarów z pojemnika na szklaną płytkę Petri znajdującą się na lodzie.</li>
<li>Przygotuj dwie strzykawki z igłami 26 G½ wypełnione PBS. Nanieś około 10 μL PBS ze strzykawki na szkiełko przedmiotowe.</li>
<li>Przenieś komary na szkiełko mikroskopowe. Pod mikroskopem stereoskopowym usuń głowy, skrzydła, odnóża i odwłoki komarów.</li>
<li>Za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami przenieś tułowia do 0,5 mL PBS w homogenizatorze o pojemności 1,5 mL (moździerz z tłuczkiem). Przechowuj tułowia na lodzie (sporozoity pozostają zakaźne przez 2-3 h).</li>
<li>Zhomogenizuj tułowia na lodzie, aby uwolnić sporozoity z gruczołów ślinowych (patrz Rysunek 3), a następnie przenieś lizaty (homogenaty) do probówki wypełnionej wełną szklaną (Krok 5.1-5.2) za pomocą pipety szklanej.</li>
<li>Wirować przez 10 do 20 s przy 10 rpm w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Zbierz przelew (oczyszczoną zawiesinę sporozoitów) za pomocą strzykawki z igłą 2-30 G. (Opcjonalnie: nanieś 10-50 μL przelewu na szkiełko mikroskopowe, nałóż szkiełko nakrywkowe i zwizualizuj żywe sporozoity pod standardowym mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 40X, patrz również Rys. 3).</li>
<li>Wstrzyknij d.o. 0,1-0,5 mL zawiesiny sporozoitów myszom (z jednego komara można zebrać do 20 0 pasożytów; patrz ref 12). W przypadku sukcesu zwierzę zostanie zainfekowane 72 h po iniekcji.</li>
</ol>
6.	Klonowanie potomstwa za pomocą ograniczonego rozcieńczenia
<ol>
<li>Siedemdziesiąt dwie godziny po wstrzyknięciu sporozoitów pobierz krew z ogonów dwóch myszy dawców zainfekowanych różnymi szczepami pasożytów w celu badania mikroskopowego po barwieniu Giemsy cienkich rozmazów krwi oraz do pomiaru gęstości czerwonych krwinek (szczegółowe procedury znajdują się w Materiałach Uzupełniających).</li>
<li>Wybierz mysz wykazującą parasitemię na poziomie 0,1–1%, w której zainfekowane czerwone krwinki zawierają głównie pojedyncze pasożyty, jako dawcę do procedury klonowania. Jeśli myszy są mikroskopowo negatywne, powtórz krok 6.1 w kolejnych dniach. Jeśli zwierzęta nie zostaną zainfekowane w ciągu 14 dni, powtórz kroki od 2 do 5 i ustal obecność sporozoitów w kroku 5.1).</li>
<li>Rozcieńcz pobraną krew z ogona w zimnym roztworze surowicy cielęcej i roztworu Ringera dla ssaków (2,7 mM chlorku potasu, 1,8 mM chlorku wapnia, 154 mM chlorku sodu) w stosunku 1:1, aby uzyskać stężenie od 0,6 do 1 zainfekowanej czerwonej krwinki na 100 μL, a następnie przechowuj inokulum w lodzie. W ten sposób większość pojedynczych myszy powinna otrzymać albo jeden, albo zero pasożytów.</li>
<li>Wstrzyknij dożylnie 10 μL rozcieńczonej zainfekowanej krwi każdej z 50 do 10 myszy.</li>
<li>Pięć do siedmiu dni później sprawdź myszy pod kątem obecności pasożytów w stadium krwi poprzez badanie cienkich rozmazów krwi barwionych metodą Giemsy. W przypadku udanego eksperymentu 20–50% myszy zostanie zainfekowanych i wykaże parasitemię na poziomie 0,1–5,0% w 8. dniu po infekcji.</li>
</ol>
7. Charakterystyka potomstwa z wykorzystaniem markerów genetycznych
<ol>
<li>Pobrać od 20 do 40 μL krwi z ogona myszy do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL zawierającej 0,2 mL schłodzonego fizjologicznego roztworu cytrynianu sodu, krótko wymieszać na wortexie, a następnie wirować przez 3 min przy 300 rpm w temperaturze pokojowej, aby wytrącić komórki krwi w osad. Wyizolować DNA natychmiast lub przechowywać osad w temperaturze -80°C.</li>
<li>Przygotować DNA pasożyta, stosując dowolną standardową metodę ekstrakcji DNA. W celu szybkiej izolacji DNA należy użyć zestawu do przygotowania matrycy PCR High Pure (Roche Applied Bioscience).</li>
<li>Rekombinowane potomstwo identyfikuje się po genotypowaniu z wykorzystaniem mikrosatelitów (MS) lub polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) na różnych chromosomach, które pozwalają na rozróżnienie dwóch szczepów rodzicielskich w krzyżówce genetycznej. Można zastosować uproszczoną metodę wykorzystującą pojedyncze startery znakowane fluorescencyjnie do genotypowania MS dla P. yoelii (patrz ref 8,9).</li>
</ol>
8. 	Kriokonserwacja pasożytów malarii w stadium krwi
<ol>
<li>Pobrać 0,5-1 mL zakażonej krwi poprzez nakłucie serca znieczulonej myszy z parasitemią na poziomie 5-20% do 5-10 mL schłodzonego roztworu soli fizjologicznej.</li>
<li>Wirować przez 5 min przy 20 obr./min w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.</li>
<li>Do osadu krwi dodać kroplami dwukrotność objętości roztworu Glycerolyte 57 (Fenwal Laboratories) i dokładnie wymieszać.</li>
<li>Przenieść zawiesinę do krioprobówek (0,2-0,5 mL na probówkę).</li>
<li>Przechowywać krio-konserwowaną krew w temperaturze -80 °C (do 1 miesiąca) lub w ciekłym azocie.</li>
</ol>
9. Reprezentatywne wyniki:

W udanym eksperymencie od 5-10% sklonowanych linii będzie stanowiło niezależne potomstwo rekombinowane.

 <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig1.jpg" alt="Schemat cyklu życiowego Plasmodium, przedstawiający etapy od wektora komarowego do gospodarza gryzoni oraz procesy genetyczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematyczny przebieg cyklu życiowego oraz zdarzeń rekombinacji genetycznej podczas krzyżówki genetycznej. Rekombinacja genetyczna zachodzi we wczesnej fazie rozwoju w organizmie komara. W wyniku zapłodnienia „haploidalnych” gamet męskich i żeńskich o różnych podłożach genetycznych w jelicie środkowym komara powstają „diploidalne” zygoty. Zygota stanowi jedyny diploidalny etap cyklu życiowego pasożyta; mejoza następuje w ciągu 12 godzin od zapłodnienia, a wszystkie kolejne stadia w organizmie komara i ssaków pozostają haploidalne. Powstałe zygoty rozwijają się w ookinety i oocysty. Wzrost i podziały mitotyczne każdej oocysty prowadzą do powstania tysięcy sporozoitów, które zostają uwolnione do hemocelu komara. Sporozoity migrujące do ślinianek są w pozycji umożliwiającej ich przeniesienie na gospodarza ssaka, gdzie odbywa się rozwój stadiów wątrobowych oraz czerwonokrwinkowych. W przebiegu cykli czerwonokrwinkowych niektóre pasożyty mogą różnicować się w dojrzałe gametocyty męskie i żeńskie. Cykl życiowy pasożyta dopełnia się, gdy gametocyty te zostaną pobrane przez kolejnego komara, co prowadzi do kontynuacji transmisji.
 <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig2.jpg" alt="Schemat krzyżowania genetycznego pasożyta; proces mejozy, gamety, zapłodnienie krzyżowe, warianty chromosomalne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Dziedziczenie genów jądrowych u pasożytów malarii i powstawanie potomstwa rekombinacyjnego. Rekombinacja genetyczna może zachodzić poprzez reasortację chromosomową lub zdarzenia crossing-over. A) Potomstwo homozygotyczne powstające w wyniku samozapłodnienia gamet tego samego klonu rodzicielskiego 1 lub 2 (A i D), odpowiednio. B) Potomstwo heterozygotyczne powstające w wyniku zapłodnienia krzyżowego gamet dwóch różnych klonów rodzicielskich, w którym jądra rekombinacyjne (niebieskie owale) powstają wyłącznie w wyniku reasortacji chromosomowej. C) Potomstwo heterozygotyczne powstające w wyniku zapłodnienia krzyżowego gamet dwóch różnych klonów rodzicielskich, w którym jądra rekombinacyjne (czerwone owale) powstają w wyniku crossing-over między niesiostrzanymi chromatydami chromosomów homologicznych.
 <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig3.jpg" alt="Mikroskopowe obrazy morfologii komórek, przedstawiające różne typy i struktury komórkowe na schematach A-K." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Morfologia pasożyta malarii gryzoni Plasmodium yoeliiA) stadium pierścienia, B) trofozoit, C) schizont, D) merozoity, E) niedojrzały gametocyt męski, F) dojrzały gametocyt męski, G) niedojrzały gametocyt żeński, H) dojrzały gametocyt żeński, I) jelito środkowe z oocystami w 10. dniu po karmieniu (dojrzałe oocysty wskazane strzałkami; powiększenie 20x), J) ślinianki komara (powiększenie 100x), K) sporozoity (powiększenie 400x).

<ol><li>Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfadoxine-pyrimethamine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).</li>
<li>Cravo, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+mefloquine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Genetics of mefloquine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47, 709-718 (2003).</li>
<li>Hunt, P., Cravo, P. V., Donleavy, P., Carlton, J. M., Walliker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroquine+resistance+in+Plasmodium+chabaudi%3A+are+chloroquine-resistance+transporter+%28crt%29+and+multi-drug+resistance+%28mdr1%29+orthologues+involved%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Chloroquine resistance in Plasmodium chabaudi: are chloroquine-resistance transporter (crt) and multi-drug resistance (mdr1) orthologues involved?</a> Mol Biochem Parasitol. 133, 27-35 (2004).</li>
<li>Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mapping+of+targets+mediating+differential+chemical+phenotypes+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic mapping of targets mediating differential chemical phenotypes in Plasmodium falciparum.</a> Nat Chem Biol. 5, 765-771 (2009).</li>
<li>Su, X., Kirkman, L. A., Fujioka, H., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+polymorphisms+in+an+approximately+330+kDa+protein+are+linked+to+chloroquine-resistant+P.+falciparum+in+Southeast+Asia+and+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complex polymorphisms in an approximately 330 kDa protein are linked to chloroquine-resistant P. falciparum in Southeast Asia and Africa.</a> Cell. 91, 593-603 (1997).</li>
<li>Hayton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+binding+protein+PfRH5+polymorphisms+determine+species-specific+pathways+of+Plasmodium+falciparum+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte binding protein PfRH5 polymorphisms determine species-specific pathways of Plasmodium falciparum invasion.</a> Cell Host Microbe. 4, 40-51 (2008).</li>
<li>Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenicity+and+genetic+polymorphism+in+cloned+lines+derived+from+a+single+isolate+of+a+rodent+malaria+parasite%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Congenicity and genetic polymorphism in cloned lines derived from a single isolate of a rodent malaria parasite.</a> Mol Biochem Parasitol. 157, 244-247 (2008).</li>
<li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hundreds+of+microsatellites+for+genotyping+Plasmodium+yoelii+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Hundreds of microsatellites for genotyping Plasmodium yoelii parasites.</a> Mol Biochem Parasitol. 166, 153-158 (2009).</li>
<li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typing+Plasmodium+yoelii+microsatellites+using+a+simple+and+affordable+fluorescent+labeling+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Typing Plasmodium yoelii microsatellites using a simple and affordable fluorescent labeling method.</a> Mol Biochem Parasitol. 155, 94-102 (2007).</li>
<li>Walliker, D., Carter, R., Morgan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+recombination+in+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic recombination in malaria parasites.</a> Nature. 232, 561-562 (1971).</li>
<li>Sinden, R. E., Hartley, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+meiotic+division+of+malarial+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Protozool%22%5BJournal%5D)">Identification of the meiotic division of malarial parasites.</a> J Protozool. 32, 742-744 (1985).</li>
<li>Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+centrifugation+method+for+rapid+separation+of+sporozoites+from+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes.</a> J Parasitol. 70, 831-833 (1984).</li>
<li>Yoeli, M., Most, H., Bone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+berghei%3A+cyclical+transmission+by+experimentally+infected+Anopheles+quadrimachulatus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plasmodium berghei: cyclical transmission by experimentally infected Anopheles quadrimachulatus.</a> Science. 144, 1580-1581 (1964).</li>
<li>Landau, I., Boulard, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLandau%2C+I+%22Life+cycles+and+Morphology%22">Life cycles and Morphology</a>. , Academic Press. London/New York/San Franciso. (1978).</li>
<li>Vanderbergh, J. P. Y., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+on+sporogonic+development+of+Plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei.</a> J Parasitol. 52, 559-564 (1966).</li>
<li>Gadsby, N., Lawrence, R., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+on+pathogenicity+and+mosquito+transmission+success+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi+adami%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A study on pathogenicity and mosquito transmission success in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi adami.</a> Int J Parasitol. 39, 347-354 (2009).</li>
<li>Pattaradilokrat, S., Culleton, R. L., Cheesman, S. J., Carter, R. G. ene <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((encoding+erythrocyte+binding+ligand+linked+to+blood+stage+multiplication+rate+phenotype+in+Plasmodium+yoelii+yoelii%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">encoding erythrocyte binding ligand linked to blood stage multiplication rate phenotype in Plasmodium yoelii yoelii.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 7161-7166 (2009).</li>
<li>Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+group+selection%3A+towards+identifying+genes+controlling+strain+specific+protective+immunity+in+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Linkage group selection: towards identifying genes controlling strain specific protective immunity in malaria.</a> PLoS One. 2, e857-e857 (2007).</li>
<li>Mackinnon, M. J., Read, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Relationships+between+Parasite+Virulence+and+Transmission+in+the+Rodent+Malaria+Plasmodium+chabaudi%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Genetic Relationships between Parasite Virulence and Transmission in the Rodent Malaria Plasmodium chabaudi.</a> Evolution. 53, 689-703 (1999).</li>
</ol>

Ponieważ autorzy są pracownikami rządowymi, a niniejsze opracowanie jest dziełem rządowym, znajduje się ono w domenie publicznej w Stanach Zjednoczonych. Niezależnie od wszelkich innych umów, NIH zastrzega sobie prawo do przekazania opracowania do PubMedCentral w celu udostępnienia i wykorzystania przez opinię publiczną, a PubMedCentral może oznaczyć lub zmodyfikować opracowanie zgodnie ze swoimi zwyczajowymi praktykami. Prawa poza obszarem USA mogą zostać ustanowione zgodnie z licencją na użytkowanie rządowe.

Prezentujemy techniki przeprowadzania krzyżówki genetycznej u zarodźca gryzoni Plasmodium yoelii, które mają zastosowanie również do tworzenia krzyżówek genetycznych u innych gatunków zarodźców gryzoni. Zakażenia myszy pojedynczymi klonami rodzicielskimi są zazwyczaj przeprowadzane w celu potwierdzenia skutecznej transmisji pasożytów rodzicielskich, aby upewnić się, że osobniki rodzicielskie są zdolne do wytwarzania funkcjonalnych gamet przed przystąpieniem do krzyżowania.
Pomyślna t...

<table><tbody><tr><td>roztwór Glyerolyte 57</td><td>Cenmed</td><td>4A7833</td><td></td></tr><tr><td>Mysz &lt;em&gt;Mus musculus&lt;/em&gt;</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Samice inbredowej linii Balb/C</td></tr><tr><td>Surowica cielęca inaktywowana termicznie</td><td>Invitrogen</td><td>26010-066</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10010-072</td><td>pH 7,4; stopień czystości do hodowli komórkowych </td></tr><tr><td>pasożyt malarii &lt;em&gt;Plasmodium y&amp;#8211;lii y&amp;#8211;lii&lt;/em&gt; 17XNL(1.1)</td><td>MR4</td><td>MRA-593</td><td>zgłoszone przez DJ Carucci</td></tr><tr><td>pasożyt malarii &lt;em&gt;Plasmodium y&amp;#8211;lii nigeriensis&lt;/em&gt; N67</td><td>MR4</td><td>MRA-427</td><td>zdeponowane przez W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick</td></tr><tr><td>Komar &lt;em&gt;Anopheles stephensi&lt;/em&gt;</td><td>MR4</td><td>MRA-128</td><td>złożone przez MQ Benedict</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek Cellometer</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa komora hemocytometryczna Cellometer CP2</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer CP2</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania matrycy PCR High Pure</td><td>Grupa Roche</td><td>11 796 828 001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>Przebadane hodowle komórkowe; przebadane hodowle komórek owadzie</td></tr><tr><td>Barwienie Giemsą, zmodyfikowane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GS500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td> Klasa farmaceutyczna; stężenie do 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>Przetestowano w hodowli komórkowej; przetestowano w hodowli komórek owadów</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>Przetestowano w hodowli komórkowej; przetestowano w hodowli komórek owadziej</td></tr><tr><td>Cytrynian trisodu dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Akorn Inc</td><td>4811-20ml</td><td>Klasy farmaceutycznej; stężenie do 20 mg/ml</td></tr><tr><td>Wełna szklana</td><td>VWR international</td><td>32848-003</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara szklana (1 &amp;mu;L)</td><td>VWR international</td><td>53440-001</td><td></td></tr><tr><td>Komora licznikowa (hemocytometr)</td><td>VWR international</td><td>15170-168</td><td>Kompletny zestaw komór</td></tr><tr><td>Homogenizator</td><td>VWR International</td><td>KT749520-0090</td><td>Tłuczek z dopasowaną probówką, 1,5 ml </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Tytuł JoVE&quot;&gt;MATERIAŁY UZUPEŁNIAJĄCE:&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Utrzymanie myszy laboratoryjnych&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Utrzymanie laboratoryjnych populacji komarów&amp;#8211;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Badanie mikroskopowe cienkich rozmazów krwi barwionych barwnikiem Giemsy&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Pomiar gęstości erytrocytów&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Utrzymanie myszy laboratoryjnych&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;W badaniu wykorzystano samice inbredowego szczepu myszy laboratoryjnych BALB/c w wieku od 5 do 8 tygodni. Myszy kwaterowano w standardowych poliwęglanowych klatkach z pełnym dnem i drutową pokrywą, wyposażonych w karmidło i butelkę z wodą. Myszy utrzymywano w stałej temperaturze (25 &amp;#177; 1&amp;#x00B0;C) w 12:12-godzinnym cyklu światło:ciemność. Myszy mają dostęp do ekstrudowanej diety dla gryzoni 2018S Harlan Teklad Global z 19% zawartością białka (sterylizowalna; od Harlan-Teklad) oraz zakwaszonej wody pitnej ad libitum. Eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w National Institute of Allergy and Infectious Disease zgodnie z protokołem LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Utrzymanie komarów laboratoryjnych&amp;#8211;S&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę dostarczyć tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;Komar&amp;#8211;Owady pochodzą z hodowanej laboratoryjnie kolonii Anopheles stephensi. Postacie dorosłe są utrzymywane w nylonowych klatkach w pomieszczeniu z kontrolowaną temperaturą i wilgotnością (23 do 25&amp;#x00B0;C dla &lt;em&gt;Plasmodium y&amp;#8211;lii&lt;/em&gt; i &lt;em&gt;Plasmodium chabaudi&lt;/em&gt;oraz od 19 do 21&amp;#x00B0;C dla &lt;em&gt;*Plasmodium berghei*&lt;/em&gt;; wilgotność od 80 do 95%; w cyklu światło:ciemność 12:12 godzin). Dorosłe komary&amp;#8211;karmi się roztworem wodnym z dodatkiem 10% glukozy i 2,00% kwasu para-aminobenzoesowego (PABA). Aby uzyskać wysokiej jakości osobniki dorosłe, 500 larw hoduje się w warunkach niskiej gęstości w 1 l wody destylowanej w naczyniu o objętości 1000 cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; otwartą szalkę zawierającą około 1 mg wodorowęglanu sodu. Po wykluciu larwy są karmione proszkiem tetramin (PETCO) aż do osiągnięcia stadium poczwarki, a następnie przeniesione do klatek dla dorosłych komarów w celu przeobrażenia.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Badanie mikroskopowe cienkich rozmazów krwi barwionych barwnikiem Giemsy&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;Za pomocą czystych nożyczek odetnij koniuszek (1,0 mm) ogona zakażonej myszy&amp;rsquo;ogona. Nanieść jedną kroplę (0,5-1,0 &amp;#x03BC;L) krwi z ogona na czyste szkiełko przedmiotowe. Krwawienie u myszy ustanie w ciągu 1–2 min. Położyć czyste szkiełko rozcierające na kropli krwi, utrzymując je pod kątem 45&amp;#x00B0; pod kątem względem preparatu i pozwolić krwi zaadsorbować się na całej szerokości szkiełka rozcierającego. Trzymając preparat, szybko i płynnie przesunąć szkiełko rozcierające do przodu, aby uzyskać cienki rozmaz. Pozostawić preparat krwi do wyschnięcia, a następnie zanurzyć szkiełka w bezwodnym metanolu. Pozostawić szkiełko do ponownego wyschnięcia na powietrzu przed pokryciem go barwnikiem Giemsy (10% roztwór barwnika Giemsy w wodzie destylowanej). Po inkubacji cienkich rozmazów krwi przez 10–15 min w temperaturze pokojowej, ostrożnie opłukać szkiełka wodą z kranu i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Liczbę zakażonych erytrocytów (iRBC; morfologię zakażonych erytrocytów przedstawiono na rysunku 3) ocenić pod mikroskopem świetlnym z użyciem olejku imersyjnego przy powiększeniu 1000x (z obiektywem 100x) i obliczyć poziom pasożytemii (liczbę iRBC na 100 policzonych erytrocytów). Różne szczepy pasożytów malarii różnią się tempem wzrostu i patogennością. Monitorowanie pasożytemii we krwi można przeprowadzić 24 h po iniekcjach, w zależności od dawki pasożytów malarii w stadium krwi. Na przykład myszy będą dawać wynik dodatni w badaniu mikroskopowym po 24 h, jeżeli wstrzyknięto im 10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; zakażone erytrocyty dojamieniowo lub 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; zakażone erytrocyty dożylnie.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Pomiar gęstości erytrocytów&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy, który należy przetłumaczyć.&quot;&gt;Podobnie jak poziomy parasytemii, gęstość erytrocytów (RBC) u zakażonych myszy zmienia się w trakcie przebiegu infekcji. Gęstość erytrocytów należy zmierzyć w ciągu 1–2 godzin przed rozpoczęciem zakażeń pojedynczymi i mieszanymi klonami oraz przed eksperymentami z klonowaniem. Istnieją dwie metody pomiaru gęstości erytrocytów: ręczne liczenie z użyciem komory licznikowej Neubauera oraz automatyczne liczenie z użyciem analizatora Cellometer (Nexcelom Bioscience). W obu metodach pobierz 1 &amp;#x03BC;L krwi z ogona myszy za pomocą szklanej kapilary (VWR), a następnie rozcieńczyć w 10 mL PBS i dobrze wymieszać. Aby użyć komory licznikowej Neubauera, nanieść 20 &amp;#x03BC;L zawiesiny na komorę countingową (hemacytometr). Umieść hemacytometr na mikroskopie świetlnym z obiektywem 10x. Hemacytometr zawiera siatkę podzieloną na 9 dużych kwadratów, z czego 4 duże kwadraty narożne są dalej podzielone na 16 małych kwadratów. Policz całkowitą liczbę komórek w każdym z 16 małych kwadratów w czterech kwadratach narożnych. Aby uniknąć błędu systematycznego lub liczenia komórek nachodzących na linię siatki, komórkę uznaje się za &quot;w&quot; jeśli nakłada się na górną lub prawą linię i &quot;na zewnątrz&quot; jeśli nakłada się na linie dolną lub lewą. Oszacuj liczbę komórek w jednym małym kwadracie i podziel ją przez 0,00625 (objętość jednego małego kwadratu wynosi 6,25 nL). Pozwala to uzyskać liczbę komórek na mikrolitr (&amp;#x03BC;L). Na podstawie tych danych oblicz końcową gęstość erytrocytów, mnożąc wynik przez 10 000 (czynnik rozcieńczenia). Przepłucz szkiełko nakrywkowe i komorę licznikową wodą destylowaną oraz 70% etanolem, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Alternatywnie, nanieś 20 &amp;#x03BC;L zawiesiny na slajd z komorą zliczającą Cellometer. Wsuń slajd do komory na slajdy w urządzeniu Cellometer (czytniku). Uruchom oprogramowanie Cellometer, wybierz &quot;erytrocyt&quot; wybrać opcję i wprowadzić współczynnik rozcieńczenia 10 000. Zapisać gęstość RBC.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

protokół otrzymywania krzyżówki genetycznej pasożytów malarii gryzoni

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Zmienność w odpowiedzi na leki przeciwmalaryczne oraz w patogenności pasożytów malarii ma istotne znaczenie biologiczne i medyczne. Mapowanie sprzężeń doprowadziło do pomyślnej identyfikacji genów lub loci leżących u podstaw różnych cech u pasożytów malarii gryzoni1-3 i ludzi4-6. Pasożyt malarii Plasmodium yoelii jest jednym z wielu gatunków malarii wyizolowanych z dzikich afrykańskich gryzoni i został przystosowany do hodowli laboratoryjnej. Gatunek ten odwzorowuje wiele cech biologicznych pasożytów malarii ludzkiej; dla tego pasożyta opracowano również markery genetyczne, takie jak markery mikrosatelitarne oraz markery polimorfizmu długości fragmentów amplifikowanych (AFLP)7-9. W związku z tym badania genetyczne nad pasożytami malarii gryzoni mogą być prowadzone jako uzupełnienie badań nad Plasmodium falciparum. W niniejszej pracy prezentujemy techniki przeprowadzania krzyżowania genetycznego u P. yoelii, które zostały po raz pierwszy opracowane przez dr. Davida Wallikera, dr. Richarda Cartera i współpracowników z Uniwersytetu w Edynburgu10.

Krzyżowania genetyczne u P. yoelii oraz innych pasożytów malarii gryzoni przeprowadza się poprzez zakażanie myszy Mus musculus inokulum zawierającym gametocyty dwóch genetycznie odrębnych klonów, różniących się badanymi fenotypami, a następnie umożliwienie komarom żerowania na zakażonych myszach 4 dni po infekcji. Przed karmieniem obecność męskich i żeńskich gametocytów we krwi myszy potwierdza się mikroskopowo. W ciągu 48 h po żerowaniu, w jelicie środkowym komara, haploidalne gametocyty różnicują się w gamety męskie i żeńskie, dochodzi do zapłodnienia i powstaje diploidalny zygota (Rys. 1). Podczas rozwoju zygoty w ookinetę prawdopodobnie zachodzi mejoza11. Jeśli zygota powstaje w wyniku zapłodnienia krzyżowego gamet dwóch genetycznie odrębnych pasożytów, mogą wystąpić wymiany genetyczne (reasortyment chromosomalny i crossing-over między niesiostrzanymi chromatydami pary chromosomów homologicznych; Rys. 2), co prowadzi do rekombinacji materiału genetycznego w loci homologicznych. Każda zygota przechodzi dwa kolejne podziały jądrowe, co prowadzi do powstania czterech jąder haploidalnych. Ookineta rozwija się następnie w oocystę. Po dojrzewaniu oocysty powstają tysiące sporozoitów (potomstwa krzyżówki), które zostają uwolnione do hemocelu komara. Sporozoity są pobierane z gruczołów ślinowych i wstrzykiwane nowemu gospodarzowi mysiemu, gdzie zachodzi rozwój w stadium przederytrocytarnym i erytrocytarnym. Formy erytrocytarne są klonowane i klasyfikowane pod kątem cech różniących linie rodzicielskie przed przeprowadzeniem mapowania sprzężeń genetycznych. Zakażenia kontrolne poszczególnymi klonami rodzicielskimi wykonuje się w ten sam sposób, co produkcję krzyżówki genetycznej.

Krzyżowanie genetyczne pasożytów malarii gryzoni przeprowadza się poprzez podanie dwóch genetycznie odmiennych pasożytów komarom. Potomstwo rekombinacyjne jest klonowane z krwi mysiej po tym, jak komary ukąsiły zainfekowane myszy. Niniejszy film pokazuje, jak przeprowadzić krzyżowanie genetyczne Plasmodium yoelii; metoda ta ma zastosowanie również do innych pasożytów malarii gryzoni.

Protokół otrzymywania krzyżówki genetycznej pasożytów malarii gryzoni

Zmienność w odpowiedzi na leki przeciwmalaryczne oraz w patogenności pasożytów malarii ma istotne znaczenie biologiczne i medyczne. Mapowanie sprzężeń doprowadziło do...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie krzyżowania genetycznego pasożyta malarii gryzoni Plasmodium yoi w celu uzyskania potomstwa rekombinowanego. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie grupie myszy mieszanego inokulum zawierającego dwa klony rodzicielskie pasożytów przeznaczonych do krzyżowania. Zainfekowane myszy służą następnie jako pokarm dla komarów; w ich organizmach gamety obu szczepów rodzicielskich łączą się w diploidalny zygot. Podział mejotyczny na tym etapie może prowadzić do rekombinacji genetycznej, co skutkuje powstaniem potomstwa rekombinowanego.Otrzymane sporozoity są następnie pozyskiwane z gruczołów ślinowych komarów i ponownie wstrzykiwane naiwnym myszom biorcom w celu uzyskania pasożytów w stadium krwi, wśród których znajdują się poszczególne klony rekombinowane, które można wyizolować metodą ograniczonego rozcieńczenia. W udanym eksperymencie od 5 do 10% linii klonalnych będą rekombinantami, które można scharakteryzować poprzez genotypowanie odpowiednich markerów genetycznych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad malarią, takie jak: jakie są genetyczne determinanty oporności na leki i transmisyjności malarii?Pasożyty W temperaturze pokojowej rozmrozić dwie fiolki zawierające zamrożone stadium krwi pasożytów malarii przeznaczonych do krzyżowania. W tym przykładzie użyte szczepy pasożytów malarii gryzoni to plasmodium yoi, oi i plasmodium. Yoi Nigerians Wyposażyć strzykawkę w igłę o rozmiarze od 22 do 30 G i pobrać 400 µL PBS pH 7,4, używając tej samej strzykawki.Należy pobrać 100 µL krwi zakażonej Thor, a następnie odwracać strzykawkę w górę i w dół do momentu homogenicznego wymieszania zawartości. W niniejszej demonstracji zostaną wykorzystane zwierzęta zdezanestezjowane, aby zminimalizować ból i stres. Anestezję przeprowadza się poprzez wstrzyknięcie do otrzewnej myszy 50 µL koktajlu leków anestetycznych zawierającego 82,5 mg/kg ketaminy oraz 7,5 mg/kg ksylazyny.Monitoruj myszy pod kątem głębokości znieczulenia, aby zapobiec śmiertelności. Stosując tę procedurę, myszy pozostaną pod wpływem znieczulenia przez 20 do 30 minut. Przed wybudzeniem wstrzyknij 200 µL roztworu zawierającego pasożyty bezpośrednio do otrzewnej myszy.Po zakończeniu procedury strzykawkę należy wyrzucić do pojemnika na odpady ostre. Stosując tę metodę, zakaź dwie myszy każdym z dwóch szczepów pasożytów, które mają zostać skrzyżowane, trzy do pięciu dni po iniekcjach. U zakażonych myszy rozwiną się pasożyty w stadium krwi.Za pomocą sterylnych nożyczek odetnij końcówki ogonów myszy dawców zainfekowanych różnymi szczepami pasożytów. Pobierz kroplę krwi z ogona myszy na szkiełko przedmiotowe i wykonaj cienkie rozmazy. Zabarw cienki rozmaz krwi barwnikiem Giemsy.Barwnik Guillem SA nie barwi niezinfekowanych erytrocytów ze względu na brak jądra w niezinfekowanych komórkach. SAI zabarwi jądra pasożytów w zainfekowanych erytrocytach; pasożyty w erytrocytach występują w postaci stadiów pierścieniowatych, trofozoitów i pękających merozoitów. Gdy poziom anemii u obu myszy osiągnie od 1 do 5%, pasożyty w stadium krwi mogą zostać pobrane do zakażenia mieszanym klonem.Odciąć końcówkę ogona myszy dawców zakażonych różnymi pasożytami. Szczepy przyciąć sterylnymi nożyczkami zgodnie z wcześniejszym opisem. Pobrać jeden mikrolitr krwi z ogona myszy za pomocą szklanej kapilary do jednego mililitra sterylnego PBS. Użyć 20 mikrolitrów zawiesiny krwi do analizy gęstości erytrocytów za pomocą systemu cell ome.Wykorzystując pomiary gęstości erytrocytów oraz parametry, rozcieńczyć próbki krwi w fizjologicznym roztworze soli z cytrynianem tak, aby uzyskać stężenie zainfekowanych erytrocytów wynoszące 1 milion na 100 µL. Połączyć próbki zainfekowanej krwi od dwóch dawców w stosunku jeden do jednego, aby otrzymać mieszane inokulum klonalne. Następnie wstrzyknąć 100 µL zmieszanej próbki do otrzewnej każdej myszy przeznaczonej do zakażenia.Do infekcji pojedynczymi klonami należy wykorzystać dwie myszy, aby umożliwić potwierdzenie skutecznej transmisji każdego szczepu rodzicielskiego. Stadium płciowe pasożyta, zwane gametocytami męskimi i żeńskimi, powinno zacząć pojawiać się we krwi myszy około czterech dni po infekcji. Należy rozpocząć codzienne monitorowanie myszy pod kątem obecności gametocytów poprzez pobieranie krwi z ogona zgodnie z wcześniejszym opisem i przygotowywanie cienkich rozmazów krwi z ogona.Komórki męskie i żeńskie są rozpoznawalne dzięki obecności dużych granuli lub pigmentów. Cytoplazma męskich komórek gato jest różowa, podczas gdy cytoplazma żeńskich komórek TER jest niebieska. Tylko dojrzałe komórki gato wykazują obecność dużej wakuoli.Po wykryciu dojrzałych gametocytów obu płci myszy mogą zostać wykorzystane do karmienia komarów. Wstrzyknij 50 µL roztworu ketaminy, ksylazyny i środka znieczulającego do otrzewnej każdej zainfekowanej myszy. Po znieczuleniu myszy umieść jedną z nich brzuchem do góry na górze klatki zawierającej od 50 do 100 samic komarów Anis defense enzyme, które były pozbawione dostępu do cukru przez 24 godziny, i pozwól komarom żerować przez 30 minut bez przerwy.Myszy należy poddać humanitarnej eutanazji bezpośrednio po okresie karmienia. Jeśli transmisja przebiegła pomyślnie, dziewięć dni po karmieniu gametocyty pobrane przez komary zfuzją się w diploidalne zygoty, które dojrzeją do postaci oocyst widocznych w jelicie środkowym owadów. Im więcej oocyst zostanie wykrytych, tym większa jest szansa na wygenerowanie rekombinowanych pasożytów.Za pomocą aspiratora należy zebrać od pięciu do 10 zakażonych komarów z klatki i przenieść je do małego pojemnika. Komary należy znieczulić za pomocą dwutlenku węgla i przenieść do szklanej szalki Petriego umieszczonej na lodzie. Samce komarów, których czułki są wyraźnie bardziej puszyste niż u samic, należy odrzucić.Napełnij dwie strzykawki PBS i załóż do nich igły o rozmiarze 26 G i długości pół cala. Nanieś około 100 µL PBS ze strzykawki na szkiełko przedmiotowe. Przenieś od pięciu do 10 znieczulonych samic komarów do kropli PBS, a następnie za pomocą igieł umieść szkiełko pod mikroskopem stereoskopowym.Usuń skrzydła i odnóża każdego komara, a następnie chwyć owada za klatkę piersiową i tylną część odwłoka. Rozdziel ciało, aż zostanie uwolniony jelito środkowe, przypominające biały woreczek. Odseparuj jelito środkowe i usuń pozostałą część ciała podczas przeprowadzania sekcji.Należy dbać o to, aby jelita środkowe pozostały wilgotne, używając PBS z igieł sekcyjnych. Po zakończeniu sekcji na jelitach środkowych należy umieścić szkiełko nakrywkowe. Jelita środkowe należy zbadać pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 100x.OOS będą rozpoznawalne jako okrągłe struktury o grubych ścianach znajdujące się na zewnętrznej powierzchni jelit środkowych. Należy policzyć liczbę OOS w każdym jelicie środkowym. 17 dni po karmieniu sporozoity uwolnione z sys powinny migrować do gruczołów ślinowych komarów, będące formami zarodnikowymi pasożytów malarii.Cienkie komórki wrzecionowate do pozyskiwania sporozoitów. Najpierw przygotuj probówkę do zbierania, używając czystych nożyczek. Odetnij nakrętkę małej probówki einor o pojemności 500 µL.Rozgrzej końcówkę sterylnej igły o rozmiarze 19 G i przebij dno probówki. Wypełnij jedną trzecią probówki szkłem ściennym, aby stworzyć filtr. Włóż probówkę z filtrem do większej probówki typu einor o pojemności 1,5 ml.Po przygotowaniu aparatury filtracyjnej należy zebrać i znieczulić komary zgodnie z wcześniejszym opisem. Owady należy zamocować metodą „na sucho” do sekcji, a następnie usunąć głowy, skrzydła, nogi i odwłoki. Tylko w klatce piersiowej znajdują się zainfekowane gruczoły ślinowe.Za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami przenieś klatkę piersiową do homogenizatora o pojemności 1,5 ml zawierającego 500 µl PBS. Homogenizuj klatkę piersiową w lodzie, aby uwolnić sporozoity z gruczołów ślinowych, a następnie za pomocą pipety szklanej przenieś homogenaty do aparatu filtracyjnego. Wirowarkuj probówkę z filtrem przez 10 do 20 sekund przy 1000 obr./min.Po odwirowaniu homogenatów należy zebrać nadsącz za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze od 22 do 30 G. Wstrzyknij od 100 do 500 µL zawiesiny sporozoitów do otrzewnej myszy. Monitorowanie gęstości leukocytów i erytrocytów u myszy należy rozpocząć trzy dni po infekcji.Wybierz mysz wykazującą poziom parasitemii od 0,1 do 1%, w której zakażone erytrocyty zawierają głównie pojedyncze pasożyty, jako dawcę do procedury klonowania. Pobierz odpowiednią ilość krwi z ogona myszy i rozcieńcz ją w PBS w zimnym roztworze surowicy cielęcej i roztworu Ringera dla ssaków w stosunku 1:1, aby uzyskać stężenie od 0,6 do 1 zakażonego erytrocytu na 100 µL, a następnie przechowuj inokulum w lodzie. Oczyść miejsce wstrzyknięcia dożylnego w ogonie za pomocą etanolu.Wstrzyknij 100 µL rozcieńczonej zakażonej krwi każdemu ze 100 myszy. W ten sposób każda mysz powinna otrzymać jednego lub zero pasożytów. W przypadku udanego eksperymentu, od 20 do 50% myszy wykaże poziom pasożytów od 0,1 do 0,5% w ósmym dniu.Pięć do siedmiu dni później należy przeprowadzić przesiew myszy w kierunku obecności pasożytów w stadium krwi, badając przygotowane cienkie rozmazy krwi. Pasożyty potomne z krzyżówki można następnie genotypować za pomocą PCR DNA wyekstrahowanego z próbek krwi z ogona, wykorzystując markery genetyczne na różnych chromosomach, takie jak mikrosatelity i polimorfizmy pojedynczego nukleotydu. Klonami rekombinacyjnymi są pasożyty, których niezależne loci genetyczne pochodzą od obu klonów rodzicielskich.Krew pobrana od zwierząt zakażonych rekombinantnymi pasożytami może być kriozachowana do późniejszego wykorzystania. W udanym eksperymencie od 5 do 10% wszystkich myszy będzie posiadać niezależne potomstwo rekombinantne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat sposobu przeprowadzania procesów genetycznych w malarii.Pasożyt plus pożywka yoi. Metodę tę można w takim samym stopniu zastosować do innych gatunków pasożytów.

protocol-for-production-genetic-cross-rodent-malaria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Protokół wytwarzania krzyżówki genetycznej pasożytów malarii szczurów

Niniejszy film przedstawia ogólne techniki stosowane w hodowli Anopheles gambiae w warunkach laboratoryjnych. Metody opieki nad komarami laboratoryjnymi są zaprezentowane na wszystkich etapach cyklu życiowego organizmu: od larw i poczwarek po dorosłe osobniki pobierające krew.

Protokół hodowli komarów (A. gambiae)

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie odpornego na malarię, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom Plasmodium w organizmie komara. Niniejszy protokół ilustruje sposób przeprowadzania analizy stopnia infekcji komarów przez Plasmodium. Przedstawiono techniki przygotowania hodowli gametocytów, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania mian wirusów w jelicie środkowym komara.

Protokół zakażania komarów *Plasmodium falciparum* i określania fenotypu zakażenia

Ten film demonstruje generowanie eksperymentalnego mysiego modelu malarii mózgowej. Sporozoity wyizolowane z samic komarów zakażonych Plasmodium berghei są wstrzykiwane do uwięzionych żył ogonowych myszy, co prowadzi do przerwania bariery krew-mózg i zapalenia mózgu, powodując malarię mózgową. Ten zakażony model myszy stanowi cenne narzędzie do badania in vivo patologii mikrokrążenia związanej z malarią mózgową.

Wygenerowanie mysiego modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem sporozoitów pochodzących od komarów gospodarzy

Gruźlica i malaria to dwie z najbardziej rozpowszechnionych infekcji u ludzi oraz główne przyczyny zachorowalności i śmiertelności w zubożałych populacjach w tropikach. Stworzyliśmy eksperymentalny system modelowy do badania wyników koinfekcji malarią i gruźlicą u myszy po prowokacji obydwoma patogenami za pośrednictwem ich naturalnej drogi zakażenia.

Model eksperymentalny do badania koinfekcji gruźlicą i malarią po naturalnym przenoszeniu Mycobacterium tuberculosis i Plasmodium berghei

Komary przenoszące malarię mają wiele ważnych epidemiologicznie cech, które można wykryć tylko za pomocą technik molekularnych. Wykorzystując platformę genotypowania SNP opartą na MALDI-TOF, opracowaliśmy test do jednoczesnego wykrywania wielu kluczowych cech (gatunek, odporność na insektycydy, zakażenie pasożytami i wybór żywiciela) wektorów malarii.

Test z wieloma wykrywaniami komarów przenoszących malarię

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Opisujemy metodę generowania mutantów warunkowego knockdown opartych na glmS w Plasmodium falciparum przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9.

Edycja genu CRISPR/Cas9 w celu stworzenia warunkowych mutantów ludzkiego pasożyta malarii P. falciparum

Dwuczęściowy system GAL4-UAS jest wszechstronnym narzędziem do modyfikacji ekspresji genów w kontrolowany sposób czasoprzestrzenny, co pozwala na funkcjonalną analizę genetyczną w Anopheles gambiae. Opisane procedury korzystania z tego systemu to częściowo ustandaryzowana strategia klonowania, określanie płci i badanie przesiewowe poczwarek pod kątem fluorescencyjnych markerów białkowych i utrwalanie zarodków.

Wykorzystanie systemu GAL4-UAS do genetyki funkcjonalnej u Anopheles gambiae

Protokół opisuje, jak dokonać zmian w genomie komarów malarii Anopheles za pomocą systemu φC31. Opisane modyfikacje obejmują zarówno integrację, jak i wymianę transgenicznych kaset w genomie linii dokujących zawierających attP.

Ukierunkowana na miejsce integracja za pośrednictwem φC31 i wymiana kaset w wektorach Anopheles malarii

Malaria jest przenoszona przez inokulację stadium sporozoitu Plasmodium przez zakażone komary. Transgeniczne zarodźce pozwoliły nam lepiej zrozumieć biologię malarii i bezpośrednio przyczyniły się do opracowania szczepionki przeciwko malarii. W tym miejscu opisujemy uproszczoną metodologię generowania transgenicznych sporozoitów Plasmodium berghei.

Wytwarzanie genetycznie zmodyfikowanych sporozoitów Plasmodium berghei

Genetyka chemiczna polega na zastąpieniu reszty strażnika aminokwasem zawierającym inny łańcuch boczny w docelowym locus. W tym przypadku wygenerowaliśmy zmutowanego pasożyta zawierającego hipomorficzny allel cdpk1 i zidentyfikowaliśmy szlaki kompensacyjne przyjęte przez pasożyta na tle mutacji.

Zrozumienie rozwoju szlaków kompensacyjnych u zmutowanego pasożyta malarii zawierającego hipomorficzny allel kinaz roślinopodobnych

Poznaj metodę krzyżowania genetycznego pasożytów malarii Plasmodium yoelii u gryzoni. Procedura obejmuje zakażanie myszy, karmienie komarów i izolację sporozoitów w celu uzyskania rekombinowanych potomstwa.

Protokół otrzymywania krzyżówki genetycznej pasożytów malarii gryzoni

Przeglądaj więcej filmów