Name: Izolowany preparat siatkówki do rejestrowania odpowiedzi świetlnej z genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Poznaj metodę izolacji siatkówki myszy do rejestracji odpowiedzi świetlnych z genetycznie znakowanych komórek zwojowych. Technika patch clamp pozwala analizować morfologię i właściwości funkcjonalne neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była częściowo wspierana przez granty NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Dziękujemy Darwinowi Hangowi za pomoc techniczną.

Oświadczenie dotyczące wykorzystania zwierząt: Zwierzęta były traktowane zgodnie z wytycznymi opisanymi w Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Minnesoty.
1) Przygotowanie roztworów
<ol>
 <li>Przed przystąpieniem do rejestracji elektrofizjologicznej należy przygotować roztwory wewnątrzkomórkowe, zewnątrzkomórkowe oraz roztwory enzymatyczne.</li>
 <li>Roztwór zewnątrzkomórkowy: wymieszać jedną butelkę (8,8 g) proszkowego medium Ames' (Sigma) z 1 l H2O i 1,9 g wodorowęglanu sodu (23 mM). Na każdym etapie roztwór zewnątrzkomórkowy musi być nasycony mieszaniną gazów 95% O2/5% CO2. Przenieść 200 mL do zlewki do przechowywania siatkówki. Pozostały roztwór przelać do pojemnika systemu perfuzyjnego w celu perfuzji grawitacyjnej po zamontowaniu siatkówki.</li>
 <li>Roztwór wewnątrzkomórkowy: roztwór wewnątrzkomórkowy powinien zostać przygotowany wcześniej, a następnie podzielony na aliquoty po 500-1000 μL i przechowywany w temperaturze -20 °C. Skład roztworu wewnątrzkomórkowego zależy od rodzaju planowanego eksperymentu; dla przedstawionych tutaj rejestracji w trybie clamp prądowy stosujemy (w mM): 125 K-glukonianu, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na2-ATP, 0,5 mM NaGTP; pH dostosować do 7,2 za pomocą KOH 5. W celu wizualizacji dendrytów podczas eksperymentu można dodać znacznik fluorescencyjny, taki jak 10 μM Alexafluor-594 hydrazide (Invitrogen), a do analizy anatomii komórki po rejestracji można dołączyć neurobiotynę (0,3%). Przed rozpoczęciem rejestracji odfreeze roztwór wewnątrzkomórkowy.</li>
 <li>Roztwór enzymatyczny: połączyć 10000 jednostek kolagenazy (Worthington Chemicals) z 83 mg hialuronidazy (Worthington Chemicals) w 4,150 mL roztworu zewnątrzkomórkowego. Przechowywać w aliquotach po 50 μL w temperaturze -20°C. Alikwoty można wykorzystywać przez kilka tygodni. Przed rozpoczęciem traktowania siatkówki rozcieńczyć aliquot w 500 μL napowietrzanego roztworu zewnątrzkomórkowego.</li>
 <li>Roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS): do 800 mL H2O dodać 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na2HPO4 oraz 0,24 g KH2PO4. Dostosować pH do 7,4 za pomocą NaOH. Uzupełnić objętość do 1 L.</li>
 <li>0,2 M bufor fosforanowy: do 800 ml H2O dodać 21,8 g Na2HPO4 oraz 6,4 g NaH2PO4. Uzupełnić objętość do 1 L.</li>
 <li>4% roztwór paraformaldehydu: podgrzać 50 ml H2O do 60°C. Dodać 4 g paraformaldehydu i mieszać przez kilka minut. Dodać kilka kropli 1M NaOH (około 5 kropli), mieszać do uzyskania klarownego roztworu. Dodać 50 ml 0,2 M buforu fosforanowego do zlewki. Sprawdzić pH za pomocą pasków wskaźnikowych (~7,4). Przefiltrować i schłodzić.</li>
 <li>Roztwór blokujący (10% surowicy koziej, 0,5% TritonX100): do 1,8 ml PBS dodać 0,2 ml surowicy koziej i 10 μL Triton X-100. TritonX-100 służy do permeabilizacji tkanki.</li>
 <li>Roztwór streptawidyny (5% surowicy koziej, 0,5% TritonX100, 1:500 Streptavidin 594): do 1,9 ml PBS dodać 0,1 ml surowicy koziej, 10 μL Triton X-100 oraz 4 μL Streptavidin 594.</li>
</ol>
2) Izolacja siatkówki myszy
Wymagane narzędzia do sekcji: 1 pęseta nr 2, 2 pęsety nr 5, nożyczki okulistyczne
<ol>
 <li>Uśmierć mysz zgodnie z zatwierdzonymi protokołami, w tym przypadku poprzez uduszenie CO2, a następnie przeprowadź enukleację gałki ocznej, delikatnie wprowadzając zakrzywioną pęsetę nr 2 za oko i wyjmując gałkę oczną.</li>
 <li>Umieść gałkę oczną w 35 mm czalce Petriego z roztworem pozakomórkowym. Przetnij nerw wzrokowy oraz wszelkie przyczepione mięśnie pozagałkowe lub tkankę łączną za pomocą nożyczek oftalmologicznych. Wycięcie rogówki wykonaj nożyczkami oftalmologicznymi, a soczewkę wyjmij pęsetą nr 5. Rozdar się twardówkę za pomocą pęsety nr 5 i użyj jej do przecięcia nerwu wzrokowego w miejscu, gdzie siatkówka i twardówka łączą się w obrębie tarczy nerwu wzrokowego. Delikatnie oddziel siatkówkę od skrzypca gałki ocznej. Wskazówka: Wykonaj każdy krok na obu siatkówkach przed przejściem do następnego etapu, aby zminimalizować czas.</li>
 <li>Użyj pęsety, aby usunąć ciało szkliste przylegające do siatkówki. Można to zrobić, „chwytając” przezroczyste ciało szkliste nad siatkówką za pomocą pęsety. Prawidłowo usunięte ciało szkliste powinno być widoczne jako przejrzysta, galaretowata substancja na pęsecie. Wskazówka: Przecięcie siatkówek na pół po usunięciu ciała szklistego pozwoli maksymalnie wykorzystać ilość tkanki i ułatwi montaż w komorze.</li>
 <li>Przechowuj siatkówki w natlenionym roztworze pozakomórkowym w temperaturze pokojowej, w ciemnym środowisku z minimalnym oświetleniem zewnętrznym, aż do momentu rozpoczęcia trawienia. Siatkówki mogą być w ten sposób przechowywane przez około 6 godzin.</li>
</ol>
3) Obróbka siatkówki mieszaniną enzymów i montaż w komorze rejestracyjnej
<ol>
 <li>Rozcieńczyć alikwot kolagenazy/hialuronidazy w 500 μL roztworu zewnątrzkomórkowego, przelać roztwór do szalki Petriego o średnicy 35 mm i przenieść siatkówkę.</li>
 <li>Przechowywać przykrytą szalkę Petriego z siatkówką w ciemności, w środowisku 95% O2/5% CO2 przez 15 min przy delikatnym mieszaniu. Krok ten wspomaga trawienie pozostałości ciała szklistego i ułatwia dostęp do warstwy komórek zwojowych. Wskazówka: w przypadku siatkówek od młodszych zwierząt z mniejszą ilością ciała szklistego lub w razie zaobserwowania działań niepożądanych, czas ten można skrócić do ok. 5 minut.</li>
 <li>Wyjąć siatkówkę z medium zawierającego enzymy i dokładnie przemyć roztworem zewnątrzkomórkowym.</li>
 <li>Przenieść siatkówkę do komory rejestracyjnej 6 warstwą fotoreceptorów skierowaną w dół. Odessać pozostały płyn za pomocą pipety lub chusteczki i rozprostować brzegi siatkówki, aby spłaszczyć tkankę, uważając, by dotykać jedynie krawędzi siatkówki i szczególnie unikając kontaktu z warstwą komórek zwojowych. Nałożyć na siatkówkę pierścień platynowy z nylonową siatką w celu zakotwiczenia tkanki i natychmiast wypełnić komorę roztworem zewnątrzkomórkowym.</li>
 <li>Zamocować komorę rejestracyjną na stole mikroskopu, podłączyć rurkę do perfuzji grawitacyjnej i ssania próżniowego oraz podłączyć przewód uziemiający.</li>
</ol>
4) Lokalizacja komórek zwojowych wykazujących ekspresję EGFP oraz stymulacja światłem
<ol>
 <li> Przepłucz siatkówkę grawitacyjnie roztworem zewnątrzkomórkowym z prędkością 1 mL/min lub szybciej. Wskazówka: Jeśli szybkość perfuzji będzie zbyt niska, tkanka nie zostanie wystarczająco utleniona, co może zakłócić sygnalizację synaptyczną.</li>
 <li> Napełnij pipetę rejestracyjną roztworem wewnątrzkomórkowym i umieść ją w uchwycie pipety. Wskazówka: Najlepsze wyniki dają pipety o oporności w zakresie od 3 do 5 MΩ.</li>
 <li> Zwizualizuj siatkówkę przy użyciu podczerwonego kontrastu interferencyjnego (DIC) przy niskim powiększeniu (obiektyw 10X, NA 0,3), aby zlokalizować pipetę rejestracyjną. Światło podczerwone stosuje się w celu zminimalizowania ekspozycji siatkówki na światło widzialne i ograniczenia adaptacji świetlnej. Przejdź na wyższe powiększenie (obiektyw 40X, NA 0,8) i wprowadź elektrodę w pole widzenia bezpośrednio nad tkanką.</li>
 <li> Przy dużym powiększeniu (obiektyw 40X) oświetl siatkówkę światłem epifluorescencyjnym (480 nm dla EGFP), wybierz fluorescencyjną komórkę zwojową i zaznacz ją na monitorze komputera za pomocą taśmy (Rysunek 1A).</li>
 <li> W warunkach oświetlenia DIC i podczerwonego ustaw elektrodę rejestracyjną w pobliżu wybranej komórki zwojowej (Rysunek 1A). Oczyść obszar bezpośrednio nad komórką, przykładając delikatne dodatnie ciśnienie do elektrody rejestracyjnej za pomocą plastikowej strzykawki 12 cc połączonej z uchwytem pipety rurką polietylenową. Wzmacniaczu wyzeruj wszelkie przesunięcia napięcia. Przystaw elektrodę do wybranej komórki zwojowej, aż na powierzchni komórki pojawi się wgłębienie.</li>
 <li> Przy ustawieniu wzmacniacza w trybie clamp napięciowy (voltage clamp) zastosuj impuls testowy i monitoruj prąd przepływający przez pipetę. Zastosuj ciśnienie ujemne, aby stworzyć uszczelnienie (seal) między elektrodą a komórką. Zwolnij ciśnienie ujemne, gdy komórka zacznie się uszczelniać, i czekaj, aż prąd podtrzymujący wskaże uszczelnienie elektryczne rzędu GΩ między błoną komórkową a pipetą. Stosuj delikatne impulsy ciśnienia ujemnego, aż pojawią się przejściowe prądy pojemnościowe, a następnie przestań aplikować ciśnienie. Wskazówka: jeśli oporność dostępu (szeregową) jest wysoka (&gt;30 MΩ), można to często poprawić poprzez dodatkowe, bardzo delikatne impulsy ciśnienia ujemnego.</li>
 <li> Po uzyskaniu stabilnego uszczelnienia zastosuj impuls ciśnienia ujemnego. Po przejściu w tryb whole cell pozwól komórce na adaptację w ciemności przez 5 minut. Zarejestruj w trybie clamp prądowy (current clamp) odpowiedź na stymulację pełnym polem białym światła (Rysunek 1B).</li>
 <li> Po zakończeniu rejestracji Alexafluor-594 dyfunduje do dendrytów. Marker można zwizualizować w epifluorescencji przy 594 nm i wykorzystać do określenia, czy komórka zwojowa jest typu On, Off lub bistratyfikowana, przełączając się między epifluorescencją a optyką podczerwoną DIC 5.</li>
 <li> Jeśli w pipecie zastosowano neurobiotynę, a siatkówka ma zostać poddana immunohistochemii, pipetę należy delikatnie wycofać, aby zminimalizować uszkodzenie błony.</li>
</ol>
5) Analiza anatomii zarejestrowanych komórek zwojowych
Wypełnianie neurobiotyną umożliwia bardziej szczegółową analizę morfologiczną komórek zwojowych po zakończeniu rejestracji. Wskazówka: Jeśli pożądane są konkretne korelacje między rejestrowaną komórką zwojową a jej szczegółową morfologią, najlepiej może być rejestrowanie i wypełnianie tylko jednej RGC na preparat.
<ol>
 <li> Jeśli do roztworu wewnątrzkomórkowego dodano neurobiotynę, należy umieścić siatkówkę w roztworze paraformaldehydu i utrwalać przez noc w temperaturze 4°C.</li>
 <li> Płukać w PBS przez co najmniej 2 godziny, wymieniając roztwór co najmniej 6 razy. Przenieść siatkówkę na płytkę zawierającą roztwór blokujący. Pozostawić w roztworze blokującym na 2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.</li>
 <li> Zastąpić roztwór blokujący roztworem streptawidyny. Inkubować przez 2 dni w temperaturze 4°C na wytrząsarce. Płukać siatkówkę w PBS (6 płukań, każde po 20 min).</li>
 <li> Zamontować siatkówkę na szkiełku przedmiotowym przy użyciu Vectashield. Siatkówkę należy umieścić komórkami zwojowymi do góry. Wykonać mikroskopię konfokalną (Rysunek 1C).</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
Jeśli siatkówka jest zdrowa, a sekcja przebiegła pomyślnie, poszczególne komórki zwojowe powinny być widoczne w mikroskopii DIC przy dużym powiększeniu (Rysunek 1A). Siatkówki niezdrowe będą charakteryzować się dużymi, ziarnistymi jądrami i powinny zostać odrzucone. Jeśli odpowiedź synaptyczna danej komórki zwojowej jest zachowana, komórka powinna reagować na włączenie lub wyłączenie światła potencjałami czynnościowymi, a w przypadku wewnątrzpochłonnych komórek zwojowych światłoczułych (Rysunek 1B) – trwałą depolaryzacją.
<img src="/files/ftp_upload/2367/2367fig1.jpg" alt="Wyniki eksperymentu elektrofizjologicznego; odpowiedź napięcia błonowego na światło; analiza obrazowania neuronów." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Lokalizacja, rejestracja i barwienie fluorescencyjnie znakowanej komórki zwojowej siatkówki. (A) RGC dodatnia pod kątem GFP wizualizowana przy oświetleniu epifluorescencyjnym z powiększeniem 40X (panel lewy) oraz przy oświetleniu DIC (panel prawy). (B) Synaptyczna odpowiedź świetlna wewnątrzicznie światłoczułej komórki zwojowej siatkówki typu M2, zarejestrowana w trybie clamp prądowy całej komórki (whole-cell current clamp) z fluorescencyjnie znakowanej RGC. (C) Wewnątrzicznie światłoczuła komórka zwojowa siatkówki typu M1, która została zidentyfikowana w epifluorescencji, wytypowana do rejestracji whole-cell, wypełniona neurobiotyną, a następnie poddana obróbce immunohistochemicznej.

<ol><li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
<li>Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+light+responses+in+melanopsin-expressing+ganglion+cells+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development.</a> J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).</li>
<li>Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62, 327-334 (2009).</li>
<li>Siegert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+address+book+for+retinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29, 476-482 (2009).</li>
<li>Newman, E. A., Bartosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eyecup+preparation+for+the+rat+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An eyecup preparation for the rat and mouse.</a> J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).</li>
<li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li>
<li>Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+retinal+dopaminergic+neurons+underlying+their+multiple+roles+in+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision.</a> J Neurosci. 27, 692-699 (2007).</li>
<li>Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flattened+retina-eyecup+preparation+suitable+for+electrophysiological+studies+of+neurons+visualized+with+trans-scleral+infrared+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination.</a> J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).</li>
<li>Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+circuitry+mediating+light-evoked+signals+in+dark-adapted+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina.</a> Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).</li>
</ol>

Technikę tę można zastosować do rejestracji z dowolnych komórek zwojowych siatkówki z wyizolowanej siatkówki. Chociaż w linii myszy użytej powyżej wewnętrznie światłoczułe, wykazujące ekspresję melanopsyny RGC są znakowane EGFP2, 5, protokół ten można łatwo przenieść na inne fluorescencyjnie znakowane linie RGC lub uogólnić w celu rejestracji z losowo wybranych RGC. Technika ta jest szczególnie cenna, ponieważ drzewo dendrytyczne każdej komórki RGC oraz odpowiadające im neurony wejściowe pozostają całkowicie n...

<table><tbody><tr><td>Pożywka Ames&amp;rsquo;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS005273</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002592</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hydrazyd AlexaFluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A10442</td><td></td></tr><tr><td>Neurobiotyna</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP1120</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki okulistyczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna 594</td><td>Invitrogen</td><td>S32356</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td></td></tr></tbody></table>

izolowany preparat siatkówki do rejestracji odpowiedzi świetlnej genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Pierwsze etapy widzenia u kręgowców zachodzą, gdy światło stymuluje fotoreceptory pręcikowe i czopkowe siatkówki 1. Informacje te są następnie rozdzielane na tak zwane szlaki ON i OFF. Fotoreceptory przekazują informacje o świetle do komórek bipolarnych (BC), które ulegają depolaryzacji w odpowiedzi na wzrost (On BC) lub spadek (Off BC) natężenia światła. Ta segregacja informacji świetlnej jest utrzymywana na poziomie komórek zwojowych siatkówki (RGC), których dendryty warstwują się albo w podwarstwie Off wewnętrznej warstwy splotowej (IPL), gdzie otrzymują bezpośrednie sygnały pobudzające od Off BC, albo w podwarstwie On IPL, gdzie otrzymują bezpośrednie sygnały pobudzające od On BC. Ta segregacja informacji dotyczących wzrostu lub spadku oświetlenia (szlaki On i Off) jest zachowana i przekazywana do mózgu równolegle.
Komórki zwojowe siatkówki (RGC) są komórkami wyjściowymi siatkówki, a zatem stanowią istotny obiekt badań w celu zrozumienia, w jaki sposób informacje świetlne są przesyłane do jąder wzrokowych w mózgu. Postępy w genetyce myszy w ostatnich dekadach doprowadziły do powstania wielu linii myszy z reporterami fluorescencyjnymi, w których konkretne populacje RGC są znakowane białkiem fluorescencyjnym, co umożliwia identyfikację podtypów RGC 2 3 4 oraz precyzyjne celowanie podczas rejestracji elektrofizjologicznej. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę rejestracji odpowiedzi na światło z fluorescencyjnie znakowanych komórek zwojowych w nienaruszonej, izolowanej preparacji siatkówki. Taka izolowana preparacja siatkówki pozwala na rejestrację z RGC, w których drzewo dendrytyczne pozostaje nienaruszone, a wejścia sygnałów w całym obszarze dendrytów RGC są zachowane. Metoda ta ma zastosowanie do różnych podtypów komórek zwojowych i jest dostosowana do szerokiego zakresu fizjologicznych technik jednokomórkowych.

Niniejszy artykuł zawiera opis sposobu wycinania i rejestrowania aktywności z izolowanego preparatu siatkówki myszy. W szczególności opisujemy, jak rejestrować odpowiedzi na światło z populacji komórek zwojowych znakowanych fluorescencyjnie, a następnie identyfikować i analizować ich morfologię.

Izolowany preparat siatkówki do rejestracji odpowiedzi świetlnej genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki

Pierwsze etapy widzenia u kręgowców następują w momencie, gdy światło stymuluje fotoreceptory pręcikowe i czopkowe siatkówki 1. Informacja ta jest następnie...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rejestracja odpowiedzi wywołanych światłem z genetycznie znakowanych komórek zwojowych w izolowanej siatkówce myszy. Jest to osiągane poprzez najpierw wypreparowanie siatkówki z oka myszy. Drugim krokiem procedury jest poddanie siatkówki działaniu enzymu w celu usunięcia pozostałości ciała szklistego.Trzecim krokiem procedury jest zamocowanie siatkówki w komorze rejestracyjnej stroną komórek zwojowych do góry, umieszczenie komory na stole mikroskopu oraz zidentyfikowanie genetycznie oznakowanych komórek zwojowych. Ostatnim krokiem procedury jest przeprowadzenie rejestracji z całej komórki (whole cell recording) zidentyfikowanej komórki zwojowej oraz rejestracja odpowiedzi wywołanych światłem. W rezultacie, dzięki rejestracjom metodą patch clamp z pojedynczej komórki, można uzyskać dane ukazujące właściwości funkcjonalne określonego typu komórki zwojowej w siatkówce myszy oraz zdefiniować sygnały, które przesyła ona do mózgu.Witam, nazywam się Tiffany Schmidt i jestem doktorantką w dziedzinie neuronauk w laboratorium dr. Paulo Ka Fuji na University of Minnesota. Technika ta umożliwia identyfikację i rejestrację sygnałów z określonej, oznakowanej genetycznie populacji komórek zwojowych oraz późniejszą analizę morfologiczną. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w zakresie pola widzenia, takie jak sposób, w jaki różne podtypy komórek zwojowych przetwarzają kluczowe cechy bodźców wzrokowych przed przeprowadzeniem operacji.Aby usunąć siatkówkę, w pierwszej kolejności należy przygotować osiem roztworów niezbędnych do przeprowadzenia eksperymentu. Skład wszystkich roztworów użytych w tym doświadczeniu podano w towarzyszącym tekście. Przenieś 200 milliliters roztworu zewnątrzkomórkowego do zlewki o pojemności 250 milliliters w celu przechowywania siatkówki.Pozostałą część roztworu zewnątrzkomórkowego należy przelać do rozdzielacza w celu perfuzji grawitacyjnej podczas rejestracji. Oba roztwory powinny być przez cały czas nasycone mieszanką 95% oxygen, 5% carbon dioxide. Aby umożliwić wizualizację dendrytów podczas eksperymentu, do roztworu wewnątrzkomórkowego należy dodać znacznik fluorescencyjny, taki jak LOR 5 94.Jeśli planujesz przeprowadzenie immunohistochemii po rejestracji z całej komórki, dodaj 0,3% neurobiotyny do roztworu wewnątrzkomórkowego. Po przygotowaniu niezbędnych roztworów uśmierć mysz poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla, a następnie wyjmij gałkę oczną, delikatnie wsuwając pod oko zagiętą pęsetę nr 2 i unosząc gałkę. Użyj nożyczek okulistycznych, aby usunąć mięśnie pozagałkowe i przeciąć nerw wzrokowy.Umieść gałkę oczną w 35 milimetrowej szalce Petriego wypełnionej roztworem zewnątrzkomórkowym. Wytnij rogówkę za pomocą nożyczek okulistycznych i wyjmij soczewkę, używając pęsety nr 5. Za pomocą pęsety nr 5 rozetnij twardówkę i przetnij pozostałą część nerwu wzrokowego w miejscu styku siatkówki i twardówki.Delikatnie odciągnij siatkówkę od oczodołu, prowadząc pęsetę w przestrzeni między siatkówką a twardówką. Aby zaoszczędzić czas, wykonuj każdy krok na obu siatkówkach. Przed przejściem do następnego etapu kluczowe jest usunięcie ciała szklistego przylegającego do siatkówki. Zacznij od chwycenia pęsetą przezroczystego ciała szklistego znajdującego się nad siatkówką.Jeśli ciało szkliste zostanie pomyślnie usunięte, na końcówce pęsety pojawi się niewielka, przezroczysta substancja galaretowata. Przetnij każdą siatkówkę na pół, aby zmaksymalizować ilość użytecznej tkanki i ułatwić montaż siatkówki w komorze rejestracyjnej. Umieść siatkówki w napowietrzonym roztworze zewnątrzkomórkowym w temperaturze pokojowej i ogranicz ekspozycję na światło, dopuszczając jedynie minimalne oświetlenie otoczenia, np. światło z ekranów komputerów; w takich warunkach siatkówki pozostają żywotne przez około sześć godzin.Po sekcji należy pobrać 500 µL roztworu zewnątrzkomórkowego z naczynia, w którym znajdują się siatkówki. Następnie należy dodać do niego alikwot roztworu enzymu kolagenazy i hialuronidazy.Należy przelać roztwór enzymu do 35 milimetrowej szalki Petriego i przenieść jedną z wypreparowanych siatkówek do szalki. Szalką Petriego należy obracać przez 15 minut, przez cały czas delikatnie napowietrzając roztwór mieszaniną 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Roztwór enzymu usuwa resztki ciała szklistego i ułatwia dostęp do warstwy komórek zwojowych. W przypadku siatkówek młodszych zwierząt z mniejszą ilością ciała szklistego lub w razie zaobserwowania działań niepożądanych, czas trawienia można skrócić do pięciu minut.Używając plastikowej pipety transferowej z odciętą końcówką, należy wyjąć siatkówkę z medium zawierającego enzymy. Następnie siatkówkę należy dokładnie wypłukać w roztworze pozakomórkowym.Przenieś siatkówkę do komory rejestracyjnej. Ustawiając warstwę fotoreceptorów skierowaną w dół, odsącz pozostały płyn za pomocą pipety lub chusteczki i rozprostuj brzegi siatkówki, aby spłaszczyć tkankę. Należy uważać, aby dotykać jedynie krawędzi siatkówki, a nie warstwy komórek zwojowych.Aby przymocować siatkówkę, należy umieścić nad nią pierścień platynowy z nylonową siatką, a następnie niezwłocznie wypełnić komorę roztworem zewnątrzkomórkowym. Zamocuj komorę rejestracyjną na stoliku mikroskopu, a następnie podłącz rurkę do perfuzji grawitacyjnej roztworu zewnątrzkomórkowego, rurkę ssącą do próżni oraz przewód uziemiający. Ustaw wysokość zbiornika tak, aby roztwór kapał z prędkością 1 ml/min lub szybciej.Jeśli szybkość perfuzji będzie zbyt niska, tkanka nie zostanie dostatecznie utleniona, co może prowadzić do zaburzeń sygnalizacji synaptycznej. Kolejnym krokiem jest przygotowanie elektrody do rejestracji w konfiguracji whole-cell. Należy wybrać pipetę o oporności w zakresie od 3 do 5 MΩ.Napełnić pipetę rejestrującą rozmrożoną porcją roztworu wewnątrzkomórkowego i umieścić ją w uchwycie do pipet, korzystając z oświetlenia podczerwienią oraz optyki kontrastu interferencyjnego (DIC) przy użyciu obiektywu 10 x. Zwizualizować siatkówkę oraz pipetę rejestrującą. Światło podczerwone jest stosowane w celu zminimalizowania ekspozycji siatkówki na światło widzialne oraz ograniczenia adaptacji świetlnej; przełączyć na obiektyw 40 x i ustawić elektrodę w polu widzenia tuż nad tkanką.Linia myszy wykorzystana w niniejszym badaniu wykazuje ekspresję EGFP w komórkach zwojowych, dzięki czemu komórki zwojowe są widoczne w epi-fluorescencji. Mikroskopia oświetla siatkówkę światłem epi-fluorescencyjnym o długości fali 480 nanometrów. Jeśli siatkówka jest zdrowa, poszczególne komórki zwojowe powinny być widoczne.Niezdrowe siatkówki będą charakteryzować się dużymi, ziarnistymi jądrami i powinny zostać odrzucone. Wybierz jedną z fluorescencyjnych komórek zwojowych do rejestracji i użyj taśmy laboratoryjnej, aby zaznaczyć wybraną komórkę na monitorze komputera. Przełącz na optykę podczerwoną, aby ciało wybranej komórki zwojowej było widoczne.Ustaw elektrodę rejestrującą w pobliżu docelowej komórki zwojowej. Oczyść obszar bezpośrednio otaczający komórkę, przykładając delikatne nadciśnienie do elektrody rejestrującej. Ciśnienie elektrody jest przykładane za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności 12 cc, połączonej z uchwytem pipety rurką polietylenową przy zerowaniu wzmacniacza.Wszelkie przesunięcia napięcia. Umieść elektrodę na wybranej komórce zwojowej, aż na powierzchni komórki pojawi się wgłębienie. Przy ustawionym wzmacniaczu w trybie clamp napięciowego, przyłóż impuls próbny i monitoruj prąd przepływający przez pipetę.Zastosuj podciśnienie, aby utworzyć uszczelnienie między elektrodą a komórką. Zwolnij podciśnienie w momencie, gdy uszczelnienie zacznie się tworzyć, i poczekaj, aż prąd podtrzymujący będzie wskazywał na powstanie gigauszczelnienia elektrycznego między membraną komórki a pipetą. Stosuj delikatne impulsy podciśnienia, aż pojawią się przejścia pojemnościowe wskazujące na uzyskanie trybu rejestracji z całej komórki (whole cell), a następnie całkowicie zwolnij ciśnienie.Jeśli rezystancja dostępowa przekracza 30 mega omów, można to często poprawić poprzez zastosowanie dodatkowych, bardzo delikatnych impulsów podciśnienia. Po uzyskaniu trybu whole cell wyłączyć światło podczerwone i przykryć mikroskop czarnym materiałem. Pozostawić komórkę do adaptacji do ciemności na pięć minut.Po pięciu minutach preparat jest gotowy do rejestracji. W trybie clamp prądowy (current clamp) należy włączyć pełnopolową stymulację białym światłem i zarejestrować odpowiedź komórki zwojowej. Jeśli komórka zwojowa ma być stymulowana wielokrotnie, między stymulacjami należy zapewnić siatkówce odpowiedni czas na adaptację do ciemności.Na tym etapie można również zmodyfikować bodziec świetlny, wprowadzając bodźce wzorcowe lub chromatyczne w celu oceny właściwości odpowiedzi komórek zwojowych. Po zakończeniu rejestracji znacznik fluorescencyjny zawarty w roztworze wewnątrzkomórkowym zdąży dyfundować do dendrytów, co można zweryfikować, przełączając się między fluorescencją epifluorescencyjną a optyką DIC w podczerwieni. Znacznik można wizualizować w trybie epifluorescencyjnym przy 594 nanometrach, co pozwala zbadać dendryty i ustalić, czy komórka zwojowa jest typu on, off czy bistratyfikowana. Neurobiotyna dodana do roztworu wewnątrzkomórkowego dyfundowała do wnętrza komórki zwojowej, w związku z czym kolejnym krokiem jest przygotowanie siatkówki do immunohistochemii.Powoli wycofaj pipetę, aby zminimalizować uszkodzenia błony komórkowej. Należy pamiętać, że jeśli rejestruje się i wypełnia tylko jedną komórkę zwojową siatkówki na preparat, można następnie ustanowić konkretne korelacje między rejestrowaną komórką zwojową a jej szczegółową morfologią. Następnie umieść siatkówkę w roztworze Paraform aldehydu i utrwal przez noc w temperaturze four degrees Celsius po utrwaleniu przez noc.Przepłucz utrwaloną siatkówkę w PBS, wymieniając roztwór PBS co najmniej sześć razy w ciągu dwóch lub więcej godzin. Po płukaniu przenieś siatkówkę na płytkę zawierającą roztwór blokujący, umieść płytkę na wytrząsarce i pozostaw na dwie godziny. W temperaturze pokojowej zastąp roztwór blokujący roztworem wykrywającym strep, umieść siatkówkę ponownie na wytrząsarce i inkubuj przez dwa dni w temperaturze 4 °C.Po dwóch dniach opłucz siatkówkę w PBS, wykonując sześć płukań po 20 minut każde, aby przygotować ją do montażu. Umieść ją warstwą komórek zwojowych do góry na szkiełku podstawowym, używając medium Vector Shield. Przykryj medium montażowym szkiełkiem nakrywnym i uszczelnij lakierem do paznokci; tak przygotowaną siatkówkę z oznakowanymi komórkami zwojowymi można teraz badać pod mikroskopem konfokalnym.Rycina ta przedstawia komórki zwojowe siatkówki wykazujące pozytywną ekspresję GFP, obrazowane po lewej stronie przy użyciu oświetlenia epifluorescencyjnego z powiększeniem 40-krotnym oraz po prawej stronie przy użyciu oświetlenia DIC. Jeśli siatkówka jest zdrowa, a sekcja przebiegła pomyślnie, poszczególne komórki zwojowe są widoczne w obrazowaniu DIC przy dużym powiększeniu. Siatkówki niezdrowe będą charakteryzować się dużymi, ziarnistymi jądrami i powinny zostać odrzucone.Rysunek ten przedstawia typ odpowiedzi na światło charakterystyczny dla komórki zwojowej siatkówki typu M2 z warstwą wewnętrzną wrażliwą na światło. W zależności od rodzaju komórki zwojowej siatkówki znakowanej genetycznie w danej preparacji, właściwości odpowiedzi będą się różnić. Jeśli odpowiedź synaptyczna danej komórki zwojowej jest zachowana, komórka powinna reagować potencjałami czynnościowymi w momencie włączenia lub wyłączenia światła.W przypadku wewnątrzpochodnie światłoczułej komórki zwojowej, przy trwałej depolaryzacji, niniejszy rysunek komórki zwojowej wypełnionej neurobiotyną przedstawia morfologię typowej, warstwującej się komórki M1 off, czyli wewnątrzpochodnie światłoczułej komórki zwojowej siatkówki. Po rejestracji z całej komórki immunohistochemia pozwala na korelację morfologii dendrytów z odpowiedzią elektrofizjologiczną komórki zwojowej siatkówki. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o natlenianiu otworu z siatkówką oraz szybkim perfuzyjnym przepływie przez tkankę w celu zachowania odpowiedzi synaptycznych.Dziękujemy za obejrzenie tej demonstracji.

an-isolated-retinal-preparation-to-record-light-response-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Preparat siatkówki pozbawiony wpływu mózgu do rejestracji reakcji na światło u genetycznie zmodyfikowanych komórek zwojowych siatkówki

W niniejszej pracy opisujemy procedurę przygotowywania adaptowanych do ciemności skrawków siatkówki mysiej do pomiarów elektrofizjologicznych.

Rejestracja metodą patch-clamp z neuronów siatkówki myszy w preparacie skrawka adaptowanego do ciemności

Opisujemy stosunkowo prostą metodę rejestracji transretinalnego elektroretinogramu (ERG) w celu uzyskania odpowiedzi fotoreceptorowych pręcików i czopków z nienaruszonej siatkówki myszy. Podejście to wykorzystuje blokadę przekaźnictwa synaptycznego z fotoreceptorów w celu wyizolowania ich odpowiedzi na światło i zarejestrowania ich za pomocą elektrod polowych umieszczonych w poprzek wyizolowanej, rozłożonej płasko siatkówki.

Rejestracja transretinalnego ERG z siatkówki myszy: fotoreakcje czopków i pręcików

Niniejszy artykuł przedstawia rejestrację sygnałów z pojedynczych komórek pochodzących z fluorescencyjnie znakowanych populacji neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy. Dzięki zastosowaniu dwufotonowego wzbudzenia w podczerwieni, transgenicznie znakowane komórki zostały wytypowane do rejestracji metodą patch-clamp w celu zbadania ich reakcji na światło, właściwości pól recepcyjnych oraz morfologii.

Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce

Opisano metodę izolacji pojedynczych komórek siatkówki oraz następującej po niej amplifikacji ich cDNA. Transkryptomika pojedynczych komórek pozwala określić stopień heterogeniczności komórkowej występującej w tkance oraz odkryć nowe geny markerowe dla rzadkich populacji komórek. Dołączony protokół można dostosować do wielu różnych typów komórek.

Profilowanie pojedynczych komórek rozwijających się i dojrzałych neuronów siatkówki

Źródło: Laboissonniere, et. al. Jednokomórkowy sekwencjoner RNA zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki. J. Vis. exp. (2017).  Ten film demonstruje technikę fluorescencyjnego śledzenia w celu identyfikacji podtypów komórek zwojowych siatkówki (RGC) w transgenicznej siatkówce myszy. Proces ten polega na zabezpieczeniu izolowanej siatkówki w komorze rejestracyjnej, utrzymaniu żywotności komórek za pomocą natlenionej perfuzji i celowaniu w znakowane fluorescencyjnie RGC za pomocą...

Identyfikacja podtypów komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą śledzenia fluorescencyjnego

Ten artykuł wideo ilustruje przygotowanie, procedury łatania ciał komórkowych oraz sposób implementacji dynamicznych zapisów zaciskowych z komórek zwojowych w całych siatkówkach myszy. Technika ta pozwala na zbadanie dokładnego udziału pobudzających i hamujących wejść synaptycznych oraz ich względnej wielkości i czasu na impulsy neuronalne.

Implementacja dynamicznego zacisku z przewodnictwem synaptycznym i sztucznym w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Pokażemy, jak przygotować wycinki siatkówki z oka myszy i rejestrować reakcje świetlne w neuronach siatkówki. Cała procedura przeprowadzana jest w warunkach przystosowanych do ciemności.

Rejestrowanie wywołanych światłem odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach w adaptowanych do ciemności, mysich preparatach siatkówki przy użyciu technik patch clamp

Ten protokół pokazuje, jak przeprowadzić zapis klamry całokomórkowej na neuronach siatkówki z preparatu do montażu płaskiego.

Zapis patch clamp komórek amakrynowych Starburst w płaskim preparacie bezkofeinowej siatkówki myszy

Tutaj prezentujemy kombinatoryczne podejście do klasyfikacji typów komórek neuronalnych przed izolacją i późniejszej charakterystyki transkryptomów jednokomórkowych. Protokół ten optymalizuje przygotowanie próbek do udanego sekwencjonowania RNA (RNA-Seq) i opisuje metodologię zaprojektowaną specjalnie w celu lepszego zrozumienia różnorodności komórkowej.

Sekwencja RNA pojedynczej komórki zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki

Miliony ludzi cierpią na choroby zwyrodnieniowe siatkówki, które prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Wspólnym elementem wielu z tych chorób jest utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC). Ten szczegółowy protokół opisuje izolację pierwotnych mysich RGC przez selekcję dodatnią i ujemną za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

Praca ta przedstawia alternatywne przygotowanie siatkówki płaskie, w którym usunięcie ciał komórek fotoreceptorowych umożliwia szybszą dyfuzję przeciwciał oraz poprawiony dostęp pipety plastrowej do wewnętrznych neuronów siatkówki do immunohistochemii, hybrydyzacji in situ oraz eksperymentów elektrofizjologicznych.

Rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej

Poznaj metodę izolacji siatkówki myszy do rejestracji odpowiedzi świetlnych z genetycznie znakowanych komórek zwojowych. Technika patch clamp pozwala analizować morfologię i właściwości funkcjonalne neuronów.

Izolowany preparat siatkówki do rejestracji odpowiedzi świetlnej genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki

Przeglądaj więcej filmów