Izolowany preparat siatkówki do rejestrowania odpowiedzi świetlnej z genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki
January 26th, 2011
Ten artykuł zawiera opis sposobu preparowania i rejestrowania z wyizolowanego preparatu siatkówki u myszy. W szczególności opisujemy, jak rejestrować reakcje świetlne z fluorescencyjnie znakowanej populacji komórek zwojowych, a następnie identyfikować i analizować ich morfologię.
Ogólnym celem tej procedury jest zarejestrowanie odpowiedzi wywołanych światłem z genetycznie znakowanych komórek zwojowych w izolowanej siatkówce myszy. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie siatkówki z oka myszy. Drugim etapem zabiegu jest potraktowanie siatkówki enzymem w celu usunięcia pozostałego ciała szklistego.
Trzecim krokiem procedury jest zamontowanie komórki zwojowej siatkówki stroną do góry w komorze rejestracyjnej, zamontowanie komory na stoliku mikroskopu i zidentyfikowanie genetycznie znakowanych komórek zwojowych. Ostatnim etapem zabiegu jest uzyskanie zapisu całej komórki zidentyfikowanej komórki zwojowej i zarejestrowanie odpowiedzi wywołanych światłem. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują właściwości funkcjonalne zdefiniowanej komórki zwojowej, wpisują siatkówkę myszy i definiują sygnały, które przekazuje ona do mózgu za pomocą nagrań z pojedynczym komórkowym patch clamp.
Cześć, nazywam się Tiffany Schmidt i jestem studentką neurologii w laboratorium dr Paulo Ka Fuji na Uniwersytecie Minnesoty. Technika ta umożliwia identyfikację i rejestrację ze zdefiniowanej, genetycznie znakowanej populacji komórek zwojowych, a następnie analizę morfologiczną. Technika ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w polu widzenia, takie jak to, w jaki sposób różne podtypy komórek zwojowych przetwarzają kluczowe cechy bodźców wzrokowych przed wykonaniem operacji.
Aby usunąć siatkówkę, pierwszym zadaniem jest wymieszanie ośmiu roztworów potrzebnych do eksperymentu. Składniki wszystkich roztworów użytych w tym eksperymencie podano w dołączonym tekście. Przenieś 200 mililitrów roztworu zewnątrzkomórkowego do 250-mililitrowej zlewki w celu przechowywania siatkówki.
Umieść pozostały roztwór zewnątrzkomórkowy w rozdzielaczu w celu uzyskania obfitości grawitacyjnej podczas nagrywania. Oba te roztwory powinny być przez cały czas nasycone 95% tlenem, 5% dwutlenkiem węgla. Aby uwidocznić dendryty podczas eksperymentu, dodaj znacznik fluorescencyjny, taki jak LOR 5 94, do roztworu wewnątrzkomórkowego.
Jeśli planujesz wykonać immunohistochemię po zapisie całej komórki, dodaj 0,3% neurobiotyny do roztworu wewnątrzkomórkowego. Po przygotowaniu niezbędnych roztworów poddaj mysz eutanazji przez uduszenie dwutlenkiem węgla, zarodkować gałkę oczną, delikatnie wkładając kątowe kleszcze numer dwa za oko i podnosząc gałkę oczną. Użyj nożyczek okulistycznych, aby oczyścić mięśnie zewnątrzgałkowe i przeciąć nerw wzrokowy.
Umieść gałkę oczną na 35-milimetrowej szalce Petriego wypełnionej roztworem zewnątrzkomórkowym. Odetnij rogówkę nożyczkami okulistycznymi i wyciągnij soczewkę za pomocą kleszczy numer pięć. Użyj kleszczy numer pięć, aby rozerwać twardówkę i przeciąć pozostały nerw wzrokowy, w którym spotykają się siatkówka i twardówka.
Delikatnie odciągnij siatkówkę od muszli ocznej, przesuwając kleszcze w przestrzeni między siatkówką a twardówką. Aby zaoszczędzić czas, wykonaj każdy krok na obu siatkówkach Zanim przejdziesz do następnego kroku, kluczowym krokiem jest usunięcie ciała szklistego przyczepionego do siatkówki. Zacznij od użycia kleszczy, aby chwycić przezroczyste ciało szkliste nad siatkówką.
Jeśli ciało szkliste zostanie pomyślnie usunięte, na czubku kleszczy zobaczysz małą, przezroczystą galaretowatą substancję. Przetnij każdą siatkówkę na pół, aby zmaksymalizować ilość użytecznej tkanki i ułatwić montaż siatkówki w komorze nagraniowej. Umieść siatkówki w natlenionym roztworze zewnątrzkomórkowym w temperaturze pokojowej i zminimalizuj ekspozycję na światło, przepuszczając tylko minimalne światło otoczenia, takie jak światło z ekranów komputerów, siatkówki pozostają żywotne przez około sześć godzin.
Po rozbiorze weź 500 mikrolitrów roztworu zewnątrzkomórkowego z roztworu, w którym bulgoczą dodatkowe siatkówki. Rozcieńczyć w nim. Podwielokrotność roztworu enzymu hialuronidazy kolagenazy.
Umieść roztwór enzymu na 35-milimetrowej szalce Petriego i przenieś jedną z wypreparowanych siatkówk do szalki Petriego. Obracaj szalkę Petriego przez 15 minut, cały czas delikatnie, super łącząc 95% tlenu, 5% dwutlenku węgla w roztworze. Roztwór enzymatyczny usuwa wszelkie pozostałe ciała szkliste i umożliwia łatwiejszy dostęp do warstwy komórek zwojowych W przypadku siatkówki u młodszych zwierząt z mniejszą wartością ciała szklistego lub w przypadku zaobserwowania działań niepożądanych trawienie można skrócić do pięciu minut.
Za pomocą plastikowej pipety transferowej z odciętą końcówką. Usunąć siatkówkę z pożywki zawierającej enzym. Dokładnie umyj siatkówkę w roztworze zewnątrzkomórkowym.
Przenieś siatkówkę do komory nagrywającej. Trzymając warstwę fotoreceptora skierowaną w dół, usuń pozostały płyn za pomocą pipety lub chusteczki i rozwałkuj boki siatkówki, aby spłaszczyć tkankę. Należy uważać, aby dotykać tylko krawędzi siatkówki, a nie warstwy komórek zwojowych.
Aby zakotwiczyć siatkówkę, umieść platynowy pierścień z nylonową siatką na siatkówce, a następnie natychmiast wypełnij komorę roztworem zewnątrzkomórkowym. Zamontuj komorę zapisu na stoliku mikroskopu, a następnie przymocuj rurkę do grawitacyjnej perfuzji roztworu zewnątrzkomórkowego, rurkę ssącą próżni i przewód uziemiający. Dostosuj grawitację tak, aby kapała z prędkością jednego mililitra na minutę lub szybciej.
Jeśli szybkość perfuzji jest zbyt niska, tkanka nie będzie wystarczająco dotleniona, a sygnalizacja synaptyczna może zostać zakłócona. Następnym krokiem jest ustawienie elektrody do nagrywania łatek całego ogniwa. Wybierz pipetę o rezystancji w zakresie od trzech do pięciu megaomów.
Napełnij pipetę rejestrującą rozmrożoną porcją roztworu wewnątrzkomórkowego i włóż ją do uchwytu pipety za pomocą oświetlenia podczerwonego i kontrastu interferencyjnego lub optyki DIC pod obiektywem 10x. Wizualizuj siatkówkę i pipetę rejestrującą. Światło podczerwone służy do zminimalizowania ekspozycji siatkówki na światło widzialne i zminimalizowania adaptacji światła, przełącz się na obiektyw 40x i umieść elektrodę w polu widzenia tuż nad tkanką.
Linia myszy użyta w tym badaniu ulega ekspresji EGFP w swoich komórkach zwojowych, a zatem komórki zwojowe są widoczne pod wpływem fluorescencji epi. Mikroskopia oświetla siatkówkę fluorescencją epi o długości 480 nanometrów. Jeśli siatkówka jest zdrowa, powinny być widoczne pojedyncze komórki zwojowe.
Niezdrowe siatkówki będą miały duże ziarniste jądra i należy je wyrzucić. Wybierz jedną z fluorescencyjnych komórek zwojowych do nagrania i użyj taśmy laboratoryjnej, aby oznaczyć wybraną komórkę na monitorze komputera. Przełącz się na optykę podczerwieni, aby wybrany korpus komórki zwojowej był widoczny.
Umieść elektrodę rejestrującą w pobliżu docelowej komórki zwojowej. Oczyść obszar bezpośrednio zakrywający komórkę, wywierając delikatny dodatni nacisk na nagranie. Ciśnienie elektrody jest wywierane za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności 12 cm³ połączonej z uchwytem na pipetę z rurką polietylenową na wzmacniaczu zero.
Dowolne przesunięcia napięcia. Umieść elektrodę na wybranej komórce zwojowej, aż na powierzchni komórki pojawi się wgłębienie. Gdy wzmacniacz jest w trybie cęgów napięciowych, zastosuj impuls testowy i monitoruj prąd przepływający przez pipetę.
Zastosuj podciśnienie, aby utworzyć uszczelnienie między elektrodą a ogniwem. Zwolnij podciśnienie, gdy uszczelka zacznie się formować i poczekaj, aż prąd podtrzymujący zacznie wskazywać na giga uszczelnienie elektryczne między błoną ogniwa a pipetą. Zastosuj delikatne impulsy podciśnienia, aż pojawią się pojemnościowe stany nieustalone wskazujące, że uzyskano tryb nagrywania całej komórki, a następnie zwolnij wszelkie naciski.
Jeśli rezystancja dostępowa jest większa niż 30 megaomów, często można ją poprawić za pomocą dodatkowych, bardzo delikatnych impulsów podciśnienia. Po uzyskaniu trybu całej komórki wyłącz światło podczerwone i przykryj mikroskop czarną szmatką. Pozwól komórce przystosować się do ciemności przez pięć minut.
Po pięciu minutach preparat jest gotowy do nagrania. W bieżącym trybie cęgowym włącz stymulację światłem białym w pełnym polu i zarejestruj odpowiedź komórki zwojowej. Jeśli komórka zwojowa ma być stymulowana wielokrotnie, siatkówka powinna mieć możliwość ciemnego przystosowania się w razie potrzeby między stymulacjami.
Bodziec świetlny może być również zmodyfikowany w tym momencie, aby uwzględnić bodźce wzorzyste lub chromatyczne w celu oceny właściwości odpowiedzi komórek zwojowych po zarejestrowaniu, znacznik fluorescencyjny w roztworze wewnątrzkomórkowym dyfunduje do dendrytów poprzez przełączanie między optyką epi fluorescencyjną a optyką podczerwieni DIC. Znacznik można uwidocznić pod wpływem fluorescencji epi przy 594 nanometrach i można zbadać dendryty, aby określić, czy komórka zwojowa jest włączona, czy warstwowa. Neurobiotyna, która została dodana do roztworu wewnątrzkomórkowego, dyfundowała do komórki zwojowej, a więc następnym krokiem jest przygotowanie siatkówki do immunohistochemii.
Delikatnie wycofaj pipetę, aby zminimalizować przerwanie błony komórkowej. Należy pamiętać, że jeśli zarejestrujesz i wypełnisz tylko jedną komórkę zwojową siatkówki na preparat, możesz ustalić specyficzne korelacje między zarejestrowaną komórką zwojową a jej szczegółową morfologią. Następnie umieść siatkówkę w roztworze aldehydu Paraform i utrwal przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza po utrwaleniu przez noc.
Przepłukać utrwaloną siatkówkę w PBS, dokonując co najmniej sześciu zmian roztworu PBS w ciągu dwóch lub więcej godzin. Po spłukaniu przenieś siatkówkę na płytkę zawierającą roztwór blokujący, umieść płytkę na shakerze i pozostaw na dwie godziny. W temperaturze pokojowej zastąp roztwór blokujący roztworem paciorkowca i umieść siatkówkę z powrotem na wytrząsarce i pozwól jej inkubować przez dwa dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po dwóch dniach przepłucz siatkówkę w PBS, wykonując sześć płukań po 20 minut każde, aby zamontować siatkówkę. Umieść go komórką ganglionową do góry na szklanym szkiełku za pomocą osłony wektorowej. Mocując pokrywę nośnika ze szklaną pokrywą, wsunąć i uszczelnić lakierem do paznokci, oznaczoną komórkę zwojową można teraz oglądać pod mikroskopem konfokalnym.
Rysunek ten przedstawia komórki zwojowe siatkówki dodatniej GFP uwidocznione w świetle fluorescencyjnym epi w 40-krotnym powiększeniu po lewej stronie i w oświetleniu DIC po prawej. Jeśli siatkówka jest zdrowa, a sekcja zakończyła się sukcesem, pojedyncze komórki zwojowe są widoczne pod DIC w dużym powiększeniu. Niezdrowe siatkówki będą miały duże ziarniste jądra i należy je wyrzucić.
Ten rysunek pokazuje rodzaj odpowiedzi na światło, która jest typowa dla M dwa na stratyfikacji wewnętrznie kopiuje wrażliwe komórki zwojowe siatkówki. W zależności od rodzaju komórki zwojowej siatkówki znakowanej genetycznie w danym preparacie, właściwości odpowiedzi będą się różnić. Jeśli odpowiedź synaptyczna danej komórki zwojowej jest nienaruszona, to komórka powinna reagować o świcie lub być przesunięta potencjałami czynnościowymi.
A w przypadku wewnętrznie światłoczułej komórki zwojowej, trwałej depolaryzacji, ta figura komórki zwojowej wypełnionej neurobiotyną pokazuje morfologię typowej M1 z stratyfikującą, wewnętrznie światłoczułą komórką zwojową siatkówki. Śledzenie zapisu całej komórki immunohistochemia pozwala na korelację morfologii dendrytycznej i odpowiedzi elektrofizjologicznej komórki zwojowej siatkówki. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dobrym dotlenieniu siatkówki i szybkiej perfuzji tkanki w celu zachowania odpowiedzi synaptycznych.
Dziękujemy za obejrzenie tej demonstracji.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę do badania i rejestracji z izolowanego preparatu siatkówki u myszy. Skupia się na rejestracji reakcji na światło z genetycznie oznaczonych komórek gangliarnych i analizie ich morfologii.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Biologia siatkówki
Tło
- Siatkówka jest kluczowa dla przetwarzania wzrokowego.
- Komórki gangliarne przenoszą informacje wzrokowe do mózgu.
- Oznaczenia genetyczne pozwalają na specyficzną identyfikację typów komórek.
- Techniki elektrofizjologiczne dostarczają informacji na temat funkcji komórkowych.
Cel badania
- Rejestrowanie reakcji wywołanych światłem z komórek gangliarnych.
- Analiza morfologii zidentyfikowanych komórek gangliarnych.
- Zrozumienie funkcjonalnych właściwości określonych typów komórek gangliarnych.
Stosowane metody
- Rozebranie siatkówki z oka myszy.
- Leczenie enzymatyczne w celu usunięcia ciała szklistego.
- Zamocowanie siatkówki w komorze rejestracji.
- Rejestrowanie całokomórkowe patch clamp z zidentyfikowanych komórek gangliarnych.
Główne wyniki
- Udane rejestrowanie reakcji wywołanych światłem z komórek gangliarnych.
- Identyfikacja określonych typów komórek gangliarnych na podstawie oznaczeń genetycznych.
- Analiza funkcjonalnych właściwości rejestrowanych komórek.
- Wgląd w sygnały przenoszone do mózgu przez te komórki.
Wnioski
- Metoda pozwala na szczegółowe badanie funkcji komórek gangliarnych.
- Oznaczenia genetyczne zwiększają specyficzność w identyfikacji typów komórek.
- Rejestrowanie elektrofizjologiczne dostarcza cennych danych na temat przetwarzania siatkówki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Direct recording of light-evoked responses from genetically labeled retinal ganglion cells (RGCs) enables precise functional characterization of defined neuronal subtypes in intact tissue. This approach strengthens early discovery by linking genetic identity to physiological output, supporting mechanistic de-risking and target validation in neuro-ophthalmic research. The method's ability to preserve dendritic architecture and synaptic inputs enhances predictive confidence for translational and preclinical studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of specific RGC subtypes for functional target validation in vision research.
- Supports mechanistic de-risking by correlating genetic labeling with electrophysiological response profiles.
- Facilitates portfolio triage by distinguishing functional diversity among ganglion cell populations.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, intact retinal systems for downstream electrophysiological and pharmacological screening.
- Ensures reproducibility and quantitative measurement of light-evoked responses across genetically defined cell types.
- Enables scalable, subtype-specific assay development for compound evaluation targeting retinal pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional readouts with disease-relevant retinal circuits for translational biomarker development.
- Maintains continuity from genetic manipulation through physiological validation in preclinical models.
- Provides predictive de-risking for therapeutic strategies targeting specific retinal cell populations.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation in neuro-ophthalmic pipelines.
- Discovery Biology: Links genetic identity to functional output, supporting hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative electrophysiological data for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Provides single-cell resolution measurements to compare light response properties across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by preserving native circuitry and response fidelity.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse RGC subtype analysis and cross-program standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in retinal target validation.
- Operational Value: Standardizes preparation and recording protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in vision-focused portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and therapeutic strategies in neuro-ophthalmology.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal dissection, electrophysiology, and genetic labeling techniques.
- Demands specialized microscopy and patch clamp instrumentation for single-cell recordings.
- Necessitates cross-team standardization of tissue preparation and recording conditions.
- Adaptation may be needed for different mouse lines or retinal disease models.
- Viability and synaptic integrity are limited by tissue handling and oxygenation constraints.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
1:01
Introduction
1:33
Preparation of Solutions
2:29
Isolation of Retina from Mouse Eye
11:21
Response of Retinal Ganglion Cell to Light Stimulation and Correlation with Morphology
4:08
Treatment of Retina with Enzyme MIxture and Mounting in Recording Chamber
6:10
Localization of EGFP Expressing Ganglion Cells and Light Stimulation
9:51
Analysis of Anatomy of Recorded Ganglion Cells
12:45
Conclusion
0:05
Title
