Izolowany preparat siatkówki do rejestracji odpowiedzi świetlnej genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rejestracja odpowiedzi wywołanych światłem z genetycznie znakowanych komórek zwojowych w izolowanej siatkówce myszy. Jest to osiągane poprzez najpierw wypreparowanie siatkówki z oka myszy. Drugim krokiem procedury jest poddanie siatkówki działaniu enzymu w celu usunięcia pozostałości ciała szklistego.

Trzecim krokiem procedury jest zamocowanie siatkówki w komorze rejestracyjnej stroną komórek zwojowych do góry, umieszczenie komory na stole mikroskopu oraz zidentyfikowanie genetycznie oznakowanych komórek zwojowych. Ostatnim krokiem procedury jest przeprowadzenie rejestracji z całej komórki (whole cell recording) zidentyfikowanej komórki zwojowej oraz rejestracja odpowiedzi wywołanych światłem. W rezultacie, dzięki rejestracjom metodą patch clamp z pojedynczej komórki, można uzyskać dane ukazujące właściwości funkcjonalne określonego typu komórki zwojowej w siatkówce myszy oraz zdefiniować sygnały, które przesyła ona do mózgu.

Witam, nazywam się Tiffany Schmidt i jestem doktorantką w dziedzinie neuronauk w laboratorium dr. Paulo Ka Fuji na University of Minnesota. Technika ta umożliwia identyfikację i rejestrację sygnałów z określonej, oznakowanej genetycznie populacji komórek zwojowych oraz późniejszą analizę morfologiczną. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w zakresie pola widzenia, takie jak sposób, w jaki różne podtypy komórek zwojowych przetwarzają kluczowe cechy bodźców wzrokowych przed przeprowadzeniem operacji.

Aby usunąć siatkówkę, w pierwszej kolejności należy przygotować osiem roztworów niezbędnych do przeprowadzenia eksperymentu. Skład wszystkich roztworów użytych w tym doświadczeniu podano w towarzyszącym tekście. Przenieś 200 milliliters roztworu zewnątrzkomórkowego do zlewki o pojemności 250 milliliters w celu przechowywania siatkówki.

Pozostałą część roztworu zewnątrzkomórkowego należy przelać do rozdzielacza w celu perfuzji grawitacyjnej podczas rejestracji. Oba roztwory powinny być przez cały czas nasycone mieszanką 95% oxygen, 5% carbon dioxide. Aby umożliwić wizualizację dendrytów podczas eksperymentu, do roztworu wewnątrzkomórkowego należy dodać znacznik fluorescencyjny, taki jak LOR 5 94.

Jeśli planujesz przeprowadzenie immunohistochemii po rejestracji z całej komórki, dodaj 0,3% neurobiotyny do roztworu wewnątrzkomórkowego. Po przygotowaniu niezbędnych roztworów uśmierć mysz poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla, a następnie wyjmij gałkę oczną, delikatnie wsuwając pod oko zagiętą pęsetę nr 2 i unosząc gałkę. Użyj nożyczek okulistycznych, aby usunąć mięśnie pozagałkowe i przeciąć nerw wzrokowy.

Umieść gałkę oczną w 35 milimetrowej szalce Petriego wypełnionej roztworem zewnątrzkomórkowym. Wytnij rogówkę za pomocą nożyczek okulistycznych i wyjmij soczewkę, używając pęsety nr 5. Za pomocą pęsety nr 5 rozetnij twardówkę i przetnij pozostałą część nerwu wzrokowego w miejscu styku siatkówki i twardówki.

Delikatnie odciągnij siatkówkę od oczodołu, prowadząc pęsetę w przestrzeni między siatkówką a twardówką. Aby zaoszczędzić czas, wykonuj każdy krok na obu siatkówkach. Przed przejściem do następnego etapu kluczowe jest usunięcie ciała szklistego przylegającego do siatkówki. Zacznij od chwycenia pęsetą przezroczystego ciała szklistego znajdującego się nad siatkówką.

Jeśli ciało szkliste zostanie pomyślnie usunięte, na końcówce pęsety pojawi się niewielka, przezroczysta substancja galaretowata. Przetnij każdą siatkówkę na pół, aby zmaksymalizować ilość użytecznej tkanki i ułatwić montaż siatkówki w komorze rejestracyjnej. Umieść siatkówki w napowietrzonym roztworze zewnątrzkomórkowym w temperaturze pokojowej i ogranicz ekspozycję na światło, dopuszczając jedynie minimalne oświetlenie otoczenia, np. światło z ekranów komputerów; w takich warunkach siatkówki pozostają żywotne przez około sześć godzin.

Po sekcji należy pobrać 500 µL roztworu zewnątrzkomórkowego z naczynia, w którym znajdują się siatkówki. Następnie należy dodać do niego alikwot roztworu enzymu kolagenazy i hialuronidazy.

Należy przelać roztwór enzymu do 35 milimetrowej szalki Petriego i przenieść jedną z wypreparowanych siatkówek do szalki. Szalką Petriego należy obracać przez 15 minut, przez cały czas delikatnie napowietrzając roztwór mieszaniną 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Roztwór enzymu usuwa resztki ciała szklistego i ułatwia dostęp do warstwy komórek zwojowych. W przypadku siatkówek młodszych zwierząt z mniejszą ilością ciała szklistego lub w razie zaobserwowania działań niepożądanych, czas trawienia można skrócić do pięciu minut.

Używając plastikowej pipety transferowej z odciętą końcówką, należy wyjąć siatkówkę z medium zawierającego enzymy. Następnie siatkówkę należy dokładnie wypłukać w roztworze pozakomórkowym.

Przenieś siatkówkę do komory rejestracyjnej. Ustawiając warstwę fotoreceptorów skierowaną w dół, odsącz pozostały płyn za pomocą pipety lub chusteczki i rozprostuj brzegi siatkówki, aby spłaszczyć tkankę. Należy uważać, aby dotykać jedynie krawędzi siatkówki, a nie warstwy komórek zwojowych.

Aby przymocować siatkówkę, należy umieścić nad nią pierścień platynowy z nylonową siatką, a następnie niezwłocznie wypełnić komorę roztworem zewnątrzkomórkowym. Zamocuj komorę rejestracyjną na stoliku mikroskopu, a następnie podłącz rurkę do perfuzji grawitacyjnej roztworu zewnątrzkomórkowego, rurkę ssącą do próżni oraz przewód uziemiający. Ustaw wysokość zbiornika tak, aby roztwór kapał z prędkością 1 ml/min lub szybciej.

Jeśli szybkość perfuzji będzie zbyt niska, tkanka nie zostanie dostatecznie utleniona, co może prowadzić do zaburzeń sygnalizacji synaptycznej. Kolejnym krokiem jest przygotowanie elektrody do rejestracji w konfiguracji whole-cell. Należy wybrać pipetę o oporności w zakresie od 3 do 5 MΩ.

Napełnić pipetę rejestrującą rozmrożoną porcją roztworu wewnątrzkomórkowego i umieścić ją w uchwycie do pipet, korzystając z oświetlenia podczerwienią oraz optyki kontrastu interferencyjnego (DIC) przy użyciu obiektywu 10 x. Zwizualizować siatkówkę oraz pipetę rejestrującą. Światło podczerwone jest stosowane w celu zminimalizowania ekspozycji siatkówki na światło widzialne oraz ograniczenia adaptacji świetlnej; przełączyć na obiektyw 40 x i ustawić elektrodę w polu widzenia tuż nad tkanką.

Linia myszy wykorzystana w niniejszym badaniu wykazuje ekspresję EGFP w komórkach zwojowych, dzięki czemu komórki zwojowe są widoczne w epi-fluorescencji. Mikroskopia oświetla siatkówkę światłem epi-fluorescencyjnym o długości fali 480 nanometrów. Jeśli siatkówka jest zdrowa, poszczególne komórki zwojowe powinny być widoczne.

Niezdrowe siatkówki będą charakteryzować się dużymi, ziarnistymi jądrami i powinny zostać odrzucone. Wybierz jedną z fluorescencyjnych komórek zwojowych do rejestracji i użyj taśmy laboratoryjnej, aby zaznaczyć wybraną komórkę na monitorze komputera. Przełącz na optykę podczerwoną, aby ciało wybranej komórki zwojowej było widoczne.

Ustaw elektrodę rejestrującą w pobliżu docelowej komórki zwojowej. Oczyść obszar bezpośrednio otaczający komórkę, przykładając delikatne nadciśnienie do elektrody rejestrującej. Ciśnienie elektrody jest przykładane za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności 12 cc, połączonej z uchwytem pipety rurką polietylenową przy zerowaniu wzmacniacza.

Wszelkie przesunięcia napięcia. Umieść elektrodę na wybranej komórce zwojowej, aż na powierzchni komórki pojawi się wgłębienie. Przy ustawionym wzmacniaczu w trybie clamp napięciowego, przyłóż impuls próbny i monitoruj prąd przepływający przez pipetę.

Zastosuj podciśnienie, aby utworzyć uszczelnienie między elektrodą a komórką. Zwolnij podciśnienie w momencie, gdy uszczelnienie zacznie się tworzyć, i poczekaj, aż prąd podtrzymujący będzie wskazywał na powstanie gigauszczelnienia elektrycznego między membraną komórki a pipetą. Stosuj delikatne impulsy podciśnienia, aż pojawią się przejścia pojemnościowe wskazujące na uzyskanie trybu rejestracji z całej komórki (whole cell), a następnie całkowicie zwolnij ciśnienie.

Jeśli rezystancja dostępowa przekracza 30 mega omów, można to często poprawić poprzez zastosowanie dodatkowych, bardzo delikatnych impulsów podciśnienia. Po uzyskaniu trybu whole cell wyłączyć światło podczerwone i przykryć mikroskop czarnym materiałem. Pozostawić komórkę do adaptacji do ciemności na pięć minut.

Po pięciu minutach preparat jest gotowy do rejestracji. W trybie clamp prądowy (current clamp) należy włączyć pełnopolową stymulację białym światłem i zarejestrować odpowiedź komórki zwojowej. Jeśli komórka zwojowa ma być stymulowana wielokrotnie, między stymulacjami należy zapewnić siatkówce odpowiedni czas na adaptację do ciemności.

Na tym etapie można również zmodyfikować bodziec świetlny, wprowadzając bodźce wzorcowe lub chromatyczne w celu oceny właściwości odpowiedzi komórek zwojowych. Po zakończeniu rejestracji znacznik fluorescencyjny zawarty w roztworze wewnątrzkomórkowym zdąży dyfundować do dendrytów, co można zweryfikować, przełączając się między fluorescencją epifluorescencyjną a optyką DIC w podczerwieni. Znacznik można wizualizować w trybie epifluorescencyjnym przy 594 nanometrach, co pozwala zbadać dendryty i ustalić, czy komórka zwojowa jest typu on, off czy bistratyfikowana. Neurobiotyna dodana do roztworu wewnątrzkomórkowego dyfundowała do wnętrza komórki zwojowej, w związku z czym kolejnym krokiem jest przygotowanie siatkówki do immunohistochemii.

Powoli wycofaj pipetę, aby zminimalizować uszkodzenia błony komórkowej. Należy pamiętać, że jeśli rejestruje się i wypełnia tylko jedną komórkę zwojową siatkówki na preparat, można następnie ustanowić konkretne korelacje między rejestrowaną komórką zwojową a jej szczegółową morfologią. Następnie umieść siatkówkę w roztworze Paraform aldehydu i utrwal przez noc w temperaturze four degrees Celsius po utrwaleniu przez noc.

Przepłucz utrwaloną siatkówkę w PBS, wymieniając roztwór PBS co najmniej sześć razy w ciągu dwóch lub więcej godzin. Po płukaniu przenieś siatkówkę na płytkę zawierającą roztwór blokujący, umieść płytkę na wytrząsarce i pozostaw na dwie godziny. W temperaturze pokojowej zastąp roztwór blokujący roztworem wykrywającym strep, umieść siatkówkę ponownie na wytrząsarce i inkubuj przez dwa dni w temperaturze 4 °C.

Po dwóch dniach opłucz siatkówkę w PBS, wykonując sześć płukań po 20 minut każde, aby przygotować ją do montażu. Umieść ją warstwą komórek zwojowych do góry na szkiełku podstawowym, używając medium Vector Shield. Przykryj medium montażowym szkiełkiem nakrywnym i uszczelnij lakierem do paznokci; tak przygotowaną siatkówkę z oznakowanymi komórkami zwojowymi można teraz badać pod mikroskopem konfokalnym.

Rycina ta przedstawia komórki zwojowe siatkówki wykazujące pozytywną ekspresję GFP, obrazowane po lewej stronie przy użyciu oświetlenia epifluorescencyjnego z powiększeniem 40-krotnym oraz po prawej stronie przy użyciu oświetlenia DIC. Jeśli siatkówka jest zdrowa, a sekcja przebiegła pomyślnie, poszczególne komórki zwojowe są widoczne w obrazowaniu DIC przy dużym powiększeniu. Siatkówki niezdrowe będą charakteryzować się dużymi, ziarnistymi jądrami i powinny zostać odrzucone.

Rysunek ten przedstawia typ odpowiedzi na światło charakterystyczny dla komórki zwojowej siatkówki typu M2 z warstwą wewnętrzną wrażliwą na światło. W zależności od rodzaju komórki zwojowej siatkówki znakowanej genetycznie w danej preparacji, właściwości odpowiedzi będą się różnić. Jeśli odpowiedź synaptyczna danej komórki zwojowej jest zachowana, komórka powinna reagować potencjałami czynnościowymi w momencie włączenia lub wyłączenia światła.

W przypadku wewnątrzpochodnie światłoczułej komórki zwojowej, przy trwałej depolaryzacji, niniejszy rysunek komórki zwojowej wypełnionej neurobiotyną przedstawia morfologię typowej, warstwującej się komórki M1 off, czyli wewnątrzpochodnie światłoczułej komórki zwojowej siatkówki. Po rejestracji z całej komórki immunohistochemia pozwala na korelację morfologii dendrytów z odpowiedzią elektrofizjologiczną komórki zwojowej siatkówki. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o natlenianiu otworu z siatkówką oraz szybkim perfuzyjnym przepływie przez tkankę w celu zachowania odpowiedzi synaptycznych.

Dziękujemy za obejrzenie tej demonstracji.