Name: Mikrodysekcja gruczołów produkujących jedwab pająka Black Widow (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:59:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Naucz się mikrodysekcji gruczołów produkujących jedwab u czarnej wdowy, aby badać biologię pająków i mechanizmy wytwarzania włókien. Ta metoda umożliwia izolację siedmiu gruczołów jedwabnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant NSF RUI MCB-0950372 zatytułowany Molecular Characterization of Black Widow Spider Silks.

1. Znieczulenie pająka i izolacja odwłoka
<ol>
	<li>Przenieś pająka ze szklanego słoika do kartonowego pudełka wyłożonego plastikiem (Rycina 1A). Zazwyczaj zbieramy pająki ze stosów drewna, garaży lub krzewów i trzymamy je w laboratorium w szklanych słoikach. Ponieważ pająk nie może wspiąć się po plastikowej wyściółce, stanowi to skuteczną metodę przeniesienia pająka ze szklanego słoika lub puszki po kawie do mniejszej probówki w celu znieczulenia. Podczas manipulowania pająkiem na tym etapie, ze względów bezpieczeństwa należy nosić dwie pary rękawiczek lateksowych lub rękawice ogrodowe.</li>
	<li>Gdy pająk znajduje się w pudełku wyłożonym plastikiem, podejdź do niego od tyłu i pozwól mu wślizgnąć się do plastikowej probówki hodowlanej. Po wejściu pająka do probówki natychmiast zamknij ją korkiem (Rycina 1B). Zalecamy użycie probówki o wymiarach około 101,6 mm x 31,75 mm (D x śr). Minimalizuje to ilość gazowego dwutlenku węgla potrzebną do etapu znieczulania.</li>
	<li>Znieczul pająka, wprowadzając gazowy dwutlenek węgla pod ciśnieniem 5-10 pounds per square inch przez 10 min (Rycina 1C). Taka ilość gazu uśpi pająka tylko na około 5 min, dlatego po znieczuleniu należy niezwłocznie przejść do kroków 1.4-1.5.</li>
	<li>Umieść znieczulonego pająka w małej szalce sekcyjnej i za pomocą pęsety ustaw go grzbietem do góry (czerwona klepsydra skierowana w dół).</li>
	<li>Odciśnij szypułkę (wąski łącznik między cefalotoraksem a odwłokiem), aby oddzielić odwłok od reszty ciała pająka (Rycina 1D). Przechowuj cefalotoraks w zamrażarce przez noc w szalce Petriego i wyrzuć go następnego dnia po zamrożeniu. Zachowaj ostrożność podczas przenoszenia cefalotoraksu, ponieważ na tym segmencie znajdują się kły pająka.</li>
	<li>Przymocuj odwłok do materiału Sylgard w małej szalce sekcyjnej za pomocą jednej szpilki entomologicznej. Wbij szpilkę w otwór powstały po odcięciu szypułki (Rycina 1E). Miejsce to można łatwo zidentyfikować jako punkt, z którego wypływa płyn po przecięciu szypułki. Upewnij się, że prząślnice (przeciwny koniec szypułki) są skierowane w dół (najbliżej Ciebie).</li>
</ol>
2. Usunięcie egzoszkieletu
<ol>
	<li>Wykonać pierwsze nacięcie przez egzoszkielet za pomocą mikronożyczek, zaczynając od otworu powstałego po odcięciu pedycelu. Ciąć bocznie, aż do osiągnięcia strony grzbietowej po obu stronach (Rysunek 1F). Używając pęsety, odsunąć przedni segment egzoszkieletu i w tym miejscu wbić drugą szpilkę. Po wbiciu drugiej szpilki obrócić kuwetę do sekcji w kierunku ogonowym (pod kątem 90°) względem początkowych nacięć bocznych i kontynuować cięcie, aż do osiągnięcia prządek (Rysunek 1G). Nacięcie to będzie prostopadłe lub pionowe w stosunku do początkowego cięcia bocznego. Podczas wykonywania pionowego nacięcia nie należy przeciąć prządek (znajdują się one tylnie względem kształtu klepsydry i mają okrągły wygląd). Nie wbicie drugiej szpilki spowoduje obracanie się odwłoka podczas wykonywania nacięć pionowych.</li>
	<li>Zanurzyć odwłok w roztworze buforu do sekcji (0.1 M NaCl, 0.015 M cytrynian sodu, 0.1% pirowęglanu diethylu).</li>
	<li>Odsunąć pozostałą część egzoszkieletu, zaczynając od początkowego nacięcia bocznego. Po zakończeniu tej czynności tkanka tłuszczowa powinna być wyraźnie widoczna (Rysunek 1H).</li>
</ol>
3. Izolacja gruczołów jedwabniczych
<ol>
	<li>Za pomocą pęsety rozpocząć delikatne oddzielanie warstwy tłuszczu (Rycina 1H). Tłuszcz będzie miał barwę od białej do żółtawej. Kontynuować czynność, aż większość tłuszczu zostanie usunięta, a gruczoły jedwabnicze staną się wyraźnie widoczne. Gruczoł rurkowaty (tubuliform) składa się z trzech par bardzo długich, cylindrycznych rurek, które są liczne w jamie brzusznej. Gruczoł główny ampullarny (major ampullate), występujący w parach, jest dużą, półksiężycowatą ampułką z długim, skręconym ogonem dystalnym i przewodem proksymalnym, który zwęża się w miarę zbliżania się do przządek pająka. Gruczoł poboczny ampullarny (minor ampullate) jest bardzo podobny morfologicznie do gruczołu głównego ampularnego, lecz jest znacznie mniejszy. Gruczoł biczowaty (flagelliform), również występujący w parach, jest okrągły i wieloklapowy z małym, cylindrycznym, zygzakowatym przewodem, który biegnie w dół w kierunku przządek. Gruczoł zbiorczy (aggregate), występujący w parach, jest bardzo dużym, wieloklapowym gruczołem z bardzo dużym przewodem wydzielniczym, który posiada duże, nieregularne klapy. Gruczoły pęcherzykowe (aciniform) występują w dużych liczbach i przypominają krótkie, małe wypustki przypominające palce. Gruczoł gruszkowaty (pyriform) jest najmniejszym gruczołem w odwłoku i posiada wiele zbitych, cylindrycznych przewodów przypominających wachlarz z wieloma małymi przewodami wydzielniczymi, które biegną w dół do przządek.</li>
	<li>Zalecamy usuwanie gruczołów w następującej kolejności: rurkowatych, głównych ampularnych, biczowatych, pobocznych ampularnych, zbiorczych, pęcherzykowych, a na końcu gruszkowatych (Rycina 2A-B).</li>
	<li>Zaczynając od gruczołów rurkowatych, delikatnie oddzielić je od pozostałych gruczołów – powinny one znajdować się na wierzchu innych gruczołów (Rycina 2A). U jednego pająka znajduje się trzy pary gruczołów rurkowatych. Pozostawić je w stanie swobodnego unoszenia, ale tak, aby pozostały przytwierdzone do przządek za pomocą przewodów.</li>
	<li>Następnie oddzielić gruczoły główne ampularne. U jednego pająka znajdują się dwa gruczoły główne ampularne. Podczas procedury usuwania należy upewnić się, że przewody pozostają przytwierdzone do gruczołów (Rycina 2A).</li>
	<li>Kontynuować oddzielanie pozostałych gruczołów od siebie, pracując ostrożnie, aby uniknąć przebicia któregokolwiek z gruczołów, zwłaszcza gruczołów zbiorczych i biczowatych. Każdy gruczoł powinien swobodnie unosić się aż do punktu wyjścia w egzoszkielecie prowadzącego do przządek. Gruczoły te również występują w parach. Usunąć każdy gruczoł, ściskając przewód pęsetą i ostrożnie pociągając, aż oddzieli się on od punktu wyjścia. Gruczoły główne ampularne, biczowate, poboczne ampularne i zbiorcze występują w parach. Gruczoły pęcherzykowe i gruszkowate występują w znacznie większej liczbie par.</li>
	<li>Usunąć każdy gruczoł, ściskając przewód pęsetą i ostrożnie pociągając, aż oddzieli się on od punktu wyjścia przy przządce. Zazwyczaj przechowujemy gruczoły w stanie wilgotnym, jednak nie dodajemy dodatkowego buforu.</li>
	<li>W miarę usuwania gruczołów umieszczać je w sterylnych, wcześniej oznakowanych probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 ml. Pojedyncze gruczoły przedstawiono na Rycinie 3A-G. Przechowywać gruczoły na lodzie, a następnie szybko zamrozić je w ciekłym azocie. Po szybkim mrożeniu w ciekłym azocie umieścić je w temperaturze -80°C do przechowywania.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Podczas usuwania poszczególnych gruczołów należy zachować szczególną ostrożność w obchodzeniu się z gruczołami flagelliform i aggregate, ponieważ dwie te struktury mogą zostać łatwo przebite i uszkodzone pęsetą. Ponadto warto zauważyć, że pod względem morfologicznym gruczoły flagelliform i aggregate wyglądają bardzo podobnie przed ich usunięciem i często są ze sobą splecione. Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu tych tkanek podczas usuwania, preparator powinien ostrożnie je od siebie oddzielić. Dodatkowo, po wstępnym odsłonięciu gruczołów produkujących jedwab, najtrudniej będzie natychmiast zlokalizować gruczoły aciniform i pyriform ze względu na ich mniejszy rozmiar i położenie anatomiczne. Często obecna jest duża liczba jaj. Co więcej, dodatkową ostrożność należy zachować przy usuwaniu gruczołu pyriform, ponieważ tkanka ta jest niezwykle lepka i często przykleja się do pęsety. Jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo, możliwe jest uzyskanie wszystkich siedmiu gruczołów produkujących jedwab od jednego pająka w sposób wysokiego stopnia oczyszczenia. Zazwyczaj z sekcji jednego pająka można odzyskać mikrogramowe ilości całkowitego RNA i białka. Przedstawiono przykład wykorzystania całkowitego RNA do qPCR w celu zbadania poziomów mRNA genu fibroiny ograniczonego do gruczołów tubuliform, TuSp1 (Rycina 4). Przedstawiono również reprezentatywne eksperymenty z wykorzystaniem lizatów białkowych pobranych z gruczołów, np. trawienie trypsyną w roztworze z następującą po nim analizą MS (może być również stosowane do analizy MS/MS) lub analizę składu aminokwasowego (odpowiednio Rycina 5-6).
<img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="Proces odłowytu i badania pająka; schemat sekwencji przedstawiający etapy izolacji i obserwacji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1a"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="Eksperyment neurochirurgiczny na chrząszczu, przedstawiający etapy sekcji w badaniu naukowym." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1e"> Rycina 1. Obsługa, znieczulanie i usuwanie egzoszkieletu z odwłoka samicy czarnej wdowy. A) Przenoszenie pająka do kartonowego pudełka wyłożonego folią plastikową w celu ułatwienia przesunięcia pająka do mniejszej plastikowej fiolki. B) Pająk umieszczony w plastikowej fiolce z korkiem. C) Znieczulanie pająka gazowym dwutlenkiem węgla. D) Oddzielenie cephalothorax od odwłoka za pomocą mikronozyczek. E) Unieruchomienie odwłoka w kuwecie sekcyjnej za pomocą szpilek entomologicznych. F) Widok po wykonaniu bocznego nacięcia nożyczkami i odchyleniu części egzoszkieletu pęsetą. G) Wykonywanie nacięć prostopadle do początkowego cięcia bocznego. H) Usunięcie egzoszkieletu i odsłonięcie warstwy tłuszczowej.
<img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="Anatomia gruczołów jedwabnych pająka, schemat; klasyfikacja: tubuliform, aciniform, pyriform, badanie biologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Wizualizacja siedmiu różnych gruczołów produkujących jedwab w nienaruszonym stanie w odwłoku pająka oraz otaczających je tkanek. A) Obrazy tkanek tubuliform, głównych ampullate, flagelliform i aggregate przy powiększeniu 12X. B) Obraz gruczołów aciniform i pyriform przy powiększeniu 12X.
<img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="Równowaga statyczna obrazów helmintów A-D; porównanie struktury organizmów, analiza mikroskopowa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3a"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="Obrazy mikroskopowe organizmów morskich; E-H. Badanie mikroskopowe form życia morskiego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3e"> Rysunek 3. Fotografie siedmiu gruczołów produkujących jedwab po ich usunięciu z odwłoka. Wszystkie obrazy zostały wykonane przy powiększeniu 20X z wyjątkiem gruczołów aciniform i pyriform, które wykonano przy powiększeniu 40X. A) gruczoł ampullate główny; B) gruczoły ampullate główny i poboczny (prawa strona) w celu porównania wielkości; C) tubuliform; D) flagelliform; E) aggregate; F) aciniform; G) pyriform.
<img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="Wykres słupkowy średniej znormalizowanej ekspresji mRNA TuSp1; analiza danych poziomów ekspresji genu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4. Reprezentatywne wyniki wzorca ekspresji genu jedwabiu, TuSp1, po zbadaniu poziomów mRNA TuSp1 w różnych gruczołach produkujących jedwab (z wyłączeniem gruczołu gruszkowatego) przy użyciu ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) po izolacji całkowitego RNA z gruczołów.
<img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="Wykres spektrometrii mas; intensywność w funkcji stosunku masy do ładunku, szczegółowo przedstawiający piki białek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> Rycina 5. Przykład analizy MS ekstraktów białkowych otrzymanych z gruczołu gruszkowatego po trawieniu trypsyną w roztworze. Uwaga: x2 oznacza 2-krotne powiększenie intensywności widma. Masy jonów peptydowych widma odpowiadające regionom fibroiny PySp1 są oznaczone symbolem #.
<img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="Skład aminokwasowy gruczołu rurkowatego; wykres słupkowy aminokwasów; wyniki analizy białek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> Rysunek 6. Typowy wynik profilu składu aminokwasowego białek wyekstrahowanych z gruczołu rurkowatego. Uwaga: ASX = Asp i Asn; GLX = Glu i Gln. Kolor niebieski oznacza aminokwasy z polarnymi grupami łańcucha bocznego, natomiast kolor czerwony reprezentuje reszty aminokwasowe z niepolarnymi grupami łańcucha bocznego.

<ol><li>Vollrath, F., Knight, D. P. Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).</li>
<li>Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).</li>
<li>Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. Endeavour. 10, 31-31 (1986).</li>
<li>Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).</li>
<li>Lewis, R. V., Xu, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).</li>
<li>Colgin, M. A., Lewis, R. V. Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).</li>
<li>Tian, M., Lewis, R. V. Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).</li>
<li>Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. Biochemistry. 44 (30), 10020-10020 (2005).</li>
<li>Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).</li>
<li>Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).</li>
<li>Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Nasza metodologia mikrodysekcji gruczołów jedwabniczych u wdowy czarnej stanowi efektywny sposób na uzyskanie wysoko oczyszczonych gruczołów jedwabniczych. Dysekcje mogą zostać przeprowadzone w czasie od 1,5 do 3 h, co pozwala na uzyskanie pełnego zestawu siedmiu różnych gruczołów jedwabniczych u pająków z rodziny Theridiidae. Pozyskanie wysoko oczyszczonych próbek gruczołów jedwabniczych umożliwia badaczom przeprowadzenie szerokiego zakresu badań biochemicznych, w tym identyfikację nowych białek jedwabiu lub białek opie...

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0420-1</td><td>0.1 M w wodzie</td></tr><tr><td>Pirowęglan dietylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758 - 5 ml</td><td>0.1% v/v</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804 - 1 kg</td><td>0.015 M w wodzie</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica MZ16</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa kamera do mikroskopu</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC320</td><td>Oprogramowanie - Leica Application Suite v2.8.1</td></tr><tr><td>Nożyczki Vannasa</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta ze stali nierdzewnej</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501764</td><td>Mini Dumont #M5S</td></tr><tr><td>Szpilki entomologiczne</td><td>Indigo Instruments</td><td>33414-2</td><td>Szpilki entomologiczne #2</td></tr><tr><td>Małe lub duże szalki do sekcji</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DD-50-S lub DD-90-S</td><td>Średnica 52 mm x wys. 18 mm (głębokość Sylgard ~6mm) lub 93 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>Fiolki do hodowli &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;</td><td>Carolina Biological</td><td>FR-17-3076</td><td>Rozmiar: średnica 31.75 mm x 101.6 mm</td></tr></tbody></table>

mikrodysekcja gruczołów produkujących jedwab u pająka wdowie czarne

Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Współczesne pająki przędą wysokowydajne włókna jedwabiu o szerokim zakresie funkcji biologicznych, w tym służące do poruszania się, chwytania ofiar oraz ochrony rozwijającego się potomstwa 1,2. Pająki realizują te zadania poprzez przędzenie kilku odrębnych typów włókien o zróżnicowanych właściwościach mechanicznych. Taka specjalizacja typów włókien wynika z ewolucji różnych gruczołów jedwabnych, które funkcjonują jako niewielkie biofabryki. Biofabryki te wytwarzają i magazynują duże ilości białek jedwabiu niezbędnych do produkcji włókien. Poprzez złożoną serię zdarzeń biochemicznych białka jedwabiu te są przekształcane z postaci ciekłej w materiał stały podczas ekstruzji.
Badania mechaniczne wykazały, że pajęcza sieć jest wytrzymalsza niż stal wysokowytrzymała 3. Analizy mające na celu zrozumienie zależności między strukturą a funkcją nici pajęczej ujawniły, że składa się ona głównie z białek, czyli fibroin, które posiadają powtórzenia blokowe w swoich sekwencjach białkowych 4. Wspólne sygnatury molekularne, które przyczyniają się do niesamowitej wytrzymałości na rozciąganie i rozciągliwości pajęczej sieci, są odkrywane poprzez analizy przetłumaczonych cDNA jedwabiu. Biorąc pod uwagę niezwykłe właściwości materiałowe pajęczej sieci, laboratoria badawcze na całym świecie ścigają się, aby zrozumieć i naśladować proces przędzenia w celu produkcji syntetycznych włókien jedwabnych do zastosowań komercyjnych, wojskowych i przemysłowych. Jednym z głównych wyzwań w przędzeniu sztucznego jedwabiu pajęczego w laboratorium badawczym jest pełne zrozumienie procesów biochemicznych zachodzących podczas ekstruzji włókien z gruczołów produkujących jedwab.
Przedstawiamy tutaj metodę izolacji siedmiu różnych gruczołów produkujących jedwab u pająka wdowy czarnej, obejmującą gruczoły ampulary główne i pomocnicze [produkują jedwab linii ciągu i rusztowania] 5,6, tubulary [syntetyzują jedwab kokonu jaj] 7,8, flagelary [funkcja nieznana u pająków sieciowych], agregatowe [produkują jedwab klejący], aciniformy [syntetyzują nici do owijania ofiar i kokonu jaj] 9 oraz piriformy [produkują jedwab dysków mocujących] 10. Podejście to opiera się na znieczuleniu pająka dwutlenkiem węgla, następującym oddzieleniu cephalothorax od odwłoka oraz mikrodysekcji odwłoka w celu uzyskania gruczołów produkujących jedwab. Po wyizolowaniu poszczególnych gruczołów produkujących jedwab, tkanki te mogą zostać wykorzystane do pozyskania różnych makrocząsteczek do odrębnych analiz biochemicznych, w tym ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, northern- i western blottingu, analiz spektrometrii mas (MS lub MS/MS) w celu identyfikacji nowych sekwencji białek jedwabiu, poszukiwania białek uczestniczących w szlaku montażu jedwabiu lub wykorzystania nienaruszonej tkanki do hodowli komórkowych bądź eksperymentów histologicznych.

W niniejszym materiale opisujemy wydajną strategię usuwania gruczołów jedwabniczych z odwłoka samic czarnej wdowy. Procedura ta umożliwia szybką izolację siedmiu odrębnych gruczołów jedwabniczych w sposób wysoce oczyszczony, co stanowi istotny proces dla badaczy zajmujących się produkcją jedwabiu pająków oraz montażem włókien.

Mikrodysekcja gruczołów produkujących jedwab u pająka wdowie czarne

Współczesne pająki przędą wysokowydajne włókna jedwabne o szerokim zakresie funkcji biologicznych, w tym służące do poruszania się, chwytania ofiar oraz ochrony...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie siedmiu różnych gruczołów jedwabników z odwłoka pająka oraz wykorzystanie tych tkanek w badaniach molekularnych i biochemicznych. Cel ten osiąga się najpierw poprzez znieczulenie pająka. Drugim krokiem procedury jest oddzielenie głowy, tułowia i odwłoka, a następnie przytwierdzenie odwłoka do małej korytka sekcyjnego za pomocą szpilek entomologicznych.Trzecim krokiem procedury jest wykonanie nacięć w egzoszkielecie w celu odsłonięcia gruczołów produkujących jedwab. Ostatnim krokiem procedury jest usunięcie poszczególnych gruczołów produkujących jedwab. W rezultacie, dzięki zastosowaniu metod molekularnych i biochemicznych, takich jak odpowiednio ilościowy PCR w czasie rzeczywistym lub spektrometria mas, można uzyskać wyniki wykazujące, że różne gruczoły produkujące jedwab wykazują ekspresję odrębnych mRNA lub białek jedwabiu.Ta metoda dostarczy istotnych informacji dla badań nad biologią pająków, ujawniając białka magazynowane w gruczołach jedwabniczych. Białka te znajdują zastosowanie w medycynie i wojskowości, a także w wielu obszarach komercyjnych i przemysłowych. Pomysł przeprowadzenia tego konkretnego badania pojawił się, gdy zaistniała potrzeba pogłębienia wiedzy na temat białek gromadzonych w gruczołach jedwabniczych.Główną zaletą tej techniki jest fakt, że samice czarnych wdów posiadają bardzo duże odwłoki, co znacznie ułatwia wyizolowanie gruczołów jedwabniczych. Osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ gruczoły te często pękają podczas sekcji. Istnieją również pewne struktury anatomiczne, które są trudne do wyizolowania.Demonstracja wizualna jest kluczowa dla prawidłowego przeprowadzenia sekcji. Procedurę zaprezentują Kobe LaMattina, Tiffany Tootin, Blasingame oraz Y Shaw. Przed rozpoczęciem sekcji należy przygotować 500 milliliters buforu do sekcji składającego się z 0,1 molar sodium chloride, 0,015 molar sodium citrate oraz 0,1% ethyl bicarbonate.Następnie należy przygotować kartonowe pudełko z plastikową wyściółką, aby utrzymać pająka wewnątrz i zapobiec jego ucieczce. Pająki wdowie zazwyczaj pozyskujemy ze stosów drewna, szop lub garaży, a w laboratorium przechowujemy je w szklanych słoikach. Po pozyskaniu pająka należy przenieść go ze szklanego słoika do pudełka, zachowując ostrożność podczas manipulacji zwierzęciem.Dla bezpieczeństwa należy założyć dwie pary rękawiczek lateksowych lub ogrodowych. Następnie, używając małej plastikowej probówki hodowlanej, należy zbliżyć się do pająka od tyłu, wsunąć go do probówki i natychmiast ją zamknąć. Do probówki należy wprowadzić gazowy dwutlenek węgla pod ciśnieniem od 5 do 10 PSI przez 10 minut, aby znieczulić pająka; wstępną sekcję odwłoka od głowotułowia należy przeprowadzić w ciągu pięciu minut, póki pająk pozostaje pod wpływem znieczulenia.Umieść znieczulonego pająka w małej kuwecie sekcyjnej. Odetnij pedułkę, czyli wąski szypułkę łączącą cefalotoraks z odwłokiem, aby oddzielić odwłok. Cefalotoraks zawiera kłykcie pająka i wymaga odpowiedniej utylizacji.Ostrożnie przenieś głowotułów do szalki Petriego i zamroź ich zawartość przez noc. Przed wyrzuceniem zlokalizuj w odwłoku pająka otwór powstały w wyniku przycinania komórki pedes, identyfikując miejsce wypływu płynu z odwłoka. Używając pojedynczej szpilki sekcyjnej, wprowadź ją przez otwór do wnętrza odwłoka, aby przymocować odwłok do tacki sekcyjnej, orientując pająka tak, aby podstawa znajdowała się jak najdalej od osoby wykonującej sekcję, a przód pająka był najbliżej niej.Używając mikronozyczek, rozpocznij od otworu po wycięciu komórki pedes i przecinaj lateralnie po każdej stronie przez egzoszkielet, aż do osiągnięcia strony grzbietowej. Używając pęsety, odchyl przedni segment egzoszkieletu i w tym miejscu wbij drugą szpilkę. Następnie obróć kasetkę sekcyjną o kąt 90 stopni względem początkowych cięć bocznych.Kontynuuj cięcie, aż dotrzesz do spints. Nacięcie powinno być prostopadłe lub pionowe w stosunku do początkowego cięcia bocznego. Spints znajdują się poniżej klepsydry i mają okrągły wygląd.Podczas wykonywania cięcia pionowego należy uważać, aby nie przeciąć przylitywek. Zanurzyć brzuch w roztworze buforu sekcyjnego. Odchylić pozostałą część egzoszkieletu, zaczynając od początkowego cięcia bocznego.Po zakończeniu tego etapu tkanka tłuszczowa o barwie od białej do żółtawej powinna być wyraźnie widoczna przy użyciu pęsety. Należy rozpocząć oddzielanie warstwy tłuszczu, aż do usunięcia większości tkanki tłuszczowej i pełnego odsłonięcia gruczołów jedwabnych. W przypadku obecności jaj powinny one zostać usunięte.W tym momencie należy przeprowadzić sekcję gruczołów w następującej kolejności: o formie rurkowej, główne o formie flagelarnej, zbiorcze mniejsze o formie asyfilnej, a następnie gruszkowate. Każdy gruczoł zostanie opisany zgodnie z kolejnością sekcji.Gruczoły rurkowate znajdują się nad wszystkimi pozostałymi gruczołami i posiadają trzy pary bardzo długich rurek cylindrycznych, które są liczne w jamie brzusznej. Ostrożnie oddziel te gruczoły od pozostałych. Pozostaw je w stanie swobodnego pływania, tak aby pozostały połączone z czerwonymi prz prząśnicami za pomocą swoich przewodów.Następnie oddziel dwie główne gruczoły ampulne, które występują również u grzebaczy. Gruczoły te są duże, mają kształt półksiężyca, z długimi, skręconymi końcami dystalnymi i zwężającymi się końcami proksymalnymi. Po dotarciu do przędzalników pająka, usuń główne gruczoły ampulne i umieść je w sterylnych probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 milliliter.Po wyjęciu żużki należy umieścić je w lodzie. Następnie należy usunąć gruczoły flagelarne. Gruczoły flagelarne są również obecne u gruszek.Jest to struktura wielopłatowa z niewielkim, cylindrycznym, zygzakowatym przewodem, który rozciąga się w dół w kierunku spints; po ich usunięciu należy umieścić je na lodzie. Następnie stwierdza się, że mniejszy alet jest bardzo podobny morfologicznie do aletu głównego, lecz znacznie mniejszy. Gruczoł zbiorczy, występujący w parach, jest duży i wielopłatowy i posiada bardzo duży przewód wydzielniczy z dużymi, nieregularnymi płatami.Gruczoły sinoformowe występują w dużym liczbie i przypominają krótkie, małe, palczaste wypustki. Gruczoł piriform jest najmniejszym gruczołem w jamie brzusznej i posiada wiele zagęszczonych cew cylindrycznych przypominających wachlarz, z wieloma małymi przewodami wydzielniczymi rozciągającymi się w dół do spintów. Gdy gruczoł tubularny pozostanie jako jedyny swobodnie zawieszony, należy go usunąć, chwytając przewód pęsetą i ostrożnie pociągając, aż oddzieli się od punktu wyjścia przy spincie. Po sekcji wszystkie wypreparowane gruczoły należy gwałtownie zamrozić, umieszczając probówkę w ciekłym azocie aż do zamrożenia, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.Alternatywnie gruczoły można zamrozić natychmiast po ich oddzielnym usunięciu podczas procedury sekcji. Rysunek ten przedstawia wyznaczenie poziomów mRNA genu jedwabiu TUSP one w różnych gruczołach produkujących jedwab, z wyłączeniem gruczołu piriform, za pomocą analizy ilościowej PCR w czasie rzeczywistym po wyizolowaniu całkowitego RNA z gruczołów. Gruczoły tubularne zawierają największą ilość mRNA TUSP one.Rysunek ten przedstawia typowy wynik profilu składu aminokwasowego białek wyekstrahowanych z gruczołu rurkowatego. Kolor niebieski odzwierciedla aminokwasy z polarnymi grupami łańcucha bocznego, natomiast kolor czerwony reprezentuje reszty aminokwasowe z niepolarnymi grupami łańcucha bocznego. Rysunek ten prezentuje analizę spektrometrią masową ekstraktów białkowych otrzymanych z gruczołu gruszkowatego po tryptyku rozpuszczania.Trawienie tutaj razy dwa oznacza dwukrotne zwiększenie intensywności widma. Masy jonów peptydowych widma oznaczone symbolem funta wskazują na peptydy pochodzące z fibroiny jedwabnej PYSP 1 po jej opracowaniu. Technika ta otworzyła drogę badaczom w środowisku biologii namaczania.Metodę tę wykorzystano do zbadania procesów chemicznych i molekularnych biorących udział w produkcji włókien nasiąkałych, montażu włókien jedwabnych oraz ich ekstruzji. Jeśli technika ta zostanie przeprowadzona prawidłowo, można ją zrealizować w czasie od półtorej do trzech godzin. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest noszenie dwóch par rękawiczek aż do momentu usunięcia kłów pająka.Po zakończeniu tej metody gruczoły produkujące jedwab mogą zostać wykorzystane do ekstrakcji RNA i białek. Materiały te można wykorzystać w dalszych analizach, takich jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, a także spektrometria mas. Informacje, które można zebrać w ramach tych badań, pomogą nam lepiej zrozumieć proces składania jedwabiu oraz ścieżkę jego ekstruzji.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować siedem różnych gruczołów produkujących jedwab u samicy pająka wdowiej czarnej.

microdissection-of-black-widow-spider-silk-producing-glands

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikrodysekcja gruczołów produkujących jedwab przez Czarną Wdowę

Pomimo wyjątkowych właściwości mechanicznych i biochemicznych jedwabiu pająków, materiał ten nie może być pozyskiwany w dużych ilościach metodami konwencjonalnymi. W niniejszej pracy opisujemy efektywną strategię przędzenia sztucznych włókien jedwabiu pająka, co stanowi istotny proces dla badaczy analizujących produkcję jedwabiu pająków oraz jego zastosowanie jako biomateriałów nowej generacji.

Produkcja syntetycznego jedwabiu pajęczego w skali laboratoryjnej

Mikroskopia przyżyciowe to potężne narzędzie, które umożliwia obrazowanie różnych procesów biologicznych u żywych zwierząt. W tym artykule przedstawiamy szczegółową metodę obrazowania dynamiki struktur subkomórkowych, takich jak ziarnistości wydzielnicze, w gruczołach ślinowych żywych myszy.

Mikroskopia przyżyteczna do obrazowania struktur subkomórkowych u żywych myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych

Gruczoły roślinne to wyspecjalizowane struktury odpowiedzialne za biosyntezę i wydzielanie wielu związków biorących udział w interakcjach ze środowiskiem biotycznym. Aby umożliwić badania nad ich cechami molekularnymi i biochemicznymi, opracowano technikę mechanicznego mikroprzygotowania w celu wyizolowania pojedynczych gruczołów aktywnych metabolicznie, w tym przypadku z mięsożernej rośliny Nepenthes.

Izolacja żywotnych gruczołów wielokomórkowych z tkanki rośliny mięsożernej, Dzbanecznik

Ten artykuł zawiera protokół ekstrakcji jadu z pająków za pomocą stymulacji elektrycznej w celu: 1) przeprowadzenia charakterystyki proteomicznej, 2) stymulowania ekspresji genów gruczołów jadowych oraz 3) przeprowadzenia badań funkcjonalnych jadów. Następnie opisano mikrodysekcje gruczołów jadowych do badań ekspresji genów.

Ekstrakcja jadu i mikrodysekcji gruczołów jadowych od pająków do analiz proteomicznych i transkryptomicznych

Przedstawiono protokół mikroprzepływowego przędzenia i charakterystyki mikrostruktury regenerowanego jedwabnego włókna fibroinowego.

Mikroprzepływowe przędzenie na sucho i charakterystyka regenerowanych włókien fibroiny jedwabiu

Tutaj prezentujemy protokół izolacji całych, nienaruszonych gruczołów sutkowych myszy w celu zbadania ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i morfologii przewodowej. Gruczoły brzuszne myszy #4 wyekstrahowano od 8-10 tygodniowych samic myszy nieródek, utrwalono w neutralnej buforowanej formalinie, pocięto i wybarwiono przy użyciu immunohistochemii białek ECM.

Izolacja nienaruszonych, całych gruczołów sutkowych myszy w celu analizy ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii gruczołów

Chociaż wiele owadów z podrzędu Heteroptera (Insecta: Hemiptera) jest jadowitych, ich skład jadu i funkcje toksyn jadowych są w większości nieznane. Protokół ten opisuje metody zbierania jadów heteropterów w celu dalszej charakterystyki, przy użyciu elektrostymulacji, nękania i sekcji gruczołów.

Zbieranie toksyn jadowych z robaków zabójców i innych owadów heteroptera

Wielkość acinus gruczołów gardłowych jest miarą odżywiania pszczół miodnych pielęgniarek. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół preparowania, barwienia, obrazowania i pomiaru gruczołów dolnych pszczół pielęgniarek.

Pomiar wielkości gruczołu podgardłowego acinus u pracowników pszczół miodnych (Apis mellifera)

Tutaj prezentujemy protokół produkcji rozpuszczalnych w wodzie rekombinowanych roztworów białek pajęczej nici oraz form materialnych, które mogą być formowane z tych roztworów.

Tworzenie materiału rekombinowanych nici pajęczych poprzez solwatację wodną przy użyciu ciepła i ciśnienia

Dorosły gruczoł ślinowy komara (SG) jest niezbędny do przenoszenia wszystkich patogenów przenoszonych przez komary na ich ludzkich gospodarzy, w tym wirusów i pasożytów. Film ten pokazuje skuteczną izolację SG od stadium larwalnego (L4) komarów Anopheles gambiae i przygotowanie SG L4 do dalszej analizy.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne larw ślinowych komarów z rodzaju Anopheles gambiae

Naucz się mikrodysekcji gruczołów produkujących jedwab u czarnej wdowy, aby badać biologię pająków i mechanizmy wytwarzania włókien. Ta metoda umożliwia izolację siedmiu gruczołów jedwabnych.

Mikrodysekcja gruczołów produkujących jedwab u pająka wdowie czarne

Przeglądaj więcej filmów