Analiza kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków za pomocą mikroiniekcji

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków. Osiąga się to poprzez mikroiniekcję mRNA lub DNA do jąder komórek hodowli tkankowej ssaków. Po mikroiniekcji próbki są utrwalane po różnych okresach inkubacji.

Następnie mRNA poddaje się barwieniu metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Ostatnim krokiem procedury jest obrazowanie komórek i ilościowe oznaczenie fluorescencji w cytoplazmie oraz jądrze. W rezultacie możliwe jest zmierzenie szybkości eksportu mRNA poprzez połączenie mikroiniekcji i mikroskopii fluorescencyjnej.

Witam, jestem SRG AV z laboratorium Alexa Palazzo w Katedrze Biochemii na Uniwersytecie w Toronto. Jestem Stefan Toski, również z laboratorium Palazzo. Jestem Amy z laboratorium Palazzo, a ja jestem Khi Maha David z laboratorium Palazzo.

Dzisiaj przedstawimy procedurę wprowadzania mRNA do jąder komórek hodowli tkankowych ssaków za pomocą mikroiniekcji. Zaprezentujemy również sposób barwienia mRNA metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Procedur tych używamy w naszym laboratorium do badania kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków.

Zacznijmy zatem. Przed mikroiniekcją należy przygotować wcześniej wyizolowany plazmidowy DNA w stężeniu od 50 do 200 µg/mL w buforze do iniekcji. Następnie do mieszaniny należy dodać Oregon Green 488 (OG) sprzężony z dekstranem 70 kDa, aby umożliwić identyfikację zainiekowanych komórek.

Dextran sprzężony z OG pomoże określić, jaka ilość płynu została wstrzyknięta do jądra, a jaka wyciekła do cytoplazmy. Próbki wiruj przy 13 000 G i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 20 minut, aby zgranulować wszelkie cząsteczki stałe, które mogłyby potencjalnie zablokować końcówkę igły. Wybierz linię komórek ssaczych do mikroiniekcji na podstawie kryteriów opisanych w protokole pisemnym.

Do tej demonstracyjnej próbki wykorzystano siedem komórek. Komórki znajdują się na przemytych kwasem szkiełkach nakrywkowych w 30 milimetrowych szalkach Petriego, przygotowanych co najmniej 24 godziny przed mikroiniekcją. Idealnie, w momencie iniekcji monowarstwa komórkowa powinna osiągać konfluencję na poziomie około 70 do 90%, aby umożliwić łatwą identyfikację zainiekowanych komórek; przed iniekcją w monowarszwie komórkowej wykonuje się nacięcie za pomocą plastikowej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Wytraw nacięcie w kształcie krzyża na szkiełku nakrywce i pozostaw komórki do regeneracji w inkubatorze do hodowli tkanek na co najmniej 15 minut przed iniekcją. Do mikroiniekcji należy użyć mikroskopu odwróconego, który jest odizolowany na stole pneumatycznym, aby zminimalizować wibracje mogące zakłócić proces mikroiniekcji. Za pomocą końcówki do nakładania żelu einor usuń około 1 µL z górnej części próbki w wirówce, aby uniknąć rozbicia osadu.

Wprowadź końcówkę pipety do tylnej części gotowej igły do mikroiniekcji i wydrukuj ciecz. Ciecz zostanie wciągnięta do czubka igły dzięki działaniu kapilarnemu. W ciągu od 5 do 30 sekund w pobliżu czubka powinien pojawić się widoczny menisk.

Wprowadź wypełnioną cieczą igłę do uchwytu i przymocuj go do mikromanipulatora. Pod kątem 45 stopni zlokalizuj igłę, korzystając z obiektywu 10x, a następnie ustaw ją w centrum pola widzenia w pobliżu płaszczyzny ogniskowania. Za pomocą grubych pokręteł mikromanipulatora ustaw odpowiednią pozycję; uchwyt jest połączony rurką ze szklaną strzykawką, która służy do wytworzenia ciśnienia niezbędnego do wypchnięcia cieczy z końcówki igły.

Aby utrzymać stałe ciśnienie, strzykawka jest zamocowana do zacisku rurkowego. Używając dwóch gumowych korków i dwóch metalowych zacisków, podnieś igłę o kilka milimetrów, aby zapobiec jej uszkodzeniu w kolejnych krokach, a następnie odsuń mikroskop. Zwiększ ciśnienie, naciskając tłok strzykawki.

Od 0,5 do dwóch centymetrów sześciennych. Umieść szalkę Petriego zawierającą szkiełko nakrywkowe z uszkodzoną warstwą monowarstwy. Na stole obserwacyjnym odsuń mikroskop.

Przesuń filar do pozycji pionowej, tak aby kondensator został wyrównany, a igła mogła wniknąć do cieczy. Należy to zrobić ostrożnie, aby zapobiec złamaniu igły o szkiełko nakrywkę. Używając obiektywu 10 x, zidentyfikuj środek przekroju i ustaw igłę nad komórkami, które mają zostać wstrzyknięte.

Zwiększ powiększenie, przełączając obiektyw na 40 x. Następnie obniż i wycentruj igłę, korzystając z pokręteł mikrometrycznych w dżojstiku. Rozpocznij wstrzykiwanie w jednym z narożników krzyża rany, obniżając igłę tak, aby dotknęła jądra.

Po wstrzyknięciu w komórce następuje wyraźna zmiana jasności w kontraście fazowym. Kontynuuj wzdłuż jednej krawędzi krzyża rany. Aby umożliwić łatwą identyfikację wstrzykniętych komórek podczas wizualizacji, kluczowe jest odpowiednie dostosowanie ciśnienia wtryskiwania dla każdej igły.

Ciśnienie musi być wystarczająco wysokie, aby przebić błony plazmatyczną i jądrową, ale nie na tyle wysokie, by zabić komórki. Wykonaj mikrowstrzyknięcia do komórek wzdłuż krawędzi rany przez określony czas. Dzięki praktyce w tym przedziale czasowym można wstrzyknąć do kilkuset komórek.

W przypadku iniekcji plazmidowego DNA, przed utrwaleniem inkubować komórki poddane mikroiniekcji w temperaturze 37°C w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 20 minut, a następnie przerwać transkrypcję poprzez potraktowanie komórek 1 µg/mL α-amantadyny rozpuszczonej w pożywce wzrostowej. Stężenie to skutecznie hamuje transkrypcję z mikroiniekcyjnych plazmidów.

Umieść komórki z powrotem w inkubatorze i pozwól im na eksport nowo zsyntetyzowanego mRNA. Pojedyncza igła może być użyta ponownie do mikroiniekcji do wielu szkiełek nakrywkowych. Igłę należy jednak wymienić, gdy zmieni się rodzaj mikroinjektowanego DNA lub RNA.

Ponadto, po wyjęciu igły z uchwytu, należy ją zutylizować, aby uzyskać dokładny pomiar kinetyki eksportu jądrowego mRNA. Oddzielne próbki należy utrwalić w czasie zero minut, 15 minut, 30 minut, 60 minut oraz 120 minut. Po odpowiednim czasie inkubacji z alpha manin, należy odessać pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przemyć komórki dwiema mililitrami roztworu PBS.

Ważne jest, aby utrzymać szkiełka nakrywkowe w stanie wilgotnym, minimalizując czas, w którym nie są one zanurzone w cieczy. Utrwalone komórki poprzez dodanie 2 mL 4% aldehydu w PBS; inkubuj komórki przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej. Po dwukrotnym ponownym przemyciu utrwalonych próbek, przeprowadź permeabilizację komórek za pomocą 2 mL 0,1% Triton X 100 w PBS, ponownie inkubując komórki przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej.

Na koniec przemyj próbki dodatkowo dwa razy, aby przygotować je do hybrydyzacji. Przemyj komórki dwukrotnie buforem płuczącym składającym się z roztworu 1XSSC zawierającego od 25 do 60% formamidu. Następnie przygotuj komorę barwienia do hybrydyzacji, pokrywając dno 150 milimetrowej szalki Petriego wodą i kładąc na jej powierzchni kawałek parafilmy.

Usunąć wodę, odwracając szalkę, aby paraform przylgnął do jej dna. Ręcznie usunąć pęcherzyki powietrza z każdego szkiełka nakrywkowe przeznaczonego do barwienia. Nanieść pipetą krople 100 µl roztworu hybrydyzacyjnego na paraform.

Należy pamiętać, że ilość formage powinna zostać zoptymalizowana dla konkretnego używanego białka rybiego przy pomocy pęsety. Należy zdjąć szkiełko nakrywkowe z utrwalonymi komórkami z 30 milimetrowej szalki Petriego. Używając papieru filtracyjnego Watman, należy osuszyć tylną stronę szkiełka nakrywkowego i odsączyć nadmiar buforu z przedniej strony, uważając, aby nie wysuszyć komórek.

Następnie połóż szkiełko nakrywkę stroną roboczą do dołu na roztwór z rybami. Powtórz ten proces dla każdego szkiełka nakrywki. Po ponownym zamknięciu pokrywy komór barwiących inkubuj próbki od 5 do 18 godzin w temperaturze 37 °C.

Przygotować kilka komór płuczących w taki sam sposób, w jaki przygotowano komorę barwiącą; do każdej z nich nanieść za pomocą pipety 1 mL buforu płuczącego na parafirmę komory płuczącej. Po inkubacji przenieść szkiełka podstawowe z komory barwiącej, nanieść 1 mL buforu płuczącego obok szkiełka, tak aby ciecz została wciągnięta pod każdą próbkę dzięki działaniu kapilarnemu.

Następnie usuń szkiełka nakrywkowe za pomocą pęsety i umieść każde z nich w kropli buforu płuczącego inkubowanego w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Przepłucz każde szkiełko nakrywkowe jeszcze dwa razy, tak aby łącznie każde z nich zostało przepłukane trzy razy. Pipetuj od 10 do 30 µL medium montażowego z DAPI na wcześniej umyty preparat. Każdy preparat może pomieścić dwa szkiełka nakrywkowe, używając pęsety i papieru filtracyjnego Watman.

Osusz spód szkiełek nakrywkowych i usuń nadmiar cieczy z ich górnej strony, uważając, aby nie wysuszyć próbek. Połóż każde szkiełko nakrywkowe stroną roboczą do dołu na kropli medium montażowego. Zamontowane próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C.

Przedstawiono tutaj wpływ alfa-mantyny na transkrypcję wstrzykniętego plazmidowego DNA w komórkach fibroblastów NIH 3T3, które zostały poddane wstępnej inkubacji z różnymi stężeniami alfa-mantyny. Do komórek wstrzyknięto plazmidowe DNA TFL s delta i oraz koniugat OG 70 kDa z dekstranem. Każdy wiersz odpowiada pojedynczemu polu widzenia obrazowanemu dla dekstranu OG 70 kDa oraz mRNA T uts delta I.

Wykazano, że wysokie stężenia leku całkowicie zahamowały produkcję transkryptu T UTS delta I, podczas gdy nie zaobserwowano tego przy niższych stężeniach. Przedstawiono przebieg czasowy kosztu nuklearnego eksportu mRNA. Siedem komórek wstrzyknięto z plazmidowym DNA T UTS delta i skoniugowanym z OG dekstranem o masie 70 kilodaltonów.

Po 30 minutach od wstrzyknięcia komórki poddano działaniu alpha mantin i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 0 minut, 60 minut oraz 120 minut. Następnie komórki utrwalono i zabarwiono sondą przeciwko mRNA T UTS delta I oraz przeciwciałami przeciwko markerowi ER trap alpha; każdy wiersz odpowiada pojedynczemu polu komórek.

Aby uzyskać informacje na temat sposobu ilościowego określania eksportu mRNA, należy zapoznać się z tekstem dostępnym online tutaj. Punkt czasowy 120 minut został powiększony. W celu wykazania kolokalizacji mRNA TFS delta I w retikulum endoplazmatycznym (ER) przedstawiono nałożenie obrazu mRNA T UTS delta I w kolorze zielonym oraz trap alpha w kolorze czerwonym. Informacje na temat sposobu barwienia mRNA wspólnie z białkami znajdują się w tekście dostępnym online.

Właśnie pokazaliśmy, jak mierzyć kinetykę eksportu jądrowego mRNA za pomocą mikroiniekcji. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że sukces mikroiniekcji wymaga odpowiedniego przygotowania. Kluczowe etapy, takie jak przygotowanie próbek DNA i RNA, wyciąganie igieł, ustawianie sprzętu optycznego oraz rozwiązywanie problemów z mikroiniekcją, zostały opisane w naszym protokole pisemnym.

Podczas obrazowania i analizy mikroiniekcyjnego mRNA ważne jest, aby kwantyfikacja była ograniczona do komórek, które przyjęły ponad 90% wstrzykniętego płynu do jądra komórkowego. Poprawność iniekcji do jądra można ocenić poprzez wizualizację rozkładu organ green dextran w jądrze i cytoplazmie. Więcej informacji na temat projektowania sond do ryb oraz korzystania z oprogramowania do analizy obrazu w celu badania rozkładu mRNA w cytoplazmie i jądrze znajduje się w naszym protokole online.

To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.