Name: Analiza kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków metodą mikroiniekcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Poznaj metodę mikroiniekcji i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do analizy kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków. Technika umożliwia precyzyjną ilościową ocenę transportu mRNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy E. Gomes za pomocne rady oraz A. Wilde za umożliwienie korzystania z różnego sprzętu. Praca ta była finansowana z grantu przyznanego A.F.P. przez Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem (Canadian Institute for Health Research, FRN 102725).

<ol><li>Luo, M. J., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+is+required+for+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).</li>
<li>Bossie, M. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+macromolecules+between+the+cytoplasm+and+the+nucleus+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).</li>
<li>Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+global+and+transcript-specific+mRNA+export+pathways+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans.</a> Genes Dev. 22, 66-78 (2008).</li>
<li>Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+kinetics+of+mRNA+splicing+and+transport+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).</li>
<li>Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+HCMV+immediate+early+mRNA+expression+in+stably+transfected+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).</li>
<li>Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signal+sequence+coding+region+promotes+nuclear+export+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA.</a> PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).</li>
<li>Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+promotes+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).</li>
<li>Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+stabilization+of+microtubules+by+integrin-+and+FAK-facilitated+Rho+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling.</a> Science. 303, 836-839 (2004).</li>
<li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proper+alignment+of+the+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proper alignment of the microscope.</a> Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).</li>
<li>Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+chemical+modification+constraints+into+a+dynamic+programming+algorithm+for+prediction+of+RNA+secondary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).</li>
<li>Görlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signal+sequence+receptor+has+a+second+subunit+and+is+part+of+a+translocation+complex+in+the+endoplasmic+reticulum+as+probed+by+bifunctional+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents.</a> J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).</li>
<li>Perales, R., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Cotranscriptionality%22%3A+the+transcription+elongation+complex+as+a+nexus+for+nuclear+transactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">"Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions.</a> Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).</li>
<li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li>
<li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li>
<li>Carter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+copy+number+estimation+using+a+mouse+whole-genome+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray.</a> Genome Biol. 6, 61-61 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Mikroiniekcja jest potężnym narzędziem, które może być wykorzystywane do badania wielu różnych procesów komórkowych. W przeciwieństwie do konwencjonalnej transfekcji komórek, mikroiniekcja pozwala badaczowi na efektywne wprowadzenie kwasów nukleinowych do jąder komórkowych w bardzo krótkim przedziale czasowym. W rezultacie możliwe jest przeprowadzenie analiz kinetycznych, takich jak określanie szybkości eksportu mRNA, lokalizacji mRNA oraz syntezy białek. Ponadto, ze względu na stosunkowo krótki czas trwania eksperymentu, można poddawać komórki działaniu związków toksycznych przez krótkie okresy bez wywoływania efektów plejotropowych. Co więcej, wraz z kwasami nukleinowymi można wstrzyknąć związki hamujące lub stymulujące, takie jak białka dominująco negatywne. Wreszcie, mikroiniekcje eliminują konieczność stosowania odczynników do transfekcji, które są często toksyczne dla komórek i mogą zaburzać różne funkcje komórkowe.
Iniekcje mRNA w porównaniu do iniekcji plazmidowego DNA
Wybór kwasu nukleinowego do iniekcji będzie zależał od szeregu rozważań. Po iniekcji plazmidowego DNA polimeraza RNA II nie tylko syntetyzuje mRNA, ale także rekrutuje czynniki białkowe do powstającego transkryptu.12,13Ponieważ czynniki te sterują takimi zdarzeniami, jak procesing mRNA, eksport jądrowy i lokalizacja cytoplazmatyczna, iniekcje DNA plazmidowego mogą być wykorzystywane do oceny, w jaki sposób transkrypcja jest sprzężona z procesami w następnych etapach. Chociaż transkrypcja może być sprzężona z eksportem jądrowym14stwierdziliśmy, że wstrzyknięty mRNA jest eksportowany nieco szybciej niż in vivo transkrybowane mRNA6Przyczyny tego stanu rzeczy nie są obecnie jasne, jednak wynik ten może sugerować, że w miarę jak nowo syntetyzowany mRNA wydostaje się z polimerazy RNA II, może on być związany w kompleksach, które opóźniają eksport jądrowy.
Iniekcje mRNA oferują pewne zalety. Po pierwsze, badacz nie musi stosować inhibitorów polimerazy RNA, co mogłoby wpłynąć na sposób, w jaki komórki regulują ogólny metabolizm RNA. Po drugie, RNA może zostać zmodyfikowane in vitro przed iniekcją. Na przykład mRNA można syntetyzować z różnymi analogami czapeczki 5' lub o różnej długości ogonów poly(A), aby ocenić, jak te cechy wpływają na eksport jądrowy6. Po trzecie, można w przybliżeniu oszacować dokładną ilość wstrzykniętego RNA. Postępując zgodnie z powyższym protokołem, szacujemy, że do każdego jądra wstrzykniętych zostaje około 20 000 do 50 000 cząsteczek, co jest wartością stosunkowo niską w porównaniu z całkowitą liczbą transkryptów w typowej komórce ssaka (400 000 do 850 000 cząsteczek)15. Główną wadą iniekcji mRNA jest to, że podczas mikroiniekcji nieunikniony jest pewien wyciek płynu do cytoplazmy. Ponieważ mRNA wstrzyknięte bezpośrednio do cytoplazmy pozostaje stabilne przez długi czas (A. Palazzo, nieopublikowana obserwacja), należy zachować szczególną ostrożność przy wyborze komórek do analizy ilościowej. Zazwyczaj analizujemy komórki, które otrzymały &gt;90% płynu iniekcyjnego w jądrze, co oceniamy na podstawie rozkładu OG-dekstranu.

<table><tbody><tr><td>Bufor do iniekcji</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>140 mM KCl i 10 mM HEPES, pH 7.4</td></tr><tr><td>Dekstran Oregon Green 488-70kD</td><td>Invitrogen</td><td>D7173</td><td>Roztwór stokowy o stężeniu 10mg/ml w buforze do iniekcji może być przechowywany przez dłuższy czas w temperaturze -80&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Kapilary borokrzemianowe</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Grotki do pipet do nakładania żelu do napełniania igieł iniekcyjnych</td><td>Eppendorf</td><td>022351656</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse Ti-S</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>NT-88-V3MSH</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka do iniekcji</td><td>BD Biosciences</td><td>512311</td><td></td></tr><tr><td>Bufor PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 2 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7.4</td></tr><tr><td>Bufor SSC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>150 mM NaCl, 15 mM cytrynian sodu, pH 7.4</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15686</td><td>Roztwór stokowy 37% paraformaldehydu rozcieńczony w PBS</td></tr><tr><td>0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>28314</td><td>Roztwór stokowy 10% Triton X-100 rozcieńczony w PBS</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>Kompleks wanadylu z rybosydem (VRC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3380</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny Whatman</td><td>VWR international</td><td>28298-020</td><td></td></tr><tr><td>Stół wibroizolacyjny</td><td>Kinetic Systems</td><td>5702E-3036-21</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-amanityna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Wytrawiacz pipet Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Smar próżniowy</td><td>Dow Corning</td><td>695400008</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA T7</td><td>New England Biolabs</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza Poly(A)</td><td>Ambion</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do hybrydyzacji</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>100mg/ml siarczanu dekstranu, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM cytrynianu sodu, 0.5mg/ml &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA, 60% formamidu</td></tr></tbody></table>

analiza kinetyki eksportu jądrowego mrna w komórkach ssaków za pomocą mikroiniekcji

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

W organizmach eukariotycznych messenger RNA (mRNA) jest transkrybowane w jądrze i musi zostać wyeksportowane do cytoplazmy, aby uzyskać dostęp do aparatu translacyjnego. Chociaż eksport jądrowy mRNA był szeroko badany w Xenopus oocytes1 oraz w organizmach podatnych na manipulacje genetyczne, takich jak drożdże2 i linia komórkowa S2 pochodząca z Drosophila3, przeprowadzono niewiele badań w komórkach ssaków. Ponadto kinetykę eksportu mRNA w somatycznych komórkach ssaków można było wnioskować jedynie pośrednio4,5. Aby zmierzyć kinetykę eksportu jądrowego mRNA w hodowlach tkankowych ssaków, opracowaliśmy analizę wykorzystującą metodę mikroiniekcji w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH). Analizy te zostały wykorzystane do wykazania, że w komórkach ssaków większość cząsteczek mRNA jest eksportowana w sposób zależny od splicingu6,7 lub w sposób wymagający specyficznych sekwencji RNA, takich jak region kodujący sekwencję sygnałową (SSCR) 6. W tej analizie do komórek mikroiniekuje się mRNA syntetyzowane in vitro lub DNA plazmidowe zawierające interesujący gen. Mikroiniekowane komórki inkubuje się przez różne odstępy czasu, a następnie utrwala i ocenia subkomórkową lokalizację RNA za pomocą metody FISH. W przeciwieństwie do transfekcji, w której transkrypcja zachodzi kilka godzin po dodaniu kwasów nukleinowych, mikroiniekcja DNA lub mRNA umożliwia szybką ekspresję i pozwala na uzyskanie precyzyjnych danych kinetycznych.

W niniejszej pracy opisujemy test wykorzystujący mikroiniekcję w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ w celu dokładnego pomiaru kinetyki eksportu mRNA z jądra w somatycznych komórkach ssaków.

Analiza kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków za pomocą mikroiniekcji

U eukariontów matrycowy RNA (mRNA) jest transkrybowany w jądrze komórkowym i musi zostać wyeksportowany do cytoplazmy, aby uzyskać dostęp do aparatu translacyjnego. Chociaż ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar kinetyki eksportu mRNA z jądra komórkowego w komórkach ssaków. Osiąga się to poprzez mikroiniekcję mRNA lub DNA do jąder komórek hodowlanych tkanek ssaków. Po mikroiniekcji próbki są utrwalane po różnych okresach inkubacji.Następnie mRNA poddaje się barwieniu metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Ostatnim etapem procedury jest obrazowanie komórek oraz ilościowe określenie poziomu fluorescencji w cytoplazmie i jądrze. W rezultacie tempo eksportu mRNA można zmierzyć, łącząc metodę mikroiniekcji z mikroskopią fluorescencyjną.Cześć, jestem SRG AV z laboratorium Alexa Palazzo w Katedrze Biochemii na Uniwersytecie w Toronto. Jestem Stefan Toski, również z laboratorium Palazzo. Jestem Amy z laboratorium Palazzo, a ja jestem Khi Maha David z laboratorium Palazzo.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wprowadzania mRNA do jąder komórek hodowli tkankowych ssaków za pomocą mikroiniekcji. Przedemonstrujemy również sposób barwienia mRNA metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Stosujemy te procedury w naszym laboratorium w celu badania kinetyki nuklearnego eksportu mRNA w komórkach ssaków.Zacznijmy zatem. Przed mikroiniekcją należy rozpuścić wcześniej przygotowane plazmidowe DNA w buforze do iniekcji do stężenia od 50 do 200 µg/mL. Następnie do mieszaniny należy dodać Oregon Green 488 (OG) sprzężony z dekstraną o masie 70 kDa, aby umożliwić identyfikację wstrzykniętych komórek.Skoniugowany dekstran OG pomoże określić, jaka ilość płynu została wstrzyknięta do jądra komórkowego, a jaka przedostała się do cytoplazmy. Próbki należy wirować przy 13 000 G i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 20 minut, aby odwirować wszelkie cząsteczki, które mogłyby potencjalnie zablokować końcówkę igły. Wybierz linię komórkową ssaków do mikroiniekcji w oparciu o kryteria opisane w pisemnym protokole kosztowym.Do tej demonstracji wykorzystano siedem komórek. Komórki umieszczono na zakwaszonych i wypłukanych szkiełkach nakrywkowych w 30 milimetrowych szalkach Petri co najmniej 24 godziny przed mikroiniekcją. Idealnie, w momencie iniekcji warstwa komórek powinna być w stopniu zlewania się (konfluencji) około 70 do 90%, aby umożliwić łatwą identyfikację iniektowanych komórek; przed iniekcją w warstwie komórkowej wykonuje się nacięcie za pomocą plastikowego końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów.Wytraw nacięcie w kształcie krzyża na szkiełku nakrywce i pozostaw komórki do regeneracji w inkubatorze do hodowli tkanek przez co najmniej 15 minut przed wstrzyknięciem. Do mikrowstrzykiwania należy użyć mikroskopu odwróconego, który jest odizolowany na stole pneumatycznym, aby zminimalizować wibracje mogące zakłócić proces mikrowstrzykiwania. Używając końcówki do nakładania żelu einor, usuń około 1 µL z górnej części próbki w wirówce, aby uniknąć rozbicia osadu.Wprowadź końcówkę pipety do tylnej części gotowej igły do mikroiniekcji i wydrukuj ciecz. Ciecz zostanie wciągnięta do końcówki igły dzięki działaniu kapilarnemu. W ciągu od 5 do 30 sekund powinien pojawić się widoczny menisk w pobliżu końcówki.Wprowadź wypełnioną cieczą igłę do uchwytu i przymocuj go do mikromanipulatora. Pod kątem 45 stopni zlokalizuj igłę przy użyciu obiektywu 10x i ustaw ją w centrum pola widzenia w pobliżu płaszczyzny ogniskowej. Za pomocą pokręteł grubego nastawiania mikromanipulatora należy przeprowadzić pozycjonowanie; uchwyt jest połączony rurką ze szklaną strzykawką, która służy do wytworzenia ciśnienia wymaganego do wypchnięcia cieczy z końcówki igły.Aby utrzymać stałe ciśnienie, strzykawkę montuje się w zacisku rurkowym. Używając dwóch gumowych korków i dwóch metalowych zacisków, należy podnieść igłę o kilka milimetrów, aby zapobiec jej uszkodzeniu w późniejszych etapach, a następnie odsunąć mikroskop. Zwiększ ciśnienie, naciskając tłok strzykawki.od 0,5 do dwóch centymetrów sześciennych. Umieść szalkę Petriego zawierającą szkiełko nakrywowe z uszkodzoną monowarstwą. Na stole obiektowym odsuń mikroskop.Przesuń filar do przodu do pozycji pionowej, tak aby kondensator został wyrównany, umożliwiając igle wniknięcie do cieczy. Należy to zrobić ostrożnie, aby zapobiec złamaniu igły o szkiełko nakrywki. Używając obiektywu 10x, zidentyfikuj środek przecięcia linii i ustaw igłę nad komórkami, które mają zostać zainfekowane.Zwiększ powiększenie, przełączając obiektyw na 40 x. Następnie opuść i wycentruj igłę, korzystając z pokręteł mikrometrycznych w dżojstiku. Rozpocznij iniekcję w jednym z narożników krzyżyka rany, opuszczając igłę tak, aby zetknęła się z jądrem.Po wstrzyknięciu w komórce następuje wyraźna zmiana jasności w kontraście fazowym. Kontynuuj wzdłuż jednej krawędzi krzyża rany. Aby umożliwić łatwą identyfikację wstrzykniętych komórek podczas wizualizacji, kluczowe jest odpowiednie dostosowanie ciśnienia wtrysku dla każdej igły.Ciśnienie musi być wystarczająco wysokie, aby przebić błony plazmatyczne i jądrowe, ale nie na tyle duże, by zabić komórki. Przeprowadź mikroiniekcje komórek wzdłuż krawędzi rany przez określony czas. Dzięki wprawie w tym przedziale czasowym można ziniekować kilkaset komórek.W przypadku wstrzykiwania plazmidowego DNA należy inkubować komórki po mikroiniekcji w temperaturze 37°C w inkubatorze do hodowli tkanek przez 20 minut przed fiksacją, a następnie przerwać transkrypcję. Należy to zrobić poprzez potraktowanie komórek roztworem 1 µg/mL α-amanityny rozpuszczonej w pożywce wzrostowej. Takie stężenie skutecznie hamuje transkrypcję z mikroiniekcyjnych plazmidów.Umieść komórki z powrotem w inkubatorze i pozwól im na eksport nowo zsyntetyzowanego mRNA. Pojedyncza igła może być użyta wielokrotnie do wstrzyknięcia materiału do wielu szkiełek nakrywkowych. Igłę należy jednak wymienić, gdy zmieni się rodzaj mikroiniekcyjnego DNA lub RNA.Ponadto, po wyjęciu igły z urządzenia, należy ją zutylizować, aby uzyskać dokładny pomiar kinetyki eksportu mRNA z jądra. Oddzielne próbki należy utrwalić w zero minut, 15 minut, 30 minut, 60 minut i 120 minut. Po zakończeniu inkubacji z alpha manin w odpowiednim czasie, należy odessać pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przemyć komórki dwiema mililitrami roztworu PBS.Ważne jest, aby utrzymać szkiełka nakrywkowe w stanie wilgotnym, minimalizując czas, w którym nie są one zanurzone w cieczy. Utwierdź komórki, dodając 2 mL 4% aldehydu w PBS, i inkubuj je przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej. Po ponownym dwukrotnym przemyciu utwierdzonych próbek, przeprowadź permeabilizację komórek za pomocą 2 mL 0,1% Triton X 100 w PBS, inkubując je ponownie przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej.Na koniec przemyj próbki dodatkowe dwa razy, aby przygotować je do hybrydyzacji. Komórki przemyj dwukrotnie buforem płuczącym w postaci rozwiązania 1XSSC zawierającego od 25 do 60% formamidu. Następnie przygotuj komorę barwienia do hybrydyzacji, pokrywając dno 150 milimetrowej płytki Petri wodą i kładąc na jej powierzchni kawałek parafiny.Usuń wodę, odwracając naczynie, aby paraformułaza przywarła do jego dna. Ręcznie usuń pęcherzyki powietrza z każdego szkiełka nakrywkowego przeznaczonego do barwienia. Nanieś pipetą krople 100 µL roztworu do hybrydyzacji na paraformułazę.Należy pamiętać, że ilość formage powinna zostać zoptymalizowana dla konkretnego używanego białka rybiego przy pomocy pęsety. Usunąć szkiełko nakrywkowe z utrwalonymi komórkami z 30 milimetrowej szalki Petriego. Używając papieru filtracyjnego Watman, osuszyć tylną stronę szkiełka nakrywkowego i odsączyć nadmiar buforu z przedniej strony, uważając, aby nie wysuszyć komórek.Następnie należy położyć szkiełko nakrywkę stroną roboczą do dołu na roztwór z rybą. Powtórz tę procedurę dla każdego szkiełka nakrywki. Po ponownym założeniu pokrywy komór barwiących inkubuj próbki przez okres od 5 do 18 godzin w temperaturze 37 °C.Przygotuj kilka komór płukania w ten sam sposób, w jaki przygotowano komorę barwienia. Do każdej z nich nanieś pipetą 1 mL buforu do płukania na parafórmę komory płukania. Po inkubacji przenieś szkiełka nakrywki z komory barwienia, dodając 1 mL buforu do płukania. Płyn powinien zostać wciągnięty pod każdą próbkę przez działanie kapilarne obok szkiełka nakrywki.Następnie za pomocą pęsety należy zdjąć szkiełka nakrywkowe i umieścić każde z nich w kropli buforu do mycia inkubowanego w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Każde szkiełko nakrywkowe należy przemyć jeszcze dwukrotnie, tak aby łącznie wykonać trzy mycia dla każdego szkiełka. Za pomocą pipety nanieść od 10 do 30 µL medium montażowego z DAPI na uprzednio umyte szkiełko podstawne. Na każdym szkiełku podstawnym można umieścić dwa szkiełka nakrywkowe, używając pęsety oraz papieru filtracyjnego Whatman.Osusz spód szkiełek nakrywkowych i usuń nadmiar cieczy z ich górnej strony, nie wysuszając próbek. Połóż każde szkiełko nakrywkowe stroną skierowaną w dół na kroplę medium montażowego. Zamontowane próbki można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsius.Tutaj przedstawiono efekty działania alfa-mantyny na transkrypcję wstrzykniętego plazmidowego DNA w komórkach fibroblastów NIH 3T3, które poddano wstępnej obróbce różnymi stężeniami alfa-mantyny. Wstrzyknięto do nich plazmidowe DNA TFL s delta i oraz koniugowany OG 70 kDa dekstran. Każdy wiersz odpowiada pojedynczemu polu widzenia obrazowanemu pod kątem OG 70 kDa dekstranu oraz mRNA T uts delta I.Wyraźnie widać, że wysokie stężenia leku całkowicie zahamowały produkcję transkryptu T UTS delta I, podczas gdy w przypadku niższych stężenia nie zaobserwowano takiego efektu. Przedstawiono przebieg czasowy kosztu eksportu mRNA z jądra. Siedem komórek wstrzyknięto z plazmidowym DNA T UTS delta i oraz koniugowanym z OG dekstranem 70 kilodalton.30 minut po iniekcji komórki traktowano alpha mantiną i inkubowano w temperaturze 37°C przez 0 minut, 60 minut oraz 120 minut. Następnie komórki utrwalono i zabarwiono sondą przeciwko mRNA T UTS delta I oraz przeciwciałami przeciwko markerowi ER trap alpha; każdy wiersz odpowiada pojedynczemu polu widzenia komórek.Informacje na temat sposobu ilościowego oznaczania eksportu mRNA znajdują się w tekście dostępnym online pod tym linkiem. Punkt czasowy 120 minut został powiększony. Aby zademonstrować kolokalizację mRNA TFS delta I w ER, przedstawiono nałożenie obrazu mRNA T UTS delta I w kolorze zielonym oraz trap alpha w kolorze czerwonym. Informacje na temat sposobu barwienia mRNA wraz z białkami można znaleźć w tekście dostępnym online.Właśnie pokazaliśmy, jak mierzyć kinetykę eksportu jądrowego mRNA za pomocą mikroiniekcji. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że skuteczna mikroiniekcja wymaga odpowiedniego przygotowania. Kluczowe kroki, takie jak przygotowanie próbek DNA i RNA, wyciąganie igieł, ustawianie sprzętu optycznego oraz rozwiązywanie problemów z mikroiniekcją, opisane są w naszym protokole pisemnym.Podczas obrazowania i analizy mikroiniekcji mRNA ważne jest, aby kwantyfikacja ograniczała się do komórek, do których jądra trafiło ponad 90% wstrzykniętego płynu. Prawidłową iniekcję do jądra można ocenić, wizualizując rozkład organ green dextranu w jądrze i cytoplazmie. Więcej informacji na temat projektowania sond dla ryb oraz korzystania z oprogramowania do analizy obrazu w celu badania rozkładu mRNA w cytoplazmie i jądrze można znaleźć w naszym protokole online.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

analysis-mrna-nuclear-export-kinetics-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza kinetyki eksportu mRNA z jądra w komórkach ssaków poprzez mikroiniekcję

W niniejszym materiale demonstrujemy mikroiniekcję cytoplazmatyczną oocytów Xenopus laevis z substratem importu jądrowego, a także przygotowanie wstrzykniętych oocytów do wizualizacji za pomocą elektronowej mikroskopii sekcji cienkich.<br...

Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis

Bezpośrednia injekcja cDNA do jądra komórkowego jest skuteczną techniką transfekcji komórek pomitotycznych. Metoda ta zapewnia wysoki poziom ekspresji białek heterologicznych z pojedynczych lub wielu konstruktów cDNA i umożliwia badanie funkcji białek w fizjologicznie istotnym środowisku z wykorzystaniem różnych testów na pojedynczych komórkach.

Wewnątrzjądrowa mikroiniekcja DNA do rozdzielonych neuronów dorosłych ssaków

Opisano protokół przygotowania stabilnych ekstraktów jądrowych z komórek HeLa w małej skali. Protokół ten jest wartościowy dla analiz wymagających użycia niewielkich populacji komórek, takich jak komórki poddane działaniu leków lub RNAi. Metoda powinna być możliwa do zastosowania w szerokim zakresie analiz ekspresji genów oraz w przypadku innych typów komórek, w tym komórek pobranych od pacjentów.

Małoskalowe ekstrakty jądrowe do analiz funkcjonalnych aparatów ekspresji genów

Ze względu na ich duży rozmiar i stosunkowo prostą organizację, komórki pielęgniarskie Drosophila idealnie nadają się do badań obrazowania żywych komórek. Ten film opisuje metodę mikroiniekcji do dostarczania związków egzogennych do komórek, a przedstawiony protokół demonstruje procedurę z fluorescencyjnymi sondami oligonukleotydowymi zwanymi latarniami molekularnymi (MB) używanymi do wizualizacji endogennych transkryptów mRNA.

Mikroiniekcja komórek pielęgniarskich Drosophila: metoda dostarczania wewnątrzkomórkowego

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji mRNA związanych z retikulum endoplazmatycznym w komórkach hodowli tkanek ssaków. Technika ta polega na selektywnej przepuszczalności błony plazmatycznej digitoniną w celu usunięcia zawartości cytoplazmatycznej, a następnie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu wykrycia masowych mRNA poli(A) lub specyficznych transkryptów.

Wizualizacja mRNA zlokalizowanych w retikulum endoplazmatycznym w komórkach ssaków

Ten protokół opisuje metodę precyzyjnego pomiaru szybkości transportu nukleocytoplazmatycznego w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych poprzez ilościowe określenie zmian w czasie rzeczywistym w imporcie jądrowym białka NLS-NES-GFP.

Test do pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych

Biogeneza spliceosomalnych snRNA to złożony proces obejmujący różne kompartmenty komórkowe. W tym przypadku zastosowaliśmy mikroiniekcję znakowanych fluorescencyjnie snRNA w celu monitorowania ich transportu wewnątrz komórki.

Analiza lokalizacji spliceosomalnego snRNA w ludzkich komórkach hela za pomocą mikroiniekcji

Opracowaliśmy test reporterowy biogenezy mikroRNA do wykorzystania w komórkach in vitro z czterema plazmidami: jeden z miRNA intronicznym, jeden z celem, jeden do nadekspresji białka regulatorowego i jeden dla lucyferazy Renilla. MiRNA zostało przetworzone i mogło kontrolować ekspresję lucyferazy poprzez wiązanie się z sekwencją docelową.

Test reporterowy do analizy dojrzewania intronowego mikroRNA w komórkach ssaków

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

Niniejszy artykuł opisuje oparte na GFP testy fluorescencyjne in vivo, które pozwalają na oddzielne ilościowe określenie rekombinacji homologicznej oraz niespecyficznego łączenia końców w komórkach ssaków.

Analiza naprawy pęknięć obu nici DNA (DSB) w komórkach ssaków

Poznaj metodę mikroiniekcji i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do analizy kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków. Technika umożliwia precyzyjną ilościową ocenę transportu mRNA.

Analiza kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków za pomocą mikroiniekcji

Przeglądaj więcej filmów