Analiza kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków metodą mikroiniekcji

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków. Osiąga się to poprzez pierwsze mikrowstrzyknięcie mRNA lub DNA do jąder komórek hodowli tkankowej ssaków. Po mikroiniekcji próbki są utrwalane po różnych okresach inkubacji.

mRNA jest następnie barwione przez fluorescencyjną hybrydyzację in situ lub ryby. Ostatnim etapem procedury jest zobrazowanie komórek i ilościowe określenie ilości fluorescencji w cytoplazmie i jądrze. Ostatecznie szybkość eksportu mRNA można zmierzyć za pomocą kombinacji mikroiniekcji i mikroskopii fluorescencyjnej.

Cześć, jestem SRG AV i pracuję w laboratorium Alexa Palazzo na Wydziale Biochemii Uniwersytetu w Toronto. Nazywam się Stefan Toski i również pracuję w Palazzo Lab. Nazywam się Amy i pracuję w laboratorium Palazzo, a nazywam się Khi Maha David i pracuję w laboratorium w Palazzo.

Dziś pokażemy Państwu procedurę wprowadzania mRNA do jąder komórek hodowli tkankowych ssaków za pomocą mikroiniekcji. Pokażemy również, jak wybarwić mRNA przez fluorescencję w hybrydyzacji C-d. Wykorzystujemy te procedury w naszym laboratorium do badania kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków.

Więc zacznijmy. Przed mikroiniekcją należy wcześniej przygotować DNA osocza do 50 do 200 mikrogramów na mililitr w buforze do wstrzykiwań. Następnie w Oregon Green 4, 88 lub OG sprzężono z 70 kilodaltonem dekstran do mieszaniny, aby umożliwić identyfikację wstrzykniętych komórek.

Sprzężony dekstran OG pomoże określić, ile płynu zostało wstrzyknięte do jądra, a ile wyciekło do wirówki cytoplazmowej. Próbki w temperaturze 13 000 g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 20 minut w celu osadzenia wszelkich cząstek stałych, które mogą potencjalnie zatkać końcówkę igły. Wybierz linię komórkową ssaków do mikroiniekcji na podstawie kryteriów opisanych w kosztach pisemnego protokołu.

Do tego demonstracyjnego materiału siewnego używa się siedmiu komórek. Komórki na mytej kwasem pokrywce umieszcza się na 30-milimetrowych szalkach Petriego co najmniej 24 godziny przed mikrowstrzyknięciem. Idealnie, monowarstwa komórek powinna być w około 70 do 90% zlewająca się w momencie wstrzyknięcia, aby umożliwić łatwą identyfikację wstrzykniętych komórek, monowarstwa komórek jest raniona przed wstrzyknięciem za pomocą plastikowej końcówki do pipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Wytrawić nawiniętą na krzyż na szkiełku nakrywkowym i pozostawić komórki do odzyskania w inkubatorze do hodowli tkankowych na co najmniej 15 minut przed wstrzyknięciem. Do mikroiniekcji należy użyć mikroskopu odwróconego, który jest odizolowany na stole powietrznym, aby zminimalizować wibracje, które mogą zostać zakłócone w procesie mikroiniekcji. Za pomocą końcówki ładowarki do żelu einor usuń około jednego mikrolitra z górnej części próbki wirówki, aby uniknąć zakłócenia osadu.

Włożyć końcówkę pipety do tylnej części prefabrykowanej igły do mikroiniekcji i wysunąć płyn. Płyn zostanie wciągnięty do końcówki igły przez działanie kapilarne. Łąkotka w pobliżu końcówki powinna być widoczna w ciągu pięciu do 30 sekund.

Umieść igłę wypełnioną płynem w różdżce i zaciśnij ją na mikromanipulatorze. Pod kątem 45 stopni zwizualizuj igłę za pomocą obiektywu 10 x i umieść ją na środku pola widzenia w pobliżu płaszczyzny ogniskowej. Za pomocą gruboziarnistych pokręteł mikromanipulatora różdżka jest połączona rurką ze szklaną strzykawką, która służy do generowania ciśnienia wymaganego do wyrzucenia płynu z końcówki igły.

Aby utrzymać stałe ciśnienie, strzykawka jest montowana na zacisku rurowym. Za pomocą dwóch gumowych korków i dwóch metalowych zacisków podnieś igłę o kilka milimetrów, aby zapobiec jej uszkodzeniu w późniejszych krokach, a następnie odepchnij mikroskop do tyłu. Filar, zwiększyć ciśnienie, naciskając tłok strzykawki.

0,5 do dwóch centymetrów sześciennych. Umieścić szalkę Petriego zawierającą szkiełko nakrywkowe ze zranioną monowarstwą. Na viewstage, pociągnij mikroskop do tyłu.

Filar wysunięty do przodu do pozycji pionowej, powodując wyrównanie skraplacza we igle, aby wejść do cieczy. Należy to zrobić ostrożnie, aby zapobiec pęknięciu igły na szkiełku nakrywkowym. Używając obiektywu 10 x, zidentyfikuj środek rany krzyżowej i umieść igłę nad komórkami, które mają zostać wstrzyknięte.

Zwiększ powiększenie, przełączając się na obiektyw 40x. Następnie opuść i wyśrodkuj igłę za pomocą pokręteł precyzyjnej regulacji w joysticku. Wstrzyknięcie należy rozpocząć w jednym z rogów skrzyżowania rany, opuszczając igłę w celu zetknięcia się z jądrem.

Po wstrzyknięciu komórka ma zauważalną zmianę jasności fazowej. Kontynuuj wzdłuż jednej krawędzi skrzyżowania rany. Aby ułatwić identyfikację wstrzykiwanych komórek podczas wizualizacji, bardzo ważne jest, aby ciśnienie iniekcji było odpowiednio dostosowane do każdej igły.

Ciśnienie musi być wystarczająco wysokie, aby przebić błonę plazmową i jądrową, ale nie tak wysokie, aby zabić komórki. Mikro wstrzykiwać komórki wzdłuż krawędzi rany przez określony czas. Przy odrobinie wprawy w tym czasie można wstrzyknąć kilkaset komórek.

W przypadku wstrzykiwania DNA z osocza należy inkubować mikro wstrzyknięte komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 20 minut przed utrwaleniem, a następnie zakończyć transkrypcję. Traktując komórki jednym mikrogramem na mililitr alfa, mantyna rozpuściła się w pożywce wzrostowej. Stężenie to skutecznie hamuje transkrypcję z mikroiniekcji plazmidów.

Umieść komórki z powrotem w inkubatorze i pozwól komórkom wyeksportować nowo zsyntetyzowane mRNA. Pojedyncza igła może być ponownie użyta do wstrzyknięcia wielu szkiełek nakrywkowych. Chociaż igła musi zostać wymieniona, gdy zmienił się rodzaj DNA lub RNA, które jest mikrowstrzykiwane.

Ponadto, po wyjęciu igły z różdżki, należy ją zutylizować, aby uzyskać dokładny pomiar kinetyki eksportu jądrowego mRNA. Oddzielne próbki należy ustalić po upływie zero minut, 15 minut, 30 minut, 60 minut i 120 minut. Po leczeniu alfa-maniną w odpowiednim czasie, odessać pożywkę wzrostową i dwukrotnie przemyć komórki w dwóch mililitrach roztworu PBS.

Ważne jest, aby szkiełka nakrywkowe były wilgotne, minimalizując czas, w którym nie są zanurzone w płynie. Napraw komórki, dodając dwa mililitry 4% aldehydu w PBS, inkubuj komórki przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej. Po dwukrotnym umyciu utrwalonych próbek, przepuszczalnie komórki dwoma mililitrami 0,1% Triton X 100 w PBS, ponownie inkubować komórki przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej.

Na koniec umyj próbki dodatkowo dwa razy, aby przygotować próbki do hybrydyzacji. Przemyć komórki dwukrotnie buforem płuczącym z jednego roztworu XSSC zawierającego od 25 do 60% roztworu w połowie pola. Następnie przygotuj komorę barwienia do hybrydyzacji, pokrywając dno 150-milimetrowej szalki Petriego wodą i unosząc na wierzchu kawałek paraformu.

Usuń wodę, odwracając naczynie, pozwalając w ten sposób paraformowi przylgnąć do dna naczynia. Ręcznie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza dla każdego szkiełka nakrywkowego, które ma zostać zabarwione. Odpipetować 100 mikrolitrów kropli roztworu hybrydyzacyjnego na paraformę.

Należy pamiętać, że ilość formowania powinna być zoptymalizowana pod kątem konkretnego używanego profesjonalisty ryb za pomocą kleszczy. Usunąć szkiełko nakrywkowe z nieruchomymi komórkami z 30-milimetrowej szalki Petriego. Używając bibuły filtracyjnej watman, wysusz tylną stronę szkiełka nakrywkowego i odsuń nadmiar bufora od przedniej strony, nie susząc komórek.

Następnie umieść szkiełko nakrywkowe stroną zadrukowaną do dołu na roztworze rybnym. Powtórz ten proces dla każdego szkiełka nakrywkowego. Po ponownym założeniu pokrywy komór barwienia należy inkubować próbki przez pięć do 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Przygotować kilka komór myjących w taki sam sposób, w jaki została przygotowana komora barwienia dla każdej pipety szkiełka nakrywkowego: jeden mililitr buforu płuczącego na paraformę komory myjącej. Po inkubacji usunąć szkiełka przykrywkowe z komory barwienia, odpipetowując jeden mililitr buforu do przemywania wody. Obok szkiełka nakrywkowego ciecz powinna zostać wciągnięta pod każdą próbkę za pomocą działania kapilarnego.

Następnie usuń szkiełka nakrywkowe za pomocą kleszczy i umieść je na kropli buforu do płukania o temperaturze pokojowej inkubowanej na pięć minut. Umyj każde szkiełko nakrywkowe jeszcze dwukrotnie, w sumie trzy razy na każde szkiełko nakrywkowe, odpipetować od 10 do 30 mikrolitrów roztworu montażowego z dappy na wcześniej umytym szkiełku. Każde szkiełko może pomieścić dwa szkiełka nakrywkowe za pomocą kleszczy i bibuły filtracyjnej watmana.

Osuszyć tylną część szkiełek nakrywkowych i usunąć nadmiar płynu z przedniej strony szkiełka nakrywkowego bez suszenia próbek. Umieść każdą szkiełko nakrywkowe stroną zadrukowaną do dołu na kropli roztworu montażowego. Zamontowane próbki można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Tutaj wpływ alfa mantyny na transkrypcję wstrzykniętego DNA osocza wykazał NIH trzy komórki fibroblastów T-trzy, które zostały wstępnie potraktowane różnymi stężeniami alfa mantyny. Wstrzyknięto TFL s delta i, plazmidowe DNA i OG sprzężone 70 kilogramów i dekstran. Każdy rząd odpowiada pojedynczemu polu widzenia zobrazowanemu dla dekstranu OG 70 kilodaltonów i mRNA T uts delta I.

Oczywiste jest, że wysokie stężenia leku całkowicie hamowały wytwarzanie transkryptu T UTS delta I, podczas gdy nie obserwowano tego przy niższych stężeniach. Pokazano. Oto przebieg czasowy kosztów eksportu jądrowego mRNA. Siedmiu komórkom wstrzyknięto DNA T UTS delta i osocza i i sprzężony OG z 70 kilodaltonem dekstranem.

30 minut po wstrzyknięciu komórki potraktowano alfa mantyną i inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez zero minut, 60 minut i 120 minut. Komórki zostały następnie utrwalone i wybarwione sondą przeciwko mRNA T UTS delta I. A w przypadku przeciwciał przeciwko pułapce alfa markera ER, każdy rząd odpowiada pojedynczemu polu komórek.

Aby uzyskać informacje o tym, jak określić ilościowo eksport mRNA, zapoznaj się z tekstem online tutaj. 120-minutowy punkt czasowy został wysadzony w powietrze Aby zademonstrować kolokalizację mRNA TFS delta I w er, pokazano nakładkę mRNA T UTS delta I na zielono i pułapkę alfa na czerwono. Informacje o tym, jak wybarwić mRNA białkami można znaleźć w tekście online.

Właśnie pokazaliśmy, jak zmierzyć kinetykę eksportu jądrowego mRNA za pomocą mikroiniekcji. Wykonując ten zabieg, należy pamiętać, że udany mikrozastrzyk wymaga odpowiedniego przygotowania. Kluczowe kroki, takie jak DNA i RNA, przygotowanie próbki, wyciąganie igieł, wyrównywanie sprzętu optycznego i rozwiązywanie problemów z mikroiniekcją, są opisane w naszym pisemnym protokole.

Podczas obrazowania i analizy mikrowstrzykniętego mRNA ważne jest, aby kwantyfikacja była ograniczona do komórek, które otrzymały więcej niż 90% wstrzykniętego płynu do jądra. Udaną iniekcję jądrową można ocenić, wizualizując rozmieszczenie zielonego dekstranu narządowego w jądrze i cytoplazmie. Zapoznaj się z naszym protokołem online, aby uzyskać więcej informacji na temat projektowania sond dla ryb oraz korzystania z oprogramowania do analizy obrazu do analizy rozkładu mRNA w cytoplazmie w jądrze.

Więc to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.