Ekspresja genów poprzez elektroporację pojedynczych komórek w mysich kulturach warstw hipokampa

Zacznij od wycinka hipokampa z mózgu myszy wyhodowanego na kulturze umieszczonej w naczyniu.

Wytnij wkładkę zawierającą plasterek i zabezpiecz ją w komorze elektroporacyjnej pod mikroskopem.

Wypełnij komorę buforem zawierającym bramkowany napięciem bloker kanału sodowego, aby zahamować nadmierne wzbudzenie i zapobiec toksyczności komórkowej.

Umieść pipetę zawierającą plazmidy z genem będącym przedmiotem zainteresowania w pobliżu wycinka.

Utrzymuj dodatnie ciśnienie, aby zapobiec zatkaniu pipety podczas zbliżania się do docelowego neuronu hipokampa, aż utworzy się wgłębienie błony.

Przełącz na podciśnienie, aby utworzyć uszczelnienie z membraną.

Przełączaj się między dodatnim i ujemnym ciśnieniem, aby zminimalizować uszkodzenia komórek.

Zastosuj impuls elektroporacyjny, aby przejściowo przepuszczalność błony, ułatwiając wejście plazmidu.

Wyjmij pipetę, utrzymując dodatnie ciśnienie, i powtórz elektroporację dla sąsiednich neuronów docelowych.

Przenieś elektroporowany plasterek do świeżej wkładki i inkubuj go, aby umożliwić ekspresję interesującego genu.

Aby przygotować kultury warstwowe do elektroporacji, przenieś interesujące nas wkładki hodowlane na indywidualne trzycentymetrowe szalki Petriego załadowane 900 mikrolitrami pożywki hodowlanej i umieść kultury w stołowym inkubatorze dwutlenku węgla. Następnie należy wstępnie inkubować świeże wkładki hodowlane z jednym mililitrem pożywki hodowlanej w plasterkach na wkładkę na 3,5-centymetrowej szalce Petriego przez co najmniej 30 minut i sterylizować linie urządzenia do elektroporacji 10% wybielaczem przez pięć minut.

Pod koniec perfuzji przepłukać linie zjonizowaną wodą autoklawowaną przez co najmniej 30 minut przed perfuzją za pomocą wysterylizowanego filtrem aCSF zawierającego 0,001 milimolowej tetrodotoksyny. Ustaw impuls elektroporatora na amplitudę minus pięć woltów, impuls prostokątny, ciąg 500 milisekund, częstotliwość 50 herców i szerokość impulsu 500 mikrosekund. Napełnij szklaną pipetę pięcioma mikrolitrami roztworu wewnętrznego zawierającego plazmid, a następnie delikatnie strzepnij i postukaj w końcówkę kilka razy, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki.

Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że końcówka nie jest uszkodzona, i bezpiecznie przymocuj końcówkę pipety do elektrody. Gdy końcówka zetknie się z płynem CSF, zapisz odczyt rezystancji pipety z elektroporatora. Aby wyizolować kulturę plastrową, odetnij membranę wkładki hodowlanej ostrym ostrzem i użyj ostrych kleszczyków, aby ostrożnie przenieść kulturę plastrów do komory elektroporacji.

Następnie ustal pozycję kultury za pomocą kotwicy do plastrów. W celu elektroporacji interesujących komórek należy zastosować nadciśnienie do pipety doustnie i za pomocą trójwymiarowych pokręteł sterujących manewrować końcówką pipety w pobliżu powierzchni kultury plastrów. Oglądając kulturę pod mikroskopem, zbliż się do komórki docelowej końcówką, utrzymując nadciśnienie przyłożone, aż na powierzchni komórki utworzy się wgłębienie.

Po wizualizacji wgłębienia szybko zastosuj doustnie łagodne podciśnienie, aby między końcówką pipety a błoną plazmatyczną utworzyło się luźne uszczelnienie. Membrana nieznacznie wejdzie do pipety. Należy zaobserwować około 2,5-krotny wzrost początkowej rezystancji pipety, na co wskazuje wzrost tonu z głośników.

Szybko ponownie zastosuj dodatnie ciśnienie, aby wgłębienie się zreformowało. Następnie natychmiast wykonaj co najmniej dwa kolejne cykle ciśnieniowe, jak właśnie pokazano, bez zatrzymywania się. Po ostatnim impulsie ciśnienia utrzymaj podciśnienie przez jedną sekundę.

Gdy ton z głośników osiągnie stabilny szczyt wysokości, użyj pedału nożnego, aby szybko uruchomić elektroporator. Po elektroporacji delikatnie cofnij pipetę na około 100 mikronów od celi bez wywierania nacisku i ponownie zastosuj nadciśnienie, sprawdzając, czy rezystancja jest podobna do odczytu linii bazowej przed zbliżeniem się do następnej celi. Gdy wszystkie interesujące komórki zostaną poddane elektroporacji, przenieś kulturę plastrową do jednej z przygotowanych świeżych wkładek hodowlanych i umieść wkładkę w temperaturze 35 stopni Celsjusza na okres do trzech dni.