Ekspresja genów poprzez elektroporację pojedynczych komórek w mysich kulturach warstw hipokampa

Zacznij od wycinka hipokampa z mózgu myszy wyhodowanego na kulturze umieszczonej w naczyniu.

Wytnij wkładkę zawierającą plasterek i zabezpiecz ją w komorze elektroporacyjnej pod mikroskopem.

Wypełnij komorę buforem zawierającym bramkowany napięciem bloker kanału sodowego, aby zahamować nadmierne wzbudzenie i zapobiec toksyczności komórkowej.

Umieść pipetę zawierającą plazmidy z genem będącym przedmiotem zainteresowania w pobliżu wycinka.

Utrzymuj dodatnie ciśnienie, aby zapobiec zatkaniu pipety podczas zbliżania się do docelowego neuronu hipokampa, aż utworzy się wgłębienie błony.

Przełącz na podciśnienie, aby utworzyć uszczelnienie z membraną.

Przełączaj się między dodatnim i ujemnym ciśnieniem, aby zminimalizować uszkodzenia komórek.

Zastosuj impuls elektroporacyjny, aby przejściowo przepuszczalność błony, ułatwiając wejście plazmidu.

Wyjmij pipetę, utrzymując dodatnie ciśnienie, i powtórz elektroporację dla sąsiednich neuronów docelowych.

Przenieś elektroporowany plasterek do świeżej wkładki i inkubuj go, aby umożliwić ekspresję interesującego genu.

Aby przygotować kultury warstwowe do elektroporacji, przenieś interesujące nas wkładki hodowlane na indywidualne trzycentymetrowe szalki Petr