Name: Izolacja i ekspansja nerwowych komórek macierzystych dorosłej myszy za pomocą testu neurosfery (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Naucz się izolować i ekspandować nerwowe komórki macierzyste z dorosłej myszy za pomocą testu neurosfery. Protokół obejmuje mikroskopową dyssekcję tkanek okołokomorowych, trawienie trypsyną oraz hodowlę sfer w odpowiednim medium.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana ze środków Overstreet Foundation.

Część 1: Podstawowe przygotowania przed przystąpieniem do sekcji:
<ol>
	<li>Odpowiednią objętość pełnej pożywki NSC przygotowuje się poprzez zmieszanie NeuroCult NSC Basal Medium oraz NeuroCult NSC Proliferation Supplements w stosunku odpowiednio 9:1. Pożywkę NSC można również przygotować w laboratorium na podstawie składu pożywki wzrostowej NSC opublikowanego w literaturze1. Jeśli laboratorium nie posiada dużego doświadczenia w przygotowywaniu pożywek, zdecydowanie zaleca się stosowanie dostępnych komercyjnie pożywek, które przed sprzedażą przeszły kontrolę jakości pod kątem wzrostu NSC (co ma miejsce w przypadku NeuroCult, Stem Cell Technolgies).</li>
	<li>Pożywkę ogrzewa się w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.</li>
	<li>Do celów sekcji i przemywania przygotowuje się zimną minimalną pożywkę niezbędną buforowaną HEPES (HEM) z wysokim stężeniem antybiotyków (10%). Alternatywnie, w tym celu można zastosować bazową pożywkę NSC z dodatkiem antybiotyków.</li>
	<li>30-40 ml zimnej pożywki HEM zawierającej antybiotyki przelewa się do sterylnych probówek o pojemności 50 ml przeznaczonych do pobierania mózgów.</li>
	<li>Do utrzymania mózgów podczas sekcji potrzebne są kilka plastikowych szalek Petri o średnicy 10 cm oraz jedna sterylna szalka Petri z szkła o średnicy 10 cm do umieszczenia wypreparowanej tkanki.</li>
	<li>Narzędzia chirurgiczne niezbędne do usunięcia mózgu (duże nożyczki, małe nożyczki z ostrzem, duże pincety, małe pincety zakrzywione i mała szpatułka) lub do sekcji tkanki (małe pincety, zakrzywione pincety precyzyjne i skalpel) sterylizuje się w sterylizatorze koralikowym w temperaturze 250°C lub za pomocą innych dostępnych metod autoklawowania.</li>
	<li>Mikroskop sekcyjny przeciera się 70% alkoholem i ustawia wewnątrz komory PC2.</li>
</ol>
Część 2: Pobieranie mózgu dorosłej myszy i mikrodysekcja:
<ol>
	<li>2-4 dorosłe myszy (w wieku 5-8 tygodni) zostają znieczulone zgodnie z zatwierdzonym przez instytucję protokołem dotyczącym zwierząt, przy użyciu 3-4% izofluranu lub poprzez podanie doprzestrzenne pentobarbitalu (120 mg/kg).</li>
	<li>Wykonuje się zwichnięcie stawów szyjnych, aby upewnić się, że zwierzę nie odczuwa bólu ani stresu.</li>
	<li>Znieczulona mysz jest kładziona na brzuchu na chłonnym papierze tkankowym, a głowa jest płukana 70% etanolem w celu sterylizacji obszaru.</li>
	<li>Duże nożyce są wykorzystywane do oddzielenia głowy zwierzęcia tuż powyżej obszaru rdzenia kręgowego szyjnego.</li>
	<li>Małe nożyczki z ostrzem są wykorzystywane do wykonania pośrodkowego cięcia w kierunku góra-dół (caudal-rostral), aby odsłonić czaszkę.</li>
	<li>Przecięte brzegi skóry służą do przytrzymania głowy, a następnie każde ostrze małych nożyczek jest umieszczane w każdej z jam oczodołowych, aby wykonać cięcie wieńcowe między orbitami.</li>
	<li>Wykorzystując otwór wielki (foramen magnum) jako punkt wejścia, wykonuje się cięcie podłużne przez czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego oraz dwa cięcia boczne na połączeniu ścian bocznych z podstawą czaszki. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić leżącego pod spodem mózgu, wykonując niewielkie nacięcia i dbając o to, by kąt ostrzy był jak najmniejszy.</li>
	<li>Fragmenty czaszki nad każdą półkulą są chwytane i odsuwane na zewnątrz za pomocą zakrzywionej pęsety, aby odsłonić mózg, a następnie przy użyciu małej, zwilżonej szpatułki mózg jest przekładany do probówki 50 ml zawierającej HEM.</li>
	<li>Procedurę tę powtarza się, aż wszystkie mózgi zostaną pobrane.</li>
	<li>Mózgi są przenoszone do komory PC2 i płukane trzykrotnie wystarczającą objętością zimnego, sterylnego HEM w celu usunięcia ewentualnych zanieczyszczeń, takich jak krew i sierść. Następnie mózgi są przenoszone do szalki Petriego o średnicy 10 cm zawierającej HEM.</li>
	<li>Aby wypreparować obszar okołokomorowy przedmózgowia, szalka z mózgami jest umieszczana pod mikroskopem stereoskopowym przy niskim powiększeniu. Mózgi są następnie ułożone płasko powierzchnią brzuszną do dołu i przytrzymywane od strony ogonowej za pomocą cienkiej, zakrzywionej pęsety. Inna zakrzywiona pęseta jest używana do usunięcia opuszek węchowych.</li>
	<li>Po usunięciu opuszek węchowych mózgi są obracane, aby odsłonić stronę brzuszną.</li>
	<li>Wykonuje się cięcie wieńcowe pod kątem 90° na poziomie skrzyżowania wzrokowego, a tylne części mózgów są odrzucane.</li>
	<li>Procedurę tę powtarza się, aż wszystkie mózgi zostaną przecięte.</li>
	<li>Przy większym powiększeniu przednie części mózgów są obracane tak, aby powierzchnia cięcia była skierowana do góry. Najpierw, za pomocą cienkich, zakrzywionych mikronożyczek lub zakrzywionej, ostrej pęsety, usuwa się i odrzuca przegrodę (septum), a następnie wycina się cienką warstwę tkanki otaczającą ścianę boczną komór, z wyłączeniem miąższu prążkowia i ciała modzelowatego. Wypreparowana tkanka jest zbierana w sterylnej, szklanej szalce Petriego o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Procedurę tę powtarza się, aż wszystkie mózgi zostaną poddane mikrodysekcji.</li>
</ol>
Część 3: Przygotowanie tkanek i wysiew komórek:
<ol>
	<li>Połączoną tkankę sieka się przez około 1-2 minuty za pomocą ostrza skalpela, aż pozostaną jedynie bardzo małe kawałki.</li>
	<li>Używa się całkowitej objętości 3 ml 0,05% trypsyny-EDTA, a całą posiekaną tkankę przenosi się do probówki o pojemności 15 ml. 3 ml trypsyny-EDTA jest wystarczające do prawidłowego trawienia tkanek pobranych od maksymalnie 8 myszy.</li>
	<li>Probówkę inkubuje się przez 7 min w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji enzymatycznej probówkę przenosi się z powrotem do komory z wyciągiem i dodaje równą objętość inhibitora trypsyny z soi, aby zatrzymać aktywność trypsyny.</li>
	<li> Zawiesinę pipetuje się w górę i w dół, aby zapewnić inaktywację trypsyny, a następnie pelletuje poprzez wirowanie przy 700 rpm (110 g) przez 5 min.</li>
	<li>Nadpłyn odrzuca się, a kawałki tkanki resuspendsuje w 150 μl sterylnego podstawowego medium NSC. Po ustawieniu pipety na 200 μl, grudki rozdziela się poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół (3-7 razy), aż do uzyskania gładkiej, mlecznej zawiesiny pojedynczych komórek. Liczba etapów pipetowania zależy bezpośrednio od wielkości cząstek w posiekanej tkance (lepiej siekać tkankę na bardzo małe kawałki, aby zwiększyć powierzchnię aktywności trypsyny). Długotrwała i intensywna dysocjacja mechaniczna może prowadzić do zmniejszenia liczby tworzonych sfer z powodu śmierci neuralnych komórek macierzystych i progenitorowych.</li>
	<li>Aby usunąć zanieczyszczenia i nierozdzielone fragmenty, do zdysocjowanej zawiesiny komórek dodaje się podstawowe medium NSC do osiągnięcia całkowitej objętości 10-15 ml. Zawiesinę komórek przepuszcza się przez sito komórkowe 40 μm do probówki o odpowiedniej wielkości, a następnie pelletuje poprzez wirowanie przy 700 rpm (110 g) przez 5 min.</li>
	<li>Aby dodatkowo usunąć zanieczyszczenia, zaleca się resuspensję pelletu w 10-15 ml medium NSC i wirowanie zawiesiny komórek przy 700 rpm (110 g) przez 5 min.</li>
	<li>Nadpłyn odrzuca się. Następnie komórki resuspendsuje się w odpowiedniej objętości kompletnego medium NSC uzupełnionego o 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml bFGF oraz 1 μl/ml 0,2% heparyny.</li>
	<li>Zdysocjowaną tkankę z jednego mózgu umieszcza się w jednej kolbie T25 (zawierającej 5 ml kompletnego medium). Komórki inkubuje się następnie w temperaturze 37°C, przy 5% CO2 przez 7-10 dni, do czasu uformowania się neurosfer. Tkanka pobrana z jednego mózgu zazwyczaj pozwala na wygenerowanie 400-600 neurosfer.</li>
</ol>
Część 4: Pasażowanie i ekspansja NSC:
<ol>
	<li>Gdy neurosfery są gotowe do pasażowania (średnica 150-200 μm), medium z zawieszonymi sferami przenosi się z kolb do sterylnej probówki do hodowli tkanek o odpowiedniej pojemności i wiruje przy 700 rpm (110 g) przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Nastawnik odlewamy, a sfery resuspendujemy w 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA. Alternatywnie neurosfery można pasażować, stosując metody dysocjacji mechanicznej lub chemicznej opisane w literaturze 2,3.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową inkubuje się w kąpieli wodnej w temperaturze 37°C przez 2-3 min, a następnie dodaje równą objętość inhibitora trypsyny z soi, aby zatrzymać aktywność trypsyny.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową delikatnie pipetuje się w górę i w dół, aby upewnić się, że trypsyna została całkowicie nieaktywowana.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową wiruje się przy 700 rpm przez 5 min. Następnie odlewa się nadsącz, a komórki resuspenduje w 1 ml medium NSC.</li>
	<li>10 μl zawiesiny komórkowej miesza się z 90 μl błękitu trypanu w celu przeprowadzenia zliczenia komórek.</li>
	<li>Komórki wysiewa się w stężeniu 5x104 cells/ml w kompletnym medium NSC uzupełnionym o 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml bFGF oraz 1 μl/ml 0,2% heparyny do kolby do hodowli tkanek o odpowiedniej wielkości. Należy użyć 5 ml medium dla kolb T25, 20 ml dla T75 i 40 ml dla T175.</li>
	<li>Wtórne neurosfery tworzą się w ciągu 5-7 dni podczas inkubacji w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2.</li>
</ol>
Część 5: Reprezentatywne wyniki:
W pierwotnej hodowli dorosłych NSC większość komórek obumrze po 2-3 dniach, natomiast komórki prekursorowe reagujące na czynniki wzrostu (w tym komórki macierzyste i progenitorowe) będą proliferować (Rysunek 1) i wytworzą kolonie niezróżnicowanych komórek po 6-8 dniach. W hodowlach tych zazwyczaj występuje znaczna ilość debris, który może przyjąć kulisty kształt i zostać pomylony z neurosferami. Ilość debris jest bezpośrednio zależna od technik mikrodysekcji i przygotowania tkanki. Prawdziwe neurosfery są jasne w fazie (świetliste) i stają się bardziej sferyczne wraz ze wzrostem rozmiaru (patrz wideo). Po 7-10 dniach sfery muszą być okrągłe, ale nie zagęszczone; powinny mieć rozmiar od 150 do 200 μm oraz posiadać sztywne mikrokolce na obwodzie przy dużym powiększeniu (Rysunek 2). Jeśli pozwoli się neurosferom urosnąć zbyt dużym, stają się one ciemne z powodu obumierania komórek w centrum sfer. Duże neurosfery są trudne do dysocjacji i z czasem zaczynają przytwierdzać się do podłoża oraz różnicować.
<img src="/files/ftp_upload/2393/2393fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopowy procesu podziału komórkowego; skupienie na aktywności mitotycznej; diagram czteropanelowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Podstawowa hodowla dorosłych NSC 3 dni po wysiewaniu. Strzałki wskazują małe kolonie proliferujących NSC. Powiększenie oryginalne; 20x.
<img src="/files/ftp_upload/2393/2393fig2.jpg" alt="Tworzenie sferoidów; obraz mikroskopowy; 3D hodowla komórkowa; badania nad rakiem; badanie struktury komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Pierwsze przejście neurosfery dorosłego osobnika 7 dni po wysiewaniu. Zwróć uwagę na mikrokolce na obwodzie sfery. Powiększenie oryginalne: 20x.

<ol><li>Louis, S. A., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+and+Neural+Colony-Forming+Cell+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture%22%5BJournal%5D)">Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays.</a> Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tissue+dissociation+protocol+for+scaled-up+production+of+neural+stem+cells+in+suspension+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors.</a> Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).</li>
<li>Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain%3A+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li>
<li>Golmohammadi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26, 979-987 (2008).</li>
<li>Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).</li>
<li>Messina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem+cells+from+human+and+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart.</a> Circ Res. 95, 911-921 (2004).</li>
<li>Ignatova, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cortical+glial+tumors+contain+neural+stem-like+cells+expressing+astroglial+and+neuronal+markers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro.</a> Glia. 39, 193-206 (2002).</li>
<li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Louis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+Neural+Stem+and+Progenitor+Cells+in+the+Neural+Colony+Forming+Cell+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay.</a> Stem Cells. , (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Metoda hodowli neurosfer 2 zyskała szerokie uznanie w środowisku badawczym nie tylko w zakresie izolacji i badania NSC z OUN 4-5, ale także w izolacji innych typów domniemanych komórek macierzystych z licznych tkanek, takich jak pierś 6 i serce 7, a także w identyfikacji komórek macierzystych nowotworów mózgu, piersi i jelita grubego 8-9, co sugeruje, że ten system hodowli może być stosowany w odniesieniu do wielu populacji somatycznych i nowotworowych komórek prekur...

<table><tbody><tr><td>Podłoże podstawowe NeuroCult NSC Basal Medium</td><td>Podłoże</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05700</td><td></td></tr><tr><td>Suplementy do proliferacji NeuroCult NSC Proliferation Supplements</td><td>Suplement do podłoża</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05701</td><td></td></tr><tr><td>%0.05 trypsyna-EDTA</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny z soi</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek</td><td>Sito</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T25</td><td>Sprzęt hodowlany</td><td>Nalge Nunc international</td><td>136196</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T80</td><td>Sprzęt hodowlany</td><td>Nalge Nunc international</td><td>178905</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Czynnik wzrostu</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2028-EG</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>*MEM</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41500-018</td><td>składnik HEM</td></tr><tr><td>*HEPES</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>składnik HEM</td></tr><tr><td>*Woda destylowana</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15230-147</td><td></td></tr><tr><td>probówki 15 ml</td><td>Sprzęt hodowlany</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>probówki 50 ml</td><td>Sprzęt hodowlany</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna pęseta zakrzywiona</td><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251&amp;#8208;35</td><td></td></tr><tr><td>Mała precyzyjna pęseta</td><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272&amp;#8208;30</td><td></td></tr><tr><td>Mała pęseta</td><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050&amp;#8208;10</td><td></td></tr><tr><td>b-FGF</td><td>Czynnik wzrostu</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3139-FB</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Czynnik wzrostu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784</td><td>rekonstytuowana w PBS</td></tr><tr><td colspan="5">&lt;p class=&quot;jove_content">*Aby przygotować HEM, zmieszaj opakowanie MEM 1&amp;#215;10L oraz 160 ml 1M HEPES i uzupełnij objętość do 8.75 L za pomocą wody destylowanej. Ustaw końcowe pH na 7.4 i przechowuj w temperaturze 4&amp;#x00B0;C.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

izolacja i ekspansja dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Izolację i ekspansję domniemanych neuronalnych komórek macierzystych (NSCs) z mózgu dorosłych myszy opisali po raz pierwszy Reynolds i Weiss w 1992 roku, stosując chemicznie zdefiniowany, bezsurowiczy system hodowli znany jako test neurosfer (NSA). W tym teście większość zróżnicowanych typów komórek obumiera w ciągu kilku dni hodowli, jednak niewielka populacja prekursorów reagujących na czynniki wzrostu ulega aktywnej proliferacji w obecności epidermalnego czynnika wzrostu (EGF) i/lub podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF). Komórki te tworzą kolonie niezróżnicowanych komórek nazywane neurosferami, które z kolei mogą być poddawane pasażowaniu w celu zwiększenia puli neuronalnych komórek macierzystych. Co więcej, komórki te można indukować do różnicowania, generując trzy główne typy komórek OUN, tj. neurony, astrocyty i oligodendrocyty. Test ten stanowi nieocenione narzędzie umożliwiające pozyskanie spójnego, odnawialnego źródła niezróżnicowanych prekursorów OUN, które mogą być wykorzystywane w badaniach in vitro, a także w celach terapeutycznych.
W tym filmie zaprezentowano metodę NSA służącą do generowania i ekspansji NSC z obszaru periwentrykularnego dorosłej myszy, a także przedstawiono wskazówki techniczne pozwalające na uzyskanie powtarzalnych kultur neurosfer. Procedura obejmuje pobranie mózgu od dorosłej myszy, mikrodysekcję obszaru periwentrykularnego, przygotowanie tkanki oraz hodowlę w NSA. Pobraną tkankę poddaje się najpierw trawieniu chemicznemu z użyciem trypsyny-EDTA, a następnie dysocjacji mechanicznej w pożywce NSC w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, którą na koniec wysiewa się do NSA. Po 7–10 dniach hodowli powstałe pierwotne neurosfery są gotowe do pasażowania, aby uzyskać liczbę komórek wymaganą do przyszłych eksperymentów.

Niniejszy protokół wideo demonstruje metodę testu neurosfer w celu generowania i namnażania neuralnych komórek macierzystych z obszaru okołokomorowego dorosłej myszy oraz dostarcza wskazówek technicznych pozwalających na uzyskanie powtarzalnych kultur neurosfer.

Izolacja i ekspansja dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Izolację i ekspansję domniemanych komórek macierzystych mózgu (NSCs) z mózgu dorosłych myszy opisali po raz pierwszy Reynolds i Weiss w 1992 roku, stosując...

Ogólnym celem następujących eksperymentów jest izolacja i namnażanie dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego myszy z wykorzystaniem testu neurosferycznego. Osiąga się to poprzez pobranie mózgów dorosłych myszy, a następnie przeprowadzenie sekcji mózgów pod mikroskopem, usunięcie przegrody oraz izolację tkanki okołokomorowej. Następnie tkankę rozdrabnia się i poddaje trypsynizacji w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.Następnie komórki wysiewa się do pożywki dla neuronalnych komórek macierzystych w celu hodowli. Cześć, nazywam się Hassan Ali i współpracuję z dr. Brentem Reynoldsem w McKnight Brain Institute na Uniwersytecie Florydy. Dzisiaj zaprezentuję, jak izolować i namnażać neuronalne komórki macierzyste z mózgu dorosłej myszy.Przejdźmy do laboratorium i zacznijmy pracę. Znieczul od dwóch do czterech dorosłych myszy, wykonaj zwichnięcie stawów szyjnych i przemyj głowę 70% etanolem. Odetnij głowę zwierzęcia i za pomocą małych ostrych nożyczek wykonaj cięcie pośrodku, od strony ogonowej do rostralnej, aby odsłonić czaszkę.Po usunięciu nadmiaru tkanki szyjnej wykonuje się cięcie w płaszczyźnie czołowej między orbitami, wprowadzając każde z ostrzy ostrych nożyczek do jam orbitowych. Wykorzystując otwór wielki jako punkt wejścia, wykonuje się cięcie podłużne przez czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić znajdującego się pod spodem mózgu, dbając o to, by ostrza wnikały jak najpłyciej.Ponownie, używając ramki i magnum, wykonaj nacięcie wzdłuż bocznych stron czaszki. Za pomocą zakrzywionej pęsety uchwyć i odchyl na zewnątrz fragmenty czaszki pokrywające każdą z półkul, aby odsłonić mózg. Następnie, używając małej szpatułki, przełóż mózg do probówki o pojemności 50 ml zawierającej hem.Powtarzaj tę procedurę, aż wszystkie mózgi zostaną pobrane. Po przeniesieniu mózgów do dygestorium PC two, odlej PBS z probówki 50 ml i zastąp go świeżym PBS, aby usunąć zanieczyszczenia, takie jak krew i włosy. Przeprowadź trzy takie przemycia.Następnie przenieś mózgi do 10 centymetrowej szalki Petriego zawierającej HEM. Umieść mózgi pod mikroskopem stereoskopowym i ułóż każdy mózg płasko powierzchnią brzuszną, trzymając go z boku ogonka za pomocą cienkich zakrzywionych pęsety. Używając drugiej pęsety, usuń cebulki węchowe.Następnie obróć mózg, aby odsłonić jego stronę brzuszną, i wykonaj cięcie koronalne prostopadle do mózgu na poziomie skrzyżowania wzrokowego. Umieść tylną część mózgu w osobnej szalce Petriego z HEM. Umieść część rostralną mózgu w taki sposób, aby widoczna była powierzchnia cięcia.Używając pęsety z ostrymi końcówkami, przytrzymaj mózg, a następnie za pomocą drugiej pęsety usuń przegrodę. Zidentyfikuj prążkowiec, ciało modzelowate oraz obszar okołokomorowy, korzystając z pęsety precyzyjnej. Wypreparuj cienką warstwę tkanki otaczającej komory boczne z każdej strony.Należy upewnić się, że wykluczono miąższ ciała suteczkowatego oraz ciałomózgowia. Przenieść wypreparowaną tkankę do nowo opisanego, sterylnego szklanego szalki Petriego o średnicy 10 centymetrów. Powtarzać tę procedurę, aż wszystkie mózgi zostaną poddane mikrodysekcji.Siekaj połączoną tkankę przez jedną do dwóch minut za pomocą ostrza skalpela, aż pozostaną jedynie bardzo małe fragmenty. Używając 1 ml podgrzanej wcześniej trypsyny, przemyj ostrze skalpela, aby zebrać wszelką przyklejoną tkankę. Następnie użyj kolejnego 1 ml trypsyny.Przemyj dno szalki Petriego, aby zebrać tkankę. Przenieś tkankę do stożkowej probówki 15 ml, aby nie pozostawić żadnych fragmentów tkanki. Trzecią porcją trypsyny przemyj dno szalki Petriego w celu zebrania pozostałej tkanki i przeniesienia jej do probówki 15 ml.Umieść probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na siedem minut. Po zakończeniu inkubacji enzymatycznej dodaj do trawionej tkanki taką samą objętość inhibitora trypsyny, a następnie kilkakrotnie pipetuj zawiesinę, aby zapewnić inaktywację trypsyny. Po tym osadź zawiesinę tkankową poprzez wirowanie przy 700 RPM lub 110 G przez pięć minut. Odsaj supernatant za pomocą pompy próżniowej i go wylej.Następnie resuspenduj komórki w 150 µL sterylnej pożywki bazowej dla neuronowych komórek macierzystych. Ustaw pipetę na 200 µL, przyłóż końcówkę do dna probówki i pipetuj w górę i w dół od trzech do siedmiu razy, aby rozbić grudki, aż do uzyskania mlecznej zawiesiny. Nadmierne pipetowanie może prowadzić do śmierci komórek.Dodaj kolejne 9,8 ml pożywki, aby osiągnąć objętość całkowitą 10 ml. Przepuść zawiesinę przez sitko komórkowe o oczkach 40 µm do probówki 50 ml w celu usunięcia zanieczyszczeń lub niepołączonych fragmentów. Następnie odwirowuj komórki przez pięć minut przy 700 RPM lub 110 G.Odssać nadmiar cieczy z osadu i zresuspender. Zawiesić komórki w 1 ml kompletnego pożywki dla neuronowych komórek macierzystych. Ponieważ dysponujemy komórkami z dwóch mózgów, odmierzyć 9 ml kompletnej pożywki dla neuronowych komórek macierzystych i przenieść do probówki o pojemności 15 ml.Wymieszać 1 ml komórek uzyskanych z dwóch mózgów myszych. Następnie przenieść je do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml kompletnego pożywki dla neurostemu. Dodać bFGF do stężenia końcowego 10 ng/ml, EGF do stężenia końcowego 20 ng/ml oraz 1 µL/ml 0,2% heparyny.Następnie wymieszać komórki znajdujące się w pełnej pożywce do hodowli neuroblastów. Z dodatkiem czynników wzrostu, przenieść 5 ml zawiesiny do każdej kolby T 25. Zazwyczaj komórki uzyskane z jednego mózgu wysiewa się do jednej kolby T 25 z 5 ml pełnej pożywki do hodowli neuroblastów.Z dodatkiem czynników wzrostu. Opisać każdą kolbę i przenieść do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ na okres od 7 do 10 dni. Po upływie 7 do 10 dni ocenić zawartość kolby pod mikroskopem.W tym czasie sferoida powinna osiągnąć średnicę od 150 do 200 µm i być gotowa do pasażowania. Zawartość każdej kolby należy zebrać i przenieść do konicznej probówki o pojemności 15 ml. Probówkę należy odwirować, usunąć nadsącz, a osad wymieszać z 1 ml podgrzanej trypsyny i inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez trzy minuty.Po zastosowaniu trypsyny należy dodać taką samą objętość inhibitora trypsyny i dokładnie wymieszać, a następnie odwirować. Ponownie usunąć nadsącz i zawiesić komórki w 1 ml pełnej pożywki do hodowli komórek macierzystych north. Odmierzyć 10 µL zawiesiny komórkowej i dodać do 90 µL barwnika trypaniego.Dokładnie wymieszaj zawiesinę i przenieś 10 µL do hematocytometru. Wykonaj zliczenie komórek. Przenieś łącznie 10 ml pełnej pożywki do komórek macierzystych nerkowych do probówki o pojemności 15 ml, aby móc wysiać komórki do dwóch kolb T 25.Następnie wymieszać komórki i dodać odpowiednią ich ilość, aby uzyskać całkowitą gęstość 50, 000 cells per ml lub 250, 000 cells per T 25 flask. Następnie dodać czynniki wzrostu opisane wcześniej, w tym E-G-F-B-F-G-F oraz heparynę. Wymieszać zawiesinę i przenieść do kolb T 25, aby uzyskać całkowitą objętość 5 mL na kolbę.Na koniec należy umieścić kolby w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w celu wygenerowania sfer. Jest to przykład kultury pierwotnej trzy dni po wysianiu. Jest to przykład kultury sfer neurosferycznych po siedmiu dniach.Jak widać, występują sfery o różnych rozmiarach. Neurosfery stają się jaśniejsze lub bardziej świetliste i przyjmują bardziej sferyczny kształt wraz ze wzrostem rozmiaru.Występują również zanieczyszczenia (debris). Ilość zanieczyszczeń zależy od wielu czynników, takich jak mikrodysekcja i przygotowanie tkanki. Zanieczyszczenia są powszechnie spotykane w pierwotnych kulturach sferycznych neuronów dorosłych.Są to przykłady pasażowania. Jedna dorosła neurosfera po siedmiu dniach. Ponownie widoczne są sfery o różnych rozmiarach, jednak ilość zanieczyszczeń jest znacznie mniejsza.Na obwodzie sfer widoczne są mikrokolce, które występują w zdrowych sferach. Jeśli sfery urosną zbyt duże, ich środek może stać się ciemny z powodu obumarcia komórek, a ich dysocjacja może być utrudniona. Mamy nadzieję, że ten film okaże się pomocny.Należy pamiętać, aby nie dopuścić do zbyt dużego wzrostu sfer, ponieważ mogą one przytwierdzić się do podłoża i ulec różnicowaniu, co dodatkowo utrudniłoby ich pasażowanie. Sfery należy pasażować co 7 do 10 dni, w zależności od ich wielkości i wyglądu. Powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

isolation-expansion-adult-mouse-neural-stem-cells-using-neurosphere

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolowanie i ekspansja dorosłych mysich komórek macierzystych z otoczki neuronowej za pomocą testu neurosferowego

Niniejszy protokół wideo demonstruje zastosowanie testu neurosfer do izolacji i ekspansji komórek macierzystych mózgu z eminencji zwojowych mózgu myszy w 14. dniu embrionalnym.

Ustanowienie hodowli embrionalnych neuralnych komórek macierzystych myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Niniejszy protokół wideo demonstruje sposób rozróżniania i zliczania rzeczywistych komórek macierzystych układu nerwowego w mieszanej populacji komórek prekursorowych układu nerwowego z wykorzystaniem testu tworzenia kolonii neuronalnych.

Test tworzenia kolonii neuronalnych: metoda różnicowania rzeczywistych komórek macierzystych układu nerwowego od komórek progenitorowych układu nerwowego

Niniejszy protokół wideo demonstruje izolację i ekspansję komórek macierzystych z chirurgicznie wyciętej tkanki guza glejaka wielopostaciowego (GBM) u człowieka przy użyciu metody hodowli neurosfer.

Izolacja i ekspansja komórek nowotworowych glejaka wielopostaciowego człowieka z wykorzystaniem testu neurosferycznego

Niniejszy protokół wideo demonstruje nową metodę generowania i następnego oczyszczania neuronalnych komórek progenitorowych z odnawialnego źródła neuralnych komórek macierzystych (NSCs) w oparciu o ich właściwości fizyczne (rozmiar i ziarnistość wewnętrzną) oraz fluorescencyjne, z wykorzystaniem technologii cytometrii przepływowej.

Analiza neuroblastów: metoda generowania i wzbogacania populacji neuronalnych komórek progenitorowych z różnicujących się potomków neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

Film pokazuje proces izolacji i hodowli nerwowych komórek macierzystych ze strefy podmodzelowej mózgu myszy. Polega na rozwarstwieniu tkanek, dysocjacji enzymatycznej i wyhodowaniu ich za pomocą czynników różnicujących, aby rozwinęły się w dojrzałe komórki nerwowe.

Izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych ze strefy podmodzelowej myszy

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Ustanowienie systemów hodowli do ekspansji dorosłych nerwowych komórek macierzystych (aNSC) pozwala na badanie i zastosowanie aNSC w terapii. Strefa podmodzelowa (SCZ) została niedawno uznana za nowy region tworzący neuroblasty u dorosłych myszy. W tym miejscu opisano metody izolacji, ekspansji i różnicowania SCZ-aNSC.

Tutaj demonstrujemy działanie modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego u dorosłej myszy, która oszczędza centralną niszę kanałową, w której znajdują się endogenne nerwowe komórki macierzyste (NSC). Pokazujemy, w jaki sposób test neurosfery można wykorzystać do ilościowego określenia aktywacji i migracji ostatecznych i pierwotnych NSC po urazie.

Test neurosfery do oceny endogennej aktywacji nerwowych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

W tym artykule szczegółowo opisujemy protokół generowania kultur neurosfery z pourodzeniowych mysich nerwowych komórek macierzystych pochodzących z głównych nisz neurogennych myszy. Neurosfery służą do identyfikacji nerwowych komórek macierzystych z tkanki mózgowej, co pozwala na oszacowanie liczby komórek prekursorowych. Co więcej, te struktury 3D mogą być powlekane w warunkach różnicowania, dając początek neuronom, oligodendrocytom i astrocytom, umożliwiając badanie losu komórek.

Izolacja i ekspansja neurosfer z postnatalnych (P1−3) mysich nisz neurogennych

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Naucz się izolować i ekspandować nerwowe komórki macierzyste z dorosłej myszy za pomocą testu neurosfery. Protokół obejmuje mikroskopową dyssekcję tkanek okołokomorowych, trawienie trypsyną oraz hodowlę sfer w odpowiednim medium.

Izolacja i ekspansja dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Przeglądaj więcej filmów