Test do oznaczania ilościowego nieorganicznego polifosforanu w bakteriach

Polifosforan nieorganiczny (polyP) to liniowy polimer fosforanowy biorący udział w zjadliwości bakterii i odpowiedzi na stres, przechowywany w postaci granulek cytoplazmatycznych.

Aby określić ilościowo poliP, należy wziąć płytkę wielodołkową o rosnących stężeniach nieorganicznych wzorców fosforanowych.

Dodaj oczyszczony ekstrakt bakteryjny poli P do pustej studzienki.

Wprowadzić bufor reakcyjny zawierający enzym egzopolifosfatazę do każdego dołka i inkubować.

Enzym rozszczepia poliP na wolny nieorganiczny fosforan, przekształcając go w postać ilościową.

Dodać odczynnik wykrywający zawierający molibdenian i kwas askorbinowy i inkubować.

Molibdenian reaguje z fosforanem, tworząc kompleksy fosfomolibdenianowe, które są redukowane przez kwas askorbinowy do kompleksów o niebieskim zabarwieniu.

Zmierz absorbancję kolorowego kompleksu. Zmierzona absorbancja odpowiada intensywności koloru niebieskiego, która jest wprost proporcjonalna do stężenia fosforanu.

Wygeneruj krzywą wzorcową i oblicz poziomy fosforanów w próbce, odzwierciedlając pierwotną zawartość poliP w bakterii.

Zacznij od przygotowania wzorców zawierających zero, pięć, 50 lub 200 mikromolowych fosforanów potasu w 50 milimolowym pH ośmiokrotnego chlorowodorku tris.

Podwielokrotność 100 mikrolitrów każdego wzorca fosforanowego i 100 mikrolitrów wyekstrahowanych próbek poliP do oddzielnych studzienek na przezroczystej 96-dołkowej płytce. Przygotować mieszankę wzorcową zawierającą, na próbkę, 30 mikrolitrów buforu reakcyjnego 5X ScPPX, 19 mikrolitrów wody i jeden mikrolitr oczyszczonego ScPPX. Dodać 50 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej.

I inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W dniu wykrycia należy przygotować świeży zapas roboczy roztworu detekcyjnego, mieszając 9,12 mililitra roztworu detekcyjnego z 88 mililitrami jednego molowego kwasu askorbinowego i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej przed użyciem. Dodaj 50 mikrolitrów roztworu detekcyjnego do każdej próbki i wzorców na płytce 96-dołkowej.

Aby umożliwić rozwój koloru, inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez około dwie minuty. Za pomocą czytnika płytek zmierz absorbancję przy 882 nanometrach i oblicz stężenie fosforanów w każdej próbce przez porównanie z krzywą wzorcową fosforanu potasu. Następnie przelicz stężenia fosforanów na nanomole fosforanu pochodzącego z poliP w każdym lizacie komórkowym i znormalizuj zawartość poliP w komórkach do całkowitego białka komórkowego, jak opisano w manuskrypcie.