Test do oznaczania ilościowego nieorganicznego polifosforanu w bakteriach

Polifosforan nieorganiczny (polyP) to liniowy polimer fosforanowy biorący udział w zjadliwości bakterii i odpowiedzi na stres, przechowywany w postaci granulek cytoplazmatycznych.

Aby określić ilościowo poliP, należy wziąć płytkę wielodołkową o rosnących stężeniach nieorganicznych wzorców fosforanowych.

Dodaj oczyszczony ekstrakt bakteryjny poli P do pustej studzienki.

Wprowadzić bufor reakcyjny zawierający enzym egzopolifosfatazę do każdego dołka i inkubować.

Enzym rozszczepia poliP na wolny nieorganiczny fosforan, przekształcając go w postać ilościową.

Dodać odczynnik wykrywający zawierający molibdenian i kwas askorbinowy i inkubować.

Molibdenian reaguje z fosforanem, tworząc kompleksy fosfomolibdenianowe, które są redukowane przez kwas askorbinowy do kompleksów o niebieskim zabarwieniu.

Zmierz absorbancję kolorowego kompleksu. Zmierzona absorbancja odpowiada intensywności koloru niebieskiego, która jest wprost proporcjonalna do stężenia fosforanu.

Wygeneruj krzywą wzorcową i oblicz poziomy fosforanów w próbce, odzwierciedlając pierwotną zawartość poliP w bakterii.

Zacznij od przygotowania wzorców zawierających zero, pięć, 50 lub 200 mikromolowych fosforanów potasu w 50 milimolowym pH ośm