Śledzenie dynamiki infekcji bakteryjnych u myszy za pomocą bioluminescencji

Rozpocząć od zawiesiny atenuowanego szczepu bakterii chorobotwórczej.

Atenuowany szczep wykazuje zmniejszoną patogenność ze względu na ukierunkowane delecje w genach wirulencji.

Bakterie są znakowane chromosomalnie za pomocą bioluminescencyjnego operonu, który umożliwia autonomiczną produkcję światła.

Bakterie wyrażają bioluminescencyjny operon, wytwarzając enzym lucyferazy i kompleks enzymatyczny, który syntetyzuje substrat lucyferazy.

Lucyferazy utlenia substrat w celu wytworzenia światła widzialnego.

Odwirować zawiesinę i odrzucić supernatant.

Umyj komórki buforem, ponownie odwiruj i wyrzuć supernatant w celu usunięcia pozostałych składników niekomórkowych.

Ponownie zawiesić komórki w buforze, aby osiągnąć optymalne stężenie bakterii i pobrać zawiesinę do strzykawki.

Zawiesinę wstrzyknąć dootrzewnowo myszy, a następnie przenieść do klatki.

Wizualizuj sygnał bioluminescencyjny w regularnych odstępach czasu.

Osłabiony szczep pozostaje zlokalizowany, a bioluminescencja stopniowo maleje, co wskazuje na usunięcie infekcji.

Rano w dniu wstrzyknięcia rozmrażaj kriowia komórek bakteryjnych w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy do czterech godzin. Po rozmrożeniu należy przechowywać fiolki na lodzie i wstrzyknąć myszom w ciągu dwóch godzin. Przenieś zawartość każdego kriowialu do nowej dwumililitrowej probówki i odwiruj ją w temperaturze 4500 razy G przez 10 minut.

Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w jednym mililitrze PBS. Powtórz wirowanie i ponownie zawiesić komórki w PBS do końcowego stężenia 2,5 razy 10 do dziewiątej jednostki tworzącej kolonię na mililitr. Pobrać trzy próbki z końcowej zawiesiny każdego szczepu, aby potwierdzić stężenie, genotyp i fenotyp.

Dla każdego szczepu należy podać 1,5 mililitra zawiesiny komórek do dwumililitrowej probówki i przygotować PBS do wstrzyknięć kontrolnych. Zbierz myszy i materiały potrzebne do wstrzyknięć w sterylnej sali operacyjnej dla zwierząt i wytrzyj wszystkie powierzchnie chusteczkami odkażającymi przed rozpoczęciem. Noś dwie pary rękawiczek lateksowych, aby ograniczyć ryzyko przebicia w przypadku ugryzienia, a także fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i maskę na twarz.

Wyjmij mysz z klatki i zważ ją, oznaczając ogon trwałym markerem do śledzenia po wstrzyknięciu. Otwórz nową strzykawkę o pojemności jednego mililitra z igłą o rozmiarze 27 i pobrać 200 mikrolitrów sterylnego PBS. Chwyć mysz za uszami, używając kciuka i palca wskazującego, i uszczypnij, aby utworzyć fałd skórny na karku.

Następnie przymocuj ogon do dłoni za pomocą małego palca, aby utrzymać mysz płasko i nieruchomo. Wbić igłę pod kątem 30 stopni do jamy otrzewnej po lewej lub prawej stronie linii środkowej. Lekko unieść igłę, aby upewnić się, że nie została wprowadzona do narządów.

Następnie powoli wstrzyknąć PBS i wyjąć igłę. Typowy jest bolus w miejscu wstrzyknięcia. Umieść igłę w wyznaczonym pojemniku na ostre przedmioty i przenieś mysz do osobnej klatki.

Powtórz procedurę z następną myszą i po wstrzyknięciu wszystkim myszom z jednej klatki przenieś je z powrotem do pierwotnej klatki. Po wstrzyknięciu grupy kontrolnej wstrzyknąć grupy testowe, stosując tę samą procedurę. Po zakończeniu wszystkich wstrzyknięć zwróć myszy do pomieszczenia mieszkalnego i wyczyść miejsce pracy chusteczkami odkażającymi.

Ustaw przepływ tlenu na 1,5 litra na minutę, a izofluran na 3,5% i przenieś mysz do komory anestezjologicznej, a następnie do etapu stabilizacji temperatury, po znieczuleniu. Ułóż mysz na plecach z wyciągniętymi ramionami i dopasuj stożek do nosa, aby podać 2,5% izofluranu podczas obrazowania.

Zamknij drzwi i wykonaj bioluminescencyjne zdjęcia i zdjęcia rentgenowskie myszy. Po zakończeniu obrazowania umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj ją. Powinien odzyskać przytomność w ciągu trzech do pięciu minut.